Eine Anpassbare Kammer zur Messung der Zellmigration

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Dieses Protokoll Informationen eine anpassbare Methode Zellmigration in Reaktion auf die chemischen Lockstoffe zu messen, die auch die Diffusionsgeschwindigkeit eines Arzneimittels verwendet werden kann, aus einer Polymermatrix zu bestimmen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chowdhury, A. N., Vo, H. T., Olang, S., Mappus, E., Peterson, B., Hlavac, N., Harvey, T., Dean, D. A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration. J. Vis. Exp. (121), e55264, doi:10.3791/55264 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Die Zellmigration ist ein wichtiger Teil der Immunantwort, Wachstum und Wundheilung. Die Zellmigration ist ein komplexer Prozess, der Wechselwirkungen zwischen Zellen, die extrazelluläre Matrix, und löslichen und nicht-löslichen chemischen Faktoren (zB chemische Lockstoffe) beinhaltet. Standardmethoden für die Migration von Zellen zu messen, wie der Boyden-Kammer-Assay, der Arbeit von Zellen auf beiden Seiten eines Teilers zu zählen. Diese Techniken sind einfach zu bedienen; Sie bieten jedoch wenig geometrische Modifikation für verschiedene Anwendungen. Im Gegensatz dazu können Mikrofluidik - Vorrichtungen verwendet werden , die Zellmigration mit anpassbaren Konzentrationsgradienten von löslichen Faktoren 1, 2 zu beobachten. Allerdings Methoden für Mikrofluidik basierte Assays machen kann schwierig sein, zu lernen.

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Erzeugung von Zellkulturkammern die Zellmigration in Reaktion auf die chemischen Konzentrationsgradienten zu messen. Unsere Zelle migration Kammerverfahren verschiedene lineare Konzentrationsgradienten, um zu schaffen Zellmigration für eine Vielzahl von Anwendungen zu untersuchen. Dieses Verfahren ist relativ einfach zu bedienen und wird in der Regel von Studenten durchgeführt.

Die Mikrokanalkammer wurde durch Einbringen eines Acryleinlage in der Form des endgültigen Mikrokanalkammer und in eine Petrischale geschaffen. Danach wird Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) wurde auf die Oberseite des Einsatzes gegossen. Das PDMS wurde härten gelassen und dann wurde die Einlage entfernt. Dies ermöglichte die Schaffung von Vertiefungen in jeder gewünschten Form oder Größe. Zellen anschließend in die Mikrokanalkammer hinzugefügt werden können, und löslichen Mittel können durch Einweichen eines Agarose-Block in dem gewünschten Mittels zu einer der Vertiefungen zugegeben werden. Die Agarose-Block wird zu einer der Vertiefungen gegeben, und Zeitraffer-Bilder können in der Reihenfolge der Mikrokanalkammer entnommen werden, die Zellmigration zu quantifizieren. Änderungen dieses Verfahrens kann für eine gegebene Anwendung gemacht werden, diese Methode hig machenhly anpassbar.

Protocol

1. Die Herstellung eines Mikrokanal-Kammer einen Konzentrationsgradienten erstellen

  1. Schneiden eines Acrylformteil
    1. Besorgen Sie sich ein Stück Acryl mit der gewünschten Breite. Normalerweise verwenden Sie 1/16-Zoll-dicke Acrylplatten. Dickere Platten sind schwierig, gut und sehr dünne Bleche zu schneiden die erforderliche mechanische Festigkeit nicht haben, so dass sie während des Prozesses zu brechen oder sich verziehen.
    2. Erstellen eines CAD-Datei mit der gewünschten Form des Acrylstück einen Hohlraum innerhalb des Polydimethylsiloxans (PDMS) zu erzeugen. Stellen Sie die Kanalbreite und Länge des gewünschten Gradienten relevant für einzelne experimentelle Protokolle zu erreichen.
      1. Hier verwenden ein Acryl Stück der folgenden Dimensionen: zwei Quadrate (0,254 cm x 0,254 cm) verbunden mit einem 0,127 cm breiten Kanal (0,254 cm lang) (Abbildung 1).
    3. Importieren Sie die CAD-Datei in die Laserschneidvorrichtung und legen Sie die Acryl-Stück in einem Laserschneider nach dem manulers Protokoll.
      HINWEIS: Alternativ 3D-Druck, das Stück aus der CAD-Konstruktion. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass alternative Materialien für die Form verwendet werden kann; kann jedoch die Auflösung und die Reproduzierbarkeit, mit 3D-Druck verringert werden im Vergleich zum Laserschneiden.

Abbildung 1
Abbildung 1: Computer-Aided Design (CAD) Darstellung von Microchannel- Kammer. Dieses Bild zeigt die CAD-Zeichnung des Acryleinsatz erforderlich, um die Mikrokanalkammer zu erzeugen. 1 A) Draufsicht der CAD - Zeichnung, 1B) Seitenansicht der CAD - Zeichnung mit Abmessungen in Zoll, 1C) Draufsicht einer CAD - Zeichnung mit Abmessungen in Zoll Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Gießen des Polydimethylsiloxans (PDMS)
    1. In einem Boot wiegen, mischen 10 Gewichtsteile der kommerziellen Elastomerbasis (zB Sylgard 184) mit 1 Gewichtsteil der kommerziellen Elastomer Härters (zB Sylgard 194). Typischerweise wurden 10 g Elastomer Base zu 1 g des Elastomer Härter mischen.
    2. Rühren Sie die Basis und das Härtungsmittel mit einer Mikropipette für 5 min zu kombinieren.
    3. Stellen Sie eine Vakuumglocke nach oben und legen Sie das wiegen Boot mit PDMS im Vakuum 30 min eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
    4. Schalten Sie das Vakuum aus, und entfernen Sie das Boot wiegen. Gießen Sie die PDMS auf der Oberseite des Acryl-Ausschnitt in eine kleine Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die PDMS vollständig den Einsatz abdeckt.
    5. Lassen Sie die PDMS über Nacht aushärten (mindestens 18 h) bei Raumtemperatur.
  1. Entfernen des Einsatzes aus PDMS
    1. Nach der PDMS-Härtung, entfernen Sie den Einsatz von sorgfältig die PDMS um das Acryl-Stück mit einem Skalpell zu schneiden.

    2. Ausplattieren der Zellen in einem Mikrokanal Chamber

    1. Sterilisieren der Kammer zum Plattieren von Zellen.
      HINWEIS: Während kann PDMS unter Verwendung von Ethylenoxid oder andere Techniken sterilisiert werden, um eine schnelle UV-Behandlung ist schnell, billig und ausreichend für die Zellkulturstudien. Die kurze UV-Behandlungsdauer beeinträchtigte nicht die Struktur oder die mechanische Integrität des PDMS Stück.
      1. In einer Standard-Zellkulturschrank vollständig bedecken die Kammer mit 70% Ethanol.
      2. Legen Sie die Petrischale in Laminar-Flow-Haube mit den Deckel ab.
      3. Schließen Sie die Haube und schalten Sie das UV-Licht. Expose mit UV-Licht für 1-2 h.
      4. Öffnen Sie die Laminarströmungsabzug und warten Sie 15 min Volumenstrom wiederherzustellen.
      5. Entfernen Sie die 70% Ethanol.
      6. Waschen Sie die Kammern zweimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Verwenden Sie 1 ml PBS für jede Wäsche. Entfernen PBS und erlauben Kammern über Nacht mit den Deckel ab, um zu trocknen.
        HINWEIS: Alternativ kann statteine Laminarströmungsabzug der Verwendung eines UV-Kammer-Box für die Sterilisation verwendet werden, wenn ein solcher vorhanden ist. Machen Sie eine UV-Box durch eine UV-Lichtquelle in der Rückseite eines Karton ausgekleidet mit Aluminiumfolie platzieren. Die Aluminiumfolie reflektiert das Licht für eine gleichmäßige Ausleuchtung der Probe zu ermöglichen.
    2. Plating Cells in Kammer
      1. Zählen von Zellen unter Verwendung von Trypanblau und einer Zählkammer.
        1. Füge 100 & mgr; l der Zellsuspension zu 400 ul von 0,4% Trypanblau und vorsichtig mischen. Anwenden 100 ul dieser Lösung in die Zählkammer durch vorsichtiges beide Kammern unter dem Deckglas gefüllt wird.
        2. Verwenden Sie ein Mikroskop mit einem 10X-Objektiv auf das Gitter auf dem Hämocytometer zu konzentrieren. Verwenden Sie einen Handtallykostenzähler die Live-ungefärbten Zellen innerhalb eines Satzes von 16 Plätzen auf dem Hämocytometer zu zählen.
        3. Zählen von Zellen in allen vier Sätzen von 16 Plätzen. Nehmen Sie die durchschnittliche Zellzahl von den vier Sätzen von 16 Plätzen und multiplizieren mit 5x10 4. Diese letzte Zahl ist die number von Zellen / ml in der Zellsuspension.
      2. In 2500 Zellen in eine Vertiefung in jeder Kammer. Dies führt zu einer nahezu konfluenten Zelldichte von ~ 30.000 / cm 2.
      3. Erlauben Zellen für 60 min in der Kammer zu sitzen, bevor das Hinzufügen Medium (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium, das 10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin).

    3. Dextran Soaked Agaroseblöcken

    1. Erstellen eines Agaroseblock
      1. Pour 3% Agarose in das 3D-Druckform (2 mm x 2 mm x 2 mm).
      2. Erlauben die Agarose in einer Vakuumkammer zum Verfestigen für 30 min alle Blasen zu entfernen.
      3. Entfernen Sie die Agarose-Block aus der Form.
        HINWEIS: Alternativ pour 3% Agarose in kleine Petrischale in einer Dicke von 2 mm. Schneiden Sie ein 2 mm x 2 mm x 2 mm Block mit einem Skalpell oder einem anderen Schneidwerkzeug. Das ist nicht so präzise wie die Formsystem, aber es kann ein wenig leichter zu tun.
    2. komplett submerge der Agarose-Block in einer Lösung der gewünschten Konzentration des chemotaktischen Faktors. Um die Konzentrationsgradienten Bildung beurteilen, spülen Sie die Kammer zunächst mit fluoreszierenden Dextran. Die Konzentration und Molekulargewicht von Dextran sollte einer löslichen Faktor oder Medikament von Interesse entsprechen.
    3. Genießen Sie die Agarose-Block über Nacht.

    4. Zeitraffer des Dextran Diffusion der löslichen Faktor Konzentrationsgradienten Beurteilen

    1. Legen Sie das Dextran getränkten Agaroseblock in einem kleinen Platz und der Mikrokanalkammer.
    2. Setzen Sie den Mikrokanalkammer in einer Zelle-Bildgebungssystem oder verwenden Sie ein anderes Fluoreszenzmikroskop mit einem Zeitraffer-Fähigkeit. Beginnen Sie mit der Zeitraffer gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Die angezeigten Ergebnisse sind mit GFP-Filter genommen, 50% Licht, 10.04 pH-Wert und 4-fache Vergrößerung.

    5. Zeitraffer des Zellwachstums

    1. Platten Zellen in der Mikrokanalkammer an einem Ende derKammer. Hier verwenden 3T3 Fibroblasten. In 2500 Zellen in eine Vertiefung in der Mikrokanalkammer. Zählen von Zellen, wie in 2.2.1 beschrieben.
      1. Erlauben Zellen für 60 min in der Kammer zu sitzen, bevor das Hinzufügen Medium (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium, das 10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin). Halten der Mikrokanalkammer , die mit plattierten Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2. Zellmigration durch den Kanal kann mit einem Mikroskop betrachtet werden.
      2. Fügen Sie einen Marker oder verwenden Sie eine mikroskopische Defekt in der Kammer als Marker, um als Ausgangspunkt dienen der Abstand zwischen der Zelle Front bewegt sich zu quantifizieren.
    2. Stellen Sie einen Gradienten durch ein Agarosegel Platzierung (8 mm 3 Block) , die das konzentrierte Wachstumsfaktor, chemo-Lockstoff, Medikament oder einem anderen Faktor getestet an einem Ende des Mikrokanals (hier 40% FBS als Beispiel wird verwendet) Kammer.
    3. Nehmen Sie Zeitrafferbilder der sich bewegenden Zelle Front. Hier zeigen die Ergebnisse, Bilder der Zelle front waren, dass alle 12 h unter Verwendung eines Abbildungssystems genommen.
    4. Verwenden Sie Bilder der Zelle Front Zellwachstumsrate zu quantifizieren. Berechnen Sie die Wachstumsrate, indem zuerst die MATLAB polyfit Funktion (roipoly) eine polygonale Maske von der Zelle Front, die Kanalwände und der Referenzmarke definiert zu erstellen. Die Abmessungen dieser Maske ergeben die Migrationsdistanz der vorderen, von dem mittleren Zellenfrontgeschwindigkeit berechnet wird. Andere Studien haben eine ähnliche Methode 8 verwendet.
      HINWEIS: Vergleichen der Rand des Zellwachstumsfront auf jedem Rahmen zu der Konzentration des löslichen Faktors in derselben Entfernung. Der lösliche Faktor Konzentrationsgradienten ist ein 1D-Diffusionsmodell Näherung berechnet.
    5. Nehmen Fluoreszenzbilder der Zellen Phalloidin und DAPI-Färbung verwendet.
      1. Fix-Zellen, bevor sie mit Phalloidin-Färbung.
        1. Warm 4% Paraformaldehyd bei 37 ° C.
        2. Fügen Sie genug 4% Paraformaldehyd Zellen zu decken. Halten der Zellen inParaformaldehyd für 10 min.
        3. Spülen zweimal mit PBS für 15 Minuten jedes Mal. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken.
      2. Entfernen PBS aus Zellen und fügen Sie genug permeabilisierend Lösung (0,1% Triton X-100 in PBS) Zellen zu decken. Lassen Lösung für 10 min.
      3. Zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken.
      4. Entfernen PBS aus Zellen und fügen Lösung (1% Rinderserumalbumin in PBS) für 20 min blockiert.
      5. Entfernen Blockierungslösung und waschen 2-mal mit PBS für jeweils 5 min. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken.
      6. Von diesem Punkt, schützen die Zellen vor Licht mit Aluminiumfolie, wenn sie nicht verwendet werden. Entfernen PBS aus Zellen und fügen Phalloidin 488 1:50 verdünnt in PBS für 1 h.
      7. Waschen Sie 2-mal in PBS für 5 Minuten für jede Wäsche. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken. Dann entfernen PBS aus Zellen.
      8. Hinzufügen DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol), verdünnt 1: 1000 in PBS zu den Zellen für 15 min.
      9. Entfernen Sie DAPI undwaschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für 5 Minuten für jede Wäsche.
      10. Entfernen letzten Waschen und fügen Sie genug PBS Zellen zu decken. Zellen können nun mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 zeigt die Bewegung der Zellenfront über den Kanal als Reaktion auf einen Gradienten von fötalem Rinderserum am entgegengesetzten Ende des Kanals angeordnet , von dem die Zellen ausplattiert. Die Zellfront wird bei 48 h (2A) gezeigt, 72 h (2B), 96 h (2C) und 120 h (Figur 2D) Post plating. Die Bewegung der Zellenfront wurde mit diesen Zeitraffer-Bildern verfolgt, und die Laufstrecke und die Wachstumsrate durch die MATLAB polyfit Funktion berechnet wurden. Daraus wurde die mittlere Zellenfrontgeschwindigkeit zu 13,4 & mgr; m / h (Abbildung 3). Figur 4 zeigt das Fluoreszenz Gradienten , der durch ein Dextran durchnässten Agarose Block an einem Ende des Kanals platziert und ermöglicht Dextran für 12 h durch den Kanal zu diffundieren. Ein Zeitraffer-Bild wurde zu jeder Stunde, und die Fluoreszenz über den Abstand genommen von der Kanal wurde gemessen und aufgetragen in Figur 4 und im Vergleich zu einem 1D - Diffusionsmodell , wie gezeigt.

Figur 2
Abbildung 2: Zelle Front - Bewegung. Zeitraffer-Bilder der Zelle Front in der Mikrokanalkammer durch den Kanal zu bewegen. Die Zellenfront in orange Linien markiert und die Wanderungsstrecke ist im Preis inbegriffen. Diese Migrationsdistanz wurde aus der Markierung auf der Platte an der Vorderseite der Zellenfront gemessen, wie dargestellt. Eine 1 mm Maßstab ist in weiß dargestellt. A) 48 Stunden nach der Plattierung, B) 72 Stunden nach der Plattierung, C) 96 Stunden nach der Plattierung, D) 120 h nach der Beschichtung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

e 3 "src =" / files / ftp_upload / 55264 / 55264fig3.jpg "/>
Abbildung 3: Wachstumsrate Berechnung. Zelle Front Bewegung verfolgt mit Zeitrafferaufnahmen. Wachstumsrate wurde mit der MATLAB polyfit Funktion (roipoly) berechnete durchschnittliche Zellfrontgeschwindigkeit von 13,4 & mgr; m / h zu erhalten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Fluorescent Gradient mit Dextran. Fluoreszenzintensität über dem Abstand des Kanals gemessen, wo jede Zeile der Gradient zu einer bestimmten Stunde darstellt. ImageJ wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität zu berechnen. Dies kann getan werden, indem die Analyse | Werkzeug messen. Zuerst wählen Sie Set Messungen unter Intensität analysieren und auszuwählen. Wählen Sie dann unter, um all zu bekommen Analysieren MaßzahlWut Pixelintensität. Dies kann in Abhängigkeit vom Abstand in Mikron aufgetragen werden, wie in dieser Figur gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Unsere Mikrokanalkammer kann für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, einschließlich der Bestimmung der Zellmigrationsrate in Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Lockstoffe und Messen der Diffusionsrate eines Arzneimittels aus einer Polymermatrix. Es ist möglich, unsere Mikrokanalkammer zu verwenden, Zellen wachsen zu lassen und einen chemoattractant an einem Ende der Kammer platzieren. Die Zellen wachsen in Reaktion auf die chemische Lockstoffe, und die Zellmigration können, indem sie Zeitrafferbilder quantifiziert werden, die analysiert werden, um möglicherweise die Zellmigration Rate zu bestimmen. Repräsentative Ergebnisse dieses Verfahrens sind in Figur 3 gezeigt, wo die Wachstumsrate wurde bestimmt 13,4 & mgr; m / h unter Verwendung der MATLAB polyfit Funktion.

Eine andere Verwendung unserer Mikrokanalkammer ist es, die Diffusionsgeschwindigkeit eines Wirkstoffes aus einer Polymer-Matrix zu messen. Ein fluoreszierend markierte Dextran eines ähnlichen Molekulargewicht auf das Medikament von Interesse verwendet werden, um die Diffusion des Dru zu modelliereng Interesse. Es ist wichtig zu beachten, daß die Proben müssen sorgfältig als eine große Menge von Konvektion gehandhabt wird, um den Gradienten zu stören. Die repräsentativen Ergebnisse dieses Verfahrens sind in Abbildung 4 dargestellt. Ein Vorteil dieses Modells im Vergleich zum Test Boyden-Kammer ist, dass es wegen der flachen Oberfläche mehr für adhärenten Zelltypen ist; während müssen die Zellen vor Einhaltung durch ein kleines Rohr in der Boyden-Kammer fallen. Eine weitere Einschränkung des Boyden-Kammer-Assay ist, dass es ein Endpunkt-Assay ist; Somit kann die Chemotaxis nicht visuell beobachtet werden. Im Gegensatz dazu mit unserer Methode, Chemotaxis wird durch die Zeitraffer-Bilder 9 beobachtet. Die Verwendung von Mikropipetten enthält Chemoattraktoren haben auch ein Verfahren zur Beobachtung der Zellmigration verwendet. Jedoch ist der Hauptnachteil dieses Verfahrens geringen Durchsatz 10. Die Dunn Chemotaxis Kammer ist ein weiterer Test, der in Verbindung mit Zeitraffer-Bildgebung wie th verwendet wirde Verfahren 11 hier detailliert, 12. Die Kammer besteht aus zwei auf dem Gesicht geschnitzt konzentrischen Kreisen des Glasobjektträger, um eine innere und äußere gut zu schaffen, und eine Brücke trennt die beiden Brunnen. Die chemoattractant wird in die äußere Vertiefung gegeben und die Zellen werden von der inneren und an der äußeren und wandern kann. Diese Migration wird unter Verwendung von Zeitrafferbilder quantifiziert, die Bildanalyse-Software analysiert werden. Ähnlich wie bei der Boyden-Assay, einer der Begrenzungen des Dunn Kammer-Assay ist, dass es nicht leicht individuelle löslichen Faktor Konzentrationsgradienten modifiziert werden kann, zu schaffen.

Eine weitere einfache Methode zur Beurteilung der Zellmigration ist ein in vitro 13 zerkratzen. Diese Methode ist schnell und kostengünstig, da es erfordert nur einen Kratzer in der Zellschicht und Erfassung von Zeitraffer-Bilder der Zellmigration der Nähe des zuvor erstellten Grund auf neu erstellen. However, der große Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es nicht geeignet ist, Antworten auf einen chemischen Faktor Konzentrationsgradienten zu messen. Unsere Methode bietet das Potenzial, einen chemischen Gradienten zu erzeugen und die Zellmigration in Bezug auf die chemischen Gradienten zu quantifizieren. Unsere Methode kann mit der Ankratzmethode als Scratch kombiniert werden können, in der Zell-Monoschicht erzeugt werden, während ein chemotaktischer Faktor in einer der Vertiefungen in der Mikrokanalkammer vorhanden ist. Dies ermöglicht die Quantifizierung und Modellierung der Wundheilung. Eine weitere potentielle Anwendung unserer Vorrichtung ist die Reaktion der Krebszellen auf Mittel, um zu bestimmen, die das Zellwachstum hemmen.

Andere Mikrofluidik - basierte Systeme wurden auch für die Zellmigration Studien verwendet wurde 14, 15. Diese Studien verwenden lithographische Techniken mit Reinräumen Urformen in Silizium und / oder Laserbearbeitung zu schaffen mikrofluidischen Kanälen in Silizium-Wafern zu schaffen. Silicon wafer Mikrobearbeitung kann im Vergleich zu unserem Verfahren teuer sein, die billiger Materialien (PDMS und Acryl) verwendet einen Mikrokanal Kammer herzustellen. Unsere Vorrichtung überwindet die Begrenzung der anderen PDMS basierend mikrofluidischen Vorrichtungen , in denen es nicht möglich war 15 kleine 3D - Kanäle zu erstellen. Mit unserer Methode haben wir erfolgreich PDMS basiertes Gerät mit kleinem Durchmesser Kanäle erstellt. Andere Studien haben eine PDMS-basierte mikrofluidische Vorrichtung mit zwei Schichten von Mikrokanälen und einer Mehrkanal - Gasmischer verwendet , die Computer gesteuert, um beliebige Gradienten von Sauerstoff zu erzeugen 16 , die Migration von Zellen , die unter unterschiedlichen Gradienten von Sauerstoff zu untersuchen. Es gibt Potenzial für unser Gerät in ähnlicher Weise mit der Zugabe einer Gasmischkammer an einem Ende des Mikrokanals Kammer verwendet werden.

Mikrofluidik-Geräte werden oft mit weichen lithographischen Techniken hergestellt; diese können angepasst werden, um Zellmigration chambe zu erstellenrs. Diese Verfahren umfassen das Drucken einer Maske mit Kanalmuster mit Computer Aided Design (CAD). Diese Masken werden dann auf einer Masterform projiziert, beschichtet mit einer lichtempfindlichen, durch optische Lithographie widerstehen. Nachdem der Masterform hergestellt wird, wird PDMS auf dem Master gegossen und um zu härten eine PDMS - Form zu erzeugen , die 17 für mikrofluidische Studien verwendet werden können, 18, 19. Chemoattractant oder chemorepulsive Verbindungen werden in der Kammer in hoher Konzentration in einem der Behälter 17 angeordnet Gradienten zu erzeugen. Während diese Techniken ähnlich unserer Einrichtung sind, können sie aufgrund der hohen Kosten für die Erstellung der Master-Form für das System und die Verwendung von Reinräumen teuer sein. Darüber hinaus können diese Verfahren schwierig für Schüler in einer Klasse basierend Einstellung zu lernen. Die Einsätze in unserem Set-up verwendet, um die Kanäle zu schaffen mit einer Vielzahl von Verfahren erzeugt werden, einschließlich 3D-printing und Laserschneiden. Somit ermöglicht unser System für die Schaffung einer Vielzahl von Formen für die relativ niedrigen Kosten besonders als 3D-Druck mehr erschwinglich und weithin verfügbar wird.

PDMS basierend mikrofluidischen Vorrichtungen zur Messung der Zellmigration und Wachstum wurden für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Zum Beispiel in den Neurowissenschaften studiert Forschung 20, wurden Geräte mit Softlithographie - Techniken hergestellt , in dem die PDMS - Komponente auf einer Gewebekulturschale oder Glas , um zwei Kammern zu bilden , gelegt wurde , die durch eine physikalische Barriere mit Mikrongröße Rillen getrennt wurden , damit Neuronen in den Abteilen zu wachsen. Zeitraffer-Bilder aufgenommen wurden Neuronen zu zeigen, die Barriere überqueren. Das Verfahren zur Mikrostrukturierung verwendet, um dieses Gerät zu erzeugen, ist komplex, während die Herstellungsverfahren für unser Gerät einfach und kann von den Forschern auf allen Ebenen verwendet werden. Eine andere Studie auch eine einfache Low-Cost-Verfahren zur Herstellung eines si Herstellungmilar PDMS Mikrofluidik-Vorrichtung eine Masterform erstellt von Klebeband, um mit einem Eindruck in den PDMS zu schaffen Mikrokanäle zu erzeugen. Ein Vorteil unseres Ansatzes über die eine in diesem Verfahren beschrieben wird , ist , dass die Kanäle in unserem Verfahren in einem Schritt hergestellt werden, wobei dieses Protokoll Anhaftung zwischen zwei PDMS Schichten erfordert , die 21 Probleme mit Mittelstrom zu den Zellen erzeugt.

Abschließend ist unser Mikrokanalkammerverfahren anpassbar und verwendet werden können, unterschiedliche Ergebnisse zu erzielen. Das Verfahren ermöglicht die Erstellung eines Konzentrationsgradienten, um die Bedürfnisse des Benutzers angepasst werden. Darüber hinaus bietet unser Gerät einen Vorteil gegenüber bestehenden Vorrichtungen aufgrund seiner relativ geringen Kosten und einfache Handhabung für die Forscher auf allen Ebenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Die Autoren erkennen an der Clemson University Creative Inquiry Programm und NSF CBET1254609 für die Finanzierung für dieses Projekt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Sigma-Aldrich 761036 poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent
Acrylic Sheets US Plastic 44200
Disposable Petri Dishes  Falcon  25373-041
Fluorescein isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich FD20s-100MG
Agarose, Type I, Low EEO Sigma-Aldrich A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Fisher Scientific 11965092 Cell media components
Fetal Bovine Serium Fisher Scientific 16000036 Cell media components
Penicillin-streptomycin Fisher Scientific 15140148 Cell media components
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP24384
EVOS XL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific AME3300 Instrument used for taking time-lapse images
Versa Laser Universal Laser Systems, Inc.  Model number VLS2.30 Laser cutter used for cutting plastic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24, (21), 3563-3576 (2003).
  2. Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4, (3), 164-167 (2004).
  3. Darby, I., Hewitson, T. Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis. Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).
  4. Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. A new approach to study fibroblast migration. Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).
  5. Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324, 1673-1677 (2009).
  6. Zengel, P., et al. µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biol. (2011).
  7. Chen, H. Boyden Chamber Assay. Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).
  8. Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models. JCB. 203, (4), 691-709 (2013).
  9. Saadi, W., et al. Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber. Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).
  10. Cammer, M., Cox, D. Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette. Methods Mol Biol. 125-135 (2014).
  11. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99, (4), 769-775 (1991).
  12. Wells, C. M., Ridley, A. J. Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. 31-41 (2005).
  13. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  14. Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci. Rep. 5, (2015).
  15. Wright, G. A., et al. On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies. Microsc. Microanal. 18, (04), 816-828 (2012).
  16. Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device. Lab Chip. 10, (3), 388-391 (2010).
  17. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, (1), 013412 (2011).
  18. Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research. Microfluid Tech: Rev Protoc. 167-177 (2006).
  19. Tang, S. K., Whitesides, G. M. Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. McGraw-Hill, 2010. (2010).
  20. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research). Langmuir. 19, (5), 1551-1556 (2003).
  21. Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains. JoVE. (69), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics