Spettroscopia NMR come uno strumento robusto per la rapida valutazione del profilo lipidico di olio di pesce integratori

Chemistry

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Summary

Qui, la spettroscopia ad alta risoluzione 1 H e 13 C Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è stato utilizzato come strumento di rapida e affidabile per l'analisi quantitativa e qualitativa dei supplementi di olio di pesce incapsulati.

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Williamson, K., Hatzakis, E. NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements. J. Vis. Exp. (123), e55547, doi:10.3791/55547 (2017).

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Abstract

La dieta occidentale è povera di acidi grassi n -3, pertanto si raccomanda il consumo di supplementi di olio di pesce per aumentare l'apporto di questi nutrienti essenziali. L'obiettivo di questo lavoro è quello di dimostrare l'analisi qualitativa e quantitativa di olio di pesce incapsulato utilizzando ad alta risoluzione 1 H e 13 C NMR utilizzando due diversi strumenti NMR; 500 MHz e uno strumento 850 MHz. Sia protone (1 H) e carbonio (13 C) spettri NMR possono essere utilizzati per la determinazione quantitativa dei principali costituenti degli integratori di olio di pesce. Quantificazione dei lipidi negli integratori di olio di pesce è ottenuta attraverso l'integrazione dei segnali NMR appropriate nel relativi spettri 1D. Risultati ottenuti da 1 H e 13 C NMR sono in buon accordo con l'altro, nonostante la differenza di risoluzione e sensibilità tra i due nuclei e due strumenti. Offerta 1H NMRsa un'analisi più rapida rispetto a 13 C NMR, lo spettro può essere registrato in meno di 1 minuto, a differenza di analisi 13 C NMR, che dura da 10 minuti a un'ora. Lo spettro NMR 13 C, tuttavia, è molto più informativo. Può fornire dati quantitativi per un maggior numero di singoli acidi grassi e può essere utilizzato per determinare la distribuzione posizionale degli acidi grassi sullo scheletro di glicerolo. Entrambi i nuclei possono fornire informazioni quantitative in un esperimento senza la necessità di purificazione o separazione gradini. La forza del campo magnetico colpisce soprattutto l'spettri NMR 1 H a causa della sua bassa risoluzione rispetto a 13 C NMR, tuttavia, strumenti NMR costo ancora più basso possono essere efficacemente applicato come un metodo standard dai laboratori dell'industria alimentare e controllo qualità.

Introduction

Il consumo di acidi grassi n -3 nella dieta ha dimostrato di essere utile contro diverse condizioni quali disturbi cardiaci 1, 2, 3, 4 e malattie infiammatorie diabete 5. La dieta occidentale è considerato povero di n -3 acidi grassi e quindi si raccomanda il consumo di integratori di olio di pesce per migliorare la n -6 / -3 n equilibrio nella nutrizione del consumatore 1. Nonostante il recente aumento del consumo di pesce supplemento di olio, le domande rimangono circa la sicurezza, l'autenticità e la qualità di alcuni di questi prodotti. L'analisi rapida ed accurata compositiva di supplementi di olio di pesce è essenziale per valutare correttamente la qualità di questi prodotti commerciali e garantire la sicurezza dei consumatori.

Le metodologie più comuni per la valutazione del supplemento di olio di pesces sono gascromatografia (GC) e la spettroscopia a infrarossi (IR). Mentre questi sono metodi altamente sensibili, soffrono di diversi inconvenienti 6. Analisi GC richiede molto tempo (4-8 h) per la separazione e derivatizzazione dei singoli composti è richiesto 7 e l'ossidazione dei lipidi possono verificarsi durante l'analisi 8, 9. Mentre la spettroscopia IR può essere quantitativa, un modello di previsione è richiesta per essere costruito usando parziale minimi quadrati regressione (PLSR), anche se ci sono eccezioni in cui bande IR possono essere attribuiti ad un singolo composto 10. PLSR richiede l'analisi di un gran numero di campioni, che aumenta il tempo di analisi 11. Per questo motivo, v'è un crescente interesse per lo sviluppo di nuove metodologie analitiche che permettono l'analisi precisa e veloce di un gran numero di campioni di olio di pesce. Organizzazioni come l'Office di integratori alimentari (ODS) presso il National Institutes of Health (NIH) e la Food and Drug Administration (FDA) hanno collaborato con l'Associazione dei chimici analitici ufficiali (AOAC) per sviluppare questi nuovi metodi 12, 13.

Uno dei metodi analitici più promettenti per lo screening e la valutazione di matrici a più componenti, come integratori alimentari, è Nucleare spettroscopia a risonanza magnetica (RMN) 14, 15. spettroscopia NMR ha diversi vantaggi: è una tecnica non distruttiva e quantitativa, richiede minima o nessuna preparazione del campione, ed è caratterizzato da un'eccellente precisione e riproducibilità. Inoltre, la spettroscopia NMR è una metodologia ecologico perché utilizza solo piccole quantità di solventi. Lo svantaggio principale della spettroscopia NMR è la sua sensibilità relativamente bassa rispetto ad altri analytiMetodi cal, tuttavia, i recenti progressi tecnologici nella strumentazione quali campi magnetici forti, sonde criogeniche di vari diametri, elaborazione dati avanzata e sequenze di impulsi versatili e tecniche hanno aumentato la sensibilità fino alla gamma nM. Mentre strumentazione NMR è alto costo, la lunga durata di spettrometri NMR e le molte applicazioni di NMR abbassare il costo delle analisi a lungo termine. Questo protocollo video dettagliato ha lo scopo di aiutare i nuovi operatori del settore evitare insidie associati con 1 H e 13 C NMR analisi spettroscopica di supplementi di olio di pesce.

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Protocol

1. Preparazione del campione NMR

Nota: Attenzione, si prega di consultare tutte le schede di sicurezza pertinenti (MSDS) prima dell'uso. Cloroformio deuterato (CDCl 3) utilizzato nella preparazione del campione è tossico. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si effettua la preparazione del campione compreso l'uso di una cappa aspirante e dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni lunghe, chiuso-punta scarpe).

  1. Preparazione di 1 H e 13 campioni C
    1. Estrarre 120 ml (~ 110 mg) di olio di pesce da una capsula dietetico utilizzando una siringa e collocarlo in una fiala di ml 4 di vetro. Registrare il peso dell'olio di pesce.
    2. la dissoluzione del campione
      1. Sciogliere circa 120 ml di olio di pesce in 500 ml di CDCl 3, contenente 0,01% di tetrametilsilano (TMS) che viene utilizzato come riferimento per il 1 H e 13 C spostamenti chimici.
        NOTA: TMS è l'usod solo per la taratura spostamento chimico (vedi numeri di passo 2.2.1.2.7 e 2.2.2.2.7), non per la quantificazione (vedi numeri di passo 2.2.1.3 e 2.2.2.3) scopi.
      2. Preparare un 2,6-di- terz-butil-4-metilfenolo (BHT) soluzione madre, se quantificazione espresso in mg / g è desiderato, sciogliendo circa 220 mg di BHT e 15 mg di cromo (III) acetilacetonato (Cr ( acac) 3) in 20 mL di CDCl 3 contenente 0,01% di TMS. Utilizzare 500 microlitri della soluzione madre di sciogliere 100 mg (± 10 mg) di olio di pesce.
    3. Dopo dissoluzione dell'olio (richiede alcuni secondi), trasferire tutta la soluzione direttamente in una elevata qualità del tubo NMR 5 mm e allegare un tappo. Analizzare i campioni entro 24 ore dopo la preparazione dei campioni.

Preparazione 2. Strumento NMR

Nota: Attenzione, attenzione che la presenza di forti campi magnetici prodotti da strumenti NMR può influenzare i dispositivi medici e implformiche come pacemaker e protesi chirurgiche, così come gli elementi elettronici come carte di credito, orologi, ecc È necessario Ulteriore cautela quando l'analisi viene eseguita utilizzando magneti non schermatura. Due strumenti NMR sono stati utilizzati per l'acquisizione di 1 H e 13 C NMR; uno spettrometro operante a 850,23 MHz e 213.81 MHz per 1 H e 13 C nuclei, rispettivamente, dotato di un'inversa tripla risonanza elio-raffreddata (TCI) sonda 5 mm e uno spettrometro operante a 500,20 MHz e 125.77 MHz per 1 H e 13 C nuclei, rispettivamente, dotato di una larga fascia constatato (BBO) raffreddato con azoto sonda 5 mm. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a 25 ± 0,1 ° C e gli spettri sono stati elaborati da un pacchetto di dati NMR acquisizione e analisi dei software di elaborazione standard (vedi Lista dei materiali).

  1. Preparazione per l'acquisizione del spettri NMR
    Nota: 1 H e 13 C NMRpossono essere acquisite conseguenza senza rimuovere il campione dallo strumento.
    1. Inserire il tubo NMR in una turbina filatrice (vedi Materiali List).
    2. Posizionare il filatore e il tubo sulla sommità di un profondimetro graduato e spingere delicatamente la parte superiore del tubo fino alla parte inferiore tocchi il fondo della sagoma.
    3. Collocare il campione NMR in un luogo aperto del SampleCase. Si noti il ​​numero di slot del campione viene posto in.
    4. Per caricare il campione nel NMR, tornare al computer di controllo e digitare 'sx #', dove # è la fessura nel SampleCase tenendo il campione.
    5. Attendere che il segnale del deuterio di CDCl 3 per apparire sullo schermo la finestra di blocco. Se non viene visualizzata automaticamente, digitare "lockdisp". Non appena il segnale di deuterio è visibile, tipo "lock" sulla linea di comando per selezionare "CDCl 3" dall'elenco del solvente, al fine di bloccare il campione utilizzando deuterio risonanza CDCl 3.
      NOTA: Deuterio signal non si può visualizzare se l'utente precedente usa un solvente diverso. L'utente deve attendere che l'indicatore che il campione è giù, quindi bloccare.
    6. Tipo "bsmsdisp" nella riga di comando per assicurarsi filatura non è attivo. Se il pulsante "SPIN" è verde, clic su di esso per disattivare filatura.
    7. Digitare il comando "nuovo" per creare un nuovo set di dati. Inserire un nome per il set di dati nella scheda "NAME" e il numero di esperimento nella scheda "EXPNO". Utilizzare il numero "1" nella scheda "PROCNO". Nella scheda "Experiment", clicca su "Seleziona" e scegliere il file di parametri "PROTON". Scrivere il titolo di questo esperimento nella scheda "TITLE". Fai clic su "OK".
    8. Tipo "getprosol" nella riga di comando per ottenere i parametri standard per la sonda NMR corrente e solvente.
    9. Ripetere passaggio 2.1.7 per 13 C, selezionare la sequenza di impulsi "C13IG" nella scheda "sperimentale" per la 1D 13 C inversa gated disaccoppiato esperimento.
    10. Tipo "getprosol" nella riga di comando per ottenere i parametri standard per la sonda NMR corrente e solvente.
    11. Digitare il comando "atma" per eseguire la sintonizzazione automatica e la congruenza della sonda per entrambi i nuclei di carbonio e protoni.
    12. Eseguire gradiente unidimensionale spessoramento per ottenere un campo magnetico molto omogenea, e quindi forma di linea ottimale per i segnali NMR.
      1. Utilizzare la procedura automatica standard per 1D spessoramento, semplicemente sequenzialmente eseguire i comandi "qu topshim 1dfast ss", "qu topshim tuneb ss," e "qu topshim rapporto" sulla linea di comando.
  2. ottimizzazione dei parametri
    1. calibrazione impulso a 90 °
      1. Creare un nuovo set di dati per 1 H (vedere i passi 2.1.7 e 2.1.8).
      2. Digitare il comando "paropt" sulla riga di comando per avviare il programma di automazione per la calibrazione del PUL 90 °SE. Selezionare durata dell'impulso, p1, come il parametro da modificare.
      3. Iniziamo con "2" ms come valore iniziale di p1, immettere "2" ms incrementi ed eseguire esperimenti "16".
      4. Creare un nuovo set di dati per 13 C (vedere fase 2.1.9) e ripetere il processo per 13 C nuclei (vedere i passi 2.2.1.2 e 2.2.1.3).
    2. T 1 misura misurata con il metodo nullo 16 per 1 H
      NOTA: Il metodo nullo utilizza la sequenza di impulsi inversion recovery, consistente in seguito a 180 ° impulso da un ritardo (tau), per consentire il rilassamento lungo l'asse z ed una finale di 90 ° impulso che crea la magnetizzazione trasversale osservabile.
      1. Creare un nuovo set di dati per 1 H (vedere i passi 2.1.7 e 2.1.8).
      2. Tipo "PULPROG t1ir1d" per modificare la sequenza di impulsi per l'esperimento di inversione di recupero.
      3. Digitare i seguenti comandi sul command linea per impostare la larghezza spettrale in ppm, al centro del trasmettitore RF, il numero di scansioni del numero di dummy scan e il numero di punti di dati "SW 8", "O1P 3.8", "ns 2" ", ds 2" e "td 64K".
      4. Tipo "p1 (valore)" e inserire i valori di durata di impulso a 90 ° come determinato dalla taratura impulso (vedi punto 2.2.1) e tipo "p2 (valore)" per l'impulso 180 ° (il valore di durata per i 180 ° impulso è la durata dell'impulso di 90 ° moltiplicato per due).
      5. Impostare il ritardo di riciclo per un valore molto grande, come ad esempio 10 s digitando "d1 10".
      6. Impostare tau per un breve valore, ad esempio 10 ms, 10 ms digitando "d7" nella riga di comando.
      7. Impostare il guadagno del ricevitore (RG) ad un valore appropriato utilizzando il "rga" comando per il calcolo automatico del RG.
      8. Eseguire uno spettro digitando il comando "zg".
      9. Eseguire Fourier-trasformazione digitando "EFP"nella linea di comando.
      10. Eseguire la correzione di fase automatica digitando il comando "apk" nella linea di comando. Se le regolazioni di fase supplementari sono necessari per migliorare ulteriormente lo spettro, clicca sulla scheda "Processo", quindi fare clic sull'icona "Adjust Fase" per accedere alla modalità di correzione di fase.
        1. Utilizzare l'ordine zero (0) e icone primo ordine (1) rifasamento trascinando il mouse fino a quando tutti i segnali sono in modalità assorbimento negativo. Applicare e salvare i valori di correzione di fase facendo clic sul pulsante "Ritorno e Salva" per uscire dalla modalità di correzione di fase.
      11. Aumentare la tau finché tutti i picchi sono o positivi o annullato ripetendo le fasi 2.2.2.6-2.2.2.9. Per determinare il valore T 1, è sufficiente dividere il valore tau dove il picco viene reso nullo con ln2.
    3. T 1 misura misurata con il metodo nullo 16 per 13 C
      1. Creare un nuovo set di dati per 13 C (vedi punto 2.1.9)
      2. Tipo "PULPROG t1irpg" per modificare la sequenza di impulsi all'esperimento inversione recupero per nuclei di carbonio.
      3. Digitare i seguenti comandi sulla riga comandi per impostare la larghezza spettrale in ppm, al centro del trasmettitore RF, il numero di scansioni, il numero di scansioni fittizi e il numero di punti dati: "sw 200", "O1P 98" , "NS 8", "ds 2" e "td 64K".
      4. Tipo "p1 (valore)" e inserire i valori di durata di impulso a 90 ° come determinato dalla taratura impulso (vedi punto 2.2.1) e "p2 (valore)" di tipo per l'impulso a 180 ° (il valore di durata è 90 ° durata dell'impulso moltiplicato per due).
      5. Impostare il ritardo di riciclo per un valore molto grande, come ad esempio 100 s digitando "d1 100".
      6. Set tau per un breve valore, ad esempio 100 ms digitando "100ms d7" nella riga di comando.
      7. Impostare il receivguadagno er (RG) ad un valore appropriato utilizzando il "rga" comando per il calcolo automatico del RG.
      8. Eseguire uno spettro digitando il comando "zg".
      9. Eseguire Fourier-trasformazione digitando "EFP" nella linea di comando.
      10. Eseguire la correzione automatica di fase digitando il comando "apk" nella riga di comando. Se le regolazioni di fase supplementari sono necessari per migliorare ulteriormente lo spettro, cliccare sull'icona "Adjust Fase" e le icone di correzione di fase per ordine zero (0) e la fase (1) la correzione del primo ordine.
        1. Mentre cliccando sulla ordine zero e di fase del primo ordine icone correzione, trascinare il mouse fino a quando tutti i segnali sono in modalità assorbimento negativo. Applicare e salvare i valori di correzione di fase facendo clic sul pulsante "Ritorno e Salva" per uscire dalla modalità di correzione di fase.
      11. Aumentare la tau finché tutti i picchi sono o positivi o annullato ripetendo le fasi 2.2.3.6-2.2.3.9. Determinareil valore T 1, è sufficiente dividere il valore tau dove il picco viene reso nullo con ln2.
  3. Unidimensionale (1D) NMR Spectra
    1. 1 H-NMR
      1. Acquisizione dei dati NMR
        1. Andare al set di dati 1 H creato nel passaggio 2.1.7 e utilizzare il "pulse-acquisizione" sequenza di impulsi standard "zg", digitando "PULPROG zg" nella linea di comando.
        2. Digitare i seguenti comandi sulla riga comandi per impostare la larghezza spettrale in ppm, al centro del trasmettitore RF, il numero di scansioni, il numero di scansioni fittizi, il numero di punti di dati e la durata dell'impulso per un angolo di impulso a 90 ° : "sw 8", "O1P 3.8", "ns 2", "ds 2", "td 64K" e "P1 (come determinato mediante calibrazione impulsi)" (vedi punto 2.2.1).
          NOTA: i punti di dati 32K possono essere utilizzati per lo strumento a 500 MHz.
        3. Impostare un ritardo di rilassamento di 7 s per lo strumento a 500 MHz o 9 s per lo strumento 850 MHz digitando "7s D1" o "9s D1", rispettivamente nella riga di comando.
        4. Impostare il guadagno del ricevitore (RG) ad un valore appropriato utilizzando il "rga" comando per il calcolo automatico del RG.
        5. Tipo "baseopt digmod" di acquisire uno spettro con una migliore linea di base.
        6. Avviare l'acquisizione digitando il comando "ZG" pulse-acquisiscono nella linea di comando.
      2. Elaborazione dei dati NMR
        1. Tipo "si 64K" nella riga di comando per applicare zero riempimento e impostare la dimensione dello spettro reale 64K.
        2. Impostare la linea ampliare parametro a 0,3 Hz digitando "lb 0.3" nella riga di comando per applicare una funzione di ponderazione (decadimento esponenziale) con una linea ampliare fattore di 0,3 Hz prima trasformata di Fourier.
        3. Eseguire Fourier-trasformazione digitando "EFP" nel comandolinea.
        4. Eseguire la correzione automatica di fase digitando il comando "apk" nella riga di comando. Se le regolazioni di fase supplementari sono necessari per migliorare ulteriormente lo spettro, clicca sulla scheda "Processo", quindi fare clic sull'icona "Adjust Fase" e le icone di correzione di fase per ordine zero (0) e del primo ordine (1) correzione di fase .
          1. Mentre cliccando sulla ordine zero e di fase del primo ordine icone correzione, trascinare il mouse fino a quando tutti i segnali sono in modalità assorbimento positivo. Applicare e salvare i valori di correzione di fase facendo clic sul pulsante "Ritorno e Salva" per uscire dalla modalità di correzione di fase.
        5. Applicare una funzione del quarto ordine polinomiale per la correzione della linea di base sull'integrazione digitando il comando "abs n".
          NOTA: Questo assicura una linea di base spettrale piatta con una minima intensità.
        6. Spostamenti Relazione chimiche in ppm da TMS = 0). Clicca sulla calibrazione ( ". Ax Calibè "icona), e posizionare il cursore con la linea rossa sulla parte superiore del segnale TMS NMR (picco più vicino a 0). click sinistro e digitare '0'.
      3. L'analisi dei dati NMR
        1. Integrare la regione spettrale da δ 1,1 a Æ 0,6 così come i picchi a δ 4.98, δ 5.05 e δ 5.81 utilizzando l'icona "Integra" (nella scheda "Processo") e il momento clou ( "Definisci nuova Regione") icona. Sinistro del mouse e trascinate attraverso gli integrali.
          NOTA: Se non v'è bisogno di concentrarsi su una regione, fare clic sull'icona evidenziazione per disattivare e click sinistro e trascinare il mouse per ingrandire la regione. Per regolare l'intensità di soglia, utilizzare il pulsante centrale del mouse, se necessario. Fare clic sull'icona clou di nuovo a fare la funzione di integrazione attiva, per poi passare a quello successivo picco.
          1. Normalizzare la somma degli integrali di cui sopra per 100 facendo clic destro sul valore integrale che appaionos sotto il segnale e selezionare "Normalizzare somma di integrali". Immettere il valore "100" nella casella e fare clic su "Ritorno e Salva" per uscire dalla modalità di integrazione.
        2. Quando si utilizza BHT come standard interno, integrare il picco a δ 6.98 e impostare il pari integrante della millimoli di BHT per 0,5 mL di soluzione madre.
        3. Integrare i picchi di interesse (vedi punto 2.3.1.3.1) estendentesi 10 Hz da ciascun lato del picco, quando possibile.
        4. Procedere per eseguire 13 C-NMR acquisizione ed elaborazione spettri in modo simile.
    2. 13 C-NMR spectra
      1. Acquisizione dei dati NMR
        1. Andare al set di dati 13 C e utilizzando inversa gated sequenza di impulsi disaccoppiato, "ZGig" digitando "PULPROG ZGig" nella linea di comando.
          NOTA: Per eseguire un esperimento di carbonio con il decou standard a banda largasequenza di impulsi PLED, tipo "PULPROG zgpg" nella linea di comando.
        2. Digitare i seguenti comandi sulla riga comandi per impostare la larghezza spettrale in ppm, al centro del trasmettitore RF, il numero di scansioni, il numero di scansioni fittizi, il numero di punti di dati e la durata dell'impulso per un angolo di impulso a 90 ° : "sw 200", "O1P 95", "ns 16" "ds 2", "td 64K" e "P1 (come determinato mediante calibrazione impulsi)" (vedi punto 2.2.1.4).
        3. Impostare un ritardo di rilassamento di 35 s per lo strumento a 500 MHz o 45 s per lo strumento 850 MHz digitando "35s D1" o "45s D1", rispettivamente nella riga di comando. Quando si utilizza BHT, ritardo di rilassamento dovrebbe essere di 50 s nello strumento a 500 MHz e 60 s nello strumento 850 MHz.
        4. Impostare il guadagno del ricevitore (RG) ad un valore appropriato utilizzando il "rga" comando per il calcolo automatico del RG.
        5. Tipo "baseopt digmod" nella riga di comando di acquisire uno spettro wesimo migliorata basale.
        6. Avviare l'acquisizione digitando il comando "ZG" pulse-acquisiscono nella linea di comando.
      2. Elaborazione dei dati NMR
        1. Tipo "si 64K" nella riga di comando per applicare zero riempimento e impostare la dimensione dello spettro reale 64K.
        2. Impostare la linea ampliare parametro a 1,0 Hz digitando "lb 1.0" nella riga di comando per applicare una funzione di ponderazione (decadimento esponenziale) con una linea ampliare fattore di 1,0 Hz prima trasformata di Fourier.
        3. Eseguire Fourier-trasformazione digitando "EFP" nella linea di comando.
        4. Eseguire la correzione automatica di fase digitando il comando "apk" nella riga di comando. Se le regolazioni di fase supplementari sono necessari per migliorare ulteriormente lo spettro, clicca sulla scheda "Processo", quindi fare clic sull'icona "Adjust Fase" e le icone di correzione di fase per ordine zero (0) e del primo ordine fase (1) Correzione .
            NOTA: Per gli spettri di carbonio registrato su frequenza di Larmor di 214 MHz (lo strumento 850 MHz) la correzione degli errori dipendenti dalla frequenza (primo ordine) può essere impegnativo e richiede tempo per gli utenti meno esperti a causa delle grandi effetti off-risonanza del 90 ° impulso.
        5. Applicare una funzione del quarto ordine polinomiale per la correzione della linea di base sull'integrazione digitando il comando "abs n" nella riga di comando.
        6. Spostamenti Relazione chimiche in ppm da TMS = 0). Clicca sulla calibrazione ( "Calib. Asse") l'icona, e posizionare il cursore con la linea rossa sulla parte superiore del segnale NMR a cui fare riferimento. Click sinistro e digitare "0".
      3. L'analisi dei dati NMR
        1. Integrare la regione spettrale da 175 a δ Æ 171 utilizzando l'icona "Integra" (nella scheda "Processo") e il momento clou ( "Definisci nuova Regione") icona. Sinistro del mouse e trascinate attraverso gli integrali.
          NOTA: Se non v'è bisogno di concentrarsi su una regione, fare clic sull'icona evidenziazione per disattivare e click sinistro e trascinare il mouse per ingrandire la regione. Fare clic sull'icona clou di nuovo a fare la funzione di integrazione attiva, per poi passare a quello successivo picco.
          1. Impostare l'integrale al 100 facendo un clic destro sul valore integrale che appare sotto il segnale e selezionare "Calibrare attuale Integrale". Immettere il valore "100" nella casella e fare clic su "Ritorno e salva" per uscire dalla modalità di integrazione.
        2. Quando si utilizza BHT come standard interno, integrare il picco a δ 151.45 e impostare il pari integrantele millimoli di BHT per 0,5 ml di soluzione di riserva.
        3. Integrare i picchi di interesse estendentesi 5 Hz da ciascun lato del picco (vedi punto 2.3.2.3.1).

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Representative Results

1 H e 13 C NMR Gli spettri sono stati raccolti per olio di pesce integratori disponibili in commercio utilizzando due strumenti NMR; un 850 MHz e uno spettrometro a 500 MHz. Questi spettri possono essere utilizzati per la determinazione quantitativa di componenti di olio di pesce, come l'acido docosaesaenoico (DHA) e acido eicosapentaenoico (EPA), come pure altri composti come n -1 catene acile e importante indice nutrizionalmente come il n -6 / n -3 rapporto. La quantificazione può essere eseguita anche senza l'uso di uno standard interno, tuttavia, i risultati quantitativi devono essere espressi come percentuali molari relative. Quando i dati devono essere espressi in valori assoluti (mg / g), è richiesto uno standard interno. I risultati ottenuti mediante NMR sono altamente riproducibili con deviazioni standard relative (RSD) variano dallo 0,3% al 2% per l'analisi 13 C NMR e dal 0,5% al 2,5% per l'analisi 1 H NMR, a seconda t egli lipidi. Il RSD leggermente superiore per 1 H NMR si osserva spesso causa spettri protonici tendono ad essere sovraffollati, che colpisce l'accuratezza dell'analisi, soprattutto per risonanze che hanno un segnale più basso rispetto al rumore (S / N). è stato trovato un ottimo accordo tra l'850 MHz e lo strumento a 500 MHz con RSD vanno dal 1% al 4%. Sono stati osservati relativamente alte RSD (fino a 8%) quando si confrontano i risultati ottenuti con 1 H e 13 C, specialmente per i composti che appaiono in concentrazioni inferiori come n -1 catene acile. spettroscopia NMR è stato precedentemente convalidato come uno strumento per l'analisi dei lipidi, compresa la determinazione di alcuni componenti di olio di pesce. I risultati hanno mostrato che è in buon accordo con i metodi tradizionali, come GC 17, 18.

Analisi 1 H NMR

"xfig"> Figura 1 confronta gli spettri 1 H NMR acquisiti su (A) un 850 MHz e (B) uno strumento 500 MHz. Lo spettro 850 MHz è caratterizzato da una maggiore risoluzione, tuttavia i principali componenti di olio di pesce tra cui DHA, EPA, e n -6 / n -3 rapporto può anche essere determinata dallo spettro 500 MHz. I segnali 1 H-NMR di acidi grassi di olio di pesce che possono essere utilizzati per scopi di quantificazione sono mostrati in Tabella 1, mentre l'assegnazione completa NMR dello spettro 1 H NMR di olio di pesce può essere trovato altrove 19.

1 H NMR ha dati affidabili per la quantificazione della quantità totale di n -3, n -6, DHA, acidi grassi trans, n -1 catene acile e acidi grassi saturi (SFA). Per l'analisi 1 H NMR, l'uso di appropriati rapporti è necessario perché la maggior parte del signals appartengono ai gruppi di protoni che sono comuni a diversi acidi grassi e lipidi. Per questo motivo, nella maggior parte dei casi la concentrazione di acidi grassi in olio di pesce può essere determinata solo combinazione di vari segnali 1 H NMR, incorporato nei rapporti appropriati. Inoltre, queste equazioni contengono coefficienti aritmetiche che normalizzano il diverso numero di protoni associati a ciascun gruppo. Quando si utilizza uno standard interno deve essere considerata la seguente equazione: C = I / I è × N IS / N × A × MW / m (1), dove C è la concentrazione dell'analita in mg / g di olio di pesce, I è l'integrale di una risonanza che viene attribuito unicamente al lipide di interesse, i è l'area di un segnale protonica che appartiene unicamente allo standard interno, N è il numero di protoni del gruppo funzionale che viene analizzato,N è il numero di protoni dello standard interno che vengono utilizzati per l'analisi, A è la millimoli di standard interno, MW è il peso molecolare dell'acido grasso (espresso in esteri metilici), ed m è la quantità di olio di pesce espressa in g.

Esempio 1, DHA: La percentuale di DHA è determinato dall'equazione C DHA = ¾ I DHA / S, dove DHA è l'integrale del segnale a δ 2,39 appartenente alla H a e H ß protoni di DHA e S è la somma di integrali dei protoni metilici di SFA, n -6, n -9, n -3, acidi grassi trans più integrali dei picchi delle catene acile n -1 a δ 4.98, 5.05 e delta δ 5,81. L'integrale che DHA è Normazato moltiplicando per 3/4 in quanto corrisponde a quattro protoni, mentre l'S integrale corrisponde a tre protoni. 1 H NMR non è in grado di fornire informazioni sulla distribuzione posizionale degli acidi grassi sul backbone glicerolo e quindi può essere utilizzato solo per la quantificazione della quantità totale di acidi grassi. Il 1 H NMR di un supplemento di olio di pesce incapsulato ha mostrato che esso è costituito da 10,5% di DHA. La concentrazione di DHA nello stesso campione utilizzando BHT è risultata essere 105.23 mg / g. Questi valori sono molto vicini ai valori ottenuti con 13 C NMR (vedi esempio 2 per analisi 13 C).

Esempio 2, n -1 acile catene: La concentrazione di catene acile n -1 è dato dal rapporto C n-1 = 3 I n-1 / S, dove n-1 è l'integrale del segnale a δ 5.818. Questosegnale corrisponde ad un protone e quindi deve essere normalizzato moltiplicando per tre. Quando si utilizza BHT, n -1 catene acile sono determinati dall'equazione C n-1 = 2 I n-1 / I BHT. I risultati non possono essere espressi in mg / g perché il MW di n -1 catene acile è sconosciuto.

Esempio 3, n -6 / n -3 rapporto: Questo indice importante può essere calcolata dal rapporto delle intensità normalizzate della risonanza a δ 2.77, che corrisponde ai protoni bis-allilici di n -6 catene acile (due protoni) sopra la tripletta a δ 0,97 che appartiene agli acidi grassi n -3 corrisponde a tre protoni. La relazione è C n-6 / C n-3 = 3/2 I A / I B, dove A e B sono gli integrali dei segnalia δ rispettivamente 2,77 e 0,97 δ,. n -6 acidi grassi sono determinati dal rapporto C n-6 = 3 / 2I n-6 / S, dove n-6 è solidale dei protoni bis-allilici a δ 2.77.

Esempio 4, acidi grassi trans: Acidi grassi trans può essere calcolato dall'equazione C trans = I trans / S, dove trans è l'integrale del segnale a δ 0.91. Il presente campione conteneva 3,07% di acidi grassi trans, come determinato mediante 1H NMR utilizzando lo strumento 850 MHz. Lo stesso campione analizzato in uno strumento a 500 MHz è stata rilevata la presenza di 3,03% di acidi grassi trans.

Esempio 5, acidi grassi saturi (SFA): La concentrazione di SFA può essere calculated dall'equazione C SFA = S - C n-3 - C n-6 - C n-9 - C n-1 - C trans. n -9 acidi grassi (principalmente acido oleico) può essere quantificato secondo l'equazione C n-9 = (3/4 Q - 3/2 I n-6) / S, dove Q è l'integrale dei protoni allilici di n -6 e -9 n δ a 2,01. La quantità di SFA in un campione di olio di pesce disponibile in commercio è risultato essere del 36,1%. Lo stesso campione analizzato con 13 C NMR risulta contenere 33,8% SFA. SFA rappresentano un gruppo di vari FA (es stearico e palmitico) con diverso MW e quindi la loro concentrazione se l'olio di pesce non può essere espressa in mg / g.

Esempio 6, steroli totali: La quantità di steroli totali (libero e esterificato) può essere determinata dal signal dei protoni metilici al carbonio 18 che compare a δ 0.68, utilizzando l'equazione C = I STE / S. Il rapporto molare di steroli totali in un campione di olio di pesce commercialmente disponibile è risultata essere 0,32%. BHT può essere utilizzato anche per la determinazione della concentrazione assoluta di steroli. I principali steroli in olio di pesce sono il colesterolo e vitamina D (o il suo precursore 7-deidrocolesterolo) e sono spesso aggiunti nei supplementi. Questi composti hanno un MW molto simile. Pertanto, i risultati possono essere espressi in mg / ge sono calcolati secondo l'equazione C = 2/3 I STE / I è un × MW STE / m, dove MW STE è la massa molecolare (386) di colesterolo, che costituisce la maggior parte della frazione sterolica in olio di pesce 20. La quantità di steroli in uno stesso campione utilizzando BHT era 3,8 mg / g di olio di pesce. La determinazione individuale di colesterolo (δ 0,678) è fattibile su uno strumento 850 MHz dopo l'applicazione di una funzione finestra di miglioramento della risoluzione.

Analisi 13 C NMR

La figura 2 illustra gli spettri 13 C NMR acquisiti su (A) un 850 MHz e (B) uno strumento 500 MHz nell'area carbonio carbonilico. I due spettri sono molto simili e possono fornire la stessa quantità di informazioni. Lo spettro NMR 13 C può essere utilizzato con successo per l'analisi di acidi grassi aggiuntivi quali acidi eicosatetraenoic (ETA) stearidonico (SDA) e, comunque più scansioni sono necessari per campioni in cui questi acidi sono in concentrazioni inferiori. Gli spettri 13 C sono caratterizzati da elevata risoluzione a causa del grande larghezza spettrale e l'applicazione di disaccoppiamento a banda larga, cheelimina l'effetto dell'accoppiamento scalare e produce singoletti. Per questo motivo, v'è limitata sovrapposizione anche quando si utilizza uno strumento di 500 MHz.

Lo spettro NMR 13C è molto più informativo rispetto allo spettro H 1 NMR e può fornire dati quantitativi più completi perché meno sovrapposizione segnale è osservato (Figure 1 e 2). La regione spettrale più utile dello spettro 13 C è la regione carbonio carbonilico perché fornisce informazioni quantitative per un gran numero di acidi grassi e per la loro distribuzione posizionale sullo scheletro glicerolo 19, 21, 22. L'area gruppo metilico da δ 14,5 a 13,5 delta può essere utilizzato per la rapida determinazione della quantità totale di n -3, n -6, n -9 e grassi saturiacidi (AFS), così come gli acidi grassi trans. Tuttavia, nello spettrometro NMR a 500 MHz, v'è una sovrapposizione parziale del n -6 e n -9 acidi grassi saturi (SFA). L'applicazione di una funzione finestra per l'aumento risoluzione può risolvere questo problema, anche se lo strumento 850 MHz è ancora considerato una soluzione più affidabile. La regione olefinica dello spettro di carbonio può essere utilizzato per la quantità totale di n -3 e n -1 catene acile, nonché per la determinazione degli acidi grassi individuali come DHA, EPA, acido arachidonico (AA), linolenico (Ln) n -3, e acido oleico (OL) (vedi Tabella 2). 13 C NMR può essere applicata anche per la caratterizzazione di olio di pesce da altre fonti, come integratori ricchi di esteri etilici (EE) utilizzando i segnali di carbonio a δ 14.31 (metil) e δ 60.20 (metilene).

Per l'analisi del carbonio, acidi grassi possono essere determined dividendo l'integrale delle appropriate alifatici, olefinico e segnali carbonilici con l'integrale totale di tutte le catene acile, secondo la relazione generale C = I / S (2), dove C è la concentrazione dell'analita in moli (% ), I è l'integrale di una risonanza che viene attribuito unicamente al lipide di interesse, e S è l'integrale del segnale totale (s) che rappresenta il contenuto totale di lipidi del campione. S integrale totale di catene acile può essere determinata integrando la regione da 175 a δ Æ 171 ed è impostato a 100.

Quantificazione di acidi grassi in mg / g di olio di pesce viene eseguita utilizzando uno standard interno sulla base della seguente relazione: C = I / I è × A × MW / m (3), dove C è la concentrazione dell'analita in mg / gdi olio di pesce, I è l'integrale di una risonanza che viene attribuito unicamente al lipide di interesse, i è è l'area di un segnale di carbonio che appartiene unicamente allo standard interno, A è la millimoli di standard interno, MW è il molecolare peso del composto di interesse (per gli acidi grassi espressi in esteri metilici), ed m è la quantità di olio di pesce in g. I segnali 13 C-NMR di acidi grassi di olio di pesce che possono essere utilizzati per scopi di quantificazione sono riportati nella Tabella 2, mentre la cessione completa NMR dello spettro 13 C NMR può essere trovato altrove 19.

Esempio 1, EPA in posizione -2 sn: La quantità (%) di EPA in posizione sn -2 viene calcolato dividendo l'integrale del segnale a δ 172.56 da S. La quantità di EPA nella posizione sn -2 in commercially campione disponibile è risultata essere del 3,4% utilizzando lo strumento 850 MHz. Utilizzando la stessa spettrometro e BHT come standard interno, la quantità di EPA nella posizione sn -2 espressa in mg / g di olio di pesce è 29.73 mg / g. Lo stesso campione analizzato in uno strumento 500 MHz risulta contenere 3,6% o 31.39 mg / g di EPA in sn -2 posizione. Risultati simili possono essere ottenuti dal calcolo dei coefficienti molecolari relativi dei APE sn -2 usando uno spettro completamente disaccoppiato. Questo perché il carbonio carbonilico di EPA risente protone disaccoppiamento nella stessa misura trascurabile degli altri carboni carbonile, che sono utilizzati come riferimento. Tuttavia, le grandi deviazioni vengono osservate quando usando BHT, perché il carbonio di BHT a δ 151.45, che viene utilizzato per la quantificazione, riceva una diversa valorizzazione NOE rispetto ai carboni carbonilici di acidi grassi. Per questo motivo, lo spettro completamente disaccoppiato dovrebbe essere evitato utilizzando standard interni o integrare carbons con diverse molteplicità.

Esempio 2, la quantità totale di DHA: La quantità totale (%) di DHA sia calcolato aggiungendo le quantità di DHA in sn -1,3 e -2 posizione sn come determinato dai segnali NMR a δ rispettivamente 172,48 e δ 172.08,. Lo stesso campione analizzato con 1 H NMR (vedi esempio 1 di 1 analisi H) risulta contenere 10,3% DHA secondo analisi 13 C NMR. La quantità di DHA può anche essere espresso in mg / g utilizzando uno standard interno e Equazione 3. La quantità totale di DHA era 103.25 mg / g.

Esempio 3, la quantità totale di SDA: La quantità totale (%) del SDA è determinato sommando gli integrali dei segnali a δ 172.99 e 172.60 δ che appartengono ai carboni carbonilici di SDA in posizione sn -1,3 esn -2, rispettivamente, dividendo la somma di S. Il campione analizzato risulta contenere 3,93% SDA o 34.54 mg / g.

Esempio 4, n -3 Ln: n -3 Ln (%) può essere calcolato dividendo l'integrale del segnale a δ 131.85 con l'S integrale. Il rapporto molare di n -3 Ln nel campione di olio di pesce analizzato era 0,7%. La concentrazione assoluta usando BHT è stato calcolato come 5,5 mg / g.

Esempio 5, acidi grassi trans: Il rapporto molare di acidi grassi trans è determinato dividendo l'integrale del segnale a δ 13.80 con S. L'analisi dello stesso campione che è stato analizzato con 1 H NMR e si è rivelata essere 3,07% di trans FA, è stata anche analizzata con 13 C NMR e il suo contenuto di acidi grassi trans è risultato essere 3,42%. Tlui 13 C NMR analisi dello stesso campione su uno strumento a 500 MHz ha mostrato un contenuto di 3,64% di acidi grassi trans. La quantità di trans FA in mmol / g di olio di pesce può essere determinata utilizzando BHT come standard interno e l'equazione C = I / I è × A / m, ma i risultati non possono essere espressi in mg / g perché il picco a δ 13.80 corrisponde a vari acidi grassi trans, trans principalmente DHA ed EPA trans, con diversa MW.

Esempio 6, EE: La concentrazione di EE in un campione di olio di pesce è calcolato dividendo l'integrale della zona spettrale da δ 60.50 a 60.00 delta, che corrisponde ai carboni metilenici del EE di vari acidi grassi, con S. L'analisi di un campione di olio di EE fish ha mostrato che consisteva di 100% EE. Va notato che in campioni di EE, ca EPAn siano calcolati dal picco carbonile a δ 173.60 o dal carbonio metilenico EE a δ 60.20, mentre DHA può essere calcolato utilizzando il segnale a δ 60.31 e / o il segnale δ 173.09.

Un elenco completo dei segnali diagnostici che possono essere utilizzati per scopi di quantificazione con 13 C e 1 H NMR si trova nelle Tabelle 1 e 2, rispettivamente, mentre una descrizione dettagliata delle equazioni che possono essere utilizzati per questa analisi può essere trovata altrove 19.

NMR può inoltre essere applicato per la valutazione dello stato di ossidazione di supplementi di olio di pesce. Figura 3 confronta l'spettri 1 H NMR di un campione di olio di pesce in due condizioni di ossidazione; esposizione al riscaldamento e l'esposizione a raggi ultravioletti (UV)leggero. ossidazione lipidica è un processo complicato, e la composizione dei prodotti di ossidazione dipende dalle condizioni di ossidazione. I principali prodotti di ossidazione sono idroperossidi 8,0-8,8), dieni coniugati idroperossidi 5.4-6.7), e aldeidi 9.0- 10).

Figura 1
Figura 1. L'analisi 1 H NMR. 850,23 (A) e 500,20 MHz (B) 1 H-NMR spettro di un integratore di olio di pesce in CDCl 3 soluzione. Sono mostrati i segnali NMR di EPA e DHA che possono essere utilizzati per la loro determinazione. Il picco a δ 0.97 può essere utilizzato per la determinazione della quantità totale di acidi grassi n -3. La busta a δ 1,39-1,20 viene ritagliata, come appartiene ai protoni metilenici di tutti catena grassas e non può essere utilizzato per scopi di identificazione o di quantificazione. Lo spettro NMR 1 H è caratterizzata da una larghezza spettrale ristretta (SW) rispetto allo spettro 13 C NMR, cioè dalle risoluzione spettrale inferiore. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. L'analisi 13 C NMR. 213,81 (A) e 125.77 MHz (B) 13 C-NMR spettro di un integratore di olio di pesce in CDCl 3 soluzione nella regione carbonile carbonio. Sono mostrati i segnali NMR di EPA e DHA sullo sn -1,3 e sn -2 posizione. Questi segnali possono essere usati per la determinazione quantitativa di EPA e DHA. Anche se la SPEctra registrato a 213.81 MHz sono caratterizzati da una maggiore risoluzione e sensibilità, gli spettri 125.77 MHz può essere utilizzata anche per la determinazione delle principali composti. L'applicazione del disaccoppiamento in C NMR esperimento 13 elimina l'effetto di accoppiamento scalare tra i nuclei di carbonio e idrogeno e quindi i segnali appaiono come singoletti rendendo l'analisi più facile rispetto allo spettro 1 H NMR. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Pesce ossidazione dell'olio. L'NMR Spettro 1 H di olio di pesce ossidato dipende dalle condizioni di ossidazione. Le risonanze attribuiti a idroperossidi 8,0-8,8), cSono mostrati dieni onjugated idroperossidi 5.4-6.7), e aldeidi. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ppm δ Protone Composto
0,677 CH 3 (18) Colesterolo
0,678 CH 3 (18) 7-deidrocolesterolo
0.88 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7.27 Hz n -9, catene acile SFA
0,883 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7.08 Hz n -6 catene acile
0,911 CH 2 CH 3 (t), J ω, 1, ω2 = 7.65 Hz Catene acile trans
0,973 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7.63 Hz n -3 catene acile
1.25 CH 2 CH 3 (t), J = 7,20 Hz esteri etilici
1.697 OCOCH2CH 2 (t), J H α, Η β = Hz catena acilica EPA
2.391 OCOCH 2 CH 2 (t) catena acilica DHA
2.772 CH = CHCH 2 CH = CH n -6 catene acile
2.81 CH = CHCH 2 CH = CH n -3 catene acile
3.593 3'a-CH 2 OCO Glicerolo di 1-MAG
3.722 3'a, 3217; b-CH 2 OCO (br) Glicerolo di 1,2-DAG
4,073 2'-CHOH (br) Glicerolo di 1,3-DAG
4.121 CH 2 CH 3 multipletto esteri etilici
4.173 1'B, 3'b-CH 2 OCO (dd) Glicerolo di 1,3-DAG
4,238 1'a-CH 2 OCO (dd) Glicerolo di 1,2-DAG
4.329 1'B-CH 2 OCO (dd) Glicerolo di 1,2-DAG
4.989 -CH = CH 2 cis (dd) n -1 catene acile
5,052 -CH = CH 2 trans (dd) n -1 catene acile
5.082 2'-CHOCO Glicerolo di 1,2-DAG
5,268 2'; -CHOCO Glicerolo di TAG
5.436 CH = CHCH 2 CH = CH 2 n -1 catene acile
5,818 -CH = CH 2 n -1 catene acile

Tabella 1: L'assegnazione dello spettro 1 H NMR. Il 1 H-NMR spostamenti chimici di segnali di acidi grassi di olio di pesce che possono essere utilizzati per scopi di quantificazione in CDCl 3 soluzione sono presentati. Gli spostamenti chimici sono misurati in ppm e forniscono informazioni sull'ambiente chimica dei nuclei.

ppm δ Carbonio
173.24 C1 SFA (SN -1,3)
172,21 C1 OL, LO (SN -1,3)
C1 ETA (SN -1,3)
173,13 C1 DPA (SN -1,3)
173,03 C1 SDA (SN -1,3)
172,97 C1 EPA (SN -1,3)
172,73 C1 ETA (SN -2)
172.69 C1 DPA (SN -2)
172.61 C1 SDA (SN -2)
172.56 C1 EPA (SN -2)
172,48 C1 DHA (SN -1,3)
172,08 C1 DHA (SN -2)
136,8 Cω1, n -1
131.85 Cω3 LN
130.37 C15 AA
130.11 C9 LN
130.06 C13 LO
129.54 C5 DHA sn -2
129.47 C5 DHA sn -1,3
128.94 C5 EPA
128.76 C6 EPA
128.45 C17 n -3
127.71 n -3
127.53 C4 DHA sn -2
127.5 C4 DHA sn -1,3
126.86 Cω4, ogni n -3
114.71 Cω2, n -1
60.08 Esteri DHA, etile
59.96 EPA, gli esteri etilici
59,95-59,85 Altri esteri FA, etile
33.48 C2 EPA sn -2
33.32 C2 EPA sn -1,3
31.44 C3 n -1
27.05 Allilico n -6
26.49 C4 EPA sn -1,3
26.47 C4 EPA sn -2
24.6 C3 EPA
24.48 C3 SDA sn -1,3
24.44 C3 SDA sn -2
14.27 Cω1, ogni n -3
14.13 Cω1, SFA
14.11 Cω1, OL
14.07 Cω1, LO
13.8 Cω1, trans FA

Tabella 2: L'assegnazione dello spettro 13 C NMR. Gli spostamenti chimici 13 C-NMR dei segnali di acidi grassi di olio di pesce che possono essere utilizzati per la quantificazione purpsistemi operativi in CDCl 3 soluzione sono presentati.

Supplemento Figura S1: Confronto tra il 13 C NMR spettri acquisiti utilizzando la banda larga standard di disaccoppiamento (A) e l'inverso gated disaccoppiamento (B) sequenze di impulsi. Gli spettri sono stati registrati per lo stesso campione con lo stesso numero di scansioni, elaborata con gli stessi parametri di processo e vengono indicati con lo stesso fattore di scala. Si prega di cliccare qui per scaricare questa cifra.

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Discussion

Modifiche e strategie per la risoluzione

Qualità spettrale. La larghezza di riga del segnale NMR e quindi la risoluzione dello spettro NMR è fortemente dipendente spessoramento, che è un processo per l'ottimizzazione della omogeneità del campo magnetico. Per le analisi di routine, 1D spessoramento è adeguata e non è necessario uno spessoramento 3D, dato che essa è stata eseguita da personale NMR su base regolare. Se questo non è il caso, una spessoramento 3D deve essere eseguita prima analisi utilizzando un campione contenente 0,6 ml di H 2 O: D 2 O (90:10). Per ottenere un migliore e più veloce spessoramento, il campione deve essere centrato nella regione di eccitazione / rilevamento della bobina a radiofrequenza (RF), utilizzando il calibro di profondità graduata, prima di essere inserito nel foro del magnete. Un altro fattore che influenza spessoramento gira il campione ad una velocità di rotazione di 10-20 Hz. Sebbene filatura il campione a questa velocità di rotazione migliora gli spessori radiali (X, Y, XY, XZ, YZ, X 2 -Y 2, ecc), è generalmente raccomandato per evitare la comparsa di bande laterali filatura del primo o ordine superiore. Tuttavia, quando si lavora su strumenti che operano in Larmor le frequenze inferiori a 400 MHz, filatura è raccomandato per esperimenti 1D NMR.

Risoluzione, nonché la sensibilità, sono influenzate dal guadagno del ricevitore valore (rg). bassi valori del guadagno del ricevitore riducono la sensibilità, mentre valori superiori appropriata trabocco causa del convertitore analogico-digitale (ADC). Risultati ADC overflow nei asimmetrica linea-forme ei segnali non possono essere usate per scopi quantitativi perché i primi punti del decadimento libero dell'induzione (FID) potrebbero essere persi. Nella maggior parte dei casi, il "rga" comando calcola un valore rg appropriato. Tuttavia, in alcuni casi, il valore rg calcolato dal software è superiore al valore ideale e v'è una distorsione nella forma Lorentziana del segnale NMR. Intal caso, l'utente dovrebbe immettere manualmente un valore minore rg digitando "rg (valore)" nella linea di comando. Un tipico valore RG per i campioni analizzati con questo protocollo è 8.

Spesso, quando si utilizza criogenicamente raffreddato sonde NMR con una qualità-alto fattore (fattore Q), un grande ritardo (tempo morto)> 200uS tra l'ultimo impulso e il periodo di rilevazione è necessario per evitare artefatti, come una gobba attorno frequenza del trasmettitore ed una laminazione in linea di base della gamma. Tuttavia, un ritardo tale causa un grande errore di fase del primo ordine negativo, che può anche introdurre un rotolamento basale e cali di grandi dimensioni intorno alla base dei segnali forti. In questi casi, una sequenza di impulsi spin-echo z ripristinata può essere usato per produrre spettri NMR con baseline significativamente migliorati, anche se una piccola riduzione sensibilità può verificarsi 23.

Fosfolipidi. Oltre alle analisi di olio di pescecampioni ricche di trigliceridi ed esteri etilici, NMR possono essere utilizzati per l'analisi dei campioni di olio di pesce ricchi di fosfolipidi (PL). Tuttavia, particolare attenzione è richiesta per tali campioni perché PLS formare aggregati, che possono causare una significativa riduzione della risoluzione spettrale e sensibilità. Per l'analisi di questi campioni, una miscela solvente di cloroformio deuterato: metanolo (CDCl 3: CD 3 OD) in un rapporto di 70:30 è richiesto per ottenere spettri di alta qualità.

Standard interno. BHT è stato scelto come standard interno in questo studio, perché è una molecola altamente simmetrico semplice 1 H e 13 C NMR e nessuno dei suoi picchi si sovrappongono con quelle di costituenti di olio di pesce. BHT ha un segnale nello spettro 1 H NMR, che appare come un singoletto a δ 6.97 e appartiene alle due protoni equivalenti aromatici (para - posizione rispetto al gruppo OH) e un segnale aδ 151.45 in C NMR Spettro 13 che appartiene al carbonio quaternario aromatici recanti il gruppo -OH. Entrambi questi segnali non hanno sovrapposizione con uno qualsiasi dei componenti di olio di pesce, e quindi può essere utilizzato per scopi di quantificazione. Altri composti come 1,2,4,5-tetracloro-3-nitrobenzene (TCNB) o cloruro di etilene possono essere utilizzati anche come standard interni alternative, tuttavia, sono caratterizzati da valori superiori T 1.

LIMITI DELLA TECNICA

La quantificazione di vari acidi grassi e lipidi negli integratori di olio di pesce è ottenuta attraverso l'integrazione delle appropriati segnali NMR diagnostici negli spettri 1D. Tali segnali devono appartenere a un componente specifico campione e devono avere alcuna interferenza con i segnali provenienti da altri composti. Questo può essere un problema per 1 H NMR poiché lo spettro 1 H NMR è caratterizzato da una bassa risoluzione a causa del breve intervallo di Cheturni MICAL. Inoltre, la presenza di accoppiamento scalare (J) produce multipletti e rende l'analisi più complicata. Ad esempio, gli esteri etilici (EE) possono essere quantificati utilizzando 1 H NMR dalla tripletta caratteristica (J = 7.20 Hz) del gruppo metilico a δ 1.25 e il multipletto a δ 4.12, che appartiene ai protoni metilenici del gruppo estere. Tuttavia, quando si utilizza strumenti NMR operanti in Larmor le frequenze inferiori a 850 MHz, l'analisi di EE usando 1 H NMR dovrebbe essere evitata a causa della parziale sovrapposizione del picco a δ 4.12 con il picco a δ 4.14 TGS, e la sovrapposizione di il segnale a δ 1.25 con l'ampio segnale dei protoni metilenici alifatici a δ 1,23-1,35. Sono stati osservati anche grandi deviazioni tra il 1 H e 13 C analisi di EPA in alcuni campioni, 13 C NMR era più vicino alla composizione dichiarata fornito da tegli produttore. Ciò è probabilmente dovuto alla sovrapposizione del segnale a δ 1.69, che viene utilizzato per l'analisi EPA, con segnali di altri composti che appaiono in alcuni tipi di integratori di olio di pesce. Ulteriori errori quantificazioni possono insorgere quando si utilizza uno standard interno grazie alla purezza incerto dello standard interno e da errori di pesatura.

L'analisi composizionale può essere espresso in concentrazioni molari relative senza l'uso di uno standard interno. Se i risultati devono essere espressi in concentrazioni assolute, per esempio come milligrammi di acido grasso per grammo di olio (mg / g), è richiesto l'uso di uno standard interno. Tuttavia, nei casi in cui il segnale NMR di interesse appartiene a più composti con pesi molecolari differenti, i risultati possono non essere espresse come mg / g, anche utilizzando uno standard interno. Inoltre, l'impiego di standard interno solito aumenta la lunghezza dell'analisi perché la s interna più comune tandards, come BHT, sono piccole molecole con elevata simmetria molecolare, che si traduce in lunghi tempi di rilassamento. Poiché il tempo di ripetizione (ritardo tra gli impulsi + tempo di acquisizione) viene impostato in base al più lungo tempo di rilassamento T 1 nel campione, l'uso di uno standard interno aumenterà la durata degli esperimenti poiché sono necessari lunghi ritardi tra gli impulsi. Questo è un fattore molto importante per analisi 13 C NMR causa della eccezionalmente lunga T 1 tempo di rilassamento di nuclei di carbonio. L'aggiunta di un composto paramagnetico come Cr (acac) 3 può ridurre efficacemente il tempo di rilassamento T 1. La concentrazione raccomandata di Cr (acac) 3 è di 0,75 mg / mL di soluzione. Concentrazioni maggiori di Cr (acac) 3 possono essere considerati per un'ulteriore riduzione di T 1, tuttavia, è richiesta cautela per evitare decrementi S / N a causa della linea allargamento.

S copi "> Sebbene il 13 C NMR è caratterizzato da una risoluzione spettrale molto più elevata rispetto a 1 H, la sensibilità dell'esperimento 13 C NMR è significativamente inferiore a causa della bassa abbondanza naturale (1,1%) ed il basso rapporto giromagnetico (67.26 10 6 rad s -1 T -1) di 13 C nuclei. Inoltre, i lunghi tempi di rilassamento T 1 di 13 C aumentano la lunghezza dell'analisi. Questo può essere un problema quando l'olio disponibile per l'analisi è limitata, in quanto un aumento numero di scansioni deve essere utilizzato per ottenere un segnale ragionevole rumore.

Limitazioni nella sensibilità e la risoluzione degli spettri NMR impediscono l'analisi di molti composti minori in olio di pesce che possono essere analizzati con altre tecniche come la GC. Ad esempio, 1 Η NMR è in grado di separare le singole steroli o acidi grassi (ad es palmitico e stearico), mentre 13 Cnon è in grado di determinare i composti che appaiono in concentrazione molto bassa in olio di pesce come l'acido miristico, dodecanoico e che si sovrappongono con i segnali di tutti gli acidi grassi saturi in δ 173.24 e δ 172,82. Sebbene l'aumento della quantità di campione che viene analizzato rende l'analisi di alcuni composti minori possibili, è necessaria cautela per campioni molto concentrati, a causa della loro maggiore viscosità. Soluzioni molto viscose contenenti più di 150 mg di olio deve essere evitata perché v'è una diminuzione di S / N dovuta alla linea allargamento causato dalle ridotte spin-spin T 2 tempi di rilassamento. Inoltre, ritardi più lunghi tra gli impulsi sono necessarie a causa del lungo T 1 e ci sono diversi problemi di spessoramento, e quindi in risoluzione.

Tutti i composti analizzati in olio di pesce con NMR possono essere quantificati simultaneamente in un'istantanea senza utilizzare alcuna procedura di separazione o di purificazione. Il un NMRALISI è rapido come lo spettro 1 H può essere registrato in meno di un minuto, mentre l'acquisizione 13 C NMR dura 10 min. Va notato, tuttavia, che ci sono alcuni fattori che influenzano il tempo di acquisizione dei dati. Specificamente, per 13 C NMR, il tempo di esecuzione 10 min può essere raggiunto solo senza l'impiego di standard interni, e con l'uso di sonde criogenicamente raffreddati, in cui la bobina RF e il preamplificatore vengono raffreddati e quindi il rumore termico è minimizzata. A 10-15 volte maggiore del tempo sperimentale dovrebbe essere previsto per analisi 13 C NMR quando la temperatura ambiente (convenzionali) vengono usate sonde.

Significative in relazione a metodi esistenti

spettroscopia NMR è risultato essere un potente strumento per la determinazione qualitativa e quantitativa della composizione di integratori di olio di pesce, e per la sua rapidness ha il potenziale di essere applicato per il throughput screening alto di un vasto nu mber dei campioni di olio di pesce. spettroscopia NMR è per definizione una metodologia quantitativa poiché l'area segnale è direttamente proporzionale al numero di nuclei che causano il segnale. Mentre chimici altamente tossici devono preparare campioni NMR, questo metodo è ecologico perché tali piccole quantità di questi agenti chimici (ad esempio CDCl 3) servono a differenza di altri metodi che richiedono grandi quantità di solvente per eluire i campioni. Inoltre, NMR ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi analitici. Nessuna calibrazione con standard è richiesto prima dell'analisi, e una minima preparazione del campione senza operazioni di separazione e purificazione viene generalmente adottato, che rende NMR uno strumento analitico molto veloce. Inoltre, 13 C NMR è la migliore metodologia disponibile per determinare la distribuzione posizionale di vari acidi grassi sullo scheletro di glicerolo. Mentre l'idrolisi enzimatica è stata utilizzata come alternativa non è sempre affidabile= "xref"> 24. Questo è di particolare importanza in quanto v'è un notevole interesse per lo studio della regiospecificity di vari acidi grassi negli alimenti, come si è scoperto che questo riguarda la loro funzione nella dieta umana 25, 26.

Applicazioni future

Nonostante l'accordo tra l'analisi NMR e l'etichetta dei prodotti, così come il fatto che ci sono alcuni studi che dimostrano accordo tra GC e NMR, riteniamo che gli studi intra-laboratorio più rigorosi e completi sono tenuti a esaminare l'accordo tra NMR e tradizionale metodologie per l'analisi dei costituenti di olio di pesce con un numero maggiore di campioni, dei prodotti di olio di pesce di diverse provenienze, e soluzioni standard certificate.

Un'altra importante applicazione futura di NMR in analisi olio di pesce sarà la determinazione dei prodotti di ossidazione. Oltre alla determinazionedei principali composti nell'olio di pesce, diversi prodotti di ossidazione primari e secondari nell'olio di pesce, come aldeidi e perossidi, sono presenti. 1 H NMR può essere potenzialmente applicato per la valutazione dello stato di ossidazione in olio di pesce, in diverse condizioni di ossidazione, come mostrato nella figura 3. La sfida più grande in questa analisi sarà l'assegnazione NMR e l'identificazione dei singoli prodotti di ossidazione. Progressi nella sensibilità del hardware NMR consentiranno inoltre l'identificazione dei singoli steroli mediante 13 C NMR. spettroscopia NMR può essere applicato anche per l'analisi del tessuto pesce nel suo complesso anche senza estrazione utilizzando alta risoluzione Magic Angle Spinning (HR-MAS) NMR.

I passaggi critici all'interno del protocollo

Due delle fasi più critiche che influenzano l'accuratezza di spettri NMR quantitativi coinvolgono la selezione di un impulso a 90 ° e l'uso di un ritardo tra puLSES ≥ 5 × T 1. L'angolo di impulsi è proporzionale alla larghezza di impulso che è un parametro NMR calibrato che dipende dalla strumentazione e il campione. Un impulso a 90 ° è essenziale per la conversione completa di longitudinale (z) magnetizzazione alla magnetizzazione trasversale osservabile (xy). È importante notare che prima della calibrazione impulso, la NMR sondato deve essere ben sintonizzato ed abbinati. Ciò consente di ottimizzare il trasferimento della potenza RF al campione e quindi massimizzare S / N e garantire disaccoppiamento efficace. La sintonizzazione sonda è principalmente influenzata dalla costante dielettrica del campione, quindi se ci sono differenze nella concentrazione tra i campioni, ripetere il processo di sintonizzazione per ciascuno. Il C NMR esperimento 1D 13 coinvolge sia 13 C e 1 H canali di sintonizzazione in modo automatico e la congruenza è necessario che entrambe nuclei.

Un ritardo tra gli impulsi più di 5 × T 1 garantisce la completa recovery della magnetizzazione netta al suo valore iniziale. Se tutte le risonanze nello spettro non hanno completamente rilassato prima di ciascun impulso, il segnale viene parzialmente soppressa e questo porta ad imprecisioni nel dell'integrazione. T 1 valore è un fattore critico che influenza la durata dell'esperimento e dipende l'intensità del campo magnetico nonché la viscosità del campione. Dato che la viscosità tra i campioni è simile, tempi T 1 rilassamento dovrebbero essere determinati per ciascuno strumento solo all'inizio della sessione di analisi.

Un'altra caratteristica importante dell'analisi olio di pesce con 13 C NMR è la selezione della sequenza di impulsi appropriata. Il metodo più affidabile per l'analisi quantitativa 13 C è l'inverso gated esperimento di disaccoppiamento, dove protone banda larga disaccoppiamento viene applicata solo durante il periodo di acquisizione e quindi non v'è alcun trasferimento di polarizzazione da 1 a 13 HC tramite l'effetto nucleare Overhauser (NOE). Tuttavia, mentre l'esperimento NMR completamente disaccoppiati può essere utilizzato per scopi quantitativi, cautela è necessaria quando si utilizza questo esperimento perché ci sono diversi fattori NOE tra atomi di carbonio con differenti molteplicità e confronto quindi solidale tra metile, metilene, metano e carbonilici carboni devono essere evitati. Nonostante ciò, quando solo carboni di molteplicità simile e ambiente chimico sono considerati nell'analisi, il metodo completamente disaccoppiato è affidabile. Un esempio di questo è carboni carbonilici di acidi grassi che sono stati trovati per avere differenze significative nei fattori NOE dopo disaccoppiamento 27. Inoltre, per carboni recanti protoni, l'esperimento completamente disaccoppiato fornisce maggiore sensibilità dovuta ai contributi NOE sull'intensità del segnale NMR. Un confronto tra spettri acquisiti con le due sequenze di impulsi viene mostrata in Figura S1.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dagli alimenti per la salute Discovery tema presso l'Ohio State University e il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari presso l'Ohio State University. Gli autori desiderano ringraziare l'impianto NMR presso l'Ohio State University e l'impianto NMR alla Penn State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avance III 850 NMR instrument Bruker
Avance III 500 NMR instrument Bruker
TCI 5 mm probe Bruker Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N)
BBO prodigy 5 mm probe Bruker Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P)
Spinner turbin Bruker NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place
Topspin 3.5 Bruker
deuterated chloroform Sigma-Aldrich  865-49-6 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol Sigma-Aldrich  128-37-0 purity >99%
Fish oil samples
NMR tubes New Era NE-RG5-7 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube
BSMS Bruker Bruker Systems Management System; control system device

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