Ana fenotipleri incelenmesi halinde

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu çalışma, bir antibiyotik ile cilt ve bağırsak mikrobiyomları toplulukları kompozisyon değiştirilmesinden model balık konak üzerindeki etkilerini ortaya çıkarmak için yöntemler içerir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carlson, J. M., Chavez, O., Aggarwal, S., Primm, T. P. Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment. J. Vis. Exp. (120), e55170, doi:10.3791/55170 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Antibiyotikler bir mikrobiyal topluluk dengesizliği anlamına dysbiosis giden insan mikrobiyomu bozabilir olduğu tespit edilmiştir. Antibiyotik tedavileri sonrasında Mikrobiyota en kompozisyon değişiklik özellikle gut 1, 2, toplumun çeşitliliğini alt kilit üyelerini azaltmak ve toplum metabolizmasını değiştirmek için gösterilmiştir. Bağırsak mikrobiyomları Antibiyotik rahatsızlık Clostridium difficile 3, 4 ve Salmonella 5 kolonizasyon direnci azaltabilir.

Buna ek olarak, mikrobiyota bozulması çok sayıda sendrom ve insanlarda hastalık gelişimi ile bağlantılıdır (örn antibiyotik ilişkili enterokolit, enflamasyonlu bağırsak hastalığı, metabolik hastalıklar, vb.). Antibiyotikler de yaygın büyüme hızlandırıcı olarak tarımda uygulananÇiftlik ve kümes hayvanları üretimi 6. Bu güçlü araçlar kullanılması antibiyotik direnci hızlı bir artışın yanı sıra bozulur mikrobiyomu etkilerinde belirgin olarak meskun ev ile olan karşılıklı yan etkiler olmadan değildir. Birçok çalışma, geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı uzun ömürlü Mikrobiyota yapısı ve işlevi için sonuçları henüz bir antibiyotik kesintiye mikrobiyomları etkileyen konak fizyolojisi yan etkileri vardır desteklenecek henüz sadece spekülasyonlar sahip olduğunu göstermiştir.

Ev sahibi, Mikrobiyota ve antibiyotik arasındaki karşılıklı etkileşim özlü bir şekilde anlaşılmaktadır uzaktır. Bu nedenle, basit ve daha çözülebilir modeli oldukça kompleks bir memeli sistemi aydınlatan avantajlıdır. bağırsaktaki dahil insanlarda mukozal yüzeyler, aynı zamanda en yüksek yoğunluk ve mikropların çeşitliliğini ve en mahrem mikrop-konak ilişkileri liman. Balık teklifler s mukozal cilt mikrobiyomlarıbir model sistem olarak Everal avantajlar. Teleostei (kemikli balıklar) Teleost'un hem doğuştan var ve kommensal bakteriyel topluluklar 7 ile bir ilişki birlikte geliştiğini bağışıklık sistemini elde ettiği Omurgalılar anlamı dahilinde sapmak için erken soylarından biridir. Balık cilt payları gibi fizyolojik fonksiyonlar, bağışıklık bileşenleri ve mukus üreten hücrelerin 8 düzenlenmesi olarak memelilerin tip 1 mukozal yüzeylerinde, pek çok özellikleri. balık derisi mukoza yüzeyi dış konumu deneysel işlemek için kolay ve örnek bir mikrobiyomları sunmaktadır.

Batı Sivrisinek, Gambusia affinis (G. affinis), çiftleşme ve toksikoloji 9, 10, 11 incelenmesi için, geçmişte kullanılan bir model, balıktır. bir istilacı türler olarak vahşi küçük boyutu, nüfus bolluk göz önüne alındığında, m inimal bakım maliyeti ve dayanıklı doğa, biz bir mukozal mikrobiyomları model olarak G. affinis geliştirdik. Dahası, Gambusia balıklarının nadirdir doğuran memeliler, genç yaşamak doğurma fizyolojisini paylaşıyoruz. Biz Gambusia 12 profilleme 16S kullanarak balık derisi, normal Mikrobiyota anda en kapsamlı çalışmayı tamamladı. Daha fazla çalışmalar deri ve bağırsak Mikrobiyota bozulması geniş spektrumlu antibiyotik 13 kullanarak aşağıdaki ana bilgisayarda üç olumsuz etkilerini göstermiştir.

Beş farklı etkiler antibiyotik maruz aşağıdaki balık incelendi. mikrobiyomları en köklü konak fayda patojenlerin rekabet dışlama olduğunu. Balık patojen Edwardsiella ictaluri ticari yayın balığı çiftliklerinde 14 enterik septisemi salgınlar neden olduğu bilinmektedir. E. ictaluri da öldürücü zebrafish enfekte ettiği gösterilmiştirclass = "xref"> 15, 16 ve Gambusia 17. su sütunu bu patojenle bir zorluk hariç bir ölçüsü olarak kullanılabilir. bağımsız bir patojene karşı duyarlılığa Karşılaştırma olarak, karışık organizmaların yüksek yoğunlukta maruz kalma sırasında hayatta kalma da gerçekleştirilmiştir. Dışkı ve organik zengin toprak mikrobiyal toplulukların sık karşılaşılan kaynak olarak kullanıldı.

Bakteriyel bağırsak topluluk gerçekleştiren başka kurulmuş rol dolayısıyla ev sahibi genel beslenme alımını etkileyen, besin işleme ve enerji hasat olduğunu. beslenme brüt ölçümü olarak, balık vücut ağırlığı standart bir diyet beslenen bir ay önce ve sonra karşılaştırılmıştır. ortalama kontrol balık ay içinde ağırlık kazandı iken, ortalama kilo kaybı olarak balık antibiyotik ile tedavi edilen. kilo eksikliğinin mekanizması net değildir. Olası bir katkı faktörü bağırsakta gıda geçiş zamanı. Bir GI motivasıflı yöntemi geçiş zamanı belirlemek için Zebra balığı (Adam Zengin, SUNY Brockport, kişisel iletişim) uyarlanmıştır. antibiyotik ile tedavi edilen balıklar değiştirilmiş transit zamanı varsa henüz tespit edilmemiştir.

Tüm organizmalar, özellikle balık, doğal ortamda yaşanan ortak bir meydan okuma ozmotik stres. Gambusia akut tuzluluğa 18 yüksek konsantrasyonlarda vurguladı zaman çabuk adapte gösterilmiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, sergilenen bir antibiyotik değişmiş mikrobiyomları balık yüksek tuz stresine hayatta indirdi. Bu yeni fenotip mekanizması soruşturma altında. Özellikle akvaryumlarında su hayvanları, başka ortak stres, toksik azot formları (amonyak, nitrat, nitrit ve) 'dir. nitrat karşı hayatta kalma antibiyotik ile tedavi edilen ve kontrol balıklar arasında anlamlı bir farklılık yoktu. Bu makalede yer alan yöntemler, zebra olarak Gambusia veya benzeri balık model organizma, kullanılabilirbalık ve Medaka, deneysel manipülasyon aşağıdaki balık fenotipleri ölçmek için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bütün hayvan deneyleri, IACUC protokolleri onayı ile yürütülmüştür, 14-05-05-1018-3-01 13-04-29-1018-3-01 ve 14-04-17-1018-3-01 numaralandırıldı.

1. Hayvan Koleksiyonu, Taşıma ve Etik Bakım

  1. 19 L kova içine küçük bir daldırma net ve yer kullanarak saha sitesinden (http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm de kimlik kılavuzu) için Gambusia affinis toplayın. türler tanımlamak için görsel denetim kullanın.
  2. gölet su ile bir kova 2 d - 1 için istirahat balık. Daha sonra, bir köpürme airstone GAZ 25 ° C'de yarım havuz suyu / yarım musluk suyu ile dolu 76 veya 189 L akvaryum tankları, içine balık aktarın. minimal kendi cilt mikrobiyomları rahatsız olarak balık tutarken küçük bir dip ağı kullanın.
    NOT: Balık yoğunluğu 20 balık / akvaryum suyuna 38 L daha yüksek olmalıdır. Balık deneme önce en az 5 gün boyunca akvaryuma acclimated.
  3. balık başına pul gıda 5 mg ile günlük rejim üzerinde balık yemi. Ho12 saatlik aydınlık / 12 saat karanlık çevrimi ile LD balık.

Tüm deneyler için 2. İlk Antibiyotik Pozlama

  1. Aynı akvaryum her deneyden tüm balık çizim, iki ayrı gruba yerleştirmek (tedavi: maruz antibiyotik ve kontrol: maruz kalmayan) 19 L kovalarda. Önceki veriler aynı akvaryumda balık topluluk bileşiminde az değişiklik cilt microbiomes homojenize olması gösterileri topladı. 12
  2. Deneyler sırasında, yapay gölet 2 L su balıkları tutmak (APW 0.33 g / L CaCl2, 0.33 g / L MgSO 4, 0.19 g / L NaHCO3) kullanımdan önce otoklavlanarak sterilize edilir.
  3. dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 50 mg / ml ekleyerek rifampisin antibiyotik stok çözelti hazırlayın. Rifampisin balık için toksik olan bir Örnek geniş spektrumlu bir antibiyotiktir. İnsanlarda ve farelerde, bu dokularda de dağıtmaktadır.
  4. rifampisin stoktan nihai yönetmek3 gün boyunca tedavi edilen balıklar grubu antibiyotik maruz kalma APW 2 L 25 ug / ml konsantrasyonda. 3 gün sonra, kültürlenebilir cilt bakteri sayısı önceden muamele edilmiş balık derisi benzer geri unutmayın.
  5. Buna paralel olarak, APW arıtılmamış balık grup tutmak ve bir kontrol grubu olarak su sütununa DMSO, eşit miktarda (APW bir L başına 0.5 mL) verir.
  6. Deneyler 2 L bir kovaya üç günlük antibiyotik maruziyetini (veya kontrol) dönemi, transfer balık sonrasında antibiyotik kendisi doğrudan etkilerinden kaçınmak amacıyla, balık fenotipleri bir antibiyotik değişmiş mikrobiyomları etkilerini ölçmek için tasarlanmıştır olarak taze APW.
    1. Antibiyotik balık organları tarafından kaldırılır böylece 10 saat dinlenme süresi kullanın. Baz balığı üç gün bir antibiyotik 25 ug / mL maruz kalan deneyler Bu eliminasyon süresi. pithing ardından omurilik kırpma yoluyla balık Euthanize, daha sonra bir doku değirmeni kullanarak tüm vücudu homojenize.
    2. agar petri merkezine 0.2 um'lik filtreleme sonra süspansiyonun 50 uL yerleştirerek antibiyotik varlığını belirlemek. Küçük bir fişi kaldırır ağar, içine steril 200 ul pipet, bir baş aşağı basarak bu süspansiyon için bir delik açın.
    3. Besin agar 20 mL ölçülen hacmi ile agar kullanın ve rifampisin duyarlı bir gösterge organizmanın, Bacillus subtilis, bir pamuklu çubuk kullanarak yayılır. 25 ° CO / N inkübe bir besin agar B. subtilis edinin ve pamuklu çubuk kullanarak bir koloni elde etmek. 25 ° C'de gece boyunca inkübe edildikten sonra, bir inhibisyon bölgesini gözlemlemek balık dokularında antibiyotik varlığını gösterir.

3. mikrobiyomu Ekstraksiyon

  1. 2 ml steril PBST (137 mM Na ile dolu steril 15 ml konik tüp içine balık koyarak dış mukozal epidermis bir cilt mikrobiyomları örneği Özü10 s duraklatma artışlarla 1 dakika için 10 bir ayarda CI, 10 mM fosfat,% 0.1 Tween-20, pH 7.4) çözeltisi ve vorteksleme. tampon içinde deterjan ve tuz çözeltisi içinde bakteri eşit bir dağılım teşvik eder. Karşılaştırılabilir sonuçlar% 0.85 serum fizyolojik ile buldum ama saf su ile bakteri sayımı düşürülmüştür.
  2. Bir kurtarma kepçeye konik tüp balık aktarın. Cilt ekstraksiyon ölümcül tipik olarak% 10 daha düşüktür. Her iki durumda da, hemen ekstraksiyonu sonucunda boru içinde bakteri süspansiyonu analiz veya gelecekteki analiz için -80 ° C'de 15,000 x g'de ve mağaza oda sıcaklığında bir santrifüj içinde 2 dakika dönüş bakterilerin pelet.
    NOT: Tüm kültür ve biyokimyasal analizler derhal vardır; DNA ya da protein izolasyonu dondurulmuş numuneler arasında olabilir.
  3. İlk steril bir petri balık koyun, bir bağırsak mikrobiyomları örneği almak için. pithing ardından, cerrahi makas ile başının arkasında doğrudan servikal omurilik kesilmesinin balık EuthanizeVe daha sonra dışarıdan% 70 etanol mendil ile vücut sterilize.
  4. diseksiyonu sonrası, yemek borusu sonra anüs önce keserek tüm gut kaldırın.
  5. uzunluğunda 2 mm ve konik bir tüp içinde, iki ml PBST solüsyonu içine tüm bölümleri yer - küçük bölümler halinde 1 gut kesin. 1 dakika boyunca vorteks sonra (bağırsak bölümleri hazırlamak değil dikkat çekmek) başka bir temiz tüpe süpernatant kaldırmak.
    NOT: kısım ya deri örnekleri için belirtilen önceki yöntemle direkt analizler için kullanılan ya da topak haline olabilir çıkarılan bağırsak bakterileri içermektedir.

Belirli Patojen 4. Enfeksiyon Modeli Hazırlama ve Banyo

  1. Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) nin bulaşıcı bir soy elde edilir ve -80 ° C'de saklandı kültür tutun. Gerilme 93 - virüslü bir yayın balığı izole bu çalışmada kullanılan 146, Mark Lawrence, Veteriner Koleji, Mississippi State Üniversitesi'nden elde edildi.
  2. streBakteri kültürüne 19 ağar E. ictaluri medya (EIM) olarak adlandırılan bir seçici ve diferansiyel medya ve 27 ° C'de 2 gün süreyle inkübe üzerine ak E. ictaluri stok.
  3. kültüründen saf izole koloni transferi ve besleyici sıvı 40 mL ihtiva eden bir 150 ml şişeye aşılamak (NB, 5 g / L pepton, 4 g / L biftek ekstresi). 27 ° C 'de 2 gün boyunca 150 rpm'de bir çalkalama yerleştirin şişe.
  4. Inkübasyondan sonra, istenen bulaşıcı doz hacimleri E. ictaluri kültürü kalibre etmek için 650 nm'de 0.2 OD bir spektrometre okuma PBST bir kültür örneği sulandırmak.
  5. Sonraki transferi hem de tedavi edilen balıklar doku ilaç temizlenmesi için yaklaşık 10 saat boyunca 130 taze yapay gölet ml su, veya APW ihtiva eden tek tek plastik kaplara ve işlenmemiş balık gruplarına (antibiyotik maruziyet 3 gün sonra).
  6. Sonra iki gruptan, temiz APW 130 mL içeren 8-ons plastik bardaklar içine tekrar her balık transferi. Her balık APW içine E. ictaluri kültürü 2,8 x 10 6 CFU / mL (banyo enfeksiyon modeli) içeren bir öldürücü doz vermek ve 24 saat süreyle 27 ° C inkübatör tutmak.
  7. E. ictaluri Banyodan sonra, APW 130 mL yeni bardak içine ayrı ayrı balık transferi.
  8. su yerine, bir hafta süresince rekor balık ölümlerinin ardından. Balık bu dönemde beslenen değildir. Yayın balığı aksine, Gambusia nedenle deneysel son nokta olarak ölümcül kullanmak gereklidir, enfeksiyonun dış belirti göstermektedir.

Dışkı ve Toprak 5. polimikrobik Mücadelesi

  1. dışkı Tedavisi
    1. steril eldiven ve steril bir 50 ml konik tüp kullanarak, daha önceki iki hafta içinde antibiyotik almamış sağlıklı gönüllü denekten alınan taze insan dışkı edinin.
    2. toplanmasından sonra steril bir plastik torba içinde dışkı toplamak ve daha sonra bir steril 15 ml C aktarmakonical tüp. 800 mg / mL - 500 bir stok çözelti elde etmek PBST içinde dışkı süspansiyon bir stok konsantrasyonu oluşturur. Bu kalın karışım açılış büyük olacak şekilde steril makas ile alt kesilmiş bir 1 ml veya daha büyük plastik pipet kullanarak aktarmak için en iyisidir.
    3. muamele edilmiş ve muamele edilmemiş kontrol balık gruplarına ilk antibiyotik maruz bırakıldıktan sonra, 130 ml'lik bir toplam hacim APW içine ya da 15 mg / mL ya da 10 mg / mL'lik nihai konsantrasyonlarda dışkı süspansiyonu içeren tek tek plastik bardak ayrılır. 25 ° C'de bir kuluçka bardak tutun.
    4. 2 gün boyunca yakın gözlemle fekal pozlama sırasında kayıt balık ölümleri.
  2. toprak Tedavisi
    1. Zengin organik humus 2 kg (mikropların en yüksek yoğunluğu ve çeşitliliği içermelidir) yaklaşık 7 - - 1 toplayın 15 cm aşağı derinlikte ve temiz bir plastik kap içine koyun. Toprak koleksiyonu izleyen iki gün içinde kullanılması gerektiğini unutmayın.
    2. Korkunçctly ilk maruziyet süresinden sonra, APW 130 ml toprak 18.2 g ihtiva eden tek tek plastik kaplara antibiyotik tedavi edilen ve edilmeyen balık iki grupları ayrılır. balık eklemeden önce elle su kuyusundan toprak karıştırın. partiküllerin çoğu askıya alma ve fincanın dibinde kalmaz.
    3. 25 ° C 'de 3 gün süre ile balık Açığa ve mortaliteye kaydedin.

6. Osmotik Stres Mücadelesi

  1. Yukarıda tarif edildiği gibi, bir 10 saat dinlenme dönemi izler muameleden sonra, APW 150 mL 17.5 mg / mL (300 mM) NaCl içeren ayrı bir bardak içine balık tek tek ele. Bu balık kontrol etmek tamamen öldürücü olmayan deniz suyu tipik tuzluluk, (<% 50) yarısı ama etkili osmotik düzenleme gerektiren, güçlü streslidir.
  2. 36 saatlik bir süre boyunca balık ölümlerinin için gözlemleyin.

7. Nitrat Toksisite Mücadelesi

  1. Antibiyotik tanitima sonra 10 saat süreyle istirahat balıkbir sodyum nitrat konsantrasyonu içeren tek tek kaplara ure ve ayrı bir balık ya da 10 mg / ml (118 mM) veya APW 130 mL, 17.5 mg / ml (206 mM).
  2. Düşük doz için mortalite 4 üzerinde d ve yüksek doz için 1 gün boyunca rekor.

Bireyselleştirilmiş veya gruplanmış Fish 8. Büyüme Analizi

  1. kova gruplar olarak tamamlayın 3 gün antibiyotik maruz kalma ya da kontrol dönemi.
  2. Bireysel için, 150 ml APW her biri 8-oz Strafor bardak doldurmak kabına bireysel balık transferi ve ilk değerlendirme için toplam vücut ağırlığı kaydedin.
    1. hem işlenmiş ve işlenmemiş gruplarındaki tüm balıklar için tekrarlayın. zaman açık bardak balık yemek olmaz çünkü yerine şeffaf plastik bardak beyaz Strafor bardak kullanın.
  3. balık başına iki pelet standart diyet ile günlük balık besleyin. pelet bireysel kitle düşük varyans (3.53 ± 0.42 mg her veya% 8 varyasyon), yolaçan çünkü topaklar gevreği yerine kullanılmıştırGıda benzer miktarlarda alan balıklarda g. görsel meyvelerin granül kaydederek tüketiminin izlenmesi. Tüketim oranları% 80 üzerinde tipik vardı.
  4. 4 hafta boyunca her hafta sonunda, balık ağırlığı belirlemek. Taze APW ile yeni bir fincan hazırlayın bir denge üzerine yerleştirin ve ağırlığı kaydedin. Ardından, orijinal bardaktan bir daldırma net bir balık dökün ve sonra tekrar tartılır yeni fincan içine aktarın. Balık stresi önlemek için işlenmez.
  5. Gruplar için, bir 19 L kovaya APW 2 L yerleştirin ve ölçek daralayın. Daha sonra grubun toplam ağırlığı kaydetmek, yeni APW kova içine aktarırken her iki grupta da birlikte balık tutmak. Tutanak balık grubu ağırlığı, yeni bir kovaya aktararak bir ay zaman aralığında her hafta.

9. Gut Transit Zaman

  1. floresein-etiketli 70 kDa anyonik dekstran kullanın. Dekstran önemli ölçüde sindirilmiş ve bağırsak tabaka boyunca absorbe edilmesi için çok büyük değil, dolayısıyla geçit bağırsak transit zamanı ölçmek olacaktır.Etiketli dekstran balık yemi dahil oldu.
  2. steril 1.7 ml'lik bir tüp içine steril deiyonize su, 360 uL ve jelatin 52 mg (% 13 solüsyon) ekleyin ve yer tüp 60 ° C sıcaklıkta bir blok üzerinde jelatin eriyene dek tamamen çözülür.
    1. bir havan ve havan tokmağı ve balık yağı 20 uL ile birlikte, tüp, bu toz, 40 mg ilave kullanılarak ince bir toz halinde öğütmek balığı gıda pullar. Karıştırma işleminden sonra, FITC-dekstran 1.6 mg ekleyin.
  3. ul laboratuarlarında Parafilm üzerine düşer 20 içine sıcak sıvı karışımı koyun ve onları hızlı bir şekilde serin ve katılaşmaya edelim. onlar çok sert balık yemek için haline gelmeden damla kadar 4 gün boyunca saklanabilir. Mağaza sonra nemlendirilmiş damla tutan bir kapalı plastik kutuda, içinde steril su süzülüyor bir petri, yarısı üzerine Parafilm koyarak buzdolabında düşer.
  4. Sadece beslenme önce, çeyrek jilet kullanarak bölüme düşer. Styro balık acclimatebesleme olmadan bireysel olarak 2 gün boyunca köpük bardak (Not: Sadece maruz kalmamış kontrol balık kullanılmıştır). balık ile kap içine gıda dört çeyrek yerleştirin ve her yemek yiyecek kaç adet 30 dakika boyunca balık gözlemlemek.
  5. Izleme dönemi başlayacak bir daldırma net kullanarak APW 80 mL bardak içine ayrı ayrı balık aktarmak için. Her 2 saat hafifçe elle APW girdap, ve daha sonra 4 ° C de, etiketlenmiş bir 1.7 mL bir tüp içinde 1 ml bir örnek ve mağaza alır. 36 saat boyunca numune almak.
  6. Deneyin tamamlanmasından sonra, aynı anda tüm örneklerin bir floresan spektrofotometre ile kayıt floresans. bir küvet içine tüm 1 ml örnek yerleştirin ve 520 nm ve 495 nm 'de bir eksitasyon ve emisyon ile ölçülen floresan kaydedin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Antibiyotik maruz 13 balık ana etkilerini incelemek için kullanılan deneysel sistemin genel şematik diyagramıdır Şekil 1A temsil balık deri (Şekil 1B) ve barsak (Şekil 1C) microbiomes ayıklanması için bir teknik içerir. önceki verileri, toplam deri kültürlenebilir sayısı tedavinin erken düşer iken, 3 gün sonra tedavi öncesi seviyelere geri döndü ortaya koymaktadır çünkü üç gün maruz antibiyotik dönemi olarak seçildi. Bu arada, toplum kompozisyon, 16S profil tarafından belirlendiği gibi, güçlü dönüşmüştür. Bu nedenle, 3 günlük süre yaklaşık aynı yoğunlukta değişmiş topluluğundan etkilerini analiz etmek için en uygun olmalıdır. türlerin sayısını bırakabilir, agar plaklarına koloni sayıları kullanarak, bu kültür analizi unutmayın. Cilt mikrobiyomları dağılım yönteminin etkinliği (Şekil 1B 5 CFU / g balık ağırlığı) aynı süspansiyon prosedürüne tabi çeşitli balık koloni sayısına ikinci kez (kalan ölçmek için - rong>) genellikle 10 4 aralığında süspansiyon tamponu (gelen tabaklarda koloni sayısını karşılaştırarak analiz edildi bakteriler). bu ikinci süspansiyon sayar süspansiyon yöntemi (yayımlanmamış) etkili olduğunu düşündüren, daha düşük 100 CFU / g idi.

Bir antibiyotik değişmiş mikrobiyomları Balık kontrol balık (Şekil 2) daha E. ictaluri enfeksiyona daha duyarlı olduğu ortaya çıktı. işlenmiş balık 56.1 ± 15 saat ve kontrol balık 98.5 ± 48 saat ölümüne ortalama zaman farkı (Student t-testi, p = 0.12 iki uçlu) istatistiksel olarak anlamlı değildi. Bunun nedeni, küçük grup ebatları muhtemeldir (tedavi n = 6, kontrol, n = 5). En azından bir düzine Grup boyutları bu nedenle tavsiye edilir. Bu enfeksiyonun modelinin bir avantajı, benfeksiyon ya da gıda alımının takibi için iğneler gerektirmez ATH protokolü. E. ictaluri doğal su sütunundan yayın balığı saldırdı. E. ictaluri hassas ısı ve insanlara, böylece zayıf enfeksiyon nedeniyle güvenlik yüksektir. Diğer çalışmalar G. affinis ölüm zamanı bakteri başlangıç dozu ile ilişkili olduğunu ortaya çıkarmıştır. 27 ° C aşılama sıcaklığında, bakteri ve balık hem de optimum olarak seçilmiştir.

Tedavi veya kontrol balık karışık mikropların yüksek sayıları ile kirlenmiş su içinde hayatta kalma önemli farklılıklar yoktu. Mortalite kontrolü için 4 gün boyunca gözlendi (n = 8) ve toprak mikrobik kaynak olarak kullanıldı (n = 9), balık işlemden geçirildi. Bazı ölüm mikroplar (Tablo 1) kaynağı olarak insan dışkısı ile meydana geldi iken, antibiyotik tedavisi hiçbir fark yaptı. % 50 - APW dışkı konsantrasyonu, 20 mg / ml, 40 ikenbalık öldü. Ancak, çözünmüş oksijen konsantrasyonu, bu yüzden, hipoksik koşullar yorumlanması eleştirilmiştir, (kova veya akvaryumlarında>% 80 ile karşılaştırıldığında) sadece% 10 idi. 16 ya da 10 mg düşük seviyelerde / ml kullanıldığında, sağkalım oranları eşleşti (iki taraflı Fisher kesin testi, p = gruplar arasında bir fark 0.95 veya üzeri). Bu iki çalışmanın içinde çözünmüş oksijen düzeyleri üzerinde% 65 ya da idi. Gambusia düşük kaliteli su içinde yaşayabileceği bir çok cesur istilacı türler vardır. Kirlenmiş su tehdidine karşı diğer türlerin hayatta kalmasını ölçmek için doğal mikrobiyal maruziyet bu testlerin kullanımı için ilginç olacaktır. Gerekir su kalitesine (çözünmüş O 2, nitrat, tuzluluk, vb.), Ancak özel çevre siteleri, ötrofikasyonuna tabi özellikle de benzer bir deneyde kullanılabilir su numuneleri, potansiyel olarak karıştırıcı bir faktör olarak tespit edilmesi.

Fish erifampisin xposed kontrol balık (Şekil 3) daha ozmotik strese karşı daha duyarlı idi. yüksek tuzluluğa sahip meydan okuduğunda log-rank testi (her iki grup için n = 9, kontrol grubu ve tedavi edilen grupta% 88 ölümle% 43 ölüm) hayatta kalma oranı önemli bir fark (p = 0.049) gözlendi. Bu testte elde edilen sonuçlar, G. affinis tatlı 20, 24 saat NaCl LC 50 18.1 mg / ml bir belirleme ile uyumluydu. tuzlu stres belirtileri balık sergi solungaçları etrafında kızarıklık dahil ve hareketi yüzme azalmıştır. Bu deneyde, tuzluluk seviyesi 18 mg üzerinde / ml hızlı balık ölümle sonuçlanmıştır.

Su içerisindeki toksin nitrat maruz kaldığında, antibiyotiğe ön-maruziyet sağkalım (Tablo 2) etkilememiştir. Her deneme için, ölüm, akut ve daha çok kronik etkileri temsil eden bir kısa ve uzun zaman noktasında hem de kaydedildi. konsantrasyon10 mg / ml 48 saat 21 de tatlı G. affinis LD 50 olmak dayalı seçildi. Bu testte elde edilen sonuçlar, 90 saat sonra her iki muamele edilmiş ve kontrol grubu% 50 ölümcül olan, bu LD50 değeri ile tutarlı olmuştur. nitrat daha yüksek zorluk (17.5 mg / ml), aynı zamanda daha hızlı ölüme yol açan, incelenmiştir. Yine tedavi gruplarındaki fark yoktu. Nitrit, 48 saat 22, 0.0015 mg / ml arasında bir LD 50 ile G. affinis nitrat daha bariz bir şekilde daha fazla toksiktir. Analitik profil dizin sistemini (yayımlanmamış) kullanarak Topluluk biyokimyasal analiz balık derisi Mikrobiyota nitrat azaltma potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir. Ancak, her iki denemeler sırasında APW nitrit düzeylerinin saptama sınırının (0.001 mg / ml) altında kalmıştır. Bu meydan okuma yöntemi herhangi bir küçük çözünür kimyasallarla kullanılabilir.

bardak ve beslenen t bireyselleştirilmiş zamano bir ay boyunca her balık aynı miktarda, bir eğilim istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmaksızın, ağırlık yanı sıra denetim balık kazanmak değil antibiyotik ile tedavi edilen balıklar için gözlenmiştir (veriler gösterilmemiştir). bireyselleşme stresi önlemek için, balık bir ay boyunca kovalarda tedavi edilen ve edilmeyen balık bir grup olarak birlikte ev sahipliği ve gıda eşleşti miktarda verildi. Bu kurulum sınırlaması balık bireysel olarak aynı yemek gelmiyor olabilir olmasıdır. Ancak grup modelinde, ortalama kazanılan ağırlık (Tablo 3) ortalama kayıp ağırlık ve kontrol balık balık tedavi. Balık tüketen edildi gıda miktarı önceden antibiyotik maruz etkilenecek görünmüyordu, bu yüzden iştah bastırma kilo eksikliği olası bir aday açıklamadır. Bir çok başka faktör bağırsak iltihabı değişiklikler, mukus üretimi seviyeleri, bağırsak geçirgenliği ve / ya da gut hareketi dahil olmak üzere katkıda bulunabilir. Bu tahlilde önemli bir avantajı nutriti ölçmekÖnal etkiler basitliği. Bu ucuz ve sadece enstrümantasyon bir laboratuar denge gerektirir. Mekanizmasını belirlemek için ilgili diğer deney giden bir etki taranması için uygundur.

Balık kilo almaya bağlı incelemek için bir örnektir faktör hareketliliği gut ilgilidir gıda transit zamanı vardır. FITC etiketli dekstran jelatinize gıda dahil ve balık ölümcül olmayan bir yapılabilir. zamanla çevredeki suya floresan ölçüm FITC-dekstran bağırsak geçerek ne kadar hızlı bir ölçüm verir. Maksimum 16 saat sonrası beslenme (Şekil 4) sonra ulaşıldı ile arka plan üzerinde floresan, en kısa sürede 2 saat olarak tespit edilebilir. Bu sonuç, bir akvaryum kontrol balık olduğunu. antibiyotik ile tedavi edilen balık güvenilir sonuçlar henüz elde edilmemiştir. Bu prosedürün bir sınırlama balık yemek yemek için 2-d açlık dönemi gerekli olmasıdır. bir zarf iki bölüm yenir, veri daha tutarlı olmasına rağmen protokol antage, sadece bir gıda bölümü sonuç verebilir balık yeme gibi yüksek hassasiyet (düşük arka plan floresan) 'dir. Bu protokol, fareler 23 için de benzer ve öldürücü bir yöntem daha az karmaşıktır.

Şekil 1
Şekil 1: Ortak Deneysel Protokol şematik bakış. Bir sağ akvaryum tankı transfer balık, antibiyotik ile tedavi edilen (kırmızı su ile temsil edilen) ve kontrol (mavi) gruba ayrıldı ve daha sonra fenotipleri izlemek için tek tek kaplara yerleştirilmiş sol, bir akış çizelgesidir. B ve C balık derisi ve bağırsak microbiomes çıkarma işlemini tasvir. Vortekslemeden sonra, bakteriler mikrobiyal eden analizi için çözeltisi içine asılır.55170 / 55170fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Patojen Duyarlılık. Balık E. ictaluri maruz kalma sırasında bir sağkalım eğrisi rifampisin (kırmızı çizgi) veya işlenmemiş bir kontrol grubu (siyah çizgi) Balık ile tedavi edilen önceden. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: Ozmotik Strese Yatkınlık. Her iki antibiyotik tedavi edilen ve edilmeyen gruplarda balıklar için yüksek tuzluluğa maruz kalma sırasında bir hayatta kalma eğrisi. please bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın.

Şekil 4,
Şekil 4: Gıda Transit Time. İki balık suda zamanla floresan FITC-dekstran beslenen. Balık iki jelatin gıda bölümleri yedik ve balık B birini yedi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

tablo 1
Tablo 1: Yüksek Mikrobiyal ortamlar Duyarlılık. insan dışkı maddesi maruz 3 farklı konsantrasyonlarda değerlendirildi. x Ölüm oranı: y deney grubu y balıkların sayısı karşılaştırıldığında x belirtilen zaman noktasında balık ölü toplam sayısını gösterir.


Tablo 2: Nitrat Toksisite meydan. toksik nitrat konsantrasyonuna maruz kalma boyunca işlemden geçirilmiş ve kontrol gruplarında balık ölümlerinin zaman kaydedildi. x Ölüm oranı: y deney grubu y balıkların sayısı karşılaştırıldığında x belirtilen zaman noktasında balık ölü toplam sayısını gösterir.

Tablo 3
Tablo 3: Büyüme Analizi. antibiyotik veya kontrol tedaviyi takiben bir ay sonra toplam vücut ağırlığında değişiklikler. Nihai ortalama vücut ağırlığına göre (diğer bir deyişle çalışma grubundaki balıklar için) başlangıçtaki ortalama vücut ağırlığında yüzde fark sütunu Δweight olup. K bu grupta balık sayısıdır. yargılama sonunda balık başına ortalama ağırlık zayıf / balıktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bazı zorluklar ilaç balık dokularında tükenmiş olması için antibiyotik tedavisinden sonra temiz APW bir dinlenme dönemi gerektirmektedir. dinlenme süresi atlanır sonra antibiyotik varlığı tahlil bakterilere maruz kalma içerir, özellikle sonuçları karıştırabilir. olacağını antibiyotik pozlama sırasında ev sahibi, ön deneyler izleme mikrobiyomları bileşimi (16S profil veya tüm genom dizileme) ve nüfus yoğunluğunun (qPCR aracılığıyla 16S kantitatif) üzerindeki mikropların toplam sayısında büyük bir değişiklik olmadan değişmiş mikrobiyomları bileşiminden etkilerini incelemek amacıyla gereklidir. 3 D bu sistemde uygun olsa da, ana değiştirme ve / veya antibiyotik yeniden kalibrasyon gerektirecektir.

biyomedikal araştırmalar tipik, bir fare modeli yaygın mikrobiyomları çalışmaları için kullanılmaktadır. En yaygın balık modeli Zebra balığı olduğunu. sırayla mukozal microb yapısı ve fonksiyonu evrensel özellikleri daha iyi anlamak içiniomes ve konak ilişkileri, yeni ve atipik modeller bir gerekliliktir. Bizim WT balık modeli nedeniyle laboratuvar kaldırdı hayvan akrabalı yetiştirme 24 nesillere diğer modeller kaybetmiş doğal konak genetik değişkenliği dahil ederek konak-mikrobiyomları etkileşimleri çalışmak için otantik bir kaynak olarak hizmet vermektedir. Gambusia önemli bir deney avantajı koşullarının geniş tolere kendi Hardy doğasıdır. Yüksek yaşam oranları sıcaklıkta değişen su içinde gözlenmiştir (4-38 ° C), tuzluluk (0-17 mg / ml), çözünmüş oksijen (110-25%) ve pH (4-8). Bu sadece, aynı zamanda sık sık diğer balık türleri için çok stresli çok adımlı deneysel prosedürler için birçok çevre koşulları inceleyerek değil sağlar.

Burada yer alan işlemler, özel bir tedaviye konakçı etkileri keşfetmek için süratle taranması için uygundur. Takip çalışmaları doğrudan nedensellik ve mekanizmasını belirlemek için gereklidir. Örnek uzatma studiBalık mikrobiyomları konak etkileri es şunlardır: bağırsak iltihabı, yağ depolarını niceleme balık sağlığı muayene ve cilt üzerinde ve bağırsaklarda mukus düzeylerinin ölçülmesi ölçme. Bir gnotobiyotik sistem belirli bir konakçı fenotipleri özgü mikropların detay bağlantıları incelemek için geliştirilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rifampicin Calbiochem 557303-1GM
Sodium Nitrate Sigma Aldrich S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran ThermoFisher Scientific D1823
Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets Calbiochem 6500-OP tablets dissolve in water to make PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Panda, S., et al. Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota. PloS ONE. 9, (4), 95476 (2014).
  2. Perez-Cobas, A. E., et al. Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach. Gut. 62, (11), 1591-1601 (2013).
  3. Theriot, C. M., Young, V. B. Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 5, (1), 86-95 (2014).
  4. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517, 205-208 (2015).
  5. Sekirov, I., et al. Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection. Infect Immun. 76, (10), 4726-4736 (2008).
  6. Looft, T., Allen, H. K. Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes. Gut Microbes. 3, (5), 463-467 (2012).
  7. Magnadottir, B. Innate immunity of fish. Fish Shellfish Immunol. 20, (2), 137-151 (2006).
  8. Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens. Fish Shellfish Immunol. 35, (6), 1729-1739 (2013).
  9. Nunes, B., et al. Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations. Arch Environ Contam Toxicol. 68, (2), 331-381 (2014).
  10. Fryxell, D. C., et al. Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish. Proc Biol Sci. 22 (2015).
  11. Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure. Environ Sci Pollu Res Int. 1-8 (2016).
  12. Leonard, A. B., et al. The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective. Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).
  13. Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).
  14. Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Appl Environ Microbiol. 75, (7), 2166-2175 (2009).
  15. Hawke, J. P., et al. Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio. J Aquat Anim Health. 25, (3), 171-183 (2013).
  16. Petrie-Hanson, L., et al. Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC). J Aquat Anim Health. 19, (3), 151-158 (2007).
  17. Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).
  18. Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio). Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).
  19. Shotts, E. B., Waltman, W. D. A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri. J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).
  20. Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  21. Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  22. Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  23. Vilz, T. O., et al. Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation. J Vis Exp. (67), e4086 (2012).
  24. Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. National Academies Press. (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics