Quantitative Lokalisierung eines Golgi-Proteins von Imaging Center der Fluoreszenz Masse

Biology

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Summary

Die präzise Lokalisierung der Golgi-Bewohner ist wesentlich für das Verständnis der zellulären Funktionen der Golgi. Konventionelle Lichtmikroskopie ist jedoch nicht in der Lage, die Sub-Golgi-Struktur zu lösen. Hier beschreiben wir das Protokoll für eine konventionellen Mikroskopie basierte Höchstauflösung Methode, um die Sub-Golgi Lokalisation eines Proteins quantitativ zu bestimmen.

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Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).

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Abstract

Der Golgi-Komplex besteht aus seriell gestapelten Membran Cisternen, die in Sub-Golgi Regionen, einschließlich der GUS-Staatenweiter kategorisiert werden können-Golgi, Medial-Golgi, Trans-Golgi und Trans-Golgi-Netzwerk. Zellfunktionen der Golgi werden durch die charakteristische Verteilung der ansässigen Proteine bestimmt. Die räumliche Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopie ist zu niedrig um Sub-Golgi Struktur oder Cisternen zu lösen. So ist Immuno-Gold-Elektronen-Mikroskopie eine Methode der Wahl, ein Protein auf der Sub-Golgi-Ebene zu lokalisieren. Das Instrument und Technik sind jedoch darüber hinaus die Möglichkeit, die meisten Zelle Biologie Labors. Hier beschreiben wir unsere neu entwickelte Höchstauflösung Methode namens Golgi Protein Lokalisierung von imaging Center der Masse (GLIM), systematisch und quantitativ ein Golgi-Protein zu lokalisieren. GLIM basiert auf standard Fluoreszenz Kennzeichnung Protokolle und konventionellen Weitfeld- oder konfokale Mikroskope. Es geht um die Kalibrierung der chromatischen Verschiebung Aberration des mikroskopischen Systems, die Bildaufnahme und die Analyse nach der Übernahme. Die Sub-Golgi Lokalisierung eines Test-Proteins wird quantitativ die Lokalisierung Quotienten ausgedrückt. Es gibt vier Hauptvorteile von GLIM; Es ist schnell, bezogen auf konventionelle Methoden und Werkzeuge, das Ergebnis der Lokalisierung ist quantitativ und es bietet ~ 30 nm praktische Auflösung entlang der Golgi-Achse. Hier beschreiben wir das ausführliche Protokoll der GLIM einenTest Golgi Protein zu lokalisieren.

Introduction

Der Golgi-Komplex spielt entscheidende Rolle sekretorischen/endocytic Handel von Proteinen und Lipiden (im folgenden Ladungen) in Säugerzellen1,2,3. Bei der Golgi sind Ladungen nicht nur auf verschiedenen subzellulären Fächer sortiert sondern auch durch verschiedene Arten der Glykosylierung modifiziert. Der Säugetier-Golgi-Komplex umfasst zahlreiche seitlich angeschlossene Golgi-Stapel, die besteht in der Regel von 4-11 eng benachbarte und flache Membran Säcken genannt Cisternen. Seriell gestapelten Golgi-Cisternen werden weiter kategorisiert, von einem Ende zum anderen, als GUS, Medial und Trans-Cisternen. Auf der Trans-Seite aus einem Golgi-Stapel, der Trans-die meisten Membran Sac entwickelt sich zu einem röhrenförmigen und Retikulum Membran-Netzwerk namens Trans-Golgi-Netzwerk (TGN)4. In der sekretorischen Weg Ladungen abgeleitet aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) geben Sie einen Golgi-Stapel in die GUS-Seite und dann nacheinander durchlaufen die Medial und Trans-Cisternen. Ladungen beenden schließlich die Golgi auf dem Trans-Golgi oder TGN destining der Plasmamembran, Endosomen oder sekretorischen Granulat.

Die molekularen und zellulären Mechanismen der wie Ladungen einen Golgi-Stapel transit und wie die Golgi seine cisternal Organisation unterhält bleibt mysteriös und werden derzeit noch eine hitzige Debatte1. Schwierigkeiten in diesem Bereich gehört, dass Golgi-Cisternen nur unter der Elektronenmikroskopie (EM) seit dem Beschluss von einem optischen Mikroskop gelöst werden können (~ 200 nm) nicht ausreicht, einzelne Golgi-Cisternen (< 100 nm in beiden cisternal Dicke zu lösen (und Entfernung). Daher werden die Sub-Golgi Lokalisierung von ansässigen Proteine und Transit Ladungen konventionell von Immuno-Gold EM bestimmt. Jedoch die Immuno-Gold-EM ist technisch sehr anspruchsvoll und es ist darüber hinaus die Möglichkeit, die meisten Zelle Biologie Labors. Obwohl die Auflösung der EM kann Sub-Nanometer, die Auflösung durch die Immuno-Gold EM gewährte wird stark von der Größe des Antikörpers Komplex (PV plus der Sekundärantikörper) und das gold Partikel behindert, und es schlimmer, als 20 sein kann nm. Darüber hinaus stammen EM Bilder von dünn-2D-Schnitte statt eine globale 3D-Ansicht des Golgi, die abhängig von der relativen Position und Ausrichtung der 2D-Schnitt5falschen Schlüssen führen kann. Beispielsweise kann ein EM einteiligen Studium ein Vesikels zuverlässig aus der orthogonalen Ansicht von einem Röhrchen zu unterscheiden, da beide identische Runde Membran Profile angezeigt werden können. Die letzten Advent Höchstauflösung Mikroskopie-Techniken, wie 3D-strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (3D-SIM), stimulierte Emission Depletion (STED), photoaktiviert-Lokalisierung-Mikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie ( (Sturm), ermöglicht es, Sub-Golgi Strukturen im Rahmen von Lichtmikroskopen6zu beheben. Allerdings gibt es mindestens vier Nachteile, die ihre Verwendung in der Zelle biologische Studie von der Golgi erheblich einschränken können. (1) aktuelle Höchstauflösung Techniken erfordern teure und spezielle Hardwarekonfiguration ist darüber hinaus die meisten Zelle Biologie Labors. (2) spezielle Fluoreszenz Kennzeichnung Protokolle sind für einige super-Resolution-Techniken erforderlich. (3) Obwohl diese Techniken unter dem besten Zustand, 20-110 nm in räumlicher Auflösung beanspruchen, kann die praktische Auflösung in realen Proben erhalten viel schlimmer sein. (4) im Vergleich zu konventionellen Mikroskopie diese super-Resolution-Techniken noch haben Schwierigkeiten bei der Durchführung von mehrfarbigen, 3D oder live Cell imaging, entweder einzeln oder in Kombination. Wahrscheinlich führen vor allem Immuno-Gold-EM und die Höchstauflösung Mikroskopiertechniken qualitative statt quantitative Lokalisierungsdaten.

Versuch, teilweise oben genannten Probleme zu lösen, haben wir vor kurzem eine konventionelle Lichtmikroskopie basierte Methode entwickelt benannt Golgi Protein Lokalisierung von imaging Center der Masse (GLIM), systematisch und quantitativ ein Golgi lokalisieren Protein mit einer Auflösung entspricht dem von der Immuno-Gold EM-7. Bei dieser Methode ist die Golgi in kultivierten Säugerzellen als Golgi Mini-Stapel durch die Behandlung von Nocodazole, ein depolymerizing Medikament Mikrotubuli verstreut. Umfangreiche Studien haben gezeigt, dass Nocodazole-induzierten Golgi Mini-Stacks (im folgenden Golgi Mini-Stacks) native Golgi-Stapel in Organisation und Zellfunktionen8,9,10ähneln, 11. Die Lokalisierung Quotient (LQ) eines Test-Proteins durch GLIM erworben werden kann und es bezeichnet die quantitative Sub-Golgi-Lokalisierung. Die Zahlenwerte der LQs verglichen werden können und eine LQ-Datenbank mit mehr als 25 Golgi Marker zur Verfügung gestanden hat.

Golgi Mini-Stacks sind in GLIM dreifach-Label von endogen oder exogen ausgedrückt GM130, GalT mCherry und Test-Protein (X). GM130 und GalT-mCherry, Cis- und Trans-Golgi-Marker bzw.12,13, bieten Bezugspunkte. Die dreifache Fluoreszenz, rot (R), grün (G) und dunkelrote (B), künstlich als rot, grün und blau, beziehungsweise angezeigt. Zentrum der Fluoreszenz Masse (im folgenden Mitte) wird angenommen, um Sub-Pixel-Auflösung zu erreichen. Die Golgi-Achse ist definiert als der Vektor aus der Mitte des GM130 mit der GalT-mCherry. Die Golgi-Mini-Stack wird als eine zylindrische Struktur mit unendlichen Rotationssymmetrie um die Golgi-Achse modelliert. Daher kann ein Mini-Golgi-Stapel weiter als eine eindimensionale Struktur entlang der Golgi-Achse modelliert werden. Die LQ Test Protein X ist definiert als dX/d1, in denen dX der Abstand von der Mitte von x mit der GM130, ist während d1 die Entfernung vom Zentrum GalT-mCherry mit der GM130 ist. Wenn x einfallenden liegt, wird seine Projektion axialen Abstand für die Berechnung verwendet. Die Variablen, einschließlich Golgi Achse, axiale Winkel, dX, d1, Winkel α und Winkel β für GLIM sind schematisch in Abbildung 1dargestellt. LQ ist unabhängig vom axialen Golgi Golgi Mini-Stacks nach dem Zufallsprinzip in eine Zelle zu orientieren.

Golgi Mini-Stacks erscheinen inhomogen in Bildern. Wir entwickelten drei Kriterien um analysierbar Golgi Mini-Stacks für GLIM auszuwählen. (1) das Signal-Rausch-Verhältnis-Kriterium, in dem das Verhältnis von die Gesamtintensität eines Golgi Mini-Stack auf die Standardabweichung (SD) des Hintergrundes ≥ 30 in jedem Kanal ist. Dieses Kriterium ist die Positioniergenauigkeit von der Mitte der Masse, die abhängig von der Signal-Rausch-Verhältnis von Golgi-Mini-Stacks. (2) die axiale Winkel oder Abstand Kriterium, wonach d1≥ 70 nm. d1 nimmt mit der Erhöhung des Golgi axiale Winkels. Wenn die axiale Winkel nähert sich 90° oder senkrecht, die Mini-Stack wird als d1 nicht auflösbar nähert sich 0. d1≥ 70 nm kann wirksam ausschließen, in der Nähe von vertikalen Golgi Mini-Stacks. (3) die co-Linearität Kriterium, in dem entweder | tan α | oder | tan β | ≤ 0,3 ist. Dieses Kriterium wird sichergestellt, dass die drei Zentren eines Mini-Stack ausreichend für unser eindimensionales Modell des Golgi Mini-Stack linear sind. Alle Lichtmikroskopen leiden chromatische Aberration, die ernsthaft die relativen Positionen der rot-, grün- und dunkelrote Fluoreszenz Zentren verzerren können. Chromatische Aberration von Mikroskopsystemen wird experimentell durch bildgebende 110 nm-Perlen, die Dreifach-gekennzeichnet durch rote, grüne und dunkelrote Fluoreszenz sind kalibriert. Für jedes Bild Perle die Mitte des roten ist definiert als die tatsächliche Position des Wulstes und chromatische Veränderungen der grünen und dunkelrote Zentren sind von erster Ordnung Polynomfunktionen ausgestattet. Zentren der Golgi Mini-Stacks unterliegen der Polynomfunktionen, die chromatische Veränderungen in grün und dunkelrote Kanäle zu korrigieren.

Durch GLIM erreichen wir eine Auflösung von ~ 30 nm entlang der Golgi-Achse unter Standardbedingungen. Wichtiger ist, bietet es eine systematische Methode um alle Golgi-Protein quantitativ abzubilden. GLIM kann durch konventionelle Mikroskope, wie z. B. Weitfeld- oder konfokale Mikroskope mit gemeinsamen Fluoreszenz Kennzeichnung Protokollen durchgeführt werden. Die Bildgebung und Datenverarbeitung können so kurz wie eine Stunde dauern. Durch GLIM, haben wir direkt bewiesen die progressiven Übergang der sekretorischen Ladung aus der Cis- Trans-Seite des Golgi-7.

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Protocol

Hinweis: Im folgenden ist ein Schritt für Schritt Protokoll von GLIM zur Bestimmung der LQ EGFP-Tags Tyrosylprotein Sulfotransferase 1 (TPST1), ein Golgi-resident-Enzym in HeLa-Zellen.

1. Vorbereitung der Fluoreszenz-markierten Golgi Mini-stacks

  1. Glasdeckgläser vorbereiten
    1. Aliquoten 0,3 mL sterile Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) zu einem Brunnen von einer 24-Well-Platte in einer Gewebekultur-Haube.
    2. Wischen Sie ein Stück Φ 12 mm No.1.5 Glas Deckglas mit weichem Tissue-Papier getupft mit 70 % Ethanol, um Ablagerungen auf der Oberfläche von Glas-Deckglas zu entfernen. Verwenden Sie ein paar scharfe Pinzette, um kurz das Deckglas in 70 % igem Ethanol einweichen, in der 24-Well-Platte übertragen und es auf den Boden gut mit sterilen DMEM sinken.
      Hinweis: Glasdeckgläser sind konventionell durch Abflammen sterilisiert. Jedoch riss Deckgläsern unter einer solchen Behandlung leicht beim anschließend handling. 70 % Ethanol Einweichen ist wirksam bei der Sterilisierung von Glasdeckgläser ohne sie zu beschädigen.
    3. Verlassen Sie mit dem Deckel abgedeckt die 24-Well-Platte in das 37 ° C CO2 Inkubator bis zur Verwendung.
  2. Samenzellen
    1. Kultur-HeLa-Zellen (im folgenden Zellen) in einem t-25 Kolben in DMEM mit 10 % ergänzt fetalen Bovine Serum (FBS) (im folgenden kompletten Medium) in einem 37 ° C CO2 Inkubator mit 5 % CO2geliefert. Antibiotika sind nicht notwendig.
    2. Wenn Zellen erreichen ~ 80 % Konfluenz Aspirieren das Kulturmedium. Hinzufügen von 0,25 % 1 mL Trypsin-EDTA in den Kolben und inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C CO2 Inkubator für komplette mittlere und 2 min. Add 1 mL in die Flasche und sanft spülen die Zellen von der Küvette Wand durch pipettieren.
    3. Übertragen Sie freistehende Zellen auf eine sterile Zentrifugation Rohr und Spin bei 500 X g für 2 min, pellet-Zellen. Aspirieren des Überstands und hängen Sie die Zelle Pellet in 1 mL komplette Medium.
    4. Aspirieren Sie das Medium in den Brunnen des 24-Well-Platte mit den sterilisierten Glas Deckglas und Samen ~ 1 x 10-5 -Zellen in den Brunnen. Das Volumen des Brunnens mit kompletten Medium bis 0,5 mL auffüllen. Brüten Sie in einem 37 ° C CO2 Inkubator mit 5 % CO2geliefert. Kulturzellen, ~ 80 % Konfluenz.
  3. Zellen zu transfizieren
    Hinweis: Gespreitete Zellen sind vorteilhaft für imaging verteilten Golgi Mini-Stacks.
    1. Transfizieren ~ 80 % konfluierende Zellen mit 80 ng GalT-mCherry-7 und 320 ng TPST1-EGFP (siehe Tabelle der Materialien) DNA Plasmide mit einem Transfection Reagens gemäß dem Protokoll des Herstellers. In einem 37 ° C CO2 Inkubator inkubieren. Verändern Sie das Medium nach 4-6 h Inkubation. Die Zellen sind bereit ~ 12 h später.
  4. Nocodazole Behandlung, Golgi Mini-Stacks zu generieren
    1. Bereiten Sie eine Nocodazole-Stammlösung (33 mM) durch Auflösen von 10 mg Nocodazole Pulver in 1 mL Dimethyl Sulfoxid. Aliquoten Vorratslösung und Store bei-20 ° C für langfristige Lagerung.
    2. Verdünnen Sie 1 µL Nocodazole-Stammlösung (33 mM) in 1 mL 37 ° C komplette Medium (Endkonzentration 33 µM). Zentrifugieren Sie bei Höchstgeschwindigkeit um Partikel zu entfernen.
    3. Aspirieren Sie das Medium in den Brunnen und 0,5 mL 33 µM Nocodazole mit kompletten Medium. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C CO2 Inkubator für 3 h fortfahren, Immunfluoreszenz Kennzeichnung (Abschnitt 1.5).
  5. Immunfluoreszenz Kennzeichnung
    Hinweis: Bewahren Sie Zellen im Dunkeln Immunofluoreszenz GalT-mCherry und TPST1-EGFP zu vermeiden.
    1. Reagenzien für die Immunfluoreszenz Kennzeichnung vorbereiten
      1. Um 4 % Paraformaldehyd Lösung vorzubereiten, 4 % (w/V) Paraformaldehyd Pulver in heißem 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auflösen und die Lösung durch 0,45 µm-Filter filtern. Die Lösung kann bei-20 ° c aufbewahrt werden
        Vorsicht: Paraformaldehyd ist giftig und karzinogen und es kann Hautreizungen verursachen. Tragen Sie geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (PSA).
      2. Um Fluoreszenz Verdünnungspuffer (FDB) vorzubereiten, mischen Sie 5 % (V/V) FBS und 2 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA) in 1 X PBS. Filtern Sie die Lösung durch 0,45 µm-Filter und speichern Sie die Lösung bei-20 ° C.
      3. Auflösen von 5,35 g NH4Cl Pulver in 1 L Wasser um 100 mM NH4Cl vorzubereiten und die Lösung bei Raumtemperatur lagern.
      4. Auflösen von 10 % (w/V) Saponin Pulver in Wasser 10 % Saponin, aliquoten vorbereiten und speichern die Lösung bei-20 ° C.
    2. Fixierung
      1. Spülen Sie gut einmal mit 0,5 mL 1 x PBS-Lösung und fügen Sie 0,5 mL 4 % Paraformaldehyd Lösung hinzu. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie nun zweimal mit 0,5 mL 1 X PBS und zweimal mit 0,5 mL 100 mM NH4Kl. Spülen den Brunnen zweimal mit 0,5 mL 1 X PBS. Zellen können mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C über Nacht im Dunkeln gehalten werden.
    3. Kennzeichnung der Fluoreszenz
      1. Verdünnen Sie 1 µL Maus Anti-GM130 Primärantikörper in 500 µL FDB mit 0,1 % Saponin. Kehren Sie den Deckel des 24-Well-Platte und 10 µL Primärantikörper Mischung auf den Deckel.
      2. Verwenden Sie scharfe Pinzette zum Extrahieren und übertragen der Glas-Deckglas auf der Tropfen Antikörper Mischung zu gewährleisten, den die Zelle Seite in Kontakt mit der Mischung ist. Inkubieren Sie die Zellen mit der primären Antikörper-Mischung für 1 h bei Raumtemperatur.
        Hinweis: Der Deckel mit dem Deckglas kann in einer befeuchteten Plastiktüte im Dunkeln platziert werden.
      3. Verwenden Sie ein paar scharfe Pinzette zu extrahieren und übertragen das Deckglas auf den Brunnen mit der Zelle-Seite auf und spülen ihn mit 0,5 mL 1 X PBS-Puffer für dreimal in ≥ 30 min. Schütteln ist nicht notwendig.
      4. Verdünnen Sie 1 µL dunkelrote Fluorophor konjugierten Ziege Anti-Maus IgG (Sekundärantikörper) in 500 µL FDB mit 0,1 % Saponin.
      5. Waschen Sie und reinigen Sie die umgekehrte Oberfläche des Deckels von der 24-Well-Platte. Wenden Sie 10 µL dunkelrote Sekundärantikörper Mischung auf den Deckel. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. Montage
      1. Bereiten Sie das Eindeckmittel durch Mischen von 1 g Glycerin, 2,2 g Poly(vinyl alcohol) (MW ~ 31.000 Da), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) und 8,8 mL H2O. lösen sich die Mischung in einem 60 ° C-Wasserbad mit gelegentlich aufschütteln. Speichern Sie die Lösung bei-20 ° C.
      2. Tauen Sie das Eindeckmittel und übertragen Sie 10 µL auf einen Objektträger. Überlagern Sie das Deckglas (Zelle Seite nach unten) auf den Tropfen Eindeckmittel. Inkubieren Sie die Objektträger bei 37 ° C für 30 Minuten oder 1 h das Eindeckmittel Härten bei Raumtemperatur. Versiegeln Sie das Deckglas mit farblosen Nagellack und speichern Sie die Objektträger bei-20 ° C.

2. Vorbereitung des fluoreszierenden Perlen für chromatische Schaltkorrektur

  1. Deckglas Reinigung
    1. Legen Sie vorsichtig ein Stück 25 mm No.1.5 Glas Deckglas auf einem Kunststoff-Rack.
    2. Übertragung der Rack mit dem Deckglas auf eine 400 mL-Becherglas gefüllt mit 300 mL 1 M NaOH und beschallen in einem Bad Sonikator (35 Watt) für 15 min. kurz spülen das Rack in eine 400 mL-Becherglas mit 300 mL entionisiertem Wasser gefüllt. Übertragen Sie das Rack auf eine 400 mL-Becherglas gefüllt mit 300 mL 99 % Ethanol und beschallen in Bad Sonikator für 15 min. kurz spülen das Rack in eine 400 mL-Becherglas mit 300 mL entionisiertem Wasser gefüllt.
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 zwei weitere Male.
    4. Spülen Sie dem Gestell mit dem Deckglas in 300 mL entionisiertem Wasser in eine 400 mL-Becherglas für 10 min. wiederholen den Schritt zwei weitere Male. Übertragen Sie das Rack auf einem 60 ° C Ofen und trocknen Sie das Deckglas für 1 h Laden der getrockneten Deckglas in einer Petrischale staubfrei.
  2. Immobilisierung von fluoreszierenden Perlen auf der Glas-Deckglas
    1. 110 nm Multi-Color fluoreszierenden Perlen 80-fold-in-1 x PBS mit 0,1 µg/µL BSA zu verdünnen. Kurz Wirbel das Rohr Wulst Aggregate zu zerstreuen. Verbreiten von 60 µL verdünnt Perlen auf den gereinigten Φ 25 mm No.1.5 Glas Deckglas (siehe Abschnitt 2.1) mit einer Pipettenspitze. Trocknen Sie das Deckglas in den Exsikkator gestellt, verbunden mit einer Vakuumpumpe im Dunkeln und montieren das Deckglas auf einem Objektträger in 50 µL Eindeckmedium (siehe Schritt 1.5.4.2).

3. die Bildaufnahme

Hinweis: GLIM erfordert Bilder von hohen Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) für hohe Präzision der Massenmittelpunkt Berechnung. Das Bild kann vom konventionellen Mikroskopen wie die Laser-scanning-konfokale, Spinning Disk konfokale oder Weitfeld-Mikroskop aufgenommen. Weitfeld-Mikroskop mit Plan-apochromatische Objektive und ein geringes Rauschen-Bildsensor ausgestattet, wie z. B. ein Charge - Coupled Device (CCD) und wissenschaftliche ergänzende Metall-Oxid-Halbleiter (sCMOS) verwendet werden können. Parameter für den Bildsensor werden angepasst, um einen niedrigen lesen-Lärm und hohen Dynamikumfang sorgen. Das Mikroskop mit der optimalen Konfiguration der Fluoreszenz-Filter für Grün, mCherry und dunkelrote Fluorophor ausgestattet werden muss, und es müssen vernachlässigbar Fluoreszenz Übersprechen. Im Idealfall die imaging-System erreicht eine Nyquist Sampling-Rate in der x-, y- und Z-Achse, die in der Regel erfordert die X, y und Z Größe ein Voxel zu weniger als 100, 100 und 200 nm, beziehungsweise. Die x- und y Größe der Voxel sind immer gleich und werden als Pixel_size bezeichnet. Die Pixel_size kann berechnet werden, indem man die Sensorgröße der Kamera durch die System-Vergrößerung.

  1. Bild mehrfarbige Perlen
    1. Bild mehrfarbige Perlen in grün, rot und dunkelrote Kanäle zu Beginn und am Ende jeder bildgebenden Sitzung.
      Hinweis: Hier wurden Bilder mit einem konventionellen Weitfeld-Epi-Fluoreszenz-Mikroskop (invertiert) 100 X NA 1.4 Plan-apochromatische Objektive, motorisierte Bühne, 200 Watt Metall-Halogenid-Lichtquelle und 16-Bit sCMOS Kamera ausgestattet erworben. Die Wellenlängen für Erregung (Bandpass), dichroitische Spiegel (langen Pass) und Emission Filter (Bandpass) des grünen Kanals Filter Cubes sind 465-495, 505 und 515-555 nm; für den Rot-Kanal Filter Cube sind 528-553, 565 und 578-633 nm; und das für die dunkelrote Kanal Filter Cube sind 590-650, 660 und 663-738 nm. Während der Akquisition, die Größe des ein Voxel entlang der x-, ist y- und Z-Achse 64, 64 und 200 nm, bzw..
    2. Finden Sie eine Sichtfeld mit gute Perle Dichte.
    3. 3D Bild-Stacks in grün, rot und dunkelrote Kanäle (KanalG, KanalR, KanalB, beziehungsweise) zu erwerben. Nehmen Sie 3 Abschnitte oberhalb und unterhalb der besten Brennebene (7 Abschnitte pro Stapel). Speichern Sie die drei Stacks als drei TIFF-Dateien.
      Hinweis: Die Belichtungszeit für jeden Kanal wird empirisch bestimmt den Dynamikbereich, Pixel-Sättigung zu vermeiden und möglichst gering Immunofluoreszenz. Andere Parameter wie Filter und die X, y und Z Größe der Voxel werden ausgewählt, wie oben beschrieben.
  2. Bild Golgi Mini-stacks
    1. Einsatz TPST1-EGFP und GalT-mCherry transfiziert und Gewebekulturen beschriftet (Abschnitt 1.5) Folien, Zellen, dass ausdrückliche TPST1-EGFP und einer niedrigen oder mittleren Ebene GalT-mCherry zu finden. 3D-Bild Stapel zu erwerben, wie in Schritt 3.1.3 beschrieben.

(4) Bildanalyse

  1. Zentren der fluoreszierenden Perlen zu erwerben
    1. In ImageJ, eine Reihe von Perle Bilder bestehend aus drei TIFF-Dateien zu öffnen (Datei > Bild > öffnen).
    2. Durchschnittlich 3 aufeinanderfolgende Abschnitte um den besten fokussierte Abschnitt im KanalR Bild > Stacks > Z Projekt. Geben Sie die Abschnittsnummer des "Start-Scheibe" und "Stop-Scheibe", und wählen Sie unter Optionen "Projektion Typ", "Mittlerer Intensität".
    3. Zeichnen Sie Regionen von Interesse (ROIs), die keine Perlen im Bild mit "Polygon-Selektionen" enthalten. In "Analyze > Set Messungen", nur "Graue Mittelwert" und "Standardabweichung" zu überprüfen. Führen Sie dann "Analyze > Messen" bedeuten und SD des ROI zu erhalten.
    4. Berechnen Sie die Hintergrundintensität als "mittlere + 6 × SD". Ziehen Sie das Bild mit den entsprechenden Hintergrund Intensitätswerte durch "Prozess > Mathematik > subtrahieren", geben Sie den Hintergrund Intensitätswert entspricht diesen Kanal.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2, 4.1.4 für KanalG und KanalB Bild Stacks mithilfe des gleichen Start und stop Scheibe und den gleichen Hintergrund ROI. Notiz, die der ROI im Schritt 4.1.3 verwendet kann auf KanalG und KanalB Bilder. kopiert werden
    6. Verschmelzen die drei Bilder Hintergrund subtrahiert (Bild > Farbe > Kanäle zusammenfügen) wählen Sie ChannelR rot, KanalG grün und KanalB blau. Ein einzelnes zusammengesetztes Bild bestehend aus drei Kanäle erhalten.
    7. Starten Sie den ROI-Manager (Analyze > Tools > ROI-Manager). Zeichnen Sie einen Quadrat ROI um einzelne Perlen, die sicherstellen, dass es nur eine Perle innerhalb jedes ROI. Fügen Sie den ROI ROI-Manager durch Drücken der Taste "t" auf der Tastatur. Wiederholen Sie diesen Vorgang, und fügen Sie so viele ROIs wie möglich.
    8. In "Analyze > Set Messungen", nur "Mitte der Masse" zu überprüfen.
    9. Wählen Sie KanalR, im ROI-Manager, klicken Sie auf "Messen" zu Zentren; zwei Spalten für x und y Koordinate der Zentren des ROIs im Fenster "Ergebnis" angezeigt. Kopieren Sie und fügen Sie die beiden Spalten in einer Tabelle.
    10. Wiederholen Sie Schritt 4.1.9 fürG und KanalB.
    11. Koordinaten der Zentren in einer einzigen Tabelle in der folgenden Reihenfolge ordnen: xR,R, y xG, yG, xB, und yB. Speichern Sie die Tabelle im Format "CSV" als "beads.csv". Leerzeichen Sie keine im Dateinamen.
  2. Wählen Sie und Messen Sie Golgi Mini-stacks
    1. Installieren Sie zwei Makros (im Anhang in Zusatzmaterialien) in ImageJ, "Makro-Golgi ROI Inspektion" und "Makro-3 Kanäle Ausgangsdaten" durch Plugins > installieren ". Klar ROI-Manager und Fenster "Ergebnis".
    2. Eine Reihe von Golgi Mini-Stapel Bilder, bestehend aus drei TIFF-Dateien zu öffnen (Datei > Bild > Open).
    3. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2 - 4.1.5 und speichern Sie drei Hintergrund subtrahiert Bilder für die spätere Verwendung. Datensatz Hintergrund SDs für KanalR,G undB Kanal als SDR, SDG und SDB, bzw. später für verwenden.
    4. Duplizieren Sie die drei Hintergrund subtrahiert Bilder generiert aus Schritt 4.2.3 (Strg + Shift + D).
    5. Im "Prozess > Bildrechner", zuerst hinzufügen den Hintergrund subtrahiert KanalG KanalR Bilder. Dem Hintergrund subtrahiert KanalB Bild das resultierende Bild hinzufügen. Das resultierende Bild in "Bild > anpassen > Schwelle", wählen Sie "set", "1" als "Niedrigste Schwellenwert" einzugeben. Nach dem Drücken von "Übernehmen", ist ein schwarz / weißes binäres Bild gebracht.
    6. In "Analyze > Partikel zu analysieren", geben Sie den Größenbereich für "Größe (Pixel ^ 2)". Geben Sie "50-Unendlichkeit". Überprüfen Sie "Ausgenommen an Kanten" und "Hinzufügen zum Manager". ROIs mit Golgi Mini-Stacks werden nun die ROI-Manager hinzugefügt.
      Hinweis: Der Größenbereich muss empirisch ermittelt werden, Geräusche auszuschließen, die in der Regel klein sind.
    7. Verschmelzen die drei Bilder Hintergrund subtrahiert (Bild > Farbe > Kanäle zusammenfügen) aus 4.2.3 Schritt wählen Sie ChannelR rot, KanalG grün und KanalB blau. Ein einzelnes zusammengesetztes Bild bestehend aus drei Kanälen wird generiert.
    8. Führen Sie das Makro "Makro-Golgi ROI Prüfung" durch die Auswahl "Plugins > Makro-Golgi ROI Inspektion". Überprüfen Sie im interaktiven Dialogfeld jedes ROI zu halten oder ihn ablehnen. Wählen Sie ROIs, die ein einzelnes Objekt in allen drei Kanälen enthalten.
      Hinweis: Nachdem Sie dieses Tool ausführen, werden abgelehnte ROIs aus dem ROI-Manager eliminiert.
    9. Nur "Area", "Mittlere Grauwert" und "Massenmittelpunkt" Einchecken "Analyze > Set Messungen". Daten durch die Einführung der Makro-Tool "Makro-Ausgabedaten 3 Kanäle" zu erwerben (Plugins > Makro-Ausgang 3 Kanäle Daten).
      Hinweis: Bereiche, mittlere Intensitäten und Zentren (X und y) des ROIs in KanalR,G -Kanal und KanalB werden im Fenster "Ergebnis" angezeigt.
    10. Kopie x und y Koordinaten zentriert in einer Tabelle und ordnen sie in der folgenden Reihenfolge: xR,R, y xG, yG, xB, und yB. Speichern Sie die Kalkulationstabelle als ".csv" Datei (MinistacksCSV). Leerzeichen Sie keine im Dateinamen. Fahren Sie mit chromatischen Schaltkorrektur der Zentren (Abschnitt 4.3) und LQ-Berechnung (Abschnitt 4.4).
  3. Chromatische Schaltkorrektur der Zentren
    1. Matlab Compiler Laufzeit (MCR) zu installieren.
    2. Installieren Sie die folgenden Dateien in einem speziellen Arbeitsordner: my_train.exe und my_test.exe. Kopieren und Einfügen von "beads.csv" und"Ministacks.csv" Dateien im selben Ordner.
    3. Starten Sie "Eingabeaufforderung" von Windows und gehen in den Arbeitsordner durch Eingabe des folgenden Befehls " cd Path_of_working_folder".
    4. Generieren Sie eine chromatische Verschiebung Kalibrierdatei mithilfe von Zentren der Perlen. Geben Sie den folgenden Befehl "my_train.exe Perlen.csv Kalibrierung.mat 1". Eine Datei namens"Kalibrierung.mat" wird in den Arbeitsordner erstellt. Ignorieren Sie andere Dateien, die generiert werden.
    5. Die chromatische Verschiebung der Zentren der Golgi Mini-Stacks zu korrigieren, indem Sie den folgenden Befehl ein "my_test.exe MinistacksCSV Corrected_ministacksCSV Kalibrierung.mat 1" eingeben.
      Hinweis: Eine Datei namens"Corrected_ministacks.csv" wird in den Arbeitsordner erstellt. Es enthält chromatische-Shift korrigierte Koordinaten der Zentren, die in der Reihenfolge von xG,G, y xB und yBangeordnet sind. Ignorieren Sie andere Dateien, die erstellt werden. Nehmen Sie zur Kenntnis, die der rote-Kanal als definiert ist frei von chromatische Aberration und daher XF und yR sind identisch mit raw-Daten.
  4. Berechnung der LQs
    1. Starten Sie die Software zur Datenanalyse und kopieren und einfügen, in der unter Sequenz, meine Grauwerte, Bereichen, Hintergrund SDs Schritt 4.2.3 entnommen (legen Sie sie in Zeile 1) und chromatische Verschiebung korrigiert x und y Koordinaten der Golgi-Mini-Stacks in KanalR in eine Arbeitsblatt als Spalten A bis E. In ähnlicher Weise Datenübertragung entsprechende fürG und KanalB Spalten F bis J und K, O, beziehungsweise.
    2. Fügen Sie acht neue Spalten P hinzu, W, benannt "integrierte Intensität der Kanal R", "integrierte Intensität der Kanal G", "integrierte Intensität von Kanal B", d1, Dx, ABS(tan a), ABS (Tan b) und LQ.
      1. Die oben in der jeweiligen Spalte einen Rechtsklick und wählen Sie "Set Spaltenwerten" zur Berechnung der Werte der einzelnen Spalten. Geben Sie für Spalte P "Col(A)Col(B)"; Geben Sie für Spalte Q "Col(F)Col(G)"; Geben Sie für Spalte R "Col(K)Col(L)"; Eingang für Spalte S, "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" wo "Pixel_size" die Größe der Pixel in nm ist; Eingang für Spalte T, "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; Eingang für Spalte U, "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) ";" Eingang für Spalte V, "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) ";" für Spalte W, Eingang "Col (T) / Col (S)".
    3. Filtern Sie die Golgi-Mini-Stacks durch die drei Kriterien, die in der Einführungbeschrieben.
      1. In der Datenanalyse-Software, gehen Sie zu "Arbeitsblatt > Arbeitsblatt Abfrage" und wählen Sie Spalte Variablen für "If"-Test. Ordnen Sie die folgenden Aliase I1, I2, I3, d1, A und B für die Spalten "integrierte Intensität der Kanal R", "integrierte Intensität der Kanal G", "integrierte Intensität von Kanal B", d1, ABS(tan a) und ABS (Tan b), beziehungsweise. In der "Wenn Bedingung" Feld, geben Sie "I1 > =30*cell(1,3) und I2 > =30*cell(1,8) und I3 > =30*cell(1,13) und d1 > = 70 und (A < = 0,3 oder B < = 0,3)".
      2. Wählen Sie "Extrahieren, neues Arbeitsblatt", klicken Sie auf "Übernehmen". Spalten A-W analysierbar Golgi Mini-Stacks sind in ein neues Arbeitsblatt extrahiert.
    4. In das neue Arbeitsblatt Rechtsklick oben in der Spalte W, wählen Sie "Statistiken über Spalte > Dialogfeld" öffnen "". Check "N Total", "Mittel", "SE bedeuten", "Histogramme". Die statistische Auswertung der LQs wird dann angezeigt.

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Representative Results

Die moderne Forschung Grade Lichtmikroskop ausgestattet mit einem Plan apochromatische Objektiv, wie verwendet in unserem Labor zeigt minimale chromatische Aberration (Abbildung 2A). Eine sorgfältige Prüfung der fluoreszierenden Perlen Multi-Color-Bild zeigen jedoch die Verlagerung der verschiedenen farbige Bilder von der gleichen Wulst (Abbildung 2B). Wir definieren, dass der rote Kanal frei von chromatischen Aberration ist und Zentren der rote Fluoreszenz daher die wahre Position der Perlen sind. Die relative chromatische-Verschiebungen der dunkelrote und grüne Fluoreszenz können von grünen und blauen Vektoren aus der Mitte der rote Fluoreszenz (Abbildung 2C) dargestellt werden. Die chromatische Verschiebung innerhalb der Imaging-Ebene wird durch den grünen und blauen Vektor für jede Perle (Abbildung 2D) empirisch dargestellt. Für unser Mikroskop die chromatische Veränderungen sind nicht einheitlich als Größen und Richtungen der Schichten ändern sich je nach x und y-Positionen. Die chromatische Verschiebung kann erheblich beeinflussen die Genauigkeit der GLIM so die Verschiebung der dunkelrote Zentren sich mehr als 50 lassen nm. Daher muss chromatische Verschiebung korrigiert werden. Sobald Zentren der Perlen gesammelt sind, beschäftigen wir erster Ordnung polynomischen passend zu kalibrieren und nachträglich korrigieren die chromatische Veränderungen der Zentren. Die chromatische Verschiebung Aberration ist durch diesen Ansatz (Abbildung 2 - D-G) stark verbessert.

In Säugetierzellen ist der Golgi-Komplex im Bereich Perinukleäre zusammengefasst, die in der Regel nicht auflösbare unter einem herkömmlichen Lichtmikroskop(Abbildung 3). Nach der Nocodazole Behandlung für 3 Stunden verschwindet der Perinukleäre Golgi-Komplex und Dutzende von Golgi Mini-Stacks montieren Ausfahrt Standorten endoplasmatische Retikulum in das Zytoplasma (Abbildung 3B). Große Teile der Golgi-Membran und aggregierte Golgi Mini-Stacks sind vorhanden und sie sind nicht für die Analyse ausgewählt. Ein Beispielbild veranschaulicht die Auswahl der Golgi Mini-Stacks ist in Abbildung 3Cdargestellt. Verwenden die "Makro-Golgi ROI" Prüfwerkzeug, 40 ausgewählte Golgi Mini-Stacks in Abbildung 3Daufgeführt sind. Nach Anwendung der drei Kriterien, waren 21 Golgi Mini-Stacks analysierbar und ausgewählten für die Berechnung der LQs des TPST1-EGFP (Abbildung 3D; als "L" bezeichnet), mit ihren Statistiken, dargestellt in Abbildung 3E. Insgesamt wurden 111 analysierbar Golgi Mini-Stacks aus 12 Zellen ausgewählt und die LQ TPST1-EGFP wurde gemessen, um 0,76 0,04 werden (Mittelwert ± SEM; n = 111) (Abbildung 3F). Die LQ TPST1-EGFP positioniert sich zwischen Giantin (LQ = 0,59) und EGFP-Rab6 (LQ = 1,04)7. Es ist in der Nähe von GS15 (LQ = 0,83) und ST6GalT1-AcGFP1 (LQ = 0,82). Haben wir die Sub-Golgi Regionen entsprechend LQs unter Berücksichtigung qualitativer Lokalisierungsdaten aus der Literatur definiert: ERES/ERGIC, < -0,25; GUS, 0,00 ± 0,25; Medial, 0,50 ± 0,25; Trans-Golgi, 1,00 ± 0,25 und TGN, 1,25-2,00. Die LQ TPST1-EGFP zeigt daher seine Trans-Golgi-Lokalisierung, die im Einvernehmen mit einer früheren Studie14ist.

Figure 1
Abbildung 1 . Schematischen Abbildungen zeigen Variablen für die Berechnung des GLIM. (A) Xz Ansicht aus einem Mini-Golgi-Stapel, die co-axial Zentren der GM130, GalT mCherry und Protein hat x Fluoreszenz zeigt Golgi, Achse, axiale Winkel und dX d1. Das Bild des Golgi Mini-Stack ist seine Projektion auf der Bildebene. (B) Xy Blick auf einen Mini-Golgi-Stapel mit einfallenden Mitte des Proteins x zeigt Winkel α, Winkel β und Projektion axialen Abstand dX. A und B sind aus Abbildung 1E und Abbildung 1F unserer früheren Publikation7, bzw. angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Korrektur der chromatischen Verschiebung. (A) Das dreifarbige zusammengefügte Bild von 110 nm mehrfarbige Perlen erworben durch ein Weitfeld-Mikroskop. Jede Perle strahlt grün, rot und dunkelrote (künstlich gefärbt als blau) Fluoreszenz. Skala bar 10 µm. (B) vergrößerte Ansicht eines zusammengeführten Single-Bead-Images mit einer spürbaren chromatische Verschiebung. Skalieren, bar, 200 nm. (C) eine schematische Darstellung zeigt, dass Verschiebungen der grünen und dunkelrote Perle Bilder von Vektoren aus der Bildmitte rote Perle (0,0) zu Zentren von Grün (grüne Vektor) und dunkelrote (blau) Perle Vektorbilder, bzw. dargestellt werden können. (D, E) Die Wirkung der chromatischen Schaltkorrektur. Im gleichen Bereich des Bildes grüne und blaue Vektoren werden gezeichnet, vor und nach Korrektur zu verlagern. Um die winzige Verschiebung zu visualisieren, ist das Ausmaß der jeden Vektor 200-fach verstärkt. (F, G) Streuen Sie Grundstücke, die Zentren der grüne (grüne Punkte) und dunkelrote (blaue Punkte) Perlen zeigen, vor und nach Schaltkorrektur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Ein typisches Beispiel für GLIM, hier Erwerb der LQ TPST1-EGFP. Eine HeLa-Zelle mit dem Ausdruck TPST1-EGFP (grün) und GalT-mCherry (rot) waren voller Flecken für endogene GM130 (blau). (A) A typische Zelle. (B, C, D, E) Eine Zelle mit Nocodazole behandelt wurde abgebildet (B). Aus dem Bild wurden analysierbar Golgi Mini-Stacks ausgewählt, wie in Cgezeigt. Ausgewählten Golgi Mini-Stacks werden Kenn-Nummern bezeichnet. Bilder von diesen maskierten Golgi Mini-Stacks werden unten in D mit ihrer ID-Nummern angezeigt. "L" bedeutet, dass der Golgi Mini-Stack für die Berechnung der LQ (analysierbar Golgi Mini-Stacks) gültig ist. Histogramm der LQs 21 Mini-Stacks aus der Zelle zeigt E. (F) Histogramm der LQs 111 Mini-Stacks aus 12 Zellen. Im Histogramm angezeigte Wert ist Mittelwert ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

ZUSATZMATERIALIEN: Makro-Golgi ROI inspection.ijm, Makro-Ausgang 3 Kanäle data.ijm, Matlab Codes, My_train.exe, My_test.exe und Tabelle template.opj.

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Discussion

Die Lokalisation eines Proteins Golgi unter der Lichtmikroskopie war bisher vor allem durch den Grad der Korrelation oder Überlappung des Bildes des Proteins mit dem Bild einer Golgi-Markierung von bekannten Lokalisierung15,16quantifiziert, 17. Resultierende Korrelation oder überlappende Koeffizient spiegelt wider, wie nah das Test-Protein die Golgi-Marker räumlich ist. Es gibt mindestens drei Einschränkungen für diesen Ansatz. Erstens die Korrelation oder überlappende Koeffizient ist nichtlinear und räumliche Distanz wird nicht direkt angezeigt. Zweitens ist der Grad der Korrelation kritisch abhängig von der Auflösung des mikroskopischen Systems. Daher ist der Koeffizient zwischen zwei Golgi Proteine keine konstante systemunabhängig. Dritten, zwei Golgi-Proteine mit dem gleichen axialen Lokalisierung, aber verschiedene Querverteilung entlang Cisternen können unterschiedliche Koeffizienten haben. Daher bedeutet die Korrelation oder überlappende Koeffizient nicht die axiale Lokalisierung eines Golgi-Proteins. In eine alternative Methode vorschlägt, Dejgaard Et Al., Cis, Trans-Golgi-Marker und das Protein des Interesses sind dreifach-Label in Nocodazole behandelt Golgi Mini-Stacks, ähnlich wie GLIM. Innerhalb jedes Golgi Mini-Stack Positionen der drei maximale Intensität Pixel erworben und die relative Position des Test-Proteins als Distanz-Verhältnis18berechnet. Ihre Methode ist jedoch nicht in der Lage, Sub-Pixel-Auflösung zu erreichen, die ihrer Anwendung sehr begrenzt. Im Vergleich zu bisherigen quantitativen Methoden, GLIM, die unabhängig voneinander entwickelt wurde, sondern trägt ein ähnliches Konzept mit der Dejgaard Et Al., ist in der Lage, die axiale Lokalisierung eines Golgi-Proteins mit bisher unerreichter Genauigkeit und Konsistenz zu quantifizieren.

Wir präsentierten das Protokoll von GLIM LQ von EXOGEN ausgedrückt GFP-markierte Protein - TPST1-EGFP zu erwerben. Der LQ des körpereigenen Proteins kann bestimmt werden, wenn die Antikörper zur Verfügung steht. Abhängig von der Sorte von den primären Antikörper, Maus oder Kaninchen, dann ein Kaninchen oder Maus Anti-GM130-Antikörper kann bzw. in der Dreifach-labeling-Protokoll verwendet werden. Hase und Maus Anti-GM130-Antikörper für die Immunfluoreszenz Kennzeichnung sind im Handel erhältlich. Wir haben bereits gezeigt, dass Kaninchen und Maus Anti-GM130 Antikörper die gleichen Ergebnisse in GLIM7geben. Wenn das Protein Test intrinsisch rot in Fluoreszenzemission, wie mCherry Fusion, ein GLP-Tags Golgi ist Marker Protein mit bekannten LQ in Kombination mit GM130 Antikörper Kennzeichnung kann verwendet werden, um Triple-Label Zellen und indirekt ableiten der LQ des Test-Proteins. Vorausgesetzt, die Marker Protein LQ ist LQm und der Abstand von der Mitte des Marker Proteins mit der GM130 dm, der LQ Test Protein X (dX/dm) × LQmerrechnet werden. Einer der größten Vorteile von GLIM im Vergleich zu super-Auflösung Mikroskopie ist, dass es leicht auf das live Cell Imaging in konventionellen mikroskopischen Setups angewendet werden kann. Wir haben eine Kombination von drei Fluoreszenz Proteine, GFP-Golgin84, mCherry-GM130 und GalT-iRFP670, versucht, für dynamische Überwachung der LQ GLP-Golgin84 in einzelnen Golgi Mini-Stacks7.

In GLIM ist der zeitaufwändigste Schritt nach der Übernahme Analyse, vor allem bei der Auswahl von analysierbar Golgi Mini-Stacks. Wie Golgi Mini-Stacks in Größe und molekulare Zusammensetzung19heterogen sind, ist es unklar, ob die Verteilung der LQs (Abbildung 3F) die heterogene Architektur des Golgi Mini-Stacks oder die Unsicherheit unserer Berechnung der repräsentiert die LQ. Unabhängig von den Ursachen fanden wir, dass es wichtig ist, eine große Anzahl von analysierbar Golgi Mini-Stacks (n) für die Richtigkeit der LQ, die gefährdet ist, wenn n klein ist. In der Regel liefert Daten mit n ≥ 100 von mehreren Zellen zuverlässig LQs. Daher gibt GLIM Ensemble gemittelt Lokalisierungsdaten verdeckt die Individualität der Golgi Mini-Stacks. Eine weitere Einschränkung der GLIM ist, dass es wird davon ausgegangen, dass alle Golgi Proteine eine enge Verteilung rund um ein einziges Zentrum haben. Einige Golgi-Proteine, wie z.B. COPI Untereinheiten, ARF1 und löslichen N-Ethylmaleimide-Sensitive Faktor Anhang Protein-Rezeptor (SNAREs)20,21, berichtet worden, im großen und ganzen verteilen aus der GUS in der Trans- Golgi und die TGN. Es ist wahrscheinlich nicht angebracht, die Golgi-Lokalisierung durch die LQ zu studieren. Wie GLIM manuelle Auswahl der Golgi-Mini-Stacks, erstreckt sich mittlerweile auf die mühsame und subjektiv ist, wird die zukünftige Entwicklung der GLIM sein, ein Software-Tool zur Golgi Mini-Stacks mit minimaler menschlicher Störung automatisch wählen umzusetzen.

Was ist die räumliche Auflösung der GLIM? Da der LQ ein Verhältnis, die ohne Einheitenangabe ist, bedeutet es keine räumliche Distanz. Hier versuchen wir, eine sehr grobe Schätzung zu geben. Die räumliche Auflösung der GLIM kann als die kleinste axialen Abstand zwischen zwei auflösbare Golgi-Proteinen definiert werden. LQs von verschiedenen Golgi Proteine7untersuchen, fanden wir, dass SEMs von Datasets mit n ≥ 100 Bereich um 0,03. Angenommen, zwei Golgi Proteine haben die gleichen n = 100 und SEM = 0,03, der zwei Golgi Proteine haben bedeutende unterschiedliche Lokalisation durch t-Test (p < 0,05), d. h.auflösbar, wenn der Unterschied zwischen ihrer LQs ≥ 3 × SEM = 0,09. Aus den EM-Daten können wir abschätzen, dass die axiale Länge des Golgi Mini-Stacks, die auch der Abstand vom GM130 zum GalT-mCherry in GLIM, ~ 300 nm8. Daher die Auflösung des GLIM wird voraussichtlich 0,09 × 300 = 30 nm entlang der Golgi-Achse. In GLIM ergibt eine größere n in der Regel kleinere SEM, was wiederum in einer höheren Auflösung führt.

Es ist wahrscheinlich nicht angebracht, die Auflösung der GLIM derjenigen der Immuno-Gold EM direkt zu vergleichen, da die letztere Technik nicht direkt quantitative Lokalisierungsdaten erbringt. Ähnlich wie bei GLIM, kann die Auflösung der Immuno-Gold EM entlang der Golgi-Achse als der kleinste Abstand zwischen zwei auflösbare Golgi-Marker definiert werden. Um seine Auflösung messen erfordert das Studium der Dual-Immuno-Gold Kennzeichnung von zwei Golgi-Proteine, die eng nebeneinander entlang der Golgi-Achse sind. Solche systemischen Studie ist nach unserem Kenntnisstand vermutlich nicht verfügbar. Wie in der Einleitung erwähnt, einer der limitierenden Faktoren in die räumliche Auflösung der Immuno-Gold EM ist die Größe des Antikörpers Komplex, wodurch die Auflösung schlechter als sein ~ 20 nm. Ein weiterer wichtiger begrenzender Faktor der Bildauflösung ist die Kennzeichnung Dichte des Antigen-Moleküle. Nach der Nyquist Sampling Theorie muss mindestens zwei Goldpartikel Stückpreis Auflösung. In den meisten Immuno-Gold EM Studien sind die Abstände zwischen den Nachbarn gold Partikel nicht < 15 nm aufgrund der sehr niedrigen Effizienz Kennzeichnung; Dies macht es schwierig für diese Technik zu einer Bildauflösung von weniger als 30 nm. Unter diesem Gesichtspunkt schätzen wir, dass die Auflösung der GLIM von Immuno-Gold EM zumindest vergleichbar ist.

GLIM ist eine robuste Methode, die sehr konsistente Ergebnisse liefert. Es ist unabhängig von der Art des Mikroskops verwendet. Wir haben getestet, dass Weitfeld- und rotierenden Scheibe konfokale Mikroskope hat die gleichen Ergebnisse ergeben. LQs der gleichen Golgi-Proteine, die bei verschiedenen Chargen von Experimenten erworben wurden auch in guter Übereinstimmung mit einander. Eine LQ-Datenbank, bestehend aus einer vielfältigen Palette von Golgi ansässigen Proteine wurde zum Vergleich und zur Auslegung generiert. Wir erwarten, dass die weitere Verwendung von GLIM in der Forschungsgemeinschaft die Datenbank deutlich erweitern wird. Infolgedessen wird eine vollständige Datenbank quantitativ beschreiben die Lokalisierung einer großen Anzahl von Golgi-Proteinen dabei helfen, in die Organisation und Funktion der Golgi-Komplex zu verstehen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir möchten D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Vereinigtes Königreich) für die TPST1-EGFP DNA Plasmid, Lakshmi Narasimhan Govindarajan Danke für die Hilfe bei der Software-Optimierung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Medical Research Council (NMRC/CBRG/007/2012), Ministerium für Bildung (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 und RG132/15 und AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073), l.l.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
saponin Sigma-Aldrich 47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
BSA Sigma-Aldrich A9647
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody

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References

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