Het meten en de wijziging van Mating Drive in Male * These authors contributed equally

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit artikel beschrijft een gedrags-test die mannetje mating drive in Drosophila melanogaste r om de motivatie te bestuderen gebruikt. Met deze methode kunnen onderzoekers gebruiken geavanceerde fly neurogenetische technieken om de genetische, moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze motivatie ontdekken.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, O., Zhang, S. X. Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (120), e55291, doi:10.3791/55291 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ondanks tientallen jaren van onderzoek, het neuronale en moleculaire basis van motivationele toestanden blijven mysterieus. We hebben onlangs een nieuwe, reductionistische en schaalbaar systeem voor een diepgaand onderzoek van de motivatie met behulp van de paring aandrijving van mannelijke Drosophila melanogaster (Drosophila), de methoden waarvoor Hier hebben we detail. De behavioral paradigma centra op de bevinding dat mannetje mating schijf afneemt langs de vruchtbaarheid in de loop van herhaalde copulaties en herstelt meer dan ~ 3 d. In dit systeem is de krachtige neurogenetische gereedschap in de vlieg samen met de genetische toegankelijkheid en vermeende aansluitschema vindt seksueel gedrag. Deze convergentie maakt een snelle isolatie en ondervraging van kleine neuronale populaties met specifieke motivationele functies. Hier hebben we detail het ontwerp en de uitvoering van de verzadiging test die wordt gebruikt voor het meten en veranderen verkering motivatie in de mannelijke vliegen. gebruik van dezeassay, we tonen ook aan dat een lage mannetje mating drive kan worden overwonnen door het stimuleren van dopaminerge neuronen. De verzadiging test is eenvoudig, betaalbaar en robuust invloeden van de genetische achtergrond. Wij verwachten dat de verzadiging test om veel nieuwe inzichten in de neurobiologie van motivationele toestanden te genereren.

Introduction

Werk in Drosophila heeft diepe en baanbrekende inzicht gegeven in vele biologische fenomenen, zoals de aard van het gen 1, beginselen van embryonale ontwikkeling 2, circadiane ritmes 3, en de ontwikkeling en bedrading van het zenuwstelsel 4, 5, 6. Motivatie blijft veel minder goed begrepen dan deze verschijnselen, misschien vanwege de beperkingen van de systemen die tot nu toe zijn onderzocht. Motivatie in de vlieg wordt vooral onderzocht in het kader van de honger, die vele uitdagingen presenteert als gevolg van hun verwaarloosbaar klein voedselinname per voeding wedstrijd en exoskeleton die duidelijke tekenen van vetopslag in de weg staat. Bijgevolg is er een behoefte om de systemen voor het bestuderen motivatie in de vlieg breiden.

We beschrijven een gedrags raamwerk voor de studie van de paring drive inDrosophila. Dit systeem maakt gebruik van de neurogenetische instrumenten in de vlieg en de toegankelijkheid 7, 8, 9, 10, 11, 12 en de vermeende connectoom van de sexueel dimorfe schakelingen 8, 13. Bovendien, veel van de aangeboren 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 en geleerde 22, 23, 24 sensomotorische Schakelingen courtship is uitgewerkt, die een zeldzame kansom de exacte circuit knooppunt waarop motivatie botst lokaliseren. We hebben onlangs gemeld dat, in de vlieg, zoals bij mensen, dopamine niveaus centraal paring aandrijving 25, 26, 27. We hebben genetische toegang tot de relevante dopamine-producerende en het ontvangen van neuronen in de vlieg, het vergemakkelijken van gedetailleerde moleculair-en circuit-niveau opgedaan analyses van deze geconserveerde fenomeen met behulp van de testen beschrijven we hier 25.

Voegt men de gedrags assays Zhang et al. 25 een nieuwe flatscreen gedrags-arena die video scoren, dat we een 2-dimensionale (2-D) verzadiging assay, een belangrijke verbetering ten opzichte van eerdere methoden bellen mogelijk maakt. Bijgevolg is de nieuwe assay is schaalbaar en meetbaar, en dus meer geschikt voor genetische screens van genen en neuronen betrokken bij motivatie. We maken gebruik van deze nieuwe test, samen met de verkering assays en neurogesche manipulaties, om aan te tonen hoe om te meten en te veranderen paring rijden in de vlieg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LET OP: Dit protocol beschrijft de bereiding (secties 1-3), uitvoering (hoofdstuk 4), en de analyse (hoofdstuk 4) van 2-D verzadiging assays. Dan, met dopaminerge stimulatie als voorbeeld, afdeling 5 laat zien hoe thermogenetische stimulatie combineren met 2-D verzadiging testen voor hypersexuality induceren. Hoofdstuk 6 beschrijft 3 manieren om de resultaten van 2-D verzadiging assays verifiëren. Tot slot, Hoofdstuk 7 laat zien hoe het herstel van de paring drive in mannelijke vliegt meten.

1. fabriceren 8- en 32-chamber Behavioral Arenas

Opmerking: Elke behavioral arena bestaat uit verschillende lagen van lasergesneden kunststofplaten samengehouden door hex schroeven en vleugelmoeren op elk van de vier hoeken (Figuur 1A).

  1. Fabriceren de lagen van de arena. Fabriceren elke laag met behulp van een laser cutter om bladen van acrylaat om de juiste vorm te snijden (zie figuur 1B, 1C voor producten).
    LET OP: Veel onderzoek Institutions hebben lasersnijmachines in hun machine winkels of maker ruimten. Als de instelling toegang tot een laser cutter heeft, gaat u verder met de volgende stappen. Zo niet, volg dan de instructies in stap 1.2 in plaats daarvan.
    1. Voor elke laag, opent u het ontwerp patroon in de software van de laser cutter's.
      LET OP: De ontwerpen zijn te vinden in de toepasselijke naam PDF-bestanden (bijvoorbeeld 8-Kamer Arena - Layer 2 - Doors.pdf) in Aanvullende Material 1. Dit bestand bevat tevens aantekeningen voor het soort plastic te gebruiken (bijvoorbeeld 1 / 8 inch (dwz 3,175 mm) helder acryl). De exacte dikte van elke laag is niet kritisch. De belangrijkste vereiste is dat 0,12 inch (3 mm) of meer vrije verticale ruimte in de kamers geven.
    2. Pas de laserinstellingen (macht, nadruk, etc.) voor het type en dikte van kunststof te gebruiken. Plaats plastic in de laser cutter bed en uitvoeren van de laser cutter.
      LET OP: Deze instellingen lopen sterk uiteen op basis van de laser cutteR model en de kracht van de laser. Vind de juiste instellingen op basis van ervaringen uit het verleden of door het maken van testen bezuinigingen op schroot plastic. De diepe zeshoekige gravures zijn opgenomen in het ontwerp van de hex schroefkoppen reces. Deze functie maakt het mogelijk om met één hand aanscherping van de vleugelmoeren en laat de arena's plat op de bank rusten (zonder uitstekende schroefkoppen). Toch maken diepe gravures vaak moeilijk te bereiken en tijdrovend, met een lasersnijmachine. Deze stap is optioneel en kan worden overgeslagen zonder de gedragsresultaten.
    3. Bij het snijden het kozijn (Layer 2, figuur 1A), geschikte laser instellingen ook graveren van de kamer nummers die in het ontwerp (zoals in figuur 1B, 1C).
  2. Plaatst een bestelling bij een online lasersnijden verwerker. Upload alle PDF-ontwerp bestanden voor de 8- en / of 32-chamber arena en geef het materiaal type (bijvoorbeeld, 1/8 inch (dwz 3,175 mm) clear acryl) op basis van de aantekeningen in de dossiers. De resultaten zullen verschijnen als in de figuren 1B (8-kamer arena) en 1C (32-kamer arena).
  3. Monteer arena's met vier hex schroeven en vier vleugelmoeren aan te sluiten en bij elkaar te houden de kunststof lagen (Figuur 1A). De arena's worden weergegeven zoals in figuur 1D, 1E (8-kamer) en figuur 1F, 1G (32-chamber).
    Opmerking: Het eten wand (laag 4 in Figuur 1A) wordt alleen 2-D verzadiging assays en weggelaten 32-chamber arena's, die worden gebruikt in courtship assays.

2. Voedsel Voorbereiding voor 2-D Satiety Assay

LET OP: Omdat een 2-D verzadiging test overspant 4,5 h, vlieg voedsel wordt gebruikt in de arena om voeding en water te voorzien. Dit protocol gebruikt, maar is niet beperkt tot de conventionele havermout-agar vlieg voedsel.

  1. Gedeeltelijk monteren van de 2-D verzadiging arena (8-kamer) met Lagen 3-6(zie figuur 1A voor laag opdrachten) en draai deze met duim noten en hex schroeven.
  2. Leg vers vlieg voedsel in een schone, magnetron-safe fles. Precies zoveel water naar het bodemoppervlak van de fles (figuur 2A) omvatten.
  3. Magnetron eten op hoog voor 30 - 45 s. Controleer de voortgang en roer om de 15 s tot gesmolten (Figuur 2B). VOORZICHTIGHEID! Vlieg voedsel kookt gemakkelijk over.
  4. Gebruik een stomp 1000-pi pipet tip (figuur 2C) langzaam over te dragen ~ 1 ml gesmolten voedsel in elke kamer (figuur 2D).
  5. Laat voedsel resolidify bij 4 ° C gedurende ~ 10 minuten (Figuur 2E) voor volledig samenstellen van de arena (figuur 2F).
  6. Gebruik de ingevulde arena voor experimenten (zie hoofdstuk 4) of op te slaan bij 4 ° C.
  7. Bewaar de overgebleven voedsel bij 4 ° C en hergebruik.

3. Voorbereiding Virgin Females for Behavioral Testen

LET OP: 2-D verzadiging assays gebruiken grote aantallen maagdelijke vrouwtjes (~ 120-160 voor een volledige gedrags-arena) die moeilijk te verzamelen met behulp van standaard methoden. Dit deel beschrijft een alternatieve benadering met behulp van de hs-HID transgeen op het Y-chromosoom 28, die met succes is toegepast in verkering assays 25, 29. De voorraad wordt gebruikt om wit-eyed maagdelijke vrouwtjes te genereren heeft het genotype w1118 (X) / hs-HID (Y); + / +, + / + (Bloomington voorraad nummer 24638).

  1. Flip vliegt in een nieuwe fles eens 20 - 50% van de poppen zijn Bijlage In (zie figuur 3A bijvoorbeeld) en er voldoende mannetjes (5-10) om de voorraad te propageren.
  2. Heat shock de oorspronkelijke fles in een 37 ° C warm water bad gedurende 1 uur voldoende activeren hs-hid om mannetjes te doden (Figuur 3B). Na de heat shock, alleen vrouwtjes ESluit van deze flessen en zo zal maagd blijven tot hetassays.
    LET OP: Zorg ervoor dat alle kanten van de fles gelijkmatig verhit (zie figuur 3A voor water lijn). Verlengen tijd tot 2 uur of 1 uur is niet voldoende om alle mannen inslapen.
  3. Isoleer verzameld vrouwtjes tenminste 3 d vóór experimenten zodat ze oud genoeg seksueel receptief 25, 29 te zijn.
    OPMERKING: Y-chromosoom-less mannetjes af en toe komen voort uit dit bestand. Deze mannetjes hebben witte ogen en worden niet beïnvloed door de heat shock omdat ze niet de hs-hid transgen bevatten. Ze kan geen sperma en daarom ontvankelijkheid niet afnemen bij vrouwen 30, 31.

4. presterende en Puntentelling 2-D Satiety Assays

Opmerking: Het is belangrijk dat de controle van de leeftijd van de mannelijke vliegen als mating station verandert met de leeftijd. Dit protocol maakt gebruik van mannetjes die 3-4 d oude 25

  1. Stel de incubator tot de gewenste temperatuur (bijvoorbeeld 23 ° C voor standaard RT experimenten) en luchtvochtigheid (> 30%). Voor incubatoren zonder vochtigheidsregeling, waardoor een kopje water in de incubator voldoende.
  2. Plaats een 2-D verzadiging assay arena in de incubator voor ~ 30 minuten om de temperatuur evenwicht en condensatie in de kamers in de loop van het experiment te voorkomen. De draaideuren moeten in de open stand.
  3. Gebruik een vlieg aspirator 32-15 zuigen - 20 maagdelijke vrouwtjes in elke kamer van de arena (figuur 4).
    Opmerking: Het is belangrijk dat de vrouwtjes en mannetjes niet verdoofd op de dag van de assay. In onze ervaring, dit kan vrouwelijke ontvankelijkheid en mannelijke paargedrag beïnvloeden.
  4. Zuig 1 man in elke kamer.
  5. Plaats de geladen arena in de incubator onder een standaard consumentencamcorder (figuur 5) en film voor 4,5 uur.
  6. Score video's door op te merken wanneer elke man begint te vliegen en eindigt elke paring (dwz copulatie). Deze stap kan tijdrovend zijn op het eerste. Met de praktijk, kan men de video's bij 5x snelheid of hoger te scoren.
    OPMERKING: Aangezien vliegen mate voor ~ 20 minuten bij ~ 23 ° C (korter bij hogere temperaturen) 29 kan men doorlopen de eerste 15 minuten van elke paring.
  7. Na het inloggen allen tijde de paring, de som van het aantal dekkingen per fly (zie representatieve resultaten).
  8. Gebruik de code in om een ​​ethogram te genereren. Zie Aanvullend materiaal 2 voor de code, instructies en voorbeeld data.
  9. Gebruik CO 2 of koude temperatuur tot de vliegen verdoven alvorens ze te verwijderen.

5. Met behulp van thermogenetische Manipulatie om Satiety Reverse in 2-D Satiety Assays

LET OP: Dit protocol test of thermogenetische stimulatie van een bepaalde neuronale populatie verzadiging kan overwinnen. De experimentele flies drukken de warmtegevoelige kationenkanaal TRPA1 in bepaalde populaties van neuronen (UAS-TRPA1). De onderstaande stappen gelden voor de stimulering van dopaminerge neuronen (TH-Gal4), waarvan is aangetoond paring station 25 te bevorderen. Deze stappen kunnen worden gebruikt in combinatie met andere neuronale bestuurders andere populaties die paring schijf bevorderen ontdekken.

  1. Om thermogenetically induceren paring gedrag in verzadigd vliegen, verhoging van de temperatuur in de incubator (bijvoorbeeld van 23 ° C tot 28,5 ° C) na afloop van een volledige 4,5 h 2-D verzadiging experiment.
  2. Na de incubator van de gewenste temperatuur bereikt, blijven de warmte stimulatie en de score van de paringen (bijv. Copulaties) van de mannetjes gedurende 1 uur (zie Representatieve resultaten).
    OPMERKING: De temperatuur en de duur van de stimulatie kan variëren afhankelijk van het genotype zodat het noodzakelijk om de optimale omstandigheden die overstimulatie van neuronen te voorkomen en toch een Robu produceren oplossen isst fenotype.

6. Gebruik Vrijage en Locomotion to Verify Satiety

NB: Dit deel beschrijft 3 optionele methoden die kunnen worden gebruikt om de resultaten van de 2-D verzadiging assays controleren. Ze zijn niet vereist voor elke assay.

  1. Gebruik verkering assays om verzadiging te controleren.
    1. Aspireren een mannelijke en een vrouwelijke maagd in elk van de 32 kamers in een verkering arena.
    2. Film de vliegen voor ~ 20 min met behulp van een standaard consument camcorder.
    3. Score de verkering index (CI) aan verkering 25 kwantificeren; dit is de fractie van de tijd besteed aan het uitvoeren baltsgedrag (zang, na, enz.) en de paring (dwz copulatie) meer dan 5 min-venster. Dit venster gaat uit van het eerste exemplaar van baltsgedrag. Als een man geen vlieg vrijage start in de eerste 15 minuten, de CI 0. Naïve WT vliegen moet een CI groter dan 0,9 vertonen, terwijl een volledig verzadigd vlieg een CI b zou moeten hebbenelow 0,2. Andere verkering maatregelen kunnen ook worden beschouwd als 23, 33.
  2. Scoren verkering in 2-D verzadiging assays
    1. Ril de hoeveelheid tijd die een mannelijke vliegen besteedt streven naar, over een periode van een 2-D verzadiging assay (bijvoorbeeld de eerste h). Verkering wordt gedefinieerd als de mannelijke uitvoeren van een stap van het ritueel (zingen, volgende, etc.). In tegenstelling tot de in paragraaf 6.1.3, is deze stap niet de tijd dat de man besteedt paring.
    2. Verdeel boven de verkering tijd door de totale tijd dat de man werd niet paring (dwz niet copulerende) in dezelfde periode. Als bijvoorbeeld een man van 20 min gerecht van 15 min en maten vliegen over het eerste uur, de verhouding 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. De verhouding wordt weergegeven als "Fractie van nonmating tijd verkering 'in Representatieve resultaten.
  3. Gebruik voortbeweging assay uitputting evalueren
    1. Gedeeltelijk monteren van de 32-kamer arena met alle onderdelen, maar het contrast vel.
    2. Zuig een mannetje fly (geen vrouwelijke vliegen) in elk van de 32 kamers in een verkering arena.
    3. Film de vliegen voor ~ 10 min met behulp van een standaard consument camcorder.
    4. Volg de vliegen met de MTrack2 plugin in ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).

7. Herstel Mating Drive na 2-D Satiety Assay

  1. Voer een 2-D verzadiging assay zoals beschreven in Sectie 4, maar zuigen de mannelijke vliegt aan het einde van de test.
  2. Isoleer de mannelijke vliegen bij 23 ° C voor het gewenste aantal dagen.
  3. Voer een 2-D verzadiging test met de herstelde mannen en scoren hun paringen (dwz copulaties) voor slechts 1 uur (zie Representatieve resultaten).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karakterisering Drosophila paring aandrijving, 3 dagen oude, WT Canton-S mannetjes werden getest in een 2-D verzadiging assay. In de loop van de test (4,5 h), mannetjes mate gemiddeld 4,8 ± 0,3 (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde, SEM) keer. Paringen initiëren meestal in de eerste 2 uur (78%) (figuur 6A, 6B) en minder frequent als test vordert (figuur 6A, 6B). Deze daling is niet te wijten aan het gebrek aan passende partners (74% vrouwen blijven ongedempte gehele test) of fysische vermoeidheid (figuur 6F). Veeleer wordt dit effect waarschijnlijk verklaard door een verlaging van courtship de man tijdens de test van 42,6 ± 8,0% (gemiddelde ± SEM) (1 st h) 2,0 ± 0,7% (gemiddelde ± SEM) (laatste uur) nonmating tijd (Figuur 6C). Deze daling in de hofmakerij wordt ook gezien als de mannetjes worden getest in verkering testen met de nieuwe vrouwen (figuur 6D, 6E) (figuur 6G, 6H). Deze resultaten tonen dat intern gehouden paring aandrijving bij mannelijke vliegen verzadigd kan raken in een 2-D verzadiging assay en kunnen herstellen tijd.

De 2-D verzadiging test kan ook gemakkelijk worden gecombineerd met Drosophila neurale manipulaties. We hebben onlangs gemeld dat thermogenetische stimulering van dopaminerge neuronen keert paring drive in verzadigd mannelijke vliegt 25. Via 2-D verzadiging assays, zien we dat dopaminerge stimulatie (TH> TRPA1, 28,5 ° C) aan het einde van de verzadiging assay verhoogde zowel courtship (Figuur 7A, 7C, rood) en paring (Figuur 7A, 7B, red). De omkering effecten zijn niet waargenomen met parental control genotypen (figuur 7A - 7C, zwart en grijs). Al deze resultaten zijn consistent met de recente studie25 en suggereren dat de 2-D verzadiging assay, samen met de extra assays (courtship en beweging), kan worden gebruikt om moleculaire en neuronale elementen van de paring aandrijving ontleden.

Figuur 1
Figuur 1. Het ontwerpen en assembleren Behavioral Arenas. Een 8-chamber arena (voor 2-D verzadiging assays) bestaat uit 6 lagen bijeengehouden door vleugelmoeren en zeskantschroeven (A). Een 32-kamer arena (voor courtship assays) op soortgelijke wijze vervaardigd, maar zonder het eten wand (laag 4). De arena delen zijn uitgesneden met een laser cutter en de lagen zijn genummerd als (B) voor 8-kamer en (C) 32-kamer. De geassembleerde 8-kamer arena getoond in (D) (vooraanzicht) en (E) (zijaanzicht met genummerde lagen). De geassembleerde 32-arena kamer gemonteerd op een vergelijkbare manier (F, G), maar Layer 4 (voedsel wand) is weggelaten (G) aangezien er geen vlieg voedsel is in de arena voor verkering assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Voorbereiden van 2-D Satiety Testen met Food. Standard Drosophila voedsel wordt geplaatst in een magnetron-safe pot met water (A). Het eten is opgewarmd in de magnetron tot het gesmolten is (B). Een stompe pipetpunt (C, pijl) wordt gebruikt om voedsel te dragen aan kamers van een gedeeltelijk geassembleerde gedrags arena (D). Het eten opnieuw wordt gestold bij 4 ° C (E) voor de gedrags arena volledig geassembleerd (F).pg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Het genereren van Virgin Vrouwtjes van de w1118 (X) / hs-HID (Y) Stock. Flessen besturen moet warmte geschokt bij 50-80% van de poppen zijn uneclosed wat blijkt uit hun ondoorzichtigheid (A). Het beeld inzet toont monsters van uneclosed (boven) en Bijlage In (onder) poppen (A). Flessen worden gewogen naar beneden en ondergedompeld in 37 ° C warm water bad gedurende 1 uur met water niveau net boven de bodem van de fles stoppers om zelfs verwarming (B) te garanderen. Zie de zwarte pijl in (A) voor de waterlijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

"Figuur Figuur 4: Laden Vliegen in een Behavioral Arena. Zuig voorzichtig en houd 15 - 20 vrouwen in de aspirator (A). De pipet wordt gebruikt om de roterende deur (B) openen en de vliegen voorzichtig vrij in de kamer (C). Gebruik de aspirator de draaideur (D) sluiten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Het uitvoeren en opnemen van een 2-D Satiety Assay. (A) Een standaard consumentencamcorder (a) wordt gebruikt voor de test in een incubator ingesteld op de gewenste temperatuur te registreren. De incubator bevat een kolf van water (b) en een vochtigheidsgraad detector (c) het zorgenjuiste vochtigheidsgraad (> 30%). De bereide 2-D verzadiging assay wordt gefilmd onder de camcorder (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6: Verzadiging en herstel van Fy Mating Drive. In een 2-D verzadiging assay mannelijke vliegen mate af tijdens de eerste 2 uur van de assay (A, B), maar hun courtship (C) en paringen (B) afneemt naarmate de test vordert. De progressieve afname baltsgedrag blijft behouden bij mannetjes na afloop van een 2-D analyse van verzadiging h 0 of 1 uur of 4,5 uur (D, E) worden overgebracht naar een courtship assay nieuwe vrouwtjes. Rode pijlen wijzen naar mannen vertonen hofmakerij en paargedrag, terwijl oranje arrijen wijzen op non-paring, non-hof vliegen (A, D). De afname van de seksuele gedrag is niet het gevolg van lichamelijke uitputting, zoals mannen vertonen gelijkwaardige bewegingsactiviteit voor en na de 2-D verzadiging assay (F). Mannetjes geleidelijk herstellen hun paring (G) en verkering (H) niveaus gedurende 3 d van de isolatie van de vrouwtjes. In deze figuur, *** p <0,001, ** p <0,01, ns niet significant voor t-test (C, F) en eenzijdige ANOVA met Tukey post-test (E, G, H). N = 15-16 voor elke voorwaarde voor alle experimenten. Fout balken geven standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7: thermogenetische Satiety Omkering in Male Flies. Zoals in de standaard 2-D verzadiging assay mannen vertonen een afname paringen in de loop van het experiment, maar thermogenetische stimulering van dopaminerge neuronen (TH> TRPA1, rood), maar geen ouderlijke controle genotypen (zwart en grijs), herstelt paring drive in verzadigd mannen (A). Nr paringen wordt gescoord als de X-as is gebroken in (A). Deze omkering van de paring aandrijving kan worden gekwantificeerd met behulp van de paring nummers (B) of verkering (C). X-as getallen tussen (B) en (C) zie weer in (A). Oranje achtergrond kleur geeft thermogenetische stimulatie (A - C). In deze figuur, *** p <0,001, ns niet significant wisselwerkingen tussen genotype en temperatuur tweeweg ANOVA met Bonferroni post-test (B, C). N = 8 voor elk genotype (B, C). Foutbalken vertegenwoordigen SEM..jove.com / files / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend materiaal 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend materiaal 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Motivational toestanden kunnen worden verzadigd, onderhouden en hersteld 34. We presenteren een 2-D verzadiging test die snel en krachtig meet al deze aspecten van paring aandrijving in de vlieg. Deze test opent de mogelijkheid om geavanceerde fly genetische manipulatie de moleculaire en circuitcomponenten van een gemotiveerd gedrag te bestuderen.

De verzadiging test is gebaseerd op het vermogen van de man om met succes de rechtbank en copuleren, en copulaties op het juiste moment te beëindigen. Hoewel hyposexual vliegen rechtbank minder, low-verkering vliegen zijn niet per se hyposexual; zij kunnen bijvoorbeeld moeite herkennen of volgen van de 35 vrouwtjes. Daarom de verzadiging test is het meest geschikt voor het testen hyperseksualiteit, een fenotype dat niet betrouwbaar in een standaard assay courtship opgemerkt omdat naïeve wildtype mannetjes tonen courtship indices naderen 1. Hyperseksualiteit in de verzadiging assay shOuld ten opzichte van het jaar worden beschouwd als de man-in onze ervaring, oudere mannen hebben de neiging om te paren iets vaker dan de 3-dagen oude mannetjes die hier gebruikt.

We gebruikten thermogenetische stimulering van dopaminerge neuronen neurogenetische de manipulaties die in dit systeem kan worden gebruikt om de componenten onderliggende motivatie onderzoeken illustreren. Daarnaast kunnen de onderzoekers ook gebruik maken van thermogenetische stimulatie gedurende een 2-D verzadiging test en kijk voor hyperseksueel mannetjes die langzamer verzadiging te bereiken zijn. Natuurlijk kan verzadiging assays ook worden gecombineerd met neuronale silencing gereedschappen 36, 37, 38 optogenetics, genetische mutaties 39, 40, 41, RNAi knockdown 28, 42, 43, 44, etc.

De verzadiging test is betaalbaar en schaalbaar. Elke arena kunnen worden vervaardigd voor de waarde van materialen ~ $ 10 (plus lasersnijden kosten, indien van toepassing) en neemt minder ruimte in dan een paperback boek. Scoren de video is een relatief eenvoudige taak. Een getrainde experimentator kan een 4,5 uur video te scoren met 8 man vliegt in ~ 1,5 uur. Voor meer high-throughput screening, kan men scoren alleen de laatste 2 uur bij normale vliegen tonen zeer lage paring aandrijving. Als alternatief kan men ter plaatse controleren de testen elke 30 minuten, omdat dit het grootste deel van de ~ 20 min lang paringen zal vangen.

We hopen dat dit systeem zal op grote schaal worden aangepast en zal bijdragen tot het ontstaan van Drosophila als een krachtig systeem voor het ontsluiten van de geheimen van de motivatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K12 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/8 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K42 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
3/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8560K219 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/32 inch black delrin McMaster-Carr 8575K132 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
Hex screws, 1 inch long (50x) McMaster-Carr 92314A115  Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas.
Thumb nuts (25x) McMaster-Carr 92741A100 Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr).
Camcorder Canon Vixia HF R700 Can be replaced by any consumer comcorder.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. The spatial relations of genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5, (5), 168-173 (1919).
  2. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (1985).
  3. Hall, J. C. Systems Approaches to Biological Rhythms in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 61-185 (2005).
  4. Luo, L. Rho GTPases in neuronal morphogenesis. Nature reviews. Neuroscience. 1, (3), 173-180 (2000).
  5. Schmucker, D., Clemens, J. C., et al. Drosophila Dscam Is an Axon Guidance Receptor Exhibiting Extraordinary Molecular Diversity. Cell. 101, (6), 671-684 (2000).
  6. Jan, Y. N., Jan, L. Y. HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis. Cell. 75, (5), 827-830 (1993).
  7. Stockinger, P., Kvitsiani, D., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, (5), 795-807 (2005).
  8. Yu, J. Y., Kanai, M. I., Demir, E., Jefferis, G. S. X. E., Dickson, B. J. Cellular Organization of the Neural Circuit that Drives Drosophila Courtship Behavior. Current biology. 20, (18), 1602-1614 (2010).
  9. Zhou, C., Pan, Y., Robinett, C. C., Meissner, G. W., Baker, B. S. Central Brain Neurons Expressing doublesex Regulate Female Receptivity in Drosophila. Neuron. 83, (1), 149-163 (2014).
  10. Rideout, E. J., Dornan, A. J., Neville, M. C., Eadie, S., Goodwin, S. F. Control of sexual differentiation and behavior by the doublesex gene in Drosophila melanogaster. Nature neuroscience. 13, (4), 458-466 (2010).
  11. Manoli, D. S., Foss, M., Villella, A., Taylor, B. J., Hall, J. C., Baker, B. S. Male-specific fruitless specifies the neural substrates of Drosophila courtship behaviour. Nature. 436, (7049), 395-400 (2005).
  12. Kimura, K. I., Ote, M., Tazawa, T., Yamamoto, D. Fruitless specifies sexually dimorphic neural circuitry in the Drosophila brain. Nature. 438, (7065), 229-233 (2005).
  13. Cachero, S., Ostrovsky, A. D., Yu, J. Y., Dickson, B. J., Jefferis, G. S. X. E. Sexual dimorphism in the fly brain. Current biology. 20, (18), 1589-1601 (2010).
  14. Clowney, E. J., Iguchi, S., Bussell, J. J., Scheer, E., Ruta, V. Multimodal Chemosensory Circuits Controlling Male Courtship in Drosophila. Neuron. 87, (5), 1036-1049 (2015).
  15. Kallman, B. R., Kim, H., Scott, K. Excitation and inhibition onto central courtship neurons biases Drosophila mate choice. eLife. 4, e11188 (2015).
  16. von Philipsborn, A. C., Liu, T., Yu, J. Y., Masser, C., Bidaye, S. S., Dickson, B. J. Neuronal control of Drosophila courtship song. Neuron. 69, (3), 509-522 (2011).
  17. Zhou, C., Franconville, R., Vaughan, A. G., Robinett, C. C., Jayaraman, V., Baker, B. S. Central neural circuitry mediating courtship song perception in male Drosophila. eLife. 4, e08477 (2015).
  18. Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila. Neuron. 69, (3), 498-508 (2011).
  19. Kohatsu, S., Yamamoto, D. Visually induced initiation of Drosophila innate courtship-like following pursuit is mediated by central excitatory state. Nature Communications. 6, 6457 (2015).
  20. Fan, P., Manoli, D. S., et al. Genetic and neural mechanisms that inhibit Drosophila from mating with other species. Cell. 154, (1), 89-102 (2013).
  21. Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446, (7135), 542-546 (2007).
  22. Ejima, A., Smith, B. P. C., et al. Generalization of Courtship Learning in Drosophila Is Mediated by cis-Vaccenyl Acetate. Current Biology. 17, 599-605 (2007).
  23. Keleman, K., Vrontou, E., Krüttner, S., Yu, J. Y., Kurtovic-Kozaric, A., Dickson, B. J. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489, (7414), 145-149 (2012).
  24. Pan, Y., Baker, B. S. Genetic Identification and Separation of Innate and Experience-Dependent Courtship Behaviors in Drosophila. Cell. 156, (1-2), 236-248 (2014).
  25. Zhang, S. X., Rogulja, D., Crickmore, M. A. Dopaminergic Circuitry Underlying Mating Drive. Neuron. 91, (1), 168-181 (2016).
  26. Bowers, M. B., Van Woert, M., Davis, L. Sexual behavior during L-dopa treatment for Parkinsonism. The American journal of psychiatry. 127, (12), 1691-1693 (1971).
  27. Sacks, O. W. Awakenings. Vintage Books. New York. (1999).
  28. Dietzl, G., Chen, D., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, (7150), 151-156 (2007).
  29. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing dopaminergic and GABAergic neurons control the duration and persistence of copulation in Drosophila. Cell. 155, (4), 881-893 (2013).
  30. Peng, J., Chen, S., Busser, S., Liu, H., Honegger, T., Kubli, E. Gradual Release of Sperm Bound Sex-Peptide Controls Female Postmating Behavior in Drosophila. Current biology. 15, (3), 207-213 (2005).
  31. Yapici, N., Kim, Y. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451, (7174), 33-37 (2008).
  32. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36, (36), 1-5 (2010).
  33. Cook, R., Cook, A. The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet. Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).
  34. Toates, F. M. Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). (1986).
  35. Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264, (5166), 1702-1714 (1994).
  36. Simpson, J. H. Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain. Advances in genetics. 65, (9), 79-143 (2009).
  37. Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit. Neuron. 72, (2), 202-230 (2011).
  38. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, (3), 338-346 (2014).
  39. Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167, (2), 761-781 (2004).
  40. Spradling, A. C., Stern, D., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, (1), 135-177 (1999).
  41. Parks, A. L., Cook, K. R., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, (3), 288-292 (2004).
  42. Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nature reviews. Genetics. 6, (3), 179-193 (2005).
  43. Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182, (4), 1089-1100 (2009).
  44. Ni, J. Q., Zhou, R., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature. 8, (5), 405-407 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics