Identifiering av Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Plantera intercellulära anslutningar, plasmodesmata (Pd), spelar centrala roller i växt fysiologi och växt-virus interaktioner. Kritisk till Pd transporter sorterar signaler att direkt proteiner till Pd. Vår kunskap om dessa sekvenser är dock fortfarande i sin linda. Vi beskriver en strategi för att identifiera Pd lokalisering signaler i Pd-riktade proteiner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) är cell-till-cell anslutningar som fungerar som gateways genom vilka små och stora molekyler transporteras mellan växtcellerna. Pd transport av små molekyler, som joner och vatten, antas uppstå passivt, cell-till-cell transport av biologiska makromolekyler, sådana proteiner, troligen sker via en aktiv mekanism som innebär särskilda inriktning signaler på den transporterade molekylen. Bristen på identifierade plasmodesmata (Pd) lokalisering signaler (PLSs) har stränga förståelsen av protein-sortering inblandade i plant cell till cell makromolekylär transport och kommunikation. Från en mängd växt endogena och virala proteiner kända trafik genom Pd, endast tre PLSs har rapporterats hittills, alla av dem från endogena vegetabiliska proteiner. Det är därför viktigt att utveckla en tillförlitlig och systematisk experimentell strategi för att identifiera en funktionell PLS sekvens, som är både nödvändig och tillräcklig för Pd inriktning, direkt i levande växtceller. Här beskriver vi en sådan strategi använder som ett paradigm proteinet cell till cell rörelse (MP) av tobak mosaic virus (TMV). Dessa experiment, som identifieras och karakteriseras först växt viral PLS, kan anpassas för upptäckten av PLS sekvenser i mest Pd-riktade proteiner.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) fungerar som transitländer för intercellulära transport av viktiga regulatorer av anläggningar utveckling och morfogenes, alltifrån transkriptionsfaktorer till mRNA och små RNA-molekyler. Dessutom utnyttjas detta makromolekylära transportkapaciteten hos Pd av de flesta växt virus för de intercellulära sprids under infektion; Om du vill flytta genom Pd, har plant virus utvecklats specialiserade proteiner, så kallade rörelse proteiner (MPs), som specifikt riktar sig till Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekylära vägar av Pd transporter troligtvis är intimt sammankopplade med de specifika sekvenser som riktar de transporterna proteinerna i dessa vägar. Identifiering av dessa Pd lokalisering signaler (PLSs) kan således vara diagnostiska av motsvarande Pd transport väg. Detta är analogt Pd transport8, till exempel att olika nukleära importera vägar, som kan vara specifika för olika cellkärnelokalisering signal (NLS) sekvenser9,10. Begreppsmässigt, representerar både NLSs och PLSs icke-cleavable subcellulär inriktning sekvenser som är nödvändig och tillräcklig för inriktning. Men till skillnad från NLSs11är sekvensinformation om PLSs starkt begränsad. Specifikt, har endast fyra proteinsekvenser som är inblandade i Pd inriktning rapporterats, alla av dem härrör från endogena vegetabiliska proteiner. Den första som representeras av en homeobox domän KN112 – en transkriptionsfaktor som flyttar från inre celllagrar till epidermis av växt blad13 – och dess KNOX homologs14. Den andra också är från en transkriptionsfaktor, Dof, som innehåller en förmodad PLS beskrivs som intercellulära människohandel (IT) motiv15. Den tredje sekvensen är från den PDLP1 plasmodesmata-resident typ 1 membranprotein, och är representerad med en transmembrana domän16. Slutligen, den fjärde Pd inriktning sekvens var nyligen rapporterat för glycosylphosphatidylinositol (GPI)-förankrade proteiner och det representeras av den glycosylphosphatidylinositol (GPI) modifiering signal17.

Tills helt nyligen, intressant, ingen PLSs rapporterats för viral MPs. Tidigare studier anges förekomsten av förmodad PLS sekvenser i växten viral MPs18,19, men ingen sann PLS, dvsen minimal aminosyrasekvens både nödvändig och tillräcklig för Pd inriktning av en icke-närstående Last molekyl ( t.ex., CFP) har upptäckts i en viral MP. Ännu var ett av dessa proteiner, MP av tobak mosaic virus (TMV), den första som Pd lokalisering och transport har varit påvisade20.

För att lösa denna lucka, utvecklade vi en experimentell strategi för att identifiera TMV MP PLS. Denna strategi baserades på tre begrepp. (i) vi definieras en minimal aminosyrasekvens som är både nödvändig och tillräcklig för proteinsekretion till Pd21PLS. (ii) eftersom TMV MP första mål Pd och sedan translocates genom dessa kanaler22, som vi syftar uncoupling dessa två aktiviteter och identifiera de bona fide PLS, som fungerar endast för Pd inriktning, och inte för efterföljande transport. (iii) Vi analyserade de identifierade PLS aminosyra restsubstanser viktigt för dess Pd inriktning aktivitet, oavsett om strukturellt eller funktionellt. Använder denna metod, avgränsad vi en 50-amino acid rester sekvens på amino-terminus av TMV MP som fungerar som bona fide PLS. Detta gjordes genom att producera en serie TMV MP fragment som mättade hela längden av proteinet, tagga deras karboxylgrupp-termini med GFP och övergående uttrycker dem i växt vävnader. PD lokalisering av var och en av de testa fragmenten bestämdes coexpressing dem med ett Pd markör protein, PDCB1 (Pd callose bindande protein 1)23. Den minsta fragment som fortfarande är lokaliserad till Pd, men inte färdas Pd, ansågs representera PLS. Slutligen var PLS alanin-skannade att fastställa de viktigaste aminosyra restsubstanser krävs för dess struktur eller funktion.

Medan här vi illustrera detta synsätt genom att beskriva identifiering av TMV MP PLS, kan det vara anställda att upptäcka PLSs i några andra Pd-riktade proteiner, oavsett om kodade av växten patogener eller växterna själva; Detta beror på att vår metod inte drar fördel av alla unika funktioner av viral MPs med avseende på deras förmåga att målet att Pd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. växtmaterial

  1. Val av växtarter
  2. Använd växtarterna som är infödda till proteinet av intresse, dvs, en som kodar detta protein för endogena proteiner eller som representerar de naturliga värdarna för patogen för virala proteiner. Dessutom måste den utvalda växtart vara mottagliga för den valda metoden för övergående genetisk transformation.
    Obs: Studierna rutinmässigt anställa Nicotiana benthamiana, som föreställer en god värd för TMV och omvandlas effektivt av Agrobacterium-medierad genetisk transformation teknik, dvs., agroinfiltration (se steg 3). Subst. benthamiana växter också odlas enkelt och har stora blad, som är enkelt inokuleras av Agrobacterium och enkelt analyseras av konfokalmikroskopi.
  3. Växternas tillväxt
    1. Subst. benthamiana frön i våt jord med hög täthet. Hålla dem i en kontrollerad miljö kammare vid 20-25 ˚C under 16 ljus på ~ 75 µmol fotoner m-2 s-1 och 8 h av mörker. Efter diametern av euphyll når 0,5 cm, försiktigt flytta plantorna till större krukor och fortsatt tillväxt i samma kammare på samma villkor.
    2. Bibehålla plantorna tills de växer till 4-8-bladstadium inom 4 veckor när de största bladen är 4-6 cm i diameter; vid denna tid, de kan användas för agroinfiltration (se steg 3).
      Obs: Viktigt, Använd aldrig plantorna om de började blomma eftersom, på denna utvecklingsstadiet, leaf arkitekturen varierar ofta24,25, ibland kan leda till inkonsekventa resultat.

2. uttrycket vektorn konstruktion

  1. Valet av uttryck system
    1. Välj uttryck systemet, dvs, vektorer och vektor leveransmetod, passar bäst för uttryck av proteinet av intresse i de växtarter som studerade.
      Obs: Ibland sådana specifika kombinationer av testade protein/växtarter kan kräva särskilda vektorer och vektor leveransmetod för optimal uttryck och funktion av proteinet av intresse. För de flesta tvåhjärtbladiga växter, dock Välj binära plasmider som uttryck vektorer och agroinfiltration som leverans system.
  2. Protein fluorescerande taggning
    1. Fluorescently tagga varje uttryckt protein för analys av dess subcellulär distribution22, inklusive Pd lokalisering.
      Obs: Anställa autofluorescent proteiner, såsom gemensamma fiskeripolitiken och DsRed2, som taggar. Tagga det testade proteinet med GFP och coexpress det med en gratis DsRed2. Gemensamma fiskeripolitiken fungerar både som taggen och en virus-orelaterade Last molekyl. DsRed2 funktioner att kalibrera totaleffektiviteten i övergående uttryck och eftersom det är cell-autonoma, att identifiera den initialt omvandlas cellen. sistnämnda funktionen är viktiga vid bedömningen av cell-till-cell rörelse av potentiellt icke-cell-autonoma testade proteiner. För coexpression med Pd markören PDCB1, som också är cell-autonomt, tagga testade proteinet med GFP och PDCB1 med DsRed2.
    2. Som en tumregel, säkring autofluorescent etiketten till karboxylgrupp-slutstationen för uttryckta proteinet. Dock om märkta fullängds testade protein utställningsföremålen äventyras Pd inriktning, överföra etiketten till den amino-terminus av protein.
    3. Klona den kodande sekvenser av proteinerna som ska testas i en lämplig växt uttryck vektor.
      Obs: Det finns många olika växt uttryck vektorer som tillåter fluorescerande taggning. Vi använder en rad pSAT plasmider26 eller vissa av deras derivat27,28, som lämpar sig för kloning av sekvensen av intresse direkt i ram med föreslagna autofluorescent Taggar (se steg 2.2.1) i båda amino- och karboxylgrupp-terminal riktlinjer.
    4. Överföra varje uttryck kassett i en Agrobacterium binära vektor.
      Obs: Även om pSAT-baserade konstruktioner är lämplig för direkt biolistic leverans till växt vävnader, agroinfiltration, vilket är omvandling metod som rekommenderas här (se steg 3), kräver att uttrycket kassetten ska placeras mellan T-DNA gränsar av en binär vektor29.
      Obs: Alla pSAT vektorer är utformade för att tillåta sådan överföring till pPZP-RCS2 multigene uttryck binära vektor26,30 genom ett enda steg kloning med sällsynta skärande nukleaser AscI, jag-PpoI, jag-SceI, jag-CeuI, PI-PspI och PI-TliI 26. forskare som föredrar att utnyttja recombinatorial kloning, t.ex., använder heterologa lox platser31, kan anställa pSAT vektor varianter26,27.
    5. För coexpression, överföra båda uttryck kassetter, t.ex., testade protein-GFP och DsRed2 eller testade protein-GFP och PDCB1-DsRed2 (se steg 2.1), till samma pPZP-RCS2 binärt vektorn.
      Obs: Alternativt Agrobacterium kulturer härbärgerat individuella binära konstruktioner kan blandas ihop för infiltration i N. benthamiana (se steg 3.1).

3. Agroinfiltration

  1. Lägg till 1 µg av en pPZP-RCS2-baserade plasmid från steg 2.2.5 till 100 µL kultur av behöriga celler av Agrobacterium tumefaciens stam EHA105 eller GV3101 beredd som beskrivs32, inkubera på is för 30 min, flash-frysa i flytande kväve för 1 min, och Inkubera vid 28 ° C under 15 minuter.
    1. Sedan, tillsätt 1 mL LB medium (10 g/L trypton, 5 g/L jästextrakt och 10 g/L NaCl) till behöriga cell blandningen och inkubera vid 28 ° C under 2 h. spinn ner cellerna vid 3000 × g i 1 min, åter avbryta dem i 0,2 mL LB , och plattan dem på LB agar kompletterad med lämplig antibiotika (t.ex., 100 mg/L Spektinomycin och 50 mg/L rifampicin för pPZP-RSC2-baserade vektorer26,30). Växer vid 28 ° C för 48 h tills enskilda kolonier är synliga.
  2. Plocka och plattan flera enskilda kolonier på färska LB agar plåt (se steg 3.1), växer vid 28 ° C för 48 h, och ta en liten mängd bakterier för analys av kolonin PCR-33 att bekräfta förekomsten av specifika binära konstruktioner.
  3. Växer varje Agrobacterium koloni med konstruktionen av intresse över natten vid 28 ° C i 5 mL LB medium kompletteras med lämpliga antibiotika (se steg 3.1.1). Centrifugera cellerna på 3000 × g, och slamma dem till OD600= 0,5 i agroinfiltration buffert (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 150 µM acetosyringone). Inkubera i 2 h i rumstemperatur.
    1. Om du använder en blandning av binära plasmider snarare än en enda multigene uttryck plasmid för proteinet coexpression, blanda motsvarande cellkulturer i 1:1 v/v-förhållandet innan infiltration. Sedan Inkubera cellerna vid 28 ° C i 2 h.
  4. Fyll inokulatet i en 1 mL spruta av plast och tryck munstycket på sprutan (utan nål) mot lägre (abaxial) epidermisen av den fullt mogen N. benthamiana lämnar. Håll bladet med en behandskade fingrar på adaxial ansikte34,35.
    1. Införa Agrobacterium i infiltration medium genom långsam injektion. För statistisk signifikans, infiltrera flera blad på varje planta.
      Obs: Observera att äldsta bladen inte används eftersom de inte ger konsekvent uttryck nivåer.
    2. Inokulera alla bladen i situ. Bibehålla den infiltrerade växten till observation enligt beskrivningen i steg 1.2.

4. konfokalmikroskopi

  1. Använd en kniv för att skära varje blad i fragment mellan venerna 24-48 h efter infiltration, (beroende på övergående uttryck av specifika testade protein effektivitet); storleken på varje vävnad skiva bör vara sådan att segmentet är helt täckt av täckglaset (22 x 40 mm) används för mikroskopi.
  2. Plats leaf skivor på objektet skjut med abaxial blad ytan vänd uppåt, placera en droppe vatten på blad skiva och täck den med täckglaset. Immobilisera täckglaset med små bitar av tejp på varje sida.
  3. Observera agroinfiltrated vävnader under en laser skanning confocal Mikroskop och registrera de resulterande bilderna.
    1. Först använda en 10 X objektiv för att identifiera celler med signalen, och sedan använda 63 x objektiv för mer detaljerade observationer.
    2. Användning av 458 nm våglängd från en argon ion laser att excitera GFP och 543 nm att väcka DsRed2. Behåll alla inställningar för bilden förvärv, dvs, laser intensitet och fotomultiplikatorn röret (PMT) inställningar, mellan experiment. I genomsnitt undersöka 100-120 celler för varje experimentella villkor.

5. identifiering av PLS

  1. Diagnostisera lokaliseringen av proteinet testade genom confocal Mikroskop (avsnitt 4). Kontrollera om det testade proteinet har den karakteristiska perifera punktuell mönster25,36,37,38,39,40,41 och colocalizes med Pd markören PDCB123. Detta indikerar att proteinet testade troligen innehåller PLS sekvenser.
  2. Efter bekräftelse av testade protein, PLS verksamhet successivt indela bokramarna öppen läsning (ORF) (genbank anslutningen nummer BAF93925.1) i mindre fragment, autofluorescently, (t.ex., GFP,) tag var och en av dem, och analysera deras subcellulär lokalisering som beskrivs i Steg4. Inledningsvis rekommenderas storlek 100 aminosyra rester för varje uppdelat fragment.
  3. Dela upp ytterligare trunkerade fragment som har aktiviteten PLS och kontrollera deras subcellulär lokalisering som beskrivs i Steg4 tills det minsta fragmentet som fortfarande lokaliserar till Pd, är dvs tillräcklig för att transportera autofluorescent taggen lasten Pd, identifieras. Detta fragment antas representera PLS sekvensen.
  4. Ta bort den förmodade PLS från fullängds testade proteinet, dvs säkring den återstående delen av proteinet test utan förmodad PLS autofluorescent-taggen, och bestämma subcellulär lokalisering av resulterande muterade proteinet som beskrivs i steg 4. om detta mutant protein som saknar den förmodade PLS inte lokalisera till Pd, visar detta att de identifierade PLS inte är endast tillräcklig (se steg 5.3), men också nödvändigt för Pd transporten av proteinet testade.
  5. Agroinfiltrate bladen med en blandning av Agrobacterium kulturer härbärgerat uttrycket konstruera för GFP-märkta PLS och gratis DsRed2 (se steg 3.3). Iaktta infiltrerade vävnad genom confocal Mikroskop med objektiv 10 x med samma inställningar som i steg 4,3.
  6. Poäng celler som innehåller både den gemensamma fiskeripolitiken och DsRed2 signaler som ursprungligen infiltrerade celler och poäng de angränsande celler som innehöll bara gemensamma fiskeripolitiken signalen som de som utställningen rörelse.
    Obs: Detta steg undersöker den identifierade PLS för dess potentiella cell till cell rörelse förmåga; Detta beror på att många proteiner som rikta Pd (inklusive de flesta plantera viral MPs) också flytta genom Pd i angränsande celler. Koncentrationen av Agrobacterium används för infiltration beror på uttrycket effektiviteten av olika strukturer respektive. För agroinfiltration, se till att använda den utspädning av cell-kultur som säkerställer a omvandlingen av enstaka celler, lämnar de intilliggande celler ej omformad, (ii) uppnår liknande effektivitet av uttryck. Till exempel utnyttja våra experiment OD600 av 0,01 och 0,005 för uttryck av GFP-märkta PLS och gratis DsRed2, respektive.

6. identifiering av nyckel PLS rester med hjälp av alanin skanning42

  1. Använda vanliga PCR-protokoll för att förstärka den PLS kodande sekvens anställa ett par primers avsedda att innehålla den önskade mutation, dvs, substitution av målet aminosyra återstoden med alanin, runt de centrala delarna av varje primer som beskrivs 21. utföra primer design och användning av webbplats riktad mutagenes kit för webbplats riktad mutagenes enligt tillverkarens anvisningar.
  2. Rena de resulterande PCR-produkterna med någon standard DNA rening kit och smälta dem vid 37 ° C med DpnI att eliminera den föräldraledighet (dvs.icke-muterade) metylerat och hemimethylated DNA. Cool detta under 5 minuter i rumstemperatur (inte på is). Sedan omvandla blandningen direkt till E. coli behöriga celler43och identifiera kolonier med önskad mutant konstruktioner som beskrivs i steg 3,2.
  3. Införa de muterade konstruktioner i binärt vektorn som beskrivs i steg 2.2.4, utför agroinfiltration som beskrivs i steg 3 och bedöma Pd inriktning som beskrivs i steg 4 och 5.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representativa uppgifter, som troget illustrera förväntade från protokollen beskrivs resultat och identifiera den TMV MP PLS, är anpassade från Yuan et al. 21. figur 1A summerar första stora konstruktioner uttrycker fullängds TMV MP (1-268), TMV MP PLS (som omfattar de första 50 aminosyra resterna av proteinet, 1-50), och dess alanin skanning V4A derivat smält till GFP (genereras som beskrivs i steg 2.2, 5.2 och 6) medan figur 1B summerar och kvantifierar subcellulär lokalisering av dessa märkta proteiner. Figur 1 c visar de karakteristiska perifera punktuell Pd lokalisering mönster observerades för TMV MP-GFP och för TMV MP PLS-gemensamma fiskeripolitiken samt beträffande coexpressed Pd markören, PDCB1-DsRed2 (se steg 5.1). Figur 2A visar Pd inriktning av TMV MP-GFP och TMV MP PLS-GFP och nucleocytoplasmic fördelning av coexpressed gratis DeRed2 (se steg 5.1). Slutligen, figur 2B illustrerar förlusten av Pd inriktning av både TMV MP och TMV MP PLS med en enda alanin substitution V4A, som anger att denna rest är viktigt för PLS struktur eller funktion; i samma celler coexpressed Pd markören PDCB1 fortfarande lokaliserar till Pd (se steg 6).

Dessa data visar att denna begreppsmässigt och tekniskt enkel procedur för systematisk produktion av protein fragment, deras fusion till en autofluorescent markör-Last protein och testning för förmågan att lokalisera till Pd kan identifiera en minimal proteinsekvens nödvändig och tillräcklig för Pd inriktning, dvs, PLS. För korrekt tolkning av uppgifterna lokalisering, är det viktigt att utföra colocalization experiment med en känd Pd-protein, t exJessicapelles eller PDCB familjemedlemmar16,23 eller en av växten viral MPs som sortera till Pd44 . Colocalization har uppenbarligen inte att vara komplett, som inte alla P-lokalisera proteiner kan vara riktad till samma Pd, men en statistiskt signifikant grad av colocalization med minst en av Pd markör proteiner är nödvändiga för att definiera aktiviteten PLS.

Figure 1
Figur 1: identifiering av TMV MP PLS. (A) Sammanfattning av huvudsakliga GFP-fusion konstruktioner används för att identifiera TMV MP PLS. TMV MP sekvenser, gröna lådor; Gemensamma fiskeripolitiken, Blå rutor; P, arrangören; T, terminator. Siffrorna till vänster anger aminosyra rester ingår i varje TMV MP fragment. (B) Sammanfattning av subcellulär lokalisering av fusionsproteinerna visas i (A). PD lokalisering eller nucleocytoplasmic lokalisering bestämdes baserat på lokaliseringen av motsvarande subcellulär markörer, PDCB1-DsRed2 och gratis DsRed2, respektive. Procentandelen celler uppvisar varje lokalisering mönster visas baserat på scoring 100 uttrycker celler per construct i tre oberoende experiment. Uppgifterna är medelvärde ± standardfel (SE). (C), Pd inriktning TMV MP-GFP, TMV MP PLS-GFP och Pd markören PDCB1-DsRed2. Gemensamma fiskeripolitiken signalen är i blått; DsRed2 signalen är i lila; plastid autofluorescens filtrerades. Bilderna är enda confocal sektioner. Skala barer = 10 µm. DIC, differentiell störningar kontrast Mikrograf. Denna siffra är anpassade från Yuan et al. 21. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Pd inriktning av TMV MP, TMV MP PLS och deras alanin-scanning mutanter. (A) subcellulär lokalisering av TMV MP-GFP, TMV MP PLS-GFP och nucleocytoplasmic markören DsRed2. (B) förlust av Pd inriktning förmåga av V4A alanin-scanning mutanter TMV MP-GFP och TMV MP PLS-GFP. PD var visualiserat av coexpression Pd markörens PDCB1-DsRed2. Gemensamma fiskeripolitiken signalen är i blått; DsRed2 signalen är i lila; plastid autofluorescens filtrerades. Bilderna är enda confocal sektioner. Skala barer = 10 µm. DIC, differentiell störningar kontrast Mikrograf. Denna siffra är anpassade från Yuan et al. 21. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll har fyra grundläggande beståndsdelar: begreppet att identifiera en sekvens som är både nödvändig och tillräcklig för inriktning till Pd, systematisk uppdelning av proteinet av intresse i fragment som successivt minskar i längd, fusing de testade fragmenten till ett autofluorescent protein som fungerar både som taggen och makromolekylär last och funktionella test för Pd inriktning i levande växt vävnader efter övergående uttryck för testade fusionsproteinerna. Observera att Agrobacterium-medierad övergående uttryck genererar data inom en relativt kort period av tid, dvs., flera dagar, jämfört med månader krävs för produktion av transgena växter som ofta används i liknande studier15.

Coexpression av proteinet av intresse med subcellulär lokalisering markörer, t.ex., PDCB1 eller gratis DsRed2, vanligtvis utförs från en multigene uttryck vektor. Dock om överföring av flera uttryck kassetter i en enda vektor är tekniskt problematiska, coexpression kan också utföras genom att överföra varje kassett till en separat binära konstruktion och kombinera motsvarande volymer av flytande kulturer i den resulterande Agrobacterium stammar för agroinfiltration. Eftersom detta protokoll använder övergående uttryck, behöver binärt vektorn inte bära markörerna för stabil omvandling, även om deras närvaro inte är skadligt för uttryck effektivitet.

Detta protokoll är optimerade för proteinuttryck och inriktning i N. benthamiana; Det kan dock användas i andra växtarter, inklusive Arabidopsis45,46, kan bli föremål för genetisk transformation av Agrobacterium. För andra växtarter, eller om annat önskas, detta protokoll kan anpassas att utnyttja biolistic leverans41 för övergående uttryck direkt från pSAT-baserade vektorer, undvika behovet av att överföra uttryck kassetter till binärt vektorer.

En kritisk punkt i detta protokoll är det konsekventa fysiologiska och utvecklande tillståndet av växtmaterialet. Specifikt, alla växter måste vara friska under hela försöket, och, för agroinfiltration, N. benthamiana växterna måste vara mindre än 4-veckor gammal och på 4-8-blad scenen med den största blad att vara 4-6 cm i diameter. Om växterna är för ung, blir effekterna av agroinfiltration alltför svår, stör uttryck och lokalisering av de märkta proteinerna. Däremot, uppvisar de äldsta växterna ofta varierande arkitektur Pd24,25, som också påverkar konsistensen av Pd-targeting mönster.

Fortfarande, på grund av varierande fysiologiska förhållanden av anläggningen som helhet och dess celler i synnerhet, effektiviteten i Pd inriktning i varje experiment variera något. Därför är det viktigt att analysera ett relativt stort antal celler (> 100) per experiment, och utföra minst tre biologiska replikat för varje experiment. Generellt anser vi att ett testade fragment innehåller Pd inriktning verksamhet, om den uppvisar Pd lokalisering i minst 70% av de transformerade cellerna. Skillnader i Pd inriktning effektiviteten av varje fragment, t.ex., procent av celler visar Pd-specifika punktuell ackumulering mönstret, bör analyseras av Students t-test, och p-värden < 0,05-0,01, motsvarar den statistiska sannolikheten större än 95-99%.

En annan viktig fråga är positionen av fluorescerande tagg/lasten i fusion molekylen. Vissa Pd-riktade proteiner även associera med endoplasmatiska retiklet (ER) och föreningen kan kräva fri amino-terminala sekvensen. I dessa fall, amino-terminal fusioner, som smälts karboxylgrupp-slutstationen för den protein fragmentet av intresse på amino-slutstationen för fluorescerande taggen, bör t.ex., gemensamma fiskeripolitiken eller DsRed2, användas. Denna standardplacering av taggen kan ändras i följande fall. a om de amino-terminal fusioner inte är användbara – dvsde inte uppvisar meningsfull subcellulär lokalisering mönster, uttrycks dåligt eller inte genererar fluorescerande signal tillräcklig för säker detektering – och om proteinet av intresse innehåller inte amino-terminal signal sekvenser eller karboxylgrupp-terminal fusioner där de amino-terminus testade Fragmentets smälts på karboxylgrupp-slutstationen för etiketten, de bör utföras. (ii) karboxylgrupp-terminal fusioner bör också användas om proteinet av intresse innehåller signal sekvenser på dess karboxylgrupp-terminus. (iii) om proteinet av intresse har båda amino - och karboxylgrupp-terminal signaler, såsom de som finns i GPI-förankrade proteiner, eller om det innehåller en amino-terminal signal peptid dess amino-terminal fusion ännu inte är användbara, bör etiketten placeras internt) antingen nedströms av amino-terminal signalen eller uppströms karboxylgrupp-terminal signalen). Några användbara rutiner för intern fluorescerande taggning av proteiner beskrivs i våra tidigare publikationer47,48.

För närvarande finns det inga kända samförstånd sekvens för PLS. Som sådan (i steg 5.2) rekommenderar vi initialt delas proteinet in i angränsande ~100-200 rester långa fragment. Dessa kan sedan göras successivt kortare baserat på observerade Pd-targeting aktiviteten eller avsaknaden därav. Man bör vara uppmärksam på andra potentiella inriktning signaler finns i proteinet (t.ex., Lantmäteriverket, signal peptider, etc.). Som potentiella överlappningen av sådana sekvenser med PLS sekvenser är okänd, bör dock dessa protein regioner ingå i denna mutationsanalys analys.

Hittills har användes detta protokoll för att identifiera en enda PLS i ett protein molekyl21. Ett protein kan potentiellt kan dock innehålla mer än en signal sekvens; faktiskt flera NLSs har beskrivits i många nukleära proteiner, inklusive GATA transkription faktorer49. Således, när analysera olika fragment av proteinet testade för Pd inriktning, är det möjligt att mer än en sådan fragment identifieras, vilket indikerar förekomst av flera PLSs som får agera självständigt eller synergistiskt.

Den största begränsningen av detta protokoll är att, efter agroinfiltration, visualisering av subcellulär lokalisering av övergående uttryckta proteiner av intresse uppnås bäst i epidermala celler och på relativt smala tillväxtfas. Vid behov kan denna begränsning övervinnas genom att producera transgena växter som stabilt express var och en av de testa proteinerna i de flesta av deras vävnader och celltyper. Dessutom skulle detta protokoll inte vara användbar för studier av viral MPs eller andra Pd-riktade proteiner som fungerar endast i växter arter som inte är mottagliga för övergående genetisk transformation.

Medan vi utvecklat denna teknik för identifiering av en PLS av TMV MP, kan det användas för upptäckten av PLSs i någon annan växt viral MPs eller i växten endogena proteiner som lokaliserar till Pd, övergående eller permanent. Dessutom om kombineras med lämpliga subcellulär lokalisering markörer47, är detta protokoll lämplig för identifiering av många andra inriktning signaler inom proteiner av intresse för växter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter förklarade.

Acknowledgments

För brist på utrymme, vi citerade mestadels översiktsartiklar och vi ber om ursäkt till våra kolleger vars ursprungliga arbetet inte nämndes. Arbetet i V.C. laboratoriet stöds genom bidrag från NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD och BSF till V.C. och S.G.L. laboratoriet stöds av NIH och medel från avdelningar i växtpatologi och växt-mikrob biologi till S.G.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15, (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42, (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley-Interscience. New York. (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics