Name: Glycoprotéomique de la matrice: Une extracellulaires Méthode danalyse Intact glycopeptides En utilisant la spectrométrie de masse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Découvrez une méthode de glycoprotéomique de la matrice extracellulaire pour identifier les sites de glycosylation dans les tissus cardiovasculaires. Cette technique permet d'étudier la fibrose tissulaire avec une résolution site-spécifique.

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JBB est un établissement de carrière Fellow au British Heart Foundation Centre du Roi. MM est Senior Fellow de la British Heart Foundation (FS / 13 / 2/29892). L&#39;étude a été soutenue par une initiative d&#39;excellence (centres de compétence pour une technologie d&#39;excellence - COMET) de l&#39;Agence pour la promotion de la recherche autrichienne FFG: « Centre d&#39;excellence en recherche en Vascular vieillissement - Tyrol, VASCage » (nombre K-projet 843536) et la NIHR recherche biomédicale centre basé à la Fondation nationale des services de santé de Guy et Saint-Thomas et confiance king College de Londres en partenariat avec College Hospital king.

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</ol>

Ce protocole a été optimisé protéomique au cours des dernières années dans notre laboratoire. Ici, nous avons utilisé le tissu cardiaque, mais seulement des ajustements mineurs peuvent être nécessaires pour son application à d&#39;autres tissus. Par exemple, le protocole d&#39;extraction doit prendre la cellularité du tissu en considération. tissu cardiaque est très cellulaire par rapport au tissu vasculaire. Lors de l&#39; utilisation du tissu vasculaire, la concentration de SDS peut être plus faible (soit 0,08%) et le temps de décellularisation est plus court (c. -à- 4 h) 11, 12, 13. L&#39;utilisation d&#39;enzymes de déglycosylation est crucial pour l&#39;analyse LC-MS / MS de composition ECM. Cependant, les temps d&#39;incubation doivent être ajustées pour différents types de tissus. Par exemple, l&#39; héparinase II durées d&#39;incubation prolongées requises à 25 ° C lors de l&#39; utilisation des échantillons tels que la peau, qui sont riches en protéines de la membrane basale (par exemple , l&#39; agrine, le perlecan) (données non présentées). L&#39; analyse directe des glycopeptides peut être effectuée sur un milieu conditionné à partir de cellules en culture 15. les étapes d&#39;enrichissement ne peuvent pas être nécessaires à l&#39;analyse de cette subproteome simplifiée. Extraits similaires à GuHCl, extraits de NaCl sont également prête pour l&#39;analyse des glycoprotéomique avec des modifications mineures. D&#39; autres protocoles d&#39;extraction pour l&#39; enrichissement de protéines d&#39;ECM peuvent être adaptées pour caractériser ECM glycopeptides 19, 20. Est le PTM glycosylation plus complexe 5. Identification indirecte des glycopeptides est réalisée par la détection de désamidée Asn avec 18 incorporé à une O NxT / S séquon. Désamidée Asn à d&#39;autres positions peuvent représenter des faux positifs. De même, la N-glycosylation doit être considérée dans le contexte des ontologies de protéines: les protéines intracellulaires contenant un séquon NxT / S ne seront pas glycosylée mais pourraient donner lieu à des faux positifs. Comme searc courantLes algorithmes de h ne permettent pas pour le criblage de PTM à des séquences prédéterminées ( à savoir Asn à NxT / S), le filtrage manuel des données est nécessaire. Identification de la présence / absence de glycosylation au niveau de ces positions peuvent être comparées entre les échantillons de la maladie et de contrôle. Il n&#39;y a pas d&#39; équivalent de l&#39; enzyme de PNGase F pour O-déglycosylation (c. -à introduire un décalage de masse sur la thréonine ou la sérine). Par conséquent, l&#39;identification de O-glycosylation est limitée à l&#39;analyse des glycopeptides directe. L&#39;analyse directe des glycopeptides est utilisée pour obtenir des informations de composition des sucres attachés aux protéines, mais ne fournit pas d&#39;information structurelle des glycanes. En outre, la composition glycane est le résultat de la synthèse et le traitement des glycanes après la sécrétion. Notre méthode d&#39;extraction en 3 étapes pour les protéines ECM ( « anglais Quickstep ») 6 a permis la caractérisation de l&#39;ECM dans une variété de tissus cardiovasculaires. Fractionnement du tissuen plusieurs extraits est nécessaire pour obtenir un protéome ECM simplifié tel que discuté ailleurs 6. protéines intracellulaires seraient autrement contribuer à une dynamique excessive des abondances de protéines dans les extraits qui entraveraient l&#39;identification des protéines ECM moins abondantes. De plus, les protéines intracellulaires portent O-glycosylations 5 qui compliqueraient l&#39; enrichissement de l&#39; ECM glycopeptidique et analyse ultérieure MS. D&#39; autres auteurs ont appliqué des méthodes d&#39;extraction similaires pour caractériser par exemple 21 poumon et les tissus du cartilage 10, mais ils n&#39;ont pas poursuivi l&#39;analyse de glycosylation. Une analyse antérieure de glycosylation a porté sur l&#39; identification des glycosites seulement, exigent le retrait de la glycane à partir du noyau de protéines, et ne peut pas évaluer O-glycosylation 22, 23. tableaux lectine et l&#39;enrichissement chimique sont disponibles pour l&#39;évaluation des typ glycaneses sur des échantillons biologiques en fonction de leur spécificité de liaison, mais ces techniques ne peuvent pas attribuer des types glycanes à des protéines spécifiques 24 ils ne peuvent pas évaluer les sites de glycosylation. Dans un premier temps, nous avons utilisé l&#39;électrophorèse sur gel avant LC-MS / MS de protéines ECM. Bien que la séparation de gel est utile pour obtenir des fractions protéiques simplifiées prêtant à une analyse LC-MS / MS, les derniers instruments offrent des vitesses de balayage plus rapides. Ainsi, on peut omettre l&#39;étape de séparation électrophorétique. Cela offre un avantage supplémentaire que de grandes protéines ECM, qui sont conservés au-dessus du gel, sont analysés de manière plus efficace. Toutefois, les informations concernant la Mw des protéines intactes est perdue. L&#39;étape d&#39;évaporation avant PNGase F déglycosylation assure l&#39; élimination complète de H 2 O régulier pour réduire au minimum les faux négatifs. Résidus de sucre ( à savoir des masses variables glycane) interfèrent avec la séparation par LC et compromettent l&#39; identification du peptide ultérieur par MS / MS. Un pun protocole-déglycosylation est également recommandé pour l&#39;analyse protéomique des protéines ECM ne porte pas sur la glycosylation. Proteomics peuvent fournir des informations sans précédent dans l&#39;ECM. Au - delà de support structurel, les glycanes attachés à l&#39;ECM sont essentiels pour l&#39; interaction hôte-pathogène, la communication cellule-cellule et la réponse immunitaire 25, à savoir le rejet d&#39;allogreffe après transplantation d&#39;organes. Glycoprotéomique sera un outil essentiel dans glycobiology.

Fibrose est une caractéristique de nombreuses maladies. Les fibroblastes prolifèrent et se différencient en direction de phénotypes très synthétiques, qui sont associées à la sécrétion et le dépôt exacerbé de la matrice extracellulaire (ECM) 1. Excessive dépôt ECM peut se poursuivre, même après la blessure initiale a diminué, ce qui conduit à une déficience fonctionnelle. Utilisation de la protéomique, nous avons déjà identifié plus de 150 ECM et des protéines associées ECM dans le tissu cardiaque 2, 3. Ils ne sont pas seulement des protéines structurales, mais aussi des protéines matricellulaires et protéases qui contribuent au remodelage continu et l&#39;adaptation dynamique du cœur. En particulier, de nombreuses protéines ECM sont glycosylés 4. Cette modification post-traductionnelle (PTM) implique l&#39;addition de résidus de sucre à certaines positions d&#39;acides aminés, et elle affecte le repliement des protéines, la solubilité, la liaison et la dégradation 5 </sup&gt;. Il existe deux principaux types de glycosylation qui se produisent chez les mammifères. (1) N-glycosylation se produit à l&#39;azote carboxamido des résidus asparagine (Asn) au sein de la séquence consensus Asn-Xaa-Thr / Ser, où Xaa est un acide aminé quelconque à l&#39;exception de la proline. (2) O-glycosylation, des résidus de sucre se fixent aux résidus de serine et la threonine (Ser, Thr) ou, dans une moindre mesure, à hydroxyproline et hydroxylysine. Bien que O-glycosylation peut se produire dans une variété de groupes de protéines, N-glycosylation est limitée à des protéines sécrétées ou des domaines extracellulaires de protéines membranaires 5. Cela rend N-glycosylation une cible lors de l&#39;étude de l&#39;ECM. Proteomics établit une nouvelle norme pour l&#39;analyse des changements de protéine dans la maladie. Jusqu&#39;à présent, la plupart des études protéomiques ont été axées sur les protéines intracellulaires 6. Ceci est principalement dû aux raisons suivantes. Tout d&#39;abord, les protéines intracellulaires abondantes entravent l&#39;identificationfication des composants ECM rares. Cela est particulièrement important dans le tissu cardiaque, dans lequel les protéines mitochondriales et myofilament représentent une proportion importante de la teneur en protéines 7. D&#39;autre part, les protéines ECM intégrales sont fortement réticulé et difficile à solubiliser. Enfin, la présence de PTM abondantes ( par exemple, glycosylation) modifie la masse moléculaire, la charge et les propriétés électrophorétiques des peptides, affectant à la fois la séparation et l&#39;identification par spectrométrie de masse en tandem de chromatographie liquide (LC-MS / MS). Ces dernières années, nous avons développé et amélioré l&#39;extraction séquentielle et la méthode d&#39;enrichissement pour les protéines ECM qui est compatible avec l&#39;analyse par spectrométrie de masse (MS) à la suite. La stratégie est basée sur incubations séquentielle. La première étape est effectuée avec du NaCl, un tampon ionique qui facilite l&#39;extraction des protéines ECM ECM associé et faiblement liée, ainsi que des protéines nouvellement synthétisées ECM. il is détergent libre, non dénaturant, sans perturbation des membranes cellulaires, et prête pour d&#39; autres tests biochimiques 8. Ensuite, la décellularisation est réalisée avec du dodécylsulfate de sodium (SDS). A ce stade, une faible concentration en SDS assure la déstabilisation de la membrane et la libération des protéines intracellulaires tout en empêchant la rupture des composants les plus solubles de l&#39;ECM non intégrés. Enfin, les protéines de la MEC sont extraites avec un tampon de chlorhydrate de guanidine (GuHCl). GuHCl est efficace pour l&#39; extraction des protéines fortement réticulée et les protéoglycanes de tissus tels que les tendons, le cartilage 10 9, les vaisseaux 11, 12, 13 et le coeur 2, 3. Nous avons appliqué ce fractionnement biochimique, en combinaison avec LC-MS / MS, pour explorer le remodelage de l&#39; ECM dans les maladies cardiovasculaires 2 <sup&gt;, 3, 11, 12, 13, 14. Les progrès récents dans la SEP comprennent de nouvelles méthodes de fragmentation, telles que des combinaisons de dissociation de collision énergie plus élevée (HCD) et de dissociation de transfert d&#39;électrons (ETD), qui permettent l&#39;analyse directe des glycopeptides intacts 3, 15. Nous décrivons ici une méthode pour préparer ECM pour l&#39;analyse MS qui permet l&#39;analyse de la composition des protéines, l&#39;identification des sites de glycosylation et la caractérisation des formes glycanniques. Par rapport aux analyses précédentes de l&#39; ECM 16 glycosylation, cette méthodologie permet l&#39;évaluation directe des changements dans la composition des profils de glycosylation d&#39;une manière spécifique à un site en utilisant MS. Nous avons appliqué cette méthode aux tissus cardiovasculaires. Cependant, il peut aldonc être appliqué, avec des modifications mineures, à l&#39;étude de l&#39;ECM dans d&#39;autres échantillons de tissus et peuvent fournir des informations sans précédent sur la biologie de l&#39;ECM.

<table><tbody><tr><td>Produits chimiques <fort>A.</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acétonitrile, grade MS&nbsp ;( ACN, C2H3N)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51101</td><td>5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéinase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>1.3,&nbsp ; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td></tr><tr><td>Phosphate disodique (Na2H2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Dithiotréitol (DTT, C4H10O2S2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>4.3</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, C10H16N2O8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>1.3, &nbsp ; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td></tr><tr><td>Éthanol (C2H6O)</td><td>VWR</td><td>437433T</td><td>2.2.1</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de guanidine (GuHCl, CH6ClN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3272</td><td>1.6.1</td></tr><tr><td>Glycérol (C3H8O3)</td><td>Acros organics</td><td>158920025</td><td>Suppl 1.1</td></tr><tr><td>H2O LC-MS Cromasolv</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39253-1L-R</td><td>Pendant toute la durée du protocole</td></tr><tr><td>H218O</td><td>Taiyo Nippon Sanso</td><td>FO3-0027</td><td>3.5</td></tr><tr><td>Hydroxylamine (HA, H3NO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td>6.4</td></tr><tr><td>Iodoacétamide (IAA, C2H4INO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3221</td><td>4.4</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 10x</td><td>Lonza</td><td>51226</td><td>1.3</td></tr><tr><td>Acétate de sodium (C2H3NaO2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7545</td><td>1.6.1</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>1.4.1, 3.2</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS, NaC12H25SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>466143</td><td>1.5.1</td></tr><tr><td>Bicarbonate de triéthylammonium (TEAB, C7H17NO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11268</td><td>4.7, 6.1</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique (TFA, C2HF3O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T62200</td><td>4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3</td></tr><tr><td>Thiourée (CH4N2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tris (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl])</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td>1.4.1, Suppl 1.</td></tr><tr><td>Urée (CH4N2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>B. Enzymes&alpha</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ; 2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase)</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0012)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>&beta ; 1,4-Galactosidase</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0004)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>&beta ;-N-Acétylglucosaminidase</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0013)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Chondroïtinase ABC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3667</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Endo-&alpha ;-N-acétylgalactosaminidase (O-glycosidase)</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0011)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Héparinase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6512</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Kératanase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6920</td><td>3.1</td></tr><tr><td>PNGase-F (N-glycosidase F)</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0001)</td><td>3.5</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Thermo Scientific</td><td>90057</td><td>4.7</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td> Commentaires</td></tr><tr><td>C. Kits de réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO spin filters&nbsp ;</td><td>Amicon, Millipore</td><td>10256744</td><td>5.9, Suppl 2</td></tr><tr><td>Macro SpinColumn C-18, plaque à 96 puits</td><td>Appareil de Harvard</td><td>74-5657</td><td>5.1</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex BisTris Gels d’acrylamide</td><td>Thermo-Scientific</td><td>NP0322PK2</td><td>Suppl 1</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>2.1.3</td></tr><tr><td>ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit</td><td>Merk Millipore</td><td>72103</td><td>7</td></tr><tr><td>Balise de masse tandem 0 (TMT0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>900067</td><td>6.2, 6.3</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>D. Équipement et logiciels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piège Acclaim PepMap100 C18, 5 mm x 300 & micro ; m, 5 et micro ; m, 100 & Aring ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td>Suppl 3, 4</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap100 C18, 50 cm x 75 & micro ; m, 3 et micro ; m, 100 & Aring ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Moteur de recherche Byonic</td><td>Protein Metrics</td><td>Version 2.9.30</td><td>Suppl 5</td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano</td><td>Thermo Scientific</td><td>n/a</td><td>Suppl 3, 4</td></tr><tr><td>Source d’ions EASY-Spray&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES081</td><td>Suppl 4</td></tr><tr><td>EASY-Spray PepMap RSLC C18,&nbsp ; 50 cm x 75 &nbsp ; m, 2 et mu ; m, 100 & Aring ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES803</td><td>Suppl 4 Mascot</td></tr> Search <tr><td>Engine</td><td>Matrix Science</td><td>Version 2.3.01</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos Tribrid</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Suppl 4</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer Software</td><td>Thermo Scientific</td><td>Version 2.1.1.21</td><td>Suppl 3, 5</td></tr><tr><td>Picoview Nanospray Source</td><td>Nouvel objectif</td><td>550</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Q Exactive HF Spectromètre</td><td>de masse Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td><td>Suppl 3 Savant</td></tr><tr><td>SpeedVac Concentrateur</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11</td></tr><tr><td>Logiciel d’échafaudage</td><td>Logiciel Proteome&nbsp ;</td><td>Version 4.3.2</td><td>Suppl 3</td></tr></tbody></table>

glycoprotéomique de la matrice: une extracellulaires méthode d&#39;analyse intact glycopeptides en utilisant la spectrométrie de masse

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

La fibrose est une caractéristique de nombreuses maladies cardio-vasculaires et est associée à la sécrétion et le dépôt exacerbé de la matrice extracellulaire (ECM). Utilisation de la protéomique, nous avons déjà identifié plus de 150 ECM et des protéines associées ECM dans les tissus cardiovasculaires. En particulier, de nombreuses protéines ECM sont glycosylée. Cette modification post-traductionnelle affecte le repliement des protéines, la solubilité, la liaison et la dégradation. Nous avons développé une extraction séquentielle et un procédé d&#39;enrichissement de protéines de la MEC qui est compatible avec l&#39;analyse par spectrométrie de masse en tandem de chromatographie en phase liquide suivant (LC-MS / MS) des glycopeptides intactes. La stratégie est basée sur incubations séquentielles avec NaCl, SDS pour décellularisation d&#39;un tissu, et le chlorhydrate de guanidine pour la solubilisation des protéines de la MEC. Les progrès récents dans LC-MS / MS comprennent des méthodes de fragmentation, telles que des combinaisons de dissociation de collision énergie plus élevée (HCD) et la dissociation de transfert d&#39;électrons (ETD), qui permettentl&#39;analyse de la composition directe des glycopeptides de protéines ECM. Dans le présent document, on décrit un procédé pour préparer l&#39;ECM à partir d&#39;échantillons de tissus. La méthode permet non seulement pour le profilage de protéines, mais aussi l&#39;évaluation et la caractérisation des glycosylation par analyse MS.

Un flux de travail schématique du protocole est fourni à la figure 1. protocole d&#39;extraction de l&#39;ECM L&#39;efficacité de l&#39;extraction peut être suivie par l&#39;exécution des aliquotes forment chaque extrait sur des gels d&#39;acrylamide Bis-Tris et en utilisant une coloration d&#39;argent pour la visualisation. La figure 2A montre la complémentarité du NaCl, du SDS et extrait GuHCl après extraction séquentielle. Ce QC permet d&#39;identifier des problèmes potentiels avec la qualité des échantillons tels que la dégradation excessive de protéines. Après extraction, les glycoprotéines de l&#39; ECM sont abondants dans les extraits GuHCl (figure 2B). déglycosylation Pour évaluer l&#39;efficacité de déglycosylation, un contrôle non déglycosylée doit être exécuté en parallel. Déglycosylation fois doivent être appropriés pour obtenir une élimination complète et homogène des résidus de sucre, comme illustré sur la figure 3A. La figure 3B montre un exemple représentatif d&#39;échantillons de manière efficace déglycosylées par l&#39;addition d&#39;enzymes pour l&#39; élimination des GAG et des enzymes déglycosylation qui ciblent les petits oligosaccharides N- et O-liés. glycoprotéomique Le protocole d&#39;évaluation de l&#39;occupation de NxT / S sequons améliore la couverture de la séquence protéique pour les glycoprotéines de l&#39; ECM après MS (Figure 3C) et permet un criblage initial de la présence de glycoprotéines. Cela permet de réduire le temps de recherche de glycopeptides, les bases de données peuvent être personnalisés pour contenir des glycoprotéines précédemment identifiés. fragmentation HCD-ETD est utilisé pour l&#39;identification et la caractérisation de la composition d&#39;oligosaccharides attachés à ECM g<html> lycoproteins. La figure 4A montre un spectre représentatif obtenu pour un peptide marqué avec 18 O après déglycosylation (analyse de glycopeptide indirect). La figure 4B est un exemple représentatif d&#39;un spectre obtenu après l&#39; analyse des glycopeptides intacts à partir d&#39; extraits de l&#39; ECM (analyse de glycopeptide directe). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig1.jpg" /> Figure 1: Vue d&#39; ensemble Méthode. (A) Après enrichissement séquentiel pour les protéines de la MEC, les analyses LC-MS / MS sont effectuées sur des extraits déglycosylées. (B) En variante, non déglycosylées extraits ECM sont en outre enrichies en glycopeptides. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2: Extraction des protéines ECM. (A) Les 3 extraits différents de la procédure d&#39;extraction séquentielle ( « Quickstep anglais ») sont complémentaires dans leur teneur en protéines. Alors que les extraits SDS sont enrichis en protéines intracellulaires, extraits GuHCl contiennent la majorité des protéines ECM. fractionnement réussie est visualisé par l&#39;autre motif de coloration à l&#39;argent. (B) des protéines de la MEC telle que la petite protéoglycanes riches en leucine décorine, le biglycane et mimecan sont détectés principalement dans les extraits GuHCl, avec peu de présence dans les extraits SDS et du NaCl. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig3.jpg" /> Figure 3. Analyse des Glycosylation. (A) des durées d&#39;incubation appropriées sont nécessaires pour la déglycosylation complète. L&#39;exemple montre l&#39;effet du temps d&#39;incubation lors de l&#39;enlèvement des chaînes de glycosaminoglycane à partir de la décorine glycoprotéine. (B) des glycoprotéines de l&#39; ECM sont décorées avec des chaînes glycosaminoglycane grandes et répétitives et N- court et diversifiés , et des oligosaccharides O-liés. Lane 1 sur chacune des immunoblots représente extraits cardiaques non traités. La piste 2 contient des extraits traités avec des enzymes qui digèrent les glycosaminoglycanes. Les échantillons dans la piste 3 contiennent, en outre, les enzymes pour l&#39;élimination des oligossacharides liés à O et N-. La galectine-1 est pas glycosylée, par conséquent, il n&#39;y a pas de changement dans la taille de la protéine. Adapté de Lynch M, et al. 4 (C) dans l&#39; analyse LC-MS / MS, les échantillons traités avec la PNGase-F en présence de H 2 18 O obtenir une meilleure couverture de séquence (%, sur le côté droit) par rapport aux échantillons non déglycosylées. réarche espaces verts représentent la couverture de séquence par LC-MS / MS. Les lignes en pointillés représentent rouges, glycosites, avec un nombre indiquant la position d&#39;acide aminé. La détection de glycosylation de décorine à la position Asn 211 (N, mis en évidence en gras) est représenté en détail à titre d&#39;exemple à la figure 4. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig4.jpg" /> Figure 4. Analyse glycopeptides par MS. (A) En utilisant une approche protéomique fusil de chasse sur les extraits enrichis ECM, glycopeptides peuvent être identifiés par la présence de asparagine déamidées dans sequons NxT / S et étiquetés avec 18 O. L&#39;exemple montre un spectre HCD MS / MS pour un peptide de décorine contenant le glycosylée précédemment Asn 211. Les données obtenues peuvent être utiliséespour créer une base de données personnalisée de glycoprotéines ECM. (B) la fragmentation HCD-ETD est utilisé pour analyser l&#39;extrait d&#39;ECM enrichi glycopeptidique. Le spectre ETD MS / MS permet la caractérisation de la composition glycanes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> A. solutions Stock </td><td></td></tr><tr><td> DTT (Dithiotreitol, C 4 H 10 O 2 S 2) </td><td> 100 mM de DTT dans ddH 2 O. 1 </td></tr><tr><td> EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique, C 10 H 16 N 2 O 8) </td><td> 250 mM d&#39; EDTA dans ddH 2 O, pH 8,0. </td></tr><tr><td> GuHCl (chlorhydrate de guanidine, CH 6 ClN 3) </td><td> 8 M GuHCl enddH 2 O. </td></tr><tr><td> IAA (iodoacétamide, C 2 H 4 INO) </td><td> 500 mM IAA dans ddH 2 O. 1,2 </td></tr><tr><td> Na acétate (acétate de sodium, C 2 H 3 NaO 2) </td><td> 1 M d&#39; acétate de Na 2 O dans ddH, pH 5,8. </td></tr><tr><td> NaCl (chlorure de sodium, NaCl) </td><td> 1 M de NaCl dans ddH 2 O. </td></tr><tr><td> Na dibasique de phosphate (phosphate disodique, Na 2 H 2 PO 4) </td><td> 1 M de phosphate de sodium dibasique jj H 2 O, pH 6,8. </td></tr><tr><td> SDS (dodécylsulfate de sodium, NaCl 12 H 25 SO 4) </td><td> 1% de SDS (35 mM) dans ddH 2 O. 3 </td></tr><tr><td> TFA (acide trifluoroacétique, C 2 HF 3 O 2) </td><td> 10% de TFA (1,2 M) dans ddH 2 O. </td></tr><tr><td> TEAB (bicarbonate de triéthylammonium, C 7 H 17 </sub&gt; NO 3) </td><td> 1 M TEAB en en ddH2O, pH 8,5 </td></tr><tr><td> Thiourée (thiourée, CH 4 N 2 S) </td><td> 3 M thiourée dans ddH 2 O. </td></tr><tr><td> Tris-HCl (Tris-chlorhydrate de (NH 4 O 11 C 3 [HCl]) </td><td> 100 mM de Tris-HCl à ddH 2 O, pH 7,5. </td></tr><tr><td> Urée (Urea, CH 4 N 2 O) </td><td> 9 M d&#39; urée dans ddH 2 O. </td></tr><tr><td> B. tampons de réaction </td><td></td></tr><tr><td> C18 tampon d&#39;équilibrage de nettoyage </td><td> 1% d&#39; ACN, 0,1% de TFA dans ddH 2 O </td></tr><tr><td> C18 tampon de lavage de la colonne de nettoyage </td><td> 80% d&#39; ACN, 0,1% de TFA dans H 2 O </td></tr><tr><td> C18 tampon d&#39;élution de nettoyage </td><td> 50% d&#39; acétonitrile, 0,1% de TFA dans ddH 2 O </td></tr><tr><td> Déglycosylation Tampon (4x) </td><td> 600 mM NaCl et 200 mM de phosphate de Na 2 O dans ddH, pH 6,8. </td></tr><tr><td> Tampon GuHCl 4 </td><td> 4 M de chlorhydrate de guanidine, l&#39; acétate de Na 50 mM et 25 mM d&#39; EDTA dans ddH 2 O, pH 5,8. Ajouter 1: 100 (v: v) de cocktail d&#39;inhibiteurs de protéinase avant utilisation. </td></tr><tr><td> Tampon NaCl 4 </td><td> 0,5 M de NaCl, 10 mM de Tris-HCl et 25 mM d&#39; EDTA dans ddH 2 O, pH 7,5. Ajouter 1: 100 (v: v) de cocktail d&#39;inhibiteurs de protéinase avant utilisation. </td></tr><tr><td> PBS (1x) </td><td> 1,7 mM KH 2 PO 4, 5 mM de Na 2 HPO 4, 150 mM de NaCl, pH 7,4. Ajouter 25 mM d&#39;EDTA et 1: 100 (v: v) de cocktail d&#39;inhibiteurs de proteinases avant utilisation. </td></tr><tr><td> un tampon d&#39;échantillon (4x) </td><td> 100 mM de Tris, 2% de SDS, 40% de glycerol, 0,02% de bleu de bromophénol dans ddH 2 O, pH 6,8. Ajouter 10% ß-mercaptoéthanol avant utilisation. </td></tr><tr><td> Tampon SDS 4 </td><td> 0,1% de SDS et 25 mM d&#39; EDTA dans ddH 2 O. Ajouter 1: 100 (v: v) de cocktail d&#39;inhibiteurs de proteinases befl&#39;utilisation du minerai. </td></tr><tr><td> C. enzymes </td><td></td></tr><tr><td> Chondroïtinase ABC 5 </td><td> 0,5 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> kératanase 5 </td><td> 0,1 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> Héparinase II 5 </td><td> 0,1 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> α2-3,6,8,9-neuraminidase (sialidase) 5 </td><td> 0,025 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> β1,4-galactosidase 5 </td><td> 0,015 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> ß-N-acétylglucosaminidase 5 </td><td> 0,25 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> Endo-α-N-acétylgalactosaminidase (O-glycosidase) 5 </td><td> 0,013 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> PNGase-F (N-glycosidase-F) 6 </td><td> 50 U / ml dans H 2 O 18 </td></tr><tr><td> trypsine </td><td> 0,01 ug / ul dans du tampon TEAB </td></tr><tr><td> Tableau NOTES. </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 1 Conserver la solution de stock congelé à -20 ° C. </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 IAA doit être conservé à l&#39; abri de la lumière. </td></tr><tr><td colspan="2"> 3 SDS cristallise facilement à &lt;20 ° C. Afin de faciliter la solubilisation du SDS à 1% (solution mère), réchauffer le tampon sous l&#39;eau chaude du robinet. </td></tr><tr><td colspan="2"> 4 tampons d&#39; extraction peuvent être stockés à température ambiante. Ajouter un cocktail à large spectre d&#39;inhibiteurs de protéinase comme indiqué avant l&#39;utilisation. </td></tr><tr><td colspan="2"> 5 Ces enzymes doivent être ajoutés au cours de la première étape de déglycosylation. </td></tr><tr><td colspan="2"> 6 PNGase-F doit être ajouté seulement au cours de la deuxième étape de déglycosylation. </td&gt; </tr></tbody></table> Tableau 1: Solutions mères, tampons de réaction et d&#39; enzymes. Ce tableau présente la composition de chaque solution mère et un tampon réactionnel requis pour l&#39;extraction et le traitement ultérieur (y compris les digestions enzymatiques) de protéines d&#39;ECM cardiaques avant l&#39;analyse MS.

Ce document décrit une méthode pour préparer des échantillons de tissus cardio-vasculaires pour l&#39;analyse MS qui permet (1) l&#39;analyse de la composition des protéines ECM, (2) l&#39;identification des sites de glycosylation, et (3) la caractérisation de la composition des formes glycanniques. Cette méthode peut être appliquée, avec des modifications mineures, à l&#39;étude de l&#39;ECM dans d&#39;autres tissus.

Glycoprotéomique de la matrice: Une extracellulaires Méthode d&#39;analyse Intact glycopeptides En utilisant la spectrométrie de masse

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

L'objectif général de ce protocole est d'analyser la composition en protéines de la matrice extracellulaire, y compris l'identification des sites de glycosylation et la caractérisation compositionnelle des formes de glycannes dans les tissus cardiovasculaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le processus de fibrose tissulaire, telles que la manière dont la glycostylation d'une matrice structurelle influence la fibrose tissulaire au cours des maladies cardiovasculaires. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle permet, contrairement aux protocoles antérieurs qui analysent les modifications globales de glycosylation, de caractériser la glycosylation au niveau de sites spécifiques des protéines de la matrice structurelle, offrant ainsi un outil pour des études mécanistiques ciblées ultérieures.Les procédures seront démontrées par le Dr Marika Fava et Mme Ferheen Baig de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, préparez tous les tampons d'extraction conformément au protocole décrit dans le texte. Ensuite, utilisez un scalpel pour découper de 20 à 50 milligrammes de tissu en trois ou quatre morceaux plus petits d'environ deux millimètres de taille.Placer le tissu haché dans un tube de 1,5 millilitre et ajouter 500 microlitres de PBS glacé. Laver le tissu cinq fois en utilisant 500 microlitres de PBS pour chaque lavage afin de minimiser la contamination par le sang. Transférer les échantillons lavés dans un tube de 1,5 millilitre à bouchon vissé et ajouter un volume de tampon de chlorure de sodium équivalent à 10 fois le poids du tissu.Vortexer à vitesse minimale pendant une heure à température ambiante. Ensuite, transférer l'extrait dans de nouveaux tubes de centrifugation et centrifuger à 16 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Laver brièvement les culots tissulaires obtenus avec un tampon frais de chlorure de sodium.Après cela, ajouter un volume de tampon SDS équivalent à 10 fois le poids du tissu et vortexer à une vitesse minimale pendant 16 heures à température ambiante. Transférer l'extrait dans de nouveaux tubes de centrifugation et centrifuger à 16 000 × g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Laver les culots obtenus avec de l'eau doublement distillée.Ajouter un volume de tampon chlorhydrate de guanidine équivalant à cinq fois le poids du tissu et vortexer à vitesse maximale pendant 72 heures à température ambiante. Transférer l'extrait obtenu dans de nouveaux tubes et centrifuger à 16 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après quantification des protéines, aliquoter 10 microgrammes dans un nouveau tube pour chaque échantillon, destiné à l'évaluation de l'occupation des sites de glycosylation, et 50 microgrammes dans un tube distinct pour l'analyse directe des glycopeptides.Ajouter 10 fois le volume d'éthanol à chacun et incuber toute la nuit à 20 degrés Celsius. Le lendemain, centrifuger les échantillons à 16 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot précipité.Ensuite, utilisez un concentrateur sous vide pour sécher les pastilles pendant 15 minutes à température ambiante. Ajoutez 10 microlitres de tampon de déglycosylation préparé à chaque échantillon. Placez les tubes d'échantillons à l'intérieur d'un tube conique de 50 millilitres et incubez-les à un angle de 45 degrés pendant deux heures à 25 degrés Celsius.Après cela, augmentez la température à 37 degrés Celsius et incubez pendant 36 heures avec agitation douce. Après centrifugation à 16 000 ×g pendant une minute, utilisez un concentrateur sous vide à température ambiante pendant 45 minutes pour évaporer l'eau. Resuspendez les échantillons séchés avec 10 microlitres d'eau marquée à l'O-18 contenant 50 unités par millilitre de PNGase F. Incubez pendant 36 heures à 37 degrés Celsius sous agitation constante, puis effectuez une digestion en solution par la trypsine pour tous les échantillons et procédez à la purification sur colonne C-18.Pour commencer, ajoutez 200 microlitres de méthanol dans chaque puits de la plaque à rotation C-18 afin d'activer la résine. Faites centrifuger à 1 000 × g pendant une minute. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d'ACN 80 % contenant 0,1 % de TFA dans l'eau dans chaque puits et centrifugez à 1 000 × g pendant une minute.Ensuite, ajoutez 200 microlitres d'une solution contenant 1 % ACN et 0,1 % TFA dans l'eau dans chaque puits, puis centrifugez pendant une minute à 1 000 × g. Répétez l'ajout de cette solution et la centrifugation deux fois. Après cela, chargez les échantillons dans les puits de la plaque à centrifuger et centrifugez à 1 500 × g pendant une minute. Rechargez le filtrat et répétez la centrifugation.Ensuite, ajouter 200 microlitres d'une solution contenant 1 % ACN et 0,1 % TFA dans de l'eau dans chaque puits, puis centrifuger à 1500 × g pendant une minute. Répéter l'ajout de cette solution et la centrifugation deux fois. Ensuite, ajouter 170 microlitres d'une solution contenant 50 % ACN et 0,1 % TFA dans de l'eau dans chaque puits et centrifuger à 1500 × g pendant une minute.Répétez cette addition et cette centrifugation une fois de plus. Utilisez un concentrateur sous vide pour sécher l'éluat combiné à température ambiante pendant deux heures. Conservez les échantillons séchés à 80 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation.Après cela, effectuez une analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem sur les échantillons destinés à l'évaluation de l'occupation des sites de glycosylation. Pour les échantillons destinés à l'analyse directe des glycopeptides, commencez par la marquage standard avec TMT zéro, tel que décrit dans le protocole. Pour commencer, ajoutez à chaque échantillon marqué avec TMT zéro (10 µL) 50 µL du tampon de liaison fourni.Ensuite, aliquoter 50 microlitres de suspension homogène de résine de capture des glycoconjugués dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et centrifuger pendant une minute à 2500 × g. Éliminer le surnageant et ajouter 60 microlitres de l'échantillon et de la solution tampon de liaison aux tubes contenant les pastilles de résine, en utilisant une pipette pour homogénéiser. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes sous agitation à 1200 tr/min. Après une centrifugation de deux minutes à 2 000 × g, transférer le surnageant dans de nouveaux tubes.Après cela, ajouter 150 microlitres de tampon de lavage dans chaque tube de résine à l’aide de la pipette pour mélanger et commencer le processus de lavage. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes sous agitation à 1200 tr/min. Après une centrifugation à 2500 × g pendant deux minutes, transférer chaque surnageant dans le tube de stockage de surnageant correspondant pour terminer le lavage.Répétez ce processus de lavage deux fois supplémentaires. Ensuite, ajoutez 75 microlitres de tampon d'élution et mélangez à l’aide d’une pipette. Incubez à température ambiante pendant cinq minutes en agitant à 1200 tr/min.Centrifuger à 2500 ×g pendant deux minutes et transférer chaque surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajouter 75 microlitres de tampon d'élution à l'aide d'une pipette pour homogénéiser, puis répéter l'incubation et la centrifugation des échantillons. Transférer chaque éluat dans le tube correspondant.Après centrifugation du liquide élué combiné pendant deux minutes à 2500 ×g, transférez chaque surnageant dans un nouveau tube afin d'assurer un retrait complet de la résine. Ensuite, utilisez un concentrateur sous vide pour sécher le liquide élué pendant deux heures à température ambiante. Resuspendez les glycopeptides séchés dans 15 µL d'une solution contenant 2 % ACN et 0,5 % TFA dans de l'eau doublement distillée.Ensuite, réaliser l'analyse par spectrométrie de masse conformément au protocole décrit dans le texte. Dans cette étude, les protéines de la matrice extracellulaire provenant de tissu cardiovasculaire sont préparées pour une analyse en spectrométrie de masse en tandem couplée à une chromatographie liquide afin de caractériser la composition de la matrice extracellulaire ainsi que pour des analyses glycopeptidiques directes et indirectes. La stratégie principale repose sur des incubations séquentielles avec du chlorure de sodium, du SDS et du chlorure de guanidine, suivies d'une analyse glycopeptidique directe ou indirecte.L'efficacité de l'extraction est surveillée sur des gels d'acrylamide bis-tris à l'aide d'une coloration argent pour la visualisation. Parmi les trois extraits analysés, la majorité des glycoprotéines de la matrice extracellulaire apparaît dans les aliquotes de chlorhydrate de guanidine. Les glycoprotéines de la matrice extracellulaire sont ornées de longues chaînes glucosaminoglycanes répétitives ainsi que d'oligosaccharides N-liés et O-liés courts et variés.L'efficacité de la déglycosylation est observée grâce à l'ajout d'enzymes qui digèrent les glycanes glycosaminiques ainsi que d'enzymes ciblant les oligosaccharides N-liés et O-liés plus petits. Les glycoprotéines sont ensuite identifiées par la présence d'asparagines déaminées marquées par de l'oxygène 18 au sein des séquons NXT ou NXS. Un spectre de masse tandem HCD représentatif d'un peptide de la décorine portant une asparagine déaminée à la position deux 11 est présenté ici.La fragmentation HCD ETD est ensuite utilisée pour analyser l'extrait de MEC enrichi en glycoprotéines. Le spectre de masse en tandem ETD permet la caractérisation de la composition des glycanes. Une fois maîtrisée, cette technique devrait prendre environ deux à trois semaines.Cette glycoprotéomique nous permet d'explorer la physiologie et la pathologie de la fonction de la fibrose, non seulement en fonction des modifications en protéomique, mais aussi selon la composition des sucres impliqués. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer des échantillons pour une étude sur la glycosylation des protéines par spectrométrie de masse. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les maladies cardiovasculaires, elle peut également être appliquée à d'autres pathologies associées à la fibrose, telles que les maladies respiratoires ou le cancer.

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