Glycoengineering metabólico del ácido siálico utilizando N-acil-modificado Mannosamines

Bioengineering

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Summary

Ácido siálico es una típica unidad de monosacárido encontrada en glicoconjugados. Participa en una gran cantidad de interacciones moleculares y celulares. Aquí presentamos un método para modificar la expresión de superficie ácido siálico celular con glycoengineering metabólico derivados de N- acetylmannosamine.

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Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

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Abstract

Ácido siálico (Sia) es un componente muy importante de los glicoconjugados, tales como N- y O- glicanos o glicolípidos. Debido a su posición en el termini no reductores de oligo - y polisacáridos, así como sus características químicas únicas, ácido siálico está implicado en una multiplicidad de las interacciones receptor-ligando diferentes. Modificando la expresión de ácido siálico en la superficie celular, por lo tanto se verá afectadas interacciones dependientes de ácido siálico. Esto puede ser útil para investigar las interacciones dependientes de ácido siálico y tiene el potencial para influir en ciertas enfermedades de una manera beneficiosa. Vía metabólica glycoengineering (MGE), puede modular la expresión de ácido siálico en la superficie celular. Aquí, las células, tejidos o incluso todo animales son tratados con C2 modificados derivados de N- acetylmannosamine (ManNAc). Estos aminos azúcares actúan como moléculas precursoras de ácido siálico y por lo tanto son metabolizados a las especies correspondientes de ácido siálico y expresó en glicoconjugados. Aplicando este método produce interesantes efectos sobre diversos procesos biológicos. Por ejemplo, puede reducir drásticamente la expresión de ácido polysialic (polySia) en células neuronales tratadas y por lo tanto afecta la diferenciación y el crecimiento neuronal. A continuación, os mostramos la síntesis química de dos de los más comunes derivados de C2 modificado N- acylmannosamine, N- propionylmannosamine (ManNProp) y N- butanoylmannosamine (ManNBut) y además mostrar cómo estos no natural aminos azúcares pueden aplicarse en los experimentos de cultivo celular. La expresión de especies modificadas el ácido siálico es cuantificada por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y más analizada mediante espectrometría de masas. Los efectos sobre la expresión de ácido polysialic son aclados mediante Western blot utilizando un anticuerpo ácido polysialic disponibles en el mercado.

Introduction

Ácido siálico es un monosacárido que normalmente se encuentran en el termini de glicoconjugados, tales como N- y O- glicanos o glicolípidos no reductores. Entre los monosacáridos, ácido siálico tiene algunas características químicas únicas. Tiene una red de la troncal 9 C-átomo, un grupo carboxílico en la posición C-1, deprotonated y tal modo negativamente cargadas bajo condiciones fisiológicas y una función amino en la posición de C-5. Aunque más de 50 que naturalmente ocurren variantes de ácido siálico se han caracterizado a fecha1, la forma predominante de ácido siálico encontrado en seres humanos es ácido de N- acetilneuramínico (Neu5Ac). Otros mamíferos también expresan altas cantidades de N- glicolilneurimínico ácido (Neu5Gc)2,3.

Debido a su posición expuesta en glicoconjugados, ácido siálico está involucrado en una gran cantidad de las interacciones receptor-ligando, por ejemplo, la Unión dependiente de hemaglutinina del virus influenza a host células4. Un epítopo de ácido siálico con importantes funciones biológicas, especialmente durante la embriogénesis y en el sistema nervioso, es el ácido polysialic. Polysialic ácido es un polímero de hasta 200 ácidos alfa siálica de 2,8-ligado. El portador de la principal proteína del ácido polysialic es la molécula de adhesión celular neural (NCAM). Expresión ácido Polysialic modula la característica adhesiva de NCAM en que expresión ácido polysialic disminuye la adherencia y aumenta la plasticidad del sistema nervioso5.

Cambios en la expresión de ácidos siálicos de (poli) en última instancia afectará a una multitud de interacciones biológicas diferentes. Esto puede usarse para estudiar procesos dependiente conocido ácido siálico a nivel molecular, para descubrir las interacciones glycoconjugate novela o explorar enfoques terapéuticos posibles. Hay diferentes métodos disponibles que puede modular la expresión de ácido siálico en la superficie celular, por ejemplo el tratamiento con ácido siálico glicosidasas específicas (sialidases), inhibición de enzimas implicadas en la biosíntesis de ácido siálico6 ,7,8, derribar o cambiar la expresión de la enzima clave de la biosíntesis de ácidos siálicos9.

Otro método versátil para modular la expresión de ácido siálico es MGE (ingeniería metabólica también conocido como oligosacáridos, MOE). Aquí, las células, tejidos o incluso animales son tratados con derivados no natural de ManNAc que tener modificaciones C2-amino. Las moléculas precursoras de ácido siálico, después de la absorción celular, estos análogos de ManNAc son unidireccionales los ácidos siálico metabolizados a no natural y pueden expresarse en glicoconjugados sialylated. Las células tratan con derivados de ManNAc llevar alifáticos C2-modificaciones, tales como ManNProp o ManNBut, incorporar ácido de N- propionylneuraminic (Neu5Prop) o el ácido N- butanoylneuraminic (Neu5But) en los glicoconjugados10 , 11. mediante el uso de grupos funcionales introducidos en la posición C2 de ManNAc, se pueden acoplar los no naturales siálico que ocurre, por ejemplo, a través de la ligadura de Staudinger o la cicloadición de azidas alkine, con tintes fluorescentes y por lo tanto visualizado en la superficie de la célula12.

La expresión de estos ácidos siálico de natural no tiene efectos interesantes en muchos procesos biológicos, incluyendo las infecciones del patógeno, la adhesión y migración de las células tumorales, adhesión celular general, así como vascularización y diferenciación (para revisión Ver: Wratil et al. 13). Curiosamente, MGE con N-acil modificado mannosamines puede utilizarse también para interferir con la expresión de ácido polysialic. Polysialic ácido se genera por dos polysialyltransferases diferentes (ST8SiaII y ST8SiaIV). Se ha demostrado, que polysialyltransferase ST8SiaII es inhibida por el ácido siálico antinatural precursores, tales como ManNProp o ManNBut de14,15. Además, se ha demostrado en células de neuroblastoma humano que uso ManNProp o ManNBut también reduce asimismo en total15.

MGE con N-acil modificado mannosamines es fácil aplicar el método que se ha utilizado con éxito, no sólo en mamíferos y cultivo celular de las bacterias sino también en todos animales de diferentes especies, como Caenorhabditis elegans16, pez cebra17, o ratones18,19,20,21. Especialmente los derivados de ManNAc teniendo modificaciones alifáticos, incluyendo ManNProp y ManNBut, son insignificante citotóxicos, incluso en concentración milimolar en medio de cultivo celular o plasma de la sangre. Además, son relativamente fáciles de sintetizar.

Aquí, nos proporcionan detalles sobre cómo usar el MGE con N-acetil modificado mannosamines. En primer lugar, la síntesis química de dos de los derivados de ManNAc más utilizados en este campo, ManNProp y ManNBut, se explica. A continuación, te mostramos cómo MGE puede ser aplicado en un experimento en vivo . Por ejemplo, la línea celular de neuroblastoma Kelly fue elegida para demostrar la expresión disminuida del epitopo polysialic por Western blot después del tratamiento con los derivados de ManNAc. Los ácidos siálicos de no natural en la superficie celular fueron cuantificados por HPLC y más analizados mediante espectrometría de masas.

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Protocol

1. preparación de tampones y reactivos

  1. Preparación de solución de metóxido de sodio de 3 mM
    1. Disolver el metóxido de sodio 8,1 mg en 50 mL de metanol (3 mM) en una botella de vidrio de 100 mL con una barra de agitación. Almacenar a temperatura ambiente (RT) por varias semanas.
  2. Preparación del tampón Tris-HCl
    1. Combinar 8,766 g NaCl, 157 mg de Tris-HCl y 146 mg de EDTA en una botella de vidrio de 100 mL con una barra de agitación y disolver en 80 mL de agua.
    2. Añadir hidróxido de sodio (1 M, en el agua) o HCl (20% en agua) a la solución de agitación, mientras observa el pH con un medidor de pH y ajustar el pH a 8.0.
    3. Añadir el volumen de agua necesario para alcanzar un volumen final de 100 mL. Filtrar la solución mediante un sistema de filtro estéril de 0,22 μm.
      Nota: 100 mL de Tris-HCl tampón contiene 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl y 5 mM EDTA (pH 8.0). La solución puede conservarse a 4 ° C durante varias semanas.
  3. Preparación de solución de aprotinina
    1. Disolver 10 mg aprotinina en 1 mL de agua (1,54 mM). Parte alícuota de la solución de aprotinina en 10 tubos de 1,5 mL de plástico (100 μL). Almacenar a-20 ° C durante varias semanas.
  4. Preparación de solución leupeptin
    1. Disolver leupeptin 10 mg en 2 mL de agua (10 mM). Alícuota de la solución leupeptin 10 tubos de 1,5 mL de plástico. Almacenar a-20 ° C durante varias semanas.
  5. Preparación de solución de fluoruro (PMSF) phenylmethylsulfonyl
    1. Disolver PMSF de 34,8 mg en 2 mL de etanol (100 mM). Parte alícuota de la solución PMSF en 10 tubos de 1,5 mL de plástico. Almacenar a-20 ° C durante varias semanas.
  6. Preparación de solución de 1, 2-diamino-4, 5-methyldioxybenzol-diclorhidrato (DMB)
    1. Combinar 15,62 mg DMB 352 μl de β-mercaptoetanol y 48 μl Sodio Bisulfito solución (39%) y añadir 9,6 mL de agua (6,9 mM DMB 500 mM β-mercaptoetanol y 0,19% bisulfito de sodio). Parte alícuota de la solución DMB en 40 tubos de 1,5 mL de plástico (250 μL). Almacenar protegido de la luz a-20 ° C durante varias semanas.
  7. Preparación 1 M ácido trifluoroacético (TFA) de solución de ácido
    1. Añadir 770.3 μl del 100% TFA a 9,23 mL de agua en un tubo de plástico de 15 mL (1 M). Almacenar a 4 ° C durante varias semanas.
  8. Preparación de solución TFA de 120 mM
    1. Añadir μl 92,4 TFA (100%) a 9,91 mL de agua (120 mM) en un tubo de plástico de 15 mL. Almacenar a 4 ° C durante varias semanas.
  9. Preparación de solución de hidróxido de sodio (NaOH) de 400 mM
    1. Disolver 160 mg NaOH en agua de 10 mL (400 mM) en un tubo de plástico de 15 mL. Almacenar a 4 ° C durante varias semanas.
  10. Preparación de buffer de lisis de Western blot
    1. Disolver 5,84 g NaCl, 0,1 g de Tris (hidroximetil)-aminomethan (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2y Triton-X100 de 1 g en 100 mL de agua y ajustar el pH a 7.8. Almacenar a 4 ° C. Añada 100 μl de cada inhibidor de la proteasa (aprotinina, leupeptin y PMSF) antes de utilizar el tampón de lisis.
  11. Preparación del tampón de electroforesis (SDS-PAGE) de gel de poliacrilamida de sodio dodecil sulfato
    1. Disolver 0,3 g de Tris, glicina 1.5 g y 0,1 g de SDS en 100 mL de agua y ajustar el pH a 7.3. Tienda a TA.
  12. Preparación de buffer de Western blot
    1. Disolver 0,3 g de Tris, glicina 1,1 g en 90 mL de agua y añadir 10 mL de etanol. Tienda a TA.
  13. Preparación de solución de bloqueo
    1. Disolver 1 g de la energía de la leche descremada en 25 mL fosfato tamponada salino (PBS). Prepare siempre fresco.

2. síntesis de ManNProp y relacionados con N-acil-modificado Mannosamines

  1. Disolver 431,2 mg de clorhidrato de mannosamine en solución de metóxido de sodio 10 mL 3 mM en un frasco de vidrio de 50 mL con una barra de agitación.
  2. Enfriar la mezcla en hielo a 0 ° C. A la solución de agitación, agregue lentamente gota a gota 210 cloruro de propionyl μl (2,4 mmol) o cloruro de butanoyl 248 μl (2,4 mmol) para sintetizar ManNProp o ManNBut, respectivamente. Incubar la mezcla de agitación a 0 ° C durante 4 horas.
  3. Transferir la solución a un tubo de plástico de 50 mL. Meter 4-8 agujeros en la tapa del tubo plástico con una aguja fina. Congelar rápidamente la solución utilizando nitrógeno líquido y posteriormente liofilizar (freeze dry) durante 48 h o hasta que haya secado por completo.
  4. Mezclar 350 g Silicagel 60 750 mL etilo acetato/metanol/agua (15:2:1) (se trata de una suspensión). Llenar una columna de vidrio (35 mm de diámetro y 70 cm de longitud) con la suspensión de gel de sílice 60 y lavar la columna preparada con un adicional 100 mL etilo acetato/metanol/agua (15:2:1) antes del uso.
  5. Disolver los productos secos del paso 2.3 (producto 5 g secada) en 10 mL etilo acetato/metanol/agua (15:2:1) y carga a través de una pipeta sobre la sílice gel columna. Recoger fracciones de 4 mL después de 500 mL (para ManNProp). Nota: ManNBut se procederá a la elución de la columna después de aproximadamente 700 mL.
  6. Las fracciones eluídas de transferencia en tubos de plástico de 15 mL. Meter 3-6 agujeros en la tapa del tubo plástico con una aguja fina. Rápida congelación de la solución utilizando nitrógeno líquido y posteriormente liofilizarlo hasta que haya secado por completo.
    Nota: Los productos liofilizados pueden almacenarse durante varios meses a TA.
  7. Verificar la pureza de los productos por espectrometría de masas (véase sección 9).
    Nota: Como alternativa, pureza puede también ser verificada por 1H resonancia magnética Nuclear (RMN).

3. cultivo celular

  1. Cultura Kelly las células del neuroblastoma en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) que contiene 10% de suero fetal bovino, penicilina U 100, estreptomicina 100 mg, 2 mM L-glutamina que contiene 5 mM ManNAc, ManNProp de 5 mM o 5 mM ManNBut, a 37 ° C y 5% CO2.
    Nota: Las células cultivadas en medio sin ManNAc o sus análogos se utilizan como un control.
  2. Antes de la aplicación de la mannosamines, separar las células de neuroblastoma de Kelly, incubando durante 10 min con tripsina/EDTA (0.25%, 0,02%, en PBS) y contar usando un contador de la cámara de Neubauer o celular. Las celdas de números definidos en función del tamaño de la placa/plato de semillas.
    1. Para medir el ácido siálico monosacáridos, semillas 1 x 105 células en 500 μl de medio en una placa de cultivo de tejidos 48-bien. Para el análisis de los ácidos polysialic, de la semilla 1 x 106 células en medio de 3 mL en una placa de cultivo celular de 6 cm de diámetro. Incubar a 37 ° C y 5% CO2. Cambiar el medio cada 24 h.
      Nota: El efecto de MGE aumenta con el tiempo total de tratamiento. De alta eficiencia metabólica tratar las células durante 5-7 días.
  3. Después del tratamiento, decante el medio. Lavar los platos/platos con PBS. Separar las células, incubando durante 10 min con tripsina/EDTA (0.25%, 0,02%, en PBS). Neutralizar la tripsina añadiendo el mismo volumen de medio de cultivo celular para las células separadas. Transferir las células separadas en tubos de plástico de 15 mL. Centrifugar las muestras durante 3 minutos a 500 XG y descartar el sobrenadante.
    1. Añadir 5 mL PBS y centrifugar las células (véase el paso 3.3). Repetir el lavado dos veces más.
      Nota: El precipitado de células lavadas sin sobrenadante puede conservarse a-20 ° C durante varios días. Si la expresión de ácido polysialic es ser aclarada continuar sección 10.

4. lisis de células para análisis de HPLC

  1. Preparación de buffer de lisis HPLC
    1. Combinar el tampón Tris-HCl de 5 mL, 5 μl aprotinina solución, solución de leupeptin de 20 μl y 50 μl PMSF solución.
      Nota: 5 mL de tampón de lisis HPLC contendrá 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl 5 mM EDTA, 1.54 μm aprotinina, 40 μm Leupeptin y 1 mM PMSF (pH 8.0). Este buffer siempre debe estar preparado fresco antes de la lisis celular.
  2. Resuspenda las células recogidas pelotillas (paso 3.3) cada en 500 μl helada HPLC-tampón de lisis y ultra-someter a ultrasonidos las muestras con una aguja de procesador ultrasónico tres veces durante un período de 30 s a amplitudes de medio-alto. Enfriar las muestras en hielo durante al menos 1 minuto entre los ciclos.

5. separación de la fracción de membrana

  1. Centrifugue las muestras sometidas a lisis celular por 2 h a 20.000 x g a 4 ° C. Separar el sobrenadante (aproximadamente 480 μL), que representan proteínas citosólicas, en tubos de plástico de 1,5 mL. Determinar la concentración de proteína de las fracciones utilizando, por ejemplo, la Bradford o el ensayo de (BCA) ácido bicinchoninic.
    Nota: La concentración de proteína (aproximadamente 1 mg/mL) de las fracciones citosólicas puede más tarde ser relacionados con dosificada de las especies de ácido siálico respetado. El sedimento representa la fracción de membrana, que se utiliza en el paso 6.1.

6. ácido hidrólisis

Nota: Oligo - y polisacáridos de las membranas celulares son hidrolizados a monosacáridos. Además, posible O-modificaciones en los monosacáridos son hidrolizados, así. Esto es necesario para análisis HPLC cuantitativo, porque la mayoría de ácidos siálicos de las fracciones de membrana es incorporada naturalmente en glicoconjugados y posiblemente podría llevar O-acetil o O- lactolyl modificaciones.

  1. Añadir 150 μL 1 M TFA-solución a las fracciones separadas de la membrana (pellet de la sección 5). Incubar las muestras durante 4 horas a 80 ° C con agitación a 200-600 rpm.
  2. Centrifugar las muestras durante aproximadamente 30 minutos a 20.000 x g y 21 ° C usando tubos con 0,5 mL de filtro con 3 membranas de exclusión kDa, hasta que el volumen de la fase superior es menos de 20 μl.
    Nota: Este paso es importante desechar basura molecular mayor.
  3. La transferencia de la fase inferior que contiene moléculas más pequeñas, incluidas las especies de ácido siálico, en tubos de plástico de 2 mL. Meter 2-4 agujeros en las tapas de los tubos de plástico con una aguja fina. Rápido congelar las muestras con nitrógeno líquido y luego les liofilizar durante la noche.
    Nota: Las muestras secas pueden almacenarse durante varios días en RT. reemplazar una tapa sin agujeros para un almacenaje más largo.

7. etiquetado fluorescente

  1. Resuspenda las muestras secadas en solución TFA de 120 mM de μl 10 y añadir 50 μl solución DMB. Transferir las muestras a tubos de 1,5 mL oscuro para protegerlos de la luz ultravioleta.
  2. Normas, disolver 1 μl Neu5Ac (60 ng/mL, en agua) o 1 μl Neu5Gc (60 ng/mL, en agua) en 10 μl 120 mM TFA solución tubos de 1.5 mL oscura. Añadir 50 μl solución DMB.
  3. Incubar las muestras de membrana de la célula y los estándares durante 1,5 h a 56 ° C protección de la luz. Después de la incubación, añadir 4 μL de solución de NaOH de 400 mM a cada muestra para detener la reacción de etiquetado.

8. HPLC análisis

Nota: Las muestras etiquetadas se analizan en un sistema HPLC equipado con una columna C18 RP (110 Å, tamaño de partícula de 3 μm, 4,6 x 150 mm), un detector de fluorescencia y un colector de fracciones. Los solventes utilizados son metanol, acetonitrilo y agua. Asegúrese de desgasificar solventes todos antes de las mediciones, si el sistema HPLC carece de un desgasificador interna.

  1. Ajustar la temperatura de la columna a 40 ° C y configurar el detector de fluorescencia con 373 nm para la excitación y 448 nm para la emisión, respectivamente. Inyectar el volumen de muestra de 10 μl y separar las puntas de prueba de 50 min a 0,5 mL/min de caudal con metanol/acetonitrilo/agua (6:8:86) como eluyente. Para el análisis de espectrometría de masas, recoger los picos de interés.
    Nota: Neu5Gc debe eluido después de 6-8 min., Neu5Ac después de 9-12 min., Neu5Prop después de 17-23 min y Neu5But después de 38-44 min. Las muestras fraccionadas pueden almacenarse durante varias horas a 4 ° C protegido de la luz.
  2. Después de medir cada muestra, se lava la columna 7,5 min a velocidad de flujo de 1.0 mL/min (volúmenes de columna 1,5 ≈) con metanol y acetonitrilo/agua (6:25:69) y volver a equilibrar el sistema de 7,5 min 1,0 mL/min de caudal con metanol y acetonitrilo/agua (6:8:86).
  3. Para el análisis cuantitativo, calcular el área bajo la curva de los picos de ácido siálico de interés utilizando el software de funcionamiento del respectivo sistema de HPLC22.
    Nota: Datos obtenidos pueden ser relacionado con el Neu5Ac o el estándar de Neu5Gc y las concentraciones de proteína medido en la fracción citosólica (ver sección 5.1).

9. espectrometría de masas análisis de monosacáridos ácido siálico

Nota: Picos de retención HPLC de interés pueden ser más analizadas por espectrometría de cromatografía líquida (LC) ionización por electrospray (ESI-MS), para verificar la especie ácido siálico antinatural.

  1. Para el análisis de espectrometría de masas, inyectar 20 μl de la muestra recogida en un sistema de Detector selectivo LC/masa (MSD) con 79.9% metanol, alcohol isopropílico al 20% y 0,1% de ácido fórmico como eluyente, tasa de flujo de 0,5 mL/min, 4 kV tensión capilar y 350 ° C temperatura capilar 22 , 23.
  2. En el software de evaluación del respectivo sistema LC/MSD, seleccionar el pico de interés en el cromatograma total de iones. Ver el espectro de masas del pico resuelto. Mostrar la relación masa/carga positiva entre 300 y 700.
    Nota: DMB etiquetado de ácidos siálicos conduce a un aumento en la masa molecular de 116.2 g/mol. Las especies de ácido siálico marca DMB tienen las siguientes masas moleculares: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, Neu5Gc DMB = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436,2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/PM común aductos son acetonitrilo, sodio o alcohol isopropílico.

10. Western Blot análisis de ácido Polysialic en las células del Kelly Neuroblastoma

  1. Preparación de lysates de la célula
    1. Añadir 1 mL del tampón de lisis Western blot a los pellets de células de paso 3.3 y de vortex. Incubar durante 30 min en hielo. Vortex cada 5 min. Centrifugar las muestras durante 1,5 h a 20.000 x g a 4 ° C. Recoger el sobrenadante que contiene las proteínas de las células sometidas a lisis.
    2. Determinar la concentración de proteína de las fracciones de proteína, por ejemplo, la Bradford o el ensayo BCA. Diluir las muestras a una concentración de proteína de 1.5 μg/μl de tampón de lisis.
    3. Preparar las muestras de la SDS-PAGE añadiendo 10 μl de tampón de muestra Laemmli a fracción de proteína de 90 μl (1,5 μg/μl) y hervir la muestra 5 minutos24.
  2. Immunoblotting
    1. Usar geles de acrilamida SDS 8% con 20-30 μL bolsillos y 0.75 o 1 mm de espesor. Correr el gel a 25 mA por 2 h a TA.
    2. Retire con cuidado la cubierta de cristal del gel. Corte y deseche la parte superior del gel que contienen las bolsas de carga. Coloque el gel en una membrana de nitrocelulosa (0.2 μm), previamente empapado en tampón de Western blot. Las proteínas de transferencia a nitrocelulosa según la recomendación del sistema (por ejemplo, 250 mA durante 1 h a 4 ° C).
    3. Retire el sistema blot a la membrana de nitrocelulosa. La mancha la mancha con Ponceau rojo para visualizar las proteínas. Transferir la membrana de nitrocelulosa en una cámara de plástico y añadir 10 mL de solución de bloqueo. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
    4. Decantar la solución de bloqueo y añadir anticuerpo monoclonal anti-polySia 735 (1 μg/mL) en PBS. Incubar la membrana durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación, lavar la membrana por lo menos tres veces durante 5 minutos con PBS.
    5. Añadir policlonal anti-ratón IgG de anticuerpo secundario (1 μg/mL) acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) o una etiqueta fluorescente en PBS. Incubar la membrana durante 1 h a TA. Después de la incubación, lavar la membrana por lo menos tres veces durante 5 minutos con PBS.
    6. Transferir la membrana sobre una placa de un aparato apropiado. Detectar la señal de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

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Representative Results

Cromatogramas HPLC del fluorescente etiquetado Neu5Ac y los estándares de Neu5Gc están representados en la figura 2. Usando el método descrito en este documento, marca DMB Neu5Gc típicamente elutes entre 7-9 min tiempo de elución y DMB-Neu5Ac entre 10-12 min. Varios pequeños picos en el cromatograma generalmente aparecen entre 2-6 min. Estos picos representan DMB no reaccionado y reacción intermedios25.

La figura 3 muestra los cromatogramas representativos de lysates de la célula. En comparación con los cromatogramas de las normas de etiquetado de DMB (figura 2), en estos cromatogramas varios picos son visibles. Esto es probablemente debido a la impureza interna de lysates de la célula y al hecho de que DMB no sólo reacciona con ácido siálico especies, pero también con otros α-ceto ácidos presentes en los lysates de la célula, incluyendo piruvato, succinato y α-cetoglutarato26. La presencia de pequeñas cantidades de ácidos siálicos teniendo O-modificaciones de acetilo que no han sido troceados por hidrólisis acético también pueden ser discutidos como una razón para estos picos indefinidos23. Cromatogramas de las células sometidas a lisis se comparan con los cromatogramas de las células que previamente han sido tratados con ManNAc o sus análogos. Como se muestra aquí, el tratamiento con ManNAc a menudo conduce a un agotamiento casi total de Neu5Gc en la superficie celular. En los cromatogramas de las células sometidas a lisis tratadas con Neu5Prop o Neu5But, son visibles picos que no aparecen en los cromatogramas de las células no tratadas. Estos picos (para ManNProp tratados las células aproximadamente 19 min tiempo de elución y para ManNBut las células de 42 min) indican la aparición de los correspondientes ácidos no natural siálico, Neu5Prop y Neu5Gc. Como se describe en la sección 8.3 del Protocolo, se pueden analizar los cromatogramas HPLC para cuantificar las cantidades de las especies diferentes de ácido siálico en los lysates de la célula.

El hecho de que distintos picos de retención HPLC corresponden a ciertas especies de ácido siálico se verificó mediante espectrometría de masas. Representante ESI-MS datos recogidos picos HPLC de interés se representan en la figura 4: el espectro del pico de retención DMB-Neu5Ac recogido en el panel izquierdo superior, DMB-Neu5Gc en el panel derecho superior y las dos especies de ácido siálico de no natural, DMB-Neu5Prop y DMB-Neu5But en los paneles izquierdos y derecho inferiores. La reacción con DMB conduce a un aumento en la masa molecular de 116.2 Da, en comparación con las especies de ácido siálico que no están etiquetadas con este colorante. En los espectros de masas, al mostrar la relación masa/carga positiva de las muestras inyectadas entre 300 y 700, varias cumbres son accesibles. Esto es debido a la aducción de la formación de la sonda marcada con DMB respetada. Además el ion protonado [M + H]+, el sodio aductos [M + Na]+ y [M + 2Na-H]+ aparecen. Acetonitrilo (ACN) esté presente durante el análisis de LC, puede encontrarse como una aducción en la espectrometría de masas (por DMB-Neu5Gc, figura 4: panel de la derecha superior). Debido a la fragmentación causada por activaciones de descompensación impacto generadas en la región de transporte electronspray entre el capilar y la primera depuradora, deshidratado ácido siálico también se pueden observar especies [M + H]+-H2O (que se muestra para DMB-Neu5Ac, figura 4: panel izquierdo superior)23,27. En la configuración de la LC, DMB Neu5Gc elutes poco después de las especies de DMB no reaccionadas o parcialmente reaccionadas. Por lo tanto, la sonda de DMB-Neu5Gc recogida puede contener impurezas causadas por estos intermedios de reacción. Esto sirve como explicación para la aparición de indefinido picos en el espectro de masas de DMB-Neu5Gc (figura 4: panel de la derecha superior).

Tratamiento de células de neuroblastoma de Kelly con ManNProp o ManNBut conduce a una expresión reducida de ácido polysialic en NCAM, como demostrado por análisis de Western blot de la membrana celular de las células sometidas a lisis (figura 5). Polysialic ácido normalmente aparece como un borrón de transferencia a su heterogeneidad en el tamaño y carga de (≈ 200 kDa). Tratamiento con análogos de la ManNAc conduce a la reducción del ácido polysialic en la superficie de las células: cuanto más tiempo los alifáticos N-acil lado cadena, mayor será la reducción28.

Figure 1
Figura 1: El principio general de MGE con N-acil modificado mannosamines. Después del tratamiento con N-acil modificado mannosamines, estos análogos de ManNAc son unidireccionalmente metabolizada (metabolismo intracelular) a los correspondientes ácidos siálico de no natural. Estos son transportados en el Golgi, transferidos al aceptador respectivos oligosacáridos de sialiltransferasas y expresados en la superficie celular en sialosides (aquí, una glicoproteína). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: cromatogramas representativos de ácido siálico DMB-labeled normas. DMB-labeled Neu5Ac (panel superior) y Neu5Gc (panel inferior) se analizaron por HPLC. Tiempos (líneas discontinuas) de retención y áreas de pico de ambos ácidos siálico fueron determinadas después de inyectar 10 ng de la especie marcada con DMB respetada en el sistema HPLC. En los cromatogramas representativos aquí se muestra, DMB-Neu5Gc eluida después de aproximadamente un tiempo de retención de 8 min y DMB-Neu5Ac en el minuto 11, respectivamente. Varios pequeños picos en el cromatograma generalmente aparecen entre 2-6 min, que representa DMB y reacción intermedios. Una pequeña fracción de Neu5Ac DMB-labeled aparece como una impureza menor en el estándar de DMB-Neu5Gc (panel inferior). Esta cifra se modifica a partir de la referencia22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: caracterización de membrana-limitan los ácidos siálico por HPLC de DMB. Las células fueron cultivadas en ausencia (no tratado, superior panel) o presencia de 5 mM ManNAc (segundo panel desde arriba), ManNProp (tercer panel desde arriba), o ManNBut (panel inferior), respectivamente, por 7 días. El medio fue cambiado cada 24 horas las células se cosecharon y fracciones de la membrana fueron preparados, etiquetados con DMB y analizadas por HPLC. En comparación con los cromatogramas de las normas de etiquetado DMB el ácido siálico (figura 2), picos en los tiempos de retención entre 8-9 min fueron identificados como DMB Neu5Gc y picos entre 10-11 min como DMB-Neu5Ac. En comparación con los picos obtenidos inyectando estándares de ácido siálico marca DMB, cromatogramas de lysates de la célula muestran picos adicionales, indefinidos. Esto es debido a la impureza interna de las sondas, así como al hecho de que DMB puede reaccionar con el ácido siálico presente en los lysates de la célula, sino también con otros α-ceto ácidos presentes en los lysates de la célula, como piruvato, succinato, α-cetoglutarato. Picos que solo aparecen en los cromatogramas de las muestras de células cultivadas en presencia de N-acil modificado mannosamine análogos indican siálico correspondientes ácidos de DMB-etiquetados no natural. Esta cifra se modifica a partir de la referencia22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: espectro de especies ácido siálico marca DMB de lysates de la célula de la masa. HPLC retención picos de interés (ver figura 3) fueron recogidos y analizados posteriormente por ESI-MS. 20 μl de las retenciones recogidas picos fueron inyectadas en el sistema LC-MSD. Reacción con DMB conduce a un aumento de la masa molecular de 116.2 Da en comparación con las especies correspondientes sin reaccionar el ácido siálico. Se muestran los espectrogramas de cociente masa/carga positiva obtenidas de especies diferentes de ácido siálico (DMB-Neu5Ac: panel izquierdo superior, DMB Neu5Gc: panel derecho superior, DMB-Neu5Prop: panel izquierdo inferior, DMB-Neu5But: parte inferior derecha). Debido a la aducción formación varias cumbres son accesibles. Además el ion protonado [M + H]+, sodio aductos [M + Na]+ y [M + 2Na-H]+ aparecen. Acetonitrilo, que está presente durante el análisis de LC, puede encontrarse también como un aducto (panel superior derecho). DMB-Neu5Ac deshidratado, que es generado por la fragmentación en el instrumento [M + H]+-H2O se observan (panel izquierdo superior). La sonda de DMB-Neu5Gc recogida puede contener impurezas causadas por DMB sin reaccionar, así como la reacción intermedios como picos indefinidos adicionales (panel superior derecho). ACN, acetonitrilo; H, hidrógeno; Na, sodio. Esta cifra se modifica a partir de la referencia22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis de la polysialylation de NCAM. Las células del neuroblastoma Kelly fueron cultivadas en ausencia o presencia de 5 mM ManNAc, ManNProp o ManNBut por 7 días. Las células se cosecharon y proteínas fueron separadas en geles de acrilamida SDS 8% y analizadas por Western blot utilizando anticuerpos monoclonales anti-polySia 735. Tenga en cuenta que polySia aparece como un borrón de transferencia debido a su heterogeneidad en el número de Sia, resultando en diferentes tamaños y cargas de polySia.

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Discussion

Si los síntesis química derivados de ManNAc, ManNProp y ManNBut son analizados mediante espectrometría de masas, sólo el pico masa correcta para ambos especímenes debe ser identificado. Por lo tanto, los productos se pueden suponer que tiene una pureza de más del 99%. Se detectan pequeñas cantidades de Neu5Gc, que normalmente no se encuentra en las células humanas29, en las fracciones de membrana de las células sometidas a lisis. Esto ocurre probablemente a través de una vía de salvamento que recluta Neu5Gc de sialoglycoconjugates de suero bovino fetal en los medios de comunicación30. Tratamiento con el precursor natural de la biosíntesis del ácido siálico, ManNAc, reduce drásticamente la expresión de la Neu5Gc epítopos en la superficie celular.

Aplicación de mannosamines modificado es insignificante tóxico para todas las células investigadas hasta ahora. Las células aceptan concentraciones de azúcar milimolar creciente en el medio, que es necesario, puesto que no hay ninguna transportadores específicos para N- acylmannosamines. Se ha demostrado que se activan vías de transducción de señal en aplicación del N- acylmannosamines, que podría afectar la célula crecimiento o diferenciación de31,32. Si esto es debido a un patrón asimismo cambiante o refleja efectos directos sobre el modificado asimismo no se conoce hasta ahora. Crecimiento de las células en presencia de los análogos de ManNAc C2 modificado, ManNProp o ManNBut los resultados en la expresión de ácido siálico de no natural especies llevando el correspondiente N-sustitución acil. Prueba de la eficiencia metabólica de los dos N-acil modificado mannosamines varía. Tratamiento con ManNProp generalmente conduce a la expresión de la Neu5Prop correspondiente en la superficie celular y a una expresión disminuida de Neu5Ac como Neu5Gc. Otros N-acil modificado mannosamine análogos, como N- cyclopropylcarbamyl mannosamine, tienden a tener una mayor eficiencia metabólica22.

Estudios anteriores revelaron que precursores siálicos interfieran con polysialylation. Polysialic ácidos se expresan casi exclusivamente en la NCAM. Curiosamente, NCAM puede polysialylated por dos polysialyltransferases distintos en el Golgi (ST8SiaII y ST8SiaIV). Resultó que ManNProp, ManNBut y otros N-acil-mannosamines modificados interferir con polysialylation y que esto es predominante debido a la interacción con ST8SiaII14. Este sialyltransferase se expresa durante el desarrollo y es importante para el desarrollo del cerebro. Curiosamente también, muchos tumores de origen neuronal vuelve a expresar ST8SiaII aumentando su malignidad y hacerlas más imperceptible de los33del sistema inmune. Por el contrario, la aplicación de ManNAc conduce a un aumento de polySia, puesto que conduce a un aumento de CMP-Neu5Ac, que es el sustrato natural de ambos polysialyltransferases.

MGE es un método único para introducir nuevos ácidos siálico en las proteínas de interés (por ejemplo, la eritropoyetina) y modular así su función. Además, puede utilizarse para modular la glicosilación de superficie celular, que pueda ser de interés en muchas enfermedades, como el cáncer, ya que muchas de las células de cáncer intentan escapar del sistema inmune expresando altos niveles de ácido siálico. El método aquí presentado permite: en primer lugar, para realizar glycoengineering usando cultivos celulares y en segundo lugar, analizar ingeniería glycans demostrar éxito glycoengineering. El método es muy robusto y hasta el momento no se reportan trampas; en contraste, el método se ha ampliado para la introducción de grupos químicos activos para realizar química del tecleo en las células13.

Aquí presentamos dos ManNAc análogos alifáticos N-acil lado cadena modificaciones son comparable fáciles de sintetizar, incluso por los laboratorios con menos equipos y menos experiencia en síntesis química. Grupos que están más familiarizados a la química orgánica podrían sintetizar otros análogos ManNAc con estructuras más complejas y utilizar éstos para MGE, incluyendo los análogos de la llamada 'bioorthogonal', que pueden ser utilizados, por ejemplo, visualizar sialylated glicoconjugados. Hay artículos de revisión, dando una visión general de la N-acetil-mannosamine derivados que se han sintetizado hasta la fecha13,34. N- azidoacetyl mannosamine (ManNAz), una sustancia que se utiliza con frecuencia para visualizar sialylated glycans, está comercialmente disponible. Debido a la permeabilidad de la membrana bajo de ManNAc análogos, puede ser ventajoso utilizar derivados de estos azúcares con grupos hidroxilo protegidos, por ejemplo, análogos de la ManNAc de peracetylated. Después de entrar en el citoplasma, los grupos de protección son troceados por esterasas citoplasmáticas, así liberando los monosacáridos activo35,36,37. Sin embargo, peracetylated ManNAc análogos exponen mayor citotoxicidad en comparación con los correspondientes derivados sin protección.

En este manuscrito, optamos por las células del neuroblastoma inmortalizados para nuestros experimentos con MGE. En general, MGE (especialmente con ManNProp y ManNBut) puede aplicarse en una amplia variedad de líneas celulares, incluyendo líneas de células inmortalizadas (ver Wratil et al. 13 por ejemplo) y células primarias38,39. Además, MGE fue utilizado con éxito para alterar asimismo en vivo en la C. elegans40pez cebra17,41, ratón19,20,42y rata 43 , 44. se pueden variar el tiempo de tratamiento y la concentración de los ManNAc análogos en experimentos MGE para afectar la eficiencia metabólica de este método. Desde nuestra experiencia, un tratamiento más largo y mayores concentraciones corresponden con el mejor reemplazo de la especie natural de ácido siálico en glicoconjugados por Neu5R modificado. Si se utilizan concentraciones muy altas de derivados de ManNAc, la citotoxicidad del tratamiento debe ser evaluada, por ejemplo, el ensayo MTT o el ensayo de reducción de la resazurina.

En este manuscrito, sugerimos usar ultra-sonicación de homogeneización de la célula. Otros métodos de lisis de la célula fueron probados en nuestro laboratorio, incluyendo douncing en hielo (aproximadamente 250 carreras) y el francés interrupción de prensa (10.000 psi, 4 pasajes), con resultados comparables con respecto a la cantidad de ácido siálico detectado en las muestras. La ventaja de la homogeneización de ultrasonidos es que necesita poco tiempo y no requiere la adición de ADNasa a las muestras antes de la lisis.

Centramos nuestro análisis en las fracciones de membrana de lysates de la célula, porque queríamos mostrar alteraciones en la asimismo de membrana destino glicoconjugados. Derivados del ácido siálico y sus concentraciones pueden también medirse en el citosol de las células, después de que la fracción de membrana se ha separado por centrifugación de alta velocidad, utilizando el mismo método como se describió anteriormente. Sin embargo, las concentraciones de ácido siálico en el citosol son hasta 100 x menor en comparación con la expresión de ácido siálico de la membrana celular7. Por lo tanto, se necesitan grandes cantidades de células para generar resultados confiables. La piscina de ácido siálicos CMP citosólica, activado puede ser medida indirectamente por tratar previamente las fracciones citosólicas de lysates de la célula con borohidruro de sodio antes de la hidrólisis7,45. Con el fin de hidrolizar ácido siálico en glicoconjugados y ácido siálico con modificaciones del oxhidrilo, se incubaron las células con 1 M TFA. Otras soluciones ácidas pueden utilizarse para la hidrólisis, así, por ejemplo, 2 M de ácido propiónico, ácido acético de 2 M o 1 M de HCl.

Un posible problema encontrado durante el análisis de HPLC es que los picos de interés se solapan con picos indefinidos. Esto es especialmente problemático cuando la cantidad de ácido siálico en una muestra debe ser calculado por el área bajo la curva de un cierto pico. Para separar un pico de interés desde un pico definido, podría ajustarse la concentración de acetonitrilo en el solvente HPLC (± 3%). Se sugiere utilizar concentraciones de solvente constantes para el análisis HPLC, dando la ventaja de preparar la mezcla solvente antes de cromatografía. Por lo tanto, nuestro método requiere solamente una bomba HPLC y es factible para una amplia gama de sistemas HPLC. Si más de una bomba está disponible en el sistema HPLC, puede aplicarse un isocrática gradiente con el aumento de las concentraciones de acetonitrilo, por ejemplo, 4-9% en 35 min45. Mediante el uso de esta técnica, el tiempo de retención de ciertos picos HPLC se verá alterado considerablemente. Esta estrategia también puede ayudar a lograr la mejor separación de superposición de picos. Ionización de desorción láser asistida por matriz de espectrometría de masas (MALDI-MS) con éxito fue establecida verificar la expresión de modificado especies de ácido siálico en la superficie celular45y sirve como un equivalente para el método de ESI-MS presentado aquí .

Debido a la hidrofilia de análogos de ManNAc y la falta de transportadores específicos para la captación de estos derivados46, se necesitan altas concentraciones en MGE experimentos con estos compuestos. Por lo tanto, en experimentos a escala, especialmente en ensayos en vivo , grandes cantidades de los respectivos análogos de ManNAc están necesarios y mostrando una posible limitación de esta técnica. Por otro lado, dependiendo de las líneas celulares usadas, un cierto número mínimo de células tratadas es necesario para obtener resultados confiables en el análisis HPLC. Desde nuestra experiencia, un mínimo de células adherentes aproximadamente 100.000 o 150.000 células de suspensión (1-2 pocillos de una placa de 96 pocillos con células confluentes) es suficiente. Esto puede convertirse en un cuello de botella, si el análisis debe ser reducido, por ejemplo en métodos de detección.

Con los métodos presentados en este manuscrito, ácido siálico y sus derivados se pueden detectar en los lysates de la célula. Sin embargo, la estructura y composición de los glicoconjugados en células tratadas con derivados de ManNAc no pueden ser evaluados con la técnica aquí descrita. Resolver la estructura de glicoconjugados, e.g.,N- y O- glicanos, generalmente requiere una mayor experiencia e INNAVES centro47. A nuestro conocimiento, hasta el momento, no existen datos sobre la estructura distinta de los glicoconjugados de células que han sido tratadas con análogos de la ManNAc.

Mancha blanca /negra occidental análisis del ácido polysialic es un método muy rápido y fácil. Sin embargo, datos obtenidos por este método no son cuantitativos, dado que la detección utiliza anticuerpos y quimioluminiscencia. Por lo tanto, el uso de métodos HPLC es una ventaja sobre el borrar occidental. Sin embargo, se sugiere utilizar el método immunoblotting, puesto que es fácil de aplicar y se sabe que funcionan muy correctamente.

La expresión de ácido siálico en la superficie celular puede ser alterada también por métodos distintos de MGE. Como se describió anteriormente, las células pueden tratarse con sialidase, una enzima que hiende residuos de ácido siálico de glicoconjugados de forma relativamente inespecífica. Tratamiento de sialidase, en consecuencia, induce hyposialylation en células tratadas. Por desgracia, sialidase tratamiento es una técnica bastante limitada, ya que es citotóxica, no es factible para el tratamiento de largo tiempo y no se aplica en experimentos en vivo . Otra técnica para inducir hyposialylation en las células es mediante el uso de inhibidores de la biosíntesis del ácido siálico. Existe una variedad de inhibidores que sea blanco la enzima clave de la biosíntesis del ácido siálico, la UDP -N- acetilglucosamina-2-epimerase /N- acetylmannosamine-quinasa (GNE/MNK), o el grupo de sialiltransferasas6, 7,8,48. Uno de estos compuestos, un ácido siálico de C3-fluorado análogo, fue demostrado para reducir la expresión de ácido siálico en la vida de ratones49. Los animales tratados con esta sustancia, sin embargo, demostró la debilitación del hígado, disfunción renal irreversible y falta de prosperar49. Estos resultados confirman el papel crucial de Neu5Ac en función de hígado y riñón y además indican los límites de inhibidores asimismo para experimentos en vivo . Un tercer método para generar células con asimismo superficie alterada de la célula está interfiriendo con la expresión de enzimas que son fundamentales para la biosíntesis de ácido siálico. Una precipitación de la GNE/MNK en células inmortalizadas, por ejemplo, fue demostrada para procesar estas células hyposialylated 9. La posibilidad relativamente fácil knock-en y - genes en celulares y en vivo usando la novela y la reconocida técnica de CRISPR Cas9 podrían conducir a nuevos descubrimientos sobre la biosíntesis del ácido siálico y de la célula de la superficie Asimismo.

La ventaja de MGE en comparación con las técnicas descritas aquí, es que es fácil de aplicar y se adapta a un sinfín de diferentes experimentos, de ensayos en vitro a base de ensayos y experimentos en vivo de la célula. Un método alternativo para medir las concentraciones de ácido siálico diferentes especies en muestras de células y expresión es por cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento (HPAEC) con detección electroquímica pulsado50. Usando que este método, la expresión de ácidos siálicos se mide directamente y etiquetado no después con un colorante fluorescente. La ventaja de este método es que puede ser utilizado también para analizar monosacáridos distintos de ácido siálico y sus derivados en muestras celulares y proteínas. Desafortunadamente, la sensibilidad de HPAEC es menor en comparación con detección fluorométrica del ácido siálicos DMB. Por lo tanto, HPAEC se limita a los experimentos con la disponibilidad de muestras grandes cantidades51.

Los métodos aquí descritos se pueden utilizar para revelar las características desconocidas de los glicoconjugados. Una multitud de ejemplos para el uso de MGE para investigar las interacciones dependientes de ácido siálico ya existe13, demostrando la viabilidad de esta técnica en el contexto de una amplia gama de configuraciones experimentales.

Hoy en día, MGE con N- acetylmannosamines se utiliza principalmente por los investigadores en el campo de la glicobiología. Esperamos que esta técnica será reconocida por un público más amplio como una herramienta versátil para modificar glicoconjugados. Otros campos, como la inmunología, la virología, la neurología o la oncología se beneficiará mediante la adaptación de esta técnica para sus propios fines. Tal investigación cruzado podría permitir el descubrimiento de las áreas aún inexploradas y por lo tanto dar una mejor comprensión de la salud y la enfermedad. En estudios iniciales, por ejemplo, esta técnica se utilizó para producir glicoproteínas con modificado glicosilación, que más tarde sirven para vacunación en vivo . En algunos casos, el tratamiento con las vacunas de glycoengineered llevar a la producción de anticuerpos que exponen avidez avanzada y toxicidad a los respectivos objetivos52,53. Otros MGE utilizan para desarrollar un modelo para la terapia específica del tumor en ratones54. Otro estudio mostró que inyección sistémica en vivo de ManNProp promover regeneración de nervio55. En el caso de polySia, fue demostrado que disminuye la expresión de este método en células de neuroblastoma por los métodos presentados en este manuscrito, aumenta la sensibilidad de estas células del tumor a la radiación o tratamiento con medicamentos anticancerosos56.

Las cantidades de ácido siálico, medidos en las muestras pueden diferir según el método utilizado para separar las células tratadas. En este manuscrito, incubación con tripsina se utiliza para separar las células. Si se utilizan, como el raspado de las células o el tratamiento de largo plazo con PBS + EDTA, otras técnicas pueden diferir las cantidades de ácido siálico en las muestras. Incluso adaptando el tiempo de incubación con tripsina puede tener un impacto en las concentraciones de ácido siálico medidas posteriormente. Desde nuestra experiencia, el impacto del método de separación celular en las cantidades de ácido siálico medido es inferior al 15%, pero si resultados son normalizados y en comparación, esto podría convertirse en un cuello de botella importante. Además, el método de lisis de las células puede afectar el resultado de los análisis HPLC. Por lo tanto, recomendamos al lector a estandarizar la separación celular y lisis en sus experimentos.

Para lograr la separación de la fracción de membrana en lysates de la célula, utilizamos centrifugación durante 2 h a 20.000 x g y 4 ° C (sección 5.1). Podrían afectar a otros protocolos de centrifugación la separación y por lo tanto las cantidades de ácido siálico detectados en las muestras. Un compuesto fundamental dentro de este protocolo es DMB, porque es muy sensible a la luz y se degrada con el tiempo. Aquí recomendamos alícuotas pequeñas porciones de la solución de DMB y tienda que almacena a - 20 ° C, protegido de la luz (sección 1.6.1). De esta manera la solución de DMB puede conservarse durante varias semanas. Si los resultados del análisis de DMB-HPLC muestran aumentando o disminuyendo las señales para las especies de ácido siálico señales dentro de los primeros 6 minutos de la medición de HPLC, representación de DMB y sus productos de reacción, nueva solución de DMB debe estar preparada. No vuelva a congelar y volver a utilizar solución de DMB después de descongelarlo. Después de DMB etiquetado, todas las muestras deben analizarse inmediatamente. Si un gran número de muestras (> 10) deben ser analizadas, estas muestras deben divididas en placas más pequeñas y poco a poco marcadas con DMB. Tanto la reacción de etiquetado, así como las sondas marcadas con DMB deben protegerse de la luz en todos veces. Después de elución, las especies de ácido siálico DMB-etiquetados deben ser analizadas inmediatamente por ESI-MS. directo acoplamiento de la HPLC con el sistema de ESI-MS (en una configuración LC-ESI-MS) no es necesario, pero puede ser ventajoso para lograr mayor calidad de la espectrometría de masas Análisis.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a L. D. Nguyen para revisar el manuscrito y fructíferos debates. Además, agradecemos a J. Dernedde y H. G. Nguyen por ayudarnos a preparar la sesión de video. Mayoría de las escenas del video se rodaron en los laboratorios de R. Tauber. También agradecemos al Instituto Max Planck para los coloides y las interfaces y por darnos acceso a sus instalaciones de espectrometría de masas. RH fue apoyada por el DFG (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

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References

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