Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en * These authors contributed equally

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lymfocyt ekstravasation i centralnervesystemet (CNS) er afgørende for immun overvågning. Sygdomsrelaterede ændringer af lymfocyt ekstravasation kan resultere i patofysiologiske forandringer i CNS. Således undersøgelse af lymfocytmigration i CNS er vigtigt at forstå inflammatoriske CNS-sygdomme og udvikle nye terapi tilgange. Vi præsenterer her en in vitro model af den menneskelige blod-hjerne-barrieren for at studere lymfocyt ekstravasation. Human hjerne mikrovaskulære endotelceller (HBMEC) er confluently dyrkes på et porøst polyethylenterephthalat Transwell indsætte at efterligne endotel af blod-hjerne-barrieren. Barrierefunktion er valideret af zonula occludens immunhistokemi, transendotele elektrisk modstand (TEER) målinger samt analyse af Evans blue permeation. Denne model giver mulighed for undersøgelse af diapedesis af sjældne lymfocytundergrupper såsom CD56 lyse CD16 dim / - NK-celler. Furthermmalm, virkningerne af andre celler, cytokiner og chemokiner, sygdomsrelaterede ændringer og distinkte behandlingsregimer på vandrende kapacitet af lymfocytter kan undersøges. Endelig kan analyseres virkningen af ​​inflammatoriske stimuli samt forskellige behandlingsregimer på endotelbarrieren.

Introduction

Lymfocytmigration fra blodet ind i væv er afgørende for immun overvågning. En sekvens af specifikke molekylære vekselvirkninger sikrer stedspecifik ekstravasation i tyndtarmen, hud, lymfeknuder, centralnervesystemet (CNS), og andre væv 1. Ændringer i lymfocytmigration er involveret i patofysiologien af en række bred spredning sygdomme 2. Migration i immun-priviligerede CNS reguleres stramt og følgelig ændringer af denne proces er involveret i CNS-relaterede sygdomme som encephalomyelitis 3, neuromyelitis optica, slagtilfælde og dissemineret sklerose (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Derfor er det vigtigt at studere lymfocyt ekstravasation til bedre at forstå sygdommen patofysiologi og udvikle værktøjer til en melioration af sygdomstilfælde 8, 9, 10, 11, 12.

Lymfocytter migrerer i CNS via distinkte veje. Ekstravasation gennem postkapillære venuler i det subarachnoide rum via blod-cerebrospinalvæske barriere inden choroid plexus og over blod-hjerne-barrieren er blevet beskrevet 1, 13, 14, 15. Migration over blod-hjerne-barrieren udføres ved interaktionen af lymfocytter med endothelceller 14. I modsætning til endotelceller i periferien, endotelceller i CNS udtrykker høje mængder af tight junction-molekyler, hvorved strengt at begrænse mængden af ​​celler og proteiner i stand til at krydse blod-hjerne-barrierenlass = "xref"> 16. Inflammation resulterer i løsning af tight junctions og inducerer ekspressionen af ​​adhæsionsmolekyler; således, øge lymfocytmigrering i CNS 1, 17, 18.

Ekstravasation via blod-hjerne-barrieren er en flertrinsproces. Lymfocytter tøjr til endotelcellerne og derefter rulle langs endotel i en proces hovedsagelig medieret af selectiner 1, 15. Efterfølgende interaktioner mellem kemokiner udskilt af endothelet og de respektive chemokinreceptorer udtrykt på lymfocytter inducerer konformationelle ændringer af integriner og dermed fremme fast adhæsion til endotelcellerne 1. Endelig lymfocytter enten kravle langs endotel barriere mod blodstrømmen inden transmigrating ind i det perivaskulære rum eller stall umiddelbart og direkte transmigrate på stedet for fast adhæsion 1, 19, 20. Alle disse trin af lymfocyt ekstravasation kan analyseres in vitro ved anvendelse distinkte teknikker 21. Time-lapse video mikroskopi bruges til at studere den indledende tethering og rullende 15. Adhæsionsanalyser give detaljerede oplysninger om fast anholdelse at endotelbarrierer 22. Transmigration assays som påvist her tillader analyse af immun-celle transmigration 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Anvendelse af det humane in vitro blodhjernebarrieren model, kunne vi for nylig viser, at en højere migrDELSE kapacitet CD56 lyse CD16 dim / - NK-celler i forhold til deres CD56 dim CD16 + modparter blev afspejlet ved en overvægt af dette NK-undergruppe i det intratekale rum 21. Således er vores forsøgsopstilling synes at være egnet til at efterligne in vivo situationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Culture of Human Brain mikrovaskulære endotelceller (HBMEC)

  1. Coating af cellekulturkolber
    1. Til fremstilling fibronectinopløsningen tilsættes 10 ml PBS til en 15 ml centrifugerør. Tilsæt 150 uL fibronektin og bland godt.
    2. At dække bunden en T-25 cellekulturkolbe tilsæt 2 ml fibronectinopløsningen. Inkubér cellekulturkolbe i mindst 3 timer ved 37 ° C i inkubatoren. Fibronectin coatede kolber kan opbevares i 2 uger ved 37 ° C / 5% CO2.
  2. Såning og cellekultur af HBMEC
    1. Aspirer fibronectin opløsning fra bunden af ​​cellekulturkolbe. Tilføje 7,2 x 10 4 HBMEC / cm suspenderet i 6 ml ECM-b-medium (= ECM-b suppleret med 5% føtalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin og 1% endotelcellevækstfaktor supplement). Der inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2. Kontrollere cellevækst daglig anvendelse af et mikroskop.
    2. Skift medium hver 3 dage.Høst eller spaltede celler, når HBMEC nå ca. 80% konfluens. HBMEC bør anvendes mellem passage 1 og 15 for at undgå tab af fysiologiske egenskaber.
  3. Harvest HBMEC.
    1. Forberede Accutase opløsning ved at blande Accutase (1x) med PBS i et forhold på 1: 1. Hold Accutase opløsning ved 37 ° C i et vandbad, indtil yderligere anvendelse.
    2. Overføre ECM-b medium fra cellekulturen kolben til et 15 ml centrifugerør. Vask HBMEC ved tilsætning af 5 ml PBS til bunden af ​​cellekulturkolbe. Aspirer PBS og gentag vasketrinnet to gange mere.
    3. Tilsæt 2 ml forvarmet Accutase opløsning. Der inkuberes ved 37 ° C i 2 min. Bagefter HBMEC genopslæmmes med flere gange fast trykke på cellekulturkolbe. Cellefrigørelse styres ved anvendelse af et mikroskop
    4. ECM-b-medium tidligere lagret i et 15 ml rør sættes tilbage til cellekulturkolbe så snart HBMEC begynder at løsne. Skyl bunden af ​​kolben gentagne gange, indtil de fleste HBMEC ergensuspenderet.
    5. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml centrifugerør. Centrifugere ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og re-suspendere celler i 1 ml ECM-b-medium. Tæl celler og fortyndes cellesuspensionen for at opnå en slutkoncentration på 3 x 10 5 HBMEC per ml ECM-b-medium.

2. Forberedelse af Cell Culture Inserts

  1. Coating af cellekultur-indsatse
    Vigtigt: Undgå at røre ved membran af cellekultur skær.
    1. 100 pi fibronectin opløsning (se 1.1.1) til hver celledyrkningsinsert (figur 1A) og en brønd i en 96-brønds fladbundet plade (optisk kontrol brønd). Inkuber i mindst 3 timer ved 37 ° C. Efter inkubation aspirat fibronectin opløsning.
    2. Tilsæt 100 pi HBMEC suspension til cellekulturen skær og den optiske kontrolbrønd. Tilføj 600 pi ECM-b-medium til det nedre rum af cellenkultur skær. Der inkuberes i 3 - 4 dage ved 37 ° C / 5% CO2, indtil barriereintegritet (figur 1B) er nået, kontrollere cellevækst ved mikroskopisk evaluering af HBMEC i den optiske kontrolbrønd. Bemærk: Cell vækst ud over fire dage kan ikke anbefales.
    3. Valgfrit: For at efterligne inflammatoriske tilstande sug mediet fra det nedre rum og erstatte det med ECM-b-medium suppleret med 500 U / ml IFN-γ / TNF-α 24 timer før migrationen assayet.

3. Kvalitetskontrol med Evans blå på dagen for den Transmigration Assay

  1. Fremstilling af Evans blue-opløsning
    1. Til fremstilling PBS / B27 opløsning mix 10 mL PBS med 200 pi B27 supplement under anvendelse af en 15 ml centrifugerør. Fortynd Evans blue stamopløsning (20 mg / ml PBS) 1: 1.000 med PBS / B27.
  2. Evans blue permeabilitet assay
    1. Sug mediet fra det nedre rum efterfulgt af det øvre rumaf en celledyrkningsinsert indeholdende et sammenflydende HBMEC monolag. Tilsæt 100 uL evans blå løsning på celledyrkningsinsert.
    2. Tilføj 600 pi PBS / B27 til det nedre rum og inkuberes i 60 minutter ved 37 ° C / 5% CO2. omhyggeligt fjerne celledyrkningsinsert med en pincet.
  3. Evans blue måling
    1. Fjern PBS / B27 fra det nedre rum og overføre 100 pi hver til to brønde i en sort polystyrol 96 brønds fladbundet plade. Sæt pladen i en Tecan Infinite M200 Pro pladelæser og bestemmelse af optimal z-stillingen.
    2. Foranstaltning excitation af Evans-blåt under anvendelse respektive indstillinger (for eksempel: excitation: 620 nm, emission: 680 nm, excitation båndbredde: 9 nm, emission båndbredde: 20 nm, 175x ekstraudstyr, 25 blinker, tidspunkt for integration: 20 mikrosekunder).
    3. For at bestemme HBMEC barriere funktioner sammenligne erhvervet data til en standardkurve skildrer Evans blue gennemtrængning HBMEC på forskellige tidspunkter efter frøing celler (figur 1B, højre).

4. Migration Assay

  1. Fremstilling af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC).
    1. Tilsæt 10 ml RPMI i et 15 ml centrifugerør og tilsæt 200 uL B27 supplement. Count PBMC og centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 min. Resuspender PBMC til en slutkoncentration på 5 x 10 6 celler / ml RPMI / B27.
  2. Opsætning af migrationen analysen
    1. Aspirer medium fra det nedre rum efterfulgt af det øvre rum af cellekultur-indsatse indeholdende sammenflydende HBMEC monolag (figur 1A). Per donor tilsættes 100 pi PBMC-suspensionen hver til cellekulturen skær og også til en brønd i en plade med 24 brønde pr (in vitro kontrol).
    2. Tilføj 600 pi RPMI / B27 til det nedre rum af cellekultur indsætter og 500 pi til PBMC af in vitro kontrol og inkuber 6 timer ved 37 ° C / 5% CO2.
    3. Høst af migrerede PBMC
      1. Tag celledyrkningsinsert med pincet og forsigtigt skylle bunden med 400 pi PBS uden at røre membranen. Kassér celledyrkningsinsert.
      2. Tilsættes 20 pi flow tæller fluorospheres (ca. 1.000 kugler / pl) til det nedre rum af cellekulturen indsætte samt til in vitro-kontrol og bland godt. Overfør 1 ml resulterende PBMC suspension flowcytometri rør.

    5. flowcytometri

    1. Prøvefremstilling
      1. Centrifuge PBMC ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
      2. Forberede antistofopløsning ved tilsætning fluorokromkonjugerede antistoffer til 100 pi flowcytometri puffer (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) pr prøve. For resultaterne præsenteret nedenfor 1 pi CD4-FITC, blev 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 pi CD56-PC7, 1 pi CD8-A700, og 1 pi CD16-A750 anvendes per prøve.
      3. Re-suspendere PBMC i 100 pi antistofopløsningen og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C.
      4. Tilsæt 250 pi flowcytometri puffer og centrifugeres ved 300 xg i 5 min.
    2. erhvervelse Sample
      1. Resuspender PBMC i den nødvendige mængde (varierer afhængigt af flowcytometeret anvendt) af flowcytometri puffer.
      2. Erhverve farvede PBMC under anvendelse af et flowcytometer med et aktivt detektor mellem 525 og 700 nm bølgelængde for at detektere flow count fluorospheres (excitation 488 nm, emission 525 - 700 nm).
        (Følgende trin er et eksempel, hvis en Gallios flowcytometer betjenes med Kaluza G software bruges:. (1) Start computeren (2) Når styresystemet er fuldt lastet, starter flowcytometeret ved at trykke på "cytometret om" knappen . (3) Læg det respektive erhvervelse protokol ved at trykke på "åben protokol" knappen. (4) Vælg den ønskede protokol og vælg "åben". (5) Duplicate protokollen for hver prøve ved at klikke med højremuseknappen på den protokol, synlig i den virtuelle karrusel og en venstre klik på feltet "duplikat". (6) Label hver prøve på listen prøve. (7) Overfør prøverne til de angivne positioner af karrusellen og start erhvervelsen.)
    3. prøveanalyse
      1. Åbent resulterer flowcytometri data ved hjælp af respektive software. Bestemme antal subpopulationer af interesse for transmigrated PBMC samt celler fra in vitro-kontrolbrønde og flow tæller fluorospheres brug af den respektive analyse software.
        (Et eksempel på gating strategi er givet i resultaterne del (figur 1 C: Til analysere transmigration af NK-celle-undergrupper, først vælge lymfocytter i en sideværts spredningskanal (SSC) versus frontal spredningskanal (FSC) plot Lymfocytter er. derefter vises i et CD3 versus CD56 plot og CD56 + CD3 -. NK celler selekteres For at skelne mellem NK-celle-undergrupper, er NK-celler vises ien CD56 versus CD16 plot og CD56 lyse CD16 dim / - såvel som CD56 dim CD16 + NK celler selekteres. Desuden er flow tæller fluorospheres valgt blandt en FSC versus SSC plot og efterfølgende vises i en afbildning af en kanal med en emission mellem 525 og 700 nm versus tid for at bestemme deres nummer.)
      2. At beregne det samlede celleantal på hver prøve, normalisere det detekterede antal celler ved brug af flow tæller fluorospheres:
        ligning
      3. Bestemme procentdelen af migrerede celler som forholdet mellem de samlede migrerede celler og totale celler i in vitro-kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative resultater, der viser transmigration af NK-celle- og T-celle delmængder ved hjælp af blod-hjerne-barrieren model humane (figur 1A) er vist. Integritet HBMEC monolaget blev valideret ved farvning af tight junction-molekylet ZO-1, transendotele elektrisk modstand (TEER) målinger, og Evans blå permeation (figur 1B). Efter 3 - 4 dage kultur HBMEC udtrykte tight junction molekyle ZO-1 (figur 1B, venstre). Endvidere HBMEC voksede i monolag udviser transendotheliale elektrisk modstand (figur 1B midten) samt reduceret gennemtrængning for Evans blue (figur 1B, højre). HBMEC monolag blev anvendt til at undersøge transmigration af NK-celler, herunder CD56 lyse CD16 dim / - og CD56 dim CD16 + NK-celle-undergrupper og T-celler, herunder CD4 + og CD8 + T-celler som to examples (figur 1D + E, henholdsvis). Procentdelen af migrerede celler blev beregnet baseret på celletællinger opnået ved flowcytometri og normaliserede ved brug af flow tæller fluorospheres som en intern kontrol (figur 1C). Den HBMEC monolag blev stimuleret med IFN-γ og TNF-α 24h før assayet for at efterligne inflammatoriske tilstande. Cytokinstimulering resulterede i forøget migration af alle analyserede lymfocytpopulationer. Dette kan skyldes en forøget ekspression af adhæsionsmolekyler, herunder ICAM-1 (data ikke vist). CD56 lyse CD16 dim / - NK-celler udviste en højere vandrende kapacitet i forhold til deres CD56 dim CD16 + NK tværs både ustimuleret (10,88% versus 0,86%) og IFN-γγ / TNF-α stimulerede (18,22% versus 2,94%) HBMEC (figur 1D). Men den relative stigning af transmigration som følge af inflammation var højere for CD56 dim CD16 + vs. + 167% for CD56 lyse CD16 dim / -). Disse resultater efterligne in vivo observationer, at CD56 lyse CD16 dim / - NK-celler er beriget i det intratekale rum. Således, blod-hjerne-barrieren model synes at være egnet til at analysere grundlæggende principper for immun-celle diapedese af sjældne lymfocytpopulationer i CNS 21. Endelig er transmigratory kapacitet af CD4 og CD8 T-celle-undergrupper vist (figur 1E).

figur 1
Figur 1: Differential Migrering af NK-celle-undergrupper tværs Uninflamed og betændte HBMEC Monolag. A. Et billede af transwell indsatser (til venstre) og illustration af forsøgsopstillingen (til højre). B. Validering af HBMEC barrierefunktioner. Venstre: immunhistokemisk farvning af den stramme krydset molecule ZO-1 under anvendelse af kanin-anti-human ZO-1 (Abcam, 1: 200) og gede-anti-kanin IgG-Cy3 (1: 300) på HBMEC dyrket i 3 dage. Center: transendotheliale elektrisk modstand (TEER) af HBMEC mellem dag 2 og dag 4 af dyrkningen. Højre: standardkurve for Evans blue permeation for HBMEC med ( "betændt", rød) eller uden ( "uninflamed", sort) stimulering med 500 U / ml IFN-γ og TNF-α i 24 timer. Transmigration assays udføres 72 - 96 timer efter podning af HBMEC (sort pil). CE. PBMC afledt fra 16 raske individer blev udsat for migration assays som beskrevet i protokollen sektion. 24 timer før assayet blev halvdelen af ​​cellekultur skær stimuleret med 500 IU / ml IFN-γ og TNF-α. Transmigrated celler blev høstet og analyseret ved flowcytometri. C. Repræsentative resultater for PBMC afledt af in vitro kontrolbrønd (øverst) og efter migrering tværs uninflamed HBMEC (nederst). NK cel ls blev gated fra totale lymfocytter CD3 - CD56 + -celler og yderligere opdeles i CD56 lyse CD16 dim / - ( "CD56 lyse ") og CD56 dim CD16 + (" CD56 dim") NK-celle-undergrupper. Flow count fluorospheres ( "perler") blev gated baseret på FSC / SSC egenskaber og deres antal blev bestemt i en FL3 versus tid plot. Eksempler beregninger for at bestemme procentdelen af migrerede CD56 lyse og CD56 svagt NK-celler er vist til højre. D. Procent af migrerede NK-celler såvel som CD56 lyse og CD56 dim NK-celle-undergrupper og E. procentdel af migrerede T-celler, herunder CD4 + og CD8 + T-celle-undergrupper efter transmigration tværs uninflamed (sort) eller betændt (rød) HBMEC afbildet som gennemsnit ± SEM. P-værdier blev beregnet ved parrede student t-test; ** p <0,01, *** p <0,001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenterer vi en teknik til at undersøge transmigration af lymfocytter på tværs af humant blod-hjerne-barrieren. In vitro analyse af lymfocyt migration til CNS er vigtigt at studere grundlæggende processer af lymfocyt ekstravasation, potentielle sygdomsrelaterede ændringer, og nye terapeutiske fremgangsmåder.

Adskillige modifikationer af blod-hjerne-barrieren model er mulige. For eksempel kunne celler fra det øvre rum analyseres for at undersøge sammensætningen af ​​den ikke-migrerede cellepopulation. Endvidere kan behandling af HBMEC monolaget med IFN-γ og TNF-α 24 timer før assayet anvendes til at efterligne en betændt blod-hjerne-barrieren for at studere virkningen af inflammatoriske CNS-sygdomme 21, 25. Tilsvarende behandling af HBMEC eller lymfocytter med andre stoffer tillader at undersøge deres virkninger på lymfocyt ekstravasation (f.eks deresvirkning på adhæsionsmolekyler) 30, 31. Kan studeres inddragelsen af visse adhæsionsmolekyler anvendelse blokerende antistoffer for integriner eller deres ligander 32. Endvidere forsøgsopstillingen præsenteres her tillader analyse af kemotaktiske virkninger fra kemokiner eller supernatanter afledt fra astrocytter eller andre celler 33, 34. Erstatning af HBMEC med primære menneskelige hjerne afledte epitelceller udvider spektret af denne eksperimentelle opsætning til undersøgelse af blod-cerebrospinalvæske barriere 15. HBMEC bør ikke erstattes med immortaliserede endotelceller eller celler afledt fra andre organer til at opretholde CNS-specificitet af modellen. Dog kan hjerne-afledte endotelceller fra andre arter anvendes til at analysere transmigration i de respektive dyr 35. Desuden retinsyre eller hydrocortisone er blevet beskrevet at øge barrierefunktioner og måske således anvendes 36, 37. I tilfælde af begrænsede celleantal mængden af celler udsat for assayet kan blive reduceret, fordi vores model giver lineære genvindingsprocent mellem 2 x 10 5 og 1 x 10 6 PBMC (data ikke vist). At analysere sjældne cellepopulationer efter transmigration kan det være nødvendigt at samle celler fra flere brønde med henblik på at opnå tilstrækkelige celler, der kræves til flowcytometri. Endelig kunne vores forsøgsopstilling også bruges til at studere leveringen lægemiddel i CNS 38. En porestørrelse på 3 um anvendes typisk til at tillade lymfocyt transmigration, hvorimod en porestørrelse på 0,4 um forhindrer lymfocyt transmigration, men tillader at studere lægemiddelafgivelse 39, 40, 41, 42.

43. Centrifugering af HBMEC ved lave g kræfter og brug af tidlige passager (dvs.

Selvom vedhæftning protokollen beskrevet her sikrer meningsfulde og reproducerbare resultater har denne teknik visse begrænsninger. Først og fremmest, in vivo blod-hjerne-barrieren er dannet af et antal celler, der interagerer på forskellige måder og styrke barrierefunktionen ved at påvirke dannelsen af tight junctions 1. Derfor, selv om dette blod-hjerne-barrieren model er en god tilnærmelse til in vivo-situationen, er vigtige aspekter mangler. Desuden lymfocyt ekstravasation i CNS over blod-hjerne-barrieren er en flertrinsproces. Mens hver enkelt trin kan undersøges hver for sig, er den teknik, der præsenteres her ikke give oplysninger om den, derle processen med ekstravasation under påvirkning af forskydningskræfter 2, 44, 45, 46. Endelig kan analyse af migrerede celler fra PBMC være udfordrende afhængigt af hyppigheden af ​​cellerne af interesse, fordi normalt kun encifrede frekvenser af celler der vandrer. Derfor kan det være nødvendigt adskillelse af bestandene af interesse forud for assay eller pooling af celler vandrede på tværs af flere cellekultur skær. Andre modeller til analyse af leukocytmigrationen i CNS dække nogle af de mangler i vores model aspekter. Co-kultur med astrocytter pericytter og / eller neuroner anvendes til at efterligne kompleksiteten af blodhjernebarrieren bedre 47. Modeller, herunder forskydningskræfter såsom DIV-BBB højere grad afspejler de fysiologiske betingelser, således muliggør en mere sofistikeret analyse af lymfocyt diapedese 48. Sammenfattende præsenterer vi en let tilgængelig teknik egnet til undersøgelse af kvalitative og kvantitative lymfocyt diapedese tværs af humant blod-hjerne-barrieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3, (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177, (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68, (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862, (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812, (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7, (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254, (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72, (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275, (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81, (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248, (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6, (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211, (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16, (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502, (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812, (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185, (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2, (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36, (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40, (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66, (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35, (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172, (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65, (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234, (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128, (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140, (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6, (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86, (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818, (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9, (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31, (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26, (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243, (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229, (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8, (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33, (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75, (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104, (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48, (3), 505-516 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics