Forberedelse og metaboliske analyse af 3-dimensionelle klumpformet Co kulturer af kræft i bugspytkirtlen celler og fibroblaster

Cancer Research
 

Summary

Her, er en metode beskrevet for udarbejdelsen af 3-dimensionelle (3D) klumpformet Co kultur af kræft i bugspytkirtlen celler og fibroblaster, efterfulgt af måling af metaboliske funktioner ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Noel, P., Muñoz, R., Rogers, G. W., Neilson, A., Von Hoff, D. D., Han, H. Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts. J. Vis. Exp. (126), e56081, doi:10.3791/56081 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mange typer af kræft, herunder kræft i bugspytkirtlen, har en tæt fibrotisk stroma, som spiller en vigtig rolle i tumor progression og invasion. Aktiveret kræft forbundet fibroblaster er en nøglekomponent i tumor stroma, der interagerer med kræftceller og støtte deres vækst og overlevelse. Modeller, der sammenfatte samspillet mellem kræftceller og aktiveret fibroblaster er vigtige værktøjer til at studere de stromale biologi og for udvikling af antitumor agenter. Her, er en metode beskrevet for den hurtige generation af robust 3-dimensionelle (3D) klumpformet Co kultur af kræft i bugspytkirtlen celler og aktiveret i bugspytkirtlen fibroblaster, der kan bruges til efterfølgende biologiske undersøgelser. Derudover er beskrives brugen af 3D spheroids i udførelsen af funktionelle metaboliske assays til sonde cellulære bioenergetik veje ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer parret med en klumpformet mikrotiterplade. Kræft i bugspytkirtlen celler (Patu8902) og aktiveret i bugspytkirtlen fibroblastceller (PS1) var Co kulturperler og magnetiseret ved hjælp af et biokompatibelt nanopartikel forsamling. Magnetiseret celler blev hurtigt bioprinted bruger magnetiske harddiske i en 96 godt format, i vækst medier til at generere spheroids med en diameter på mellem 400-600 µm i 5-7 dage af kultur. Funktionelle metaboliske assays ved hjælp af Patu8902-PS1 spheroids blev derefter gennemført ved hjælp af ekstracellulære flux teknologi for at sonde cellulære energiske veje. Metoden heri er simpel, tillader konsekvent generation af kræft celle fibroblast klumpformet Co kulturer og potentielt kan tilpasses andre kræft celletyper ved optimering af den nuværende beskrevne metode.

Introduction

I det sidste årti, er talrige in vitro- 3D modeller blevet udviklet for at sammenfatte og undersøge i vivo tumor biology, mikromiljø og vækst betingelserne af kræft celler1,2. Todimensionale (2D) éncellelag celle kultur systemer med ensartet eksponering til biokemiske faktorer og investigational forbindelser undlader at replikere de native 3D tumor-stromale interaktioner udsat til et forløb af forbindelser spreder gennem den ekstracellulære matrix proteiner (ECM)3,4. Således, i forhold til 2D vævskultur modeller, 3D kræft modeller har dukket op for at vise bedre potentiale på simulering tumor mikromiljø og fungerede som vigtige værktøjer til bedre forstå i vivo tumor karakteristika, såsom hypoksi, desmoplasia, vækstdvale, drug penetrans, toksicitet og terapeutiske modstand5,6. Med henblik herpå har 3D modeller potentiale til at bygge bro over kløften mellem 2D cellekultur og heldyrsmodeller ved at efterligne i vivo tumor funktioner, mens at være relativt billig og optimeret for hurtige generation og konsistens. Disse fordele udnyttes for at fremskynde Translationel forskning i mange områder, herunder kræft biologi, morfogenese og tissue engineering7,8.

I en bølge af skiftende 3D vævskultur metoder, magnetisk levitation teknik er for nylig blevet udviklet og beskrevet for vækst, materialeprøvning og imaging af spheroids stammer fra forskellige celle typer9,10, 11 , 12. magnetiske 3D bioprinting udnytter brugen af magnetiske kræfter at ingeniør væv af magnetizing celler med biokompatible nanopartikler og udskrive dem i multi godt formater. Dette giver mulighed for hurtig produktion af konsekvent, i nærheden af identiske 3D spheroids, som kan udnyttes og ansat i et væld af downstream ansøgninger om undersøgelse af biokemiske og biofysiske10. Her har vi tilpasset den magnetiske bioprinting teknik ved hjælp af en biokompatible materiale kaldet Nanoshuttle (NS) sammensat af jernoxid, poly L-lysin og guld nanopartikler at mærke bugspytkirtelkræftceller og fibroblaster. NS tillægger elektrostatisk plasmamembran, vides ikke at binde sig til nogen specifikke receptorer, og udgivelser fra cellen overfladen inden for en uge. Det kræver meget lav magnetiske kræfter (30pN), nok til sammenlagt, men ikke skade celler og ikke påvirker cellernes levedygtighed, metabolisme eller spredning til at gøre det meget biokompatible for 3D kulturer10,13,14 ,15.

I denne undersøgelse, beskriver ved hjælp af kræft i bugspytkirtlen som et eksempel og model, vi generation og metaboliske assay af 3D kræft celle fibroblast spheroids. Startende fra celler dyrkes i 2D fartøjer, illustrere vi kultur og vækst betingelserne af pancreas tumor-fibroblast Co kultur spheroids ved hjælp af magnetiske bioprinting. Kulturperler spheroids blev derefter brugt i funktionelle metaboliske assays ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer, en teknologi godtgjort, at samtidig foranstaltning to store energi producerer veje, glykolyse og mitokondriel respiration, i en bred vifte af levende celler og væv16,17,18,19,20. Glykolyse blev målt som en ændring i den ekstracellulære forsuring sats (ECAR), mens mitokondrie respiration eller oxidativ fosforylering blev målt som ilt forbrugssats (OCR). Vi foreslår, at denne metode udviklet til pancreas tumor spheroids kan tjene som en rygrad for optimering og oversætte 3D tumor klumpformet generation og assay til andre celle/vævstyper.

Protocol

1. kultur af bugspytkirtelkræft 3D Spheroids ved hjælp af magnetisk Bioprinting

  1. ved hjælp af standard aseptisk vævskultur teknik, kultur celler af interesse i en T75 kolben til en confluency på 70-80% i passende vækst medier.
    Bemærk: Typisk 5-7 × 10 6 celler fra en 70-80% sammenflydende T75 kolbe er høstet. To forskellige celletyper blev anvendt i denne undersøgelse - Patu8902 (pancreas tumorceller) og PS1 celler (aktiveret i bugspytkirtlen Stjernehus celler 21). Begge cellelinjer var kulturperler i Roswell Park Memorial Institute media 1640 (RPMI-1640) suppleret med 10% (v/v) føtal bovin serum(FBS), 1 × penicillin-streptomycin (Poulsen).
  2. Vaske cellerne en gang med 5 mL af Dulbecco ' s fosfatbufferet saline(DPBS).
  3. Frigør celler fra plastik overflade af trypsinizing med 2 mL 0,05% Trypsin-EDTA for 5-10 min. ved 37 ° C. Check for celle detachement under et mikroskop.
  4. Deaktiver trypsin ved tilsætning af 8 mL vækst medier til løsrevet celler. Undgå over trypsinization, da dette kan påvirke celler sundhed/levedygtighed.
  5. Afpipetteres celler op og ned for at generere en enkelt cellesuspension og tælle celle tæthed ved hjælp af en automatiseret celle counter eller en hemocytometer.
  6. i mellemtiden reagensglasset et hætteglas med NS til omgivelsestemperatur.
  7. Beregning af celler kræves for såning det ønskede antal spheroids (brønde) og delprøve til en ny 15 mL konisk slange. For eksempel, at frø en hele 96 godt plade med 5.000 celler/brønd, alikvot mindst 5,5 × 10 5 celler.
  8. Indsamle celler ved centrifugering ved 500 x g i 3 min. omhyggeligt Aspirér eller den dekanteres og resuspend celler i en koncentration på 1,0 x 10 6 celler/mL i vækst medier. Pipette forsigtigt ved hjælp af en bred kede afpipetteres tip til at undgå klipning. For eksempel resuspend 5,5 x 10 5 celler i 550 µl af vækst medier.
  9. Magnetisere den ønskede mængde af celler ved hjælp af den afbalancerede NS (trin 1,6).
    1. Direkte tilføje NS til cellesuspension i vækst medier og gnub forsigtigt. For effektiv magnetiske mærkning af celler, bruge 10 µL NS pr. 100 µL celler (genopslemmes på 1 x 10 6 celler/mL).
      Bemærk: For en typisk eksperiment, etiket 5.5 × 10 5 Patu8902 celler i 550 µL med 55 µL NS og 1.1 × 10 6 PS1 celler i 1100 µL, (separat) med 110 µL NS.
    2. Forsigtigt inverter rør et par gange at sikre cellesuspension. Midlertidigt, overføre celle-NS mix i en enkelt brønd af en 24-godt plade. Gøre dette særskilt for hver celletype til magnetisk. Dække plade og inkuberes cellerne ved stuetemperatur i 2 timer med blid ryste for at tillade NS binding til celleoverfladen.
      Bemærk: Kultur og analysen af spheroids starter enten fra Patu8902 eller PS1 alene celler, ud over fælles kultur spheroids startende med både celle typer forblandet før udskrivning på magnetisk drev blev realiseret ved hjælp af denne metode i uafhængige eksperimenter. En metode til at generere Co kultur spheroids fra Patu8902 og PS2 celler er beskrevet nedenfor i de efterfølgende trin.
  10. Afpipetteres op og ned de magnetiserede celler forsigtigt at blande jævnt og forberede en master mix, der indeholder den ønskede celle nummer. For såning spheroids, anvendes i alt 15.000 celler (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) og tilpasse sig en samlet volumen af 150 µL pr. brønd af en 96-brønd plade.
    Bemærk: Endelige mængden udleveres i hver brønd skal være den samme, uanset antallet af celler, der bruges.
  11. Placerer en celle frastødende 96-brønd plade på toppen 96-brønd magnetiske klumpformet drev og dispensere 150 µL af celle mix i hver brønd. Iagttage cellerne langsomt indsamle til midten af godt over magneten. Dække og inkuberes plade natten over i en 5% CO 2 inkubator, indstillet på 37 ° C med magnetisk klumpformet drevet stadig fastgjort. Fjerne den magnetisk drev og der inkuberes i yderligere vækst i op til 7 dage.
    Bemærk: Det er afgørende at bruge celle frastødende vækstzoner for klumpformet udskrivning ved hjælp af magnetiske klumpformet drev. Sikre, bruges den sfæroide kørsel med tyndere mindre magneter, ikke bedrift drevet.
  12. Overvåge vækst af spheroids hver dag. Genopbygge med friske vækst medier hver tre dage ved at placere den vækst plade monteret på den magnetiske holder drev i en vinkel og bruger en multikanals pipette til at trække ud brugt media.
    Bemærk: Patu8902 og PS1 celler Co seedede på 15.000 celler/brønd vil vokse ind i 3D spheroids med en diameter på 400-600 µm i 5-7 dage. På dette tidspunkt spheroids er klar til metaboliske karakterisering, drug evaluering og andre downstream applikationer.

2. Metaboliske Assay af 3D pancreas Tumor Spheroids for bioenergetik veje ved hjælp af den ekstracellulære Flux Analyzer

Note: I dette afsnit, analysen af de metaboliske funktioner af spheroids ved hjælp af en ekstracellulære flux Analyzer med assay mikroplader specialdesignet til 3D spheroids er beskrevet.

  1. Vask og overførsel af spheroids fra vækstzoner til klumpformet assay mikroplader.
    Bemærk: Spheroids kan bruges til metaboliske assays, når de når en diameter på ~ 500 µm.
    1. Dagen før du udfører analysen, fugte sonde eller sensor patronen med assay kalibratoren (200 µL/brønd) i den medfølgende nytte plade, og der inkuberes natten (4-18 h) i en fugtig inkubator (ikke-CO 2) indstillet på 37 ° C.
    2. Forberede passende assay medium ønskede metaboliske analysen ved at supplere den base media (se tabel materialer) med enten 2 mM L-glutamin for glykolyse stress test (GST) assay eller med 1 mM pyruvat, 2 mM L-glutamin og 10 mM glukose for en mitokondrie stresstest (MST) assay.
      Bemærk: Ekstracellulære flux analyzer måler både mitokondrie respiration (OCR) og glykolyse (ECAR) af levende celler i en 96-brønd plade format. Disse priser giver et overblik over cellulære metaboliske funktion i prøver under undersøgelsen. Der henvises til håndbog i assay kits for detaljerede instruktioner.
    3. Efter tilføjelse af assay specifikke kosttilskud (Se trin 2.1.1), varme suppleret assay medium i et 37 ° C vandbad og ph indstilles til 7,4 ± 0,1 med 0.1N NaOH. Holde mediet varme indtil brug.
    4. Rekonstruere assay kit reagenserne i kalibreret assay mellemlang anbefalede stock koncentrationer.
      Bemærk: Disse er lavet på 10 × slutkoncentration ønskes i brøndene. Stock koncentrationer for glukose, oligomycinets og 2-deoxy-glucose (2-DG) er henholdsvis 100 mM, 100 µM og 500 mM,.
    5. Observere spheroids i vækst plade under en lys mikroskop for at kontrollere for klumpformet morfologi og samlede ensartethed, med hensyn til form og strukture af spheroids.
    6. Overføre væksten plade på en magnetisk bedrift drev og Aspirér omhyggeligt ~ 120 µL vækst medier. Forsigtigt vaske spheroids med ~ 120 µL af varmede og forud kalibrerede assay medier, Aspirér og Gentag vask to gange. Inspicere spheroids under mikroskop igen for at sikre, at ikke er vaskede spheroids.
    7. Forbered klumpformet assay mikrotiterplade ved at tilføje 180 µL varm assay medier til hver brønd.
    8. Sat en P20 mikropipette til 10 µL og passe et bredt kede tip til det. Hvis bred kede tips ikke er tilgængelige, afbrød tips af regelmæssige pipette tips med en ren saks eller skalpel udvide boringen.
      Bemærk: Dette bør reducere klipning og bevare den overordnede morfologi af spheroids mens overføres for at assay plader.
    9. Brug en varm (37 ° C) overfladen til at foretage overførslen af spheroids. Brug en X-ray film fremviser overflade varmet med en hvid-lys lampe til at øge kontrasten og støtte visualisering af spheroids under overførselsprocessen.
    10. Omhyggeligt aspirat en enkelt pre vasket klumpformet fra celle frastødende vækst plade ved hjælp af en P20 mikropipette udstyret med en bred kede tip og forsigtigt overførsel klumpformet direkte ind i midten af hver brønd af et klumpformet assay plade for udførelsen af den metaboliske assay. Tillade hver klumpformet at forsigtigt falde i den centrale mikro-kammer i hver brønd af ren tyngdekraften til at udfylde assay plade.
      Bemærk: Det tager normalt 5-8 s for hver klumpformet at falde ind i midten af brønden af tyngdekraften. Må ikke trækkes ud pipetten indtil spheroids har slået sig ned i mikro-kammeret. Gør ikke depositum spheroids i 4 hjørne wells af assay plade (A1, A12, H1, H12) da disse vil blive brugt som baggrund wells.
    11. Overvåge morfologi og placeringen af hver klumpformet til at sikre, at hver klumpformet midt i hver brønd. Hvis det er nødvendigt, Flyt til midten af godt af sugning ud klumpformet ved hjælp af en bred bar afpipetteres tip og efterfølgende deposition af tyngdekraften.
    12. Når alle spheroids er blevet overført, assay pladen anbringes i et 37 ° C befugtet luft inkubator (ikke-CO 2) for en time før at assay.
  2. Loading sensor patron med forbindelser og udfører analysen
    1. Forbered 10 × koncentreret specifikke analysereagenserne i analysen særlig medierne beskrevet taktfast 2.1.2. For eksempel, at udføre GST, rekonstruere glukose, oligomycinets og 2-GD i anbefalede mængder omhandlet i manualen assay. Både GST og MST assays blev udført ved hjælp af Patu8902-PS1 spheroids.
    2. Korrekt orientere sensor patronen med rækker mærket A-H på venstre side og placere en loading guide oven på sensoren patron. Sikre korrekt indlæsning af ønskede port af orientere lastning guide så at brevet svarende til port indlæses er på den øverste venstre hjørne.
    3. Ved hjælp af en multikanalpipette fritage reagenser direkte til injektion havne. Hold læsning guider i position ved hjælp af fingerspidserne under hele proceduren.
      Bemærk: Hver reagens vil blive injiceret i en anbefalede port nævnt i manualen assay. Undgå at skabe luftbobler, men ikke trykke på nogen del af blækpatronen for at fjerne luftbobler.
    4. Fjerne lastning guide og position i øjenhøjde med patron til at visuelt inspicere injektion porte til selv lastning.
    5. Oprette den eksperimentelle assay design/instrument protokol bruger instrument controller bølge software (fremover, analyse software), som beskrevet i afsnit 2.3.
  3. Assay design og udførelse ved hjælp af analyse software
    1. Opret en assay skabelon for eksperimentet
      1. åbne analyse software og klik " skabeloner " eller vælge fra en eksisterende analyse skabelon. Dobbeltklik på " tom skabelon ".
      2. Definer eksperimentelle grupper og betingelser.
        1. Definere injektion strategier for havne A, B og C. Efterlad port D tom.
          Bemærk: For GST assay, kun disse havne vil blive indlæst med glukose, oligomycinets og 2-GD. I tilfælde af MST assay, oligomycinets, FCCP og rotenon vil blive indlæst.
        2. Definer pre behandlinger hvis spheroids blev behandlet med en eller flere test forbindelser og kontrolgruppen. Definere assay medierne til at omfatte kilde, kosttilskud og andre oplysninger.
        3. Definerer en eller flere celletype (f.eks. Patu8902, PS1) at se de oplysninger om tæthed og passage.
      3. Klik " generere grupper ".
      4. Klik " plade kort " fanen og tildele grupper til assay pladen svarende til forsøgets udformning.
      5. Vælg de fire hjørne brønde som baggrund brønde. Sikre, at der er ingen spheroids i disse brønde.
  4. Køre assay på analysatoren
    1. Klik på fanen Instrument protokol holde standarden protokol kommandoer ved at kontrollere " Kalibrer ", " ekvilibreres " og " Baseline måling cyklus ".
    2. Klik " injektioner " og definere sammensatte for hver port. Redigere måling cykler til 6 cyklusser fra standard 3 cyklusser for spheroids. Holde standard 3 min mix, 0 min ventetid og 3 min foranstaltning gange.
      Bemærk: Standard mix-vent-foranstaltning gange er 3 min, 0 min., 3 min., henholdsvis. Tre basale sats målinger er typisk taget før injektion af første assay sammensatte. Disse målinger kan være kalibreret og justeres efter forsøgets udformning.
    3. Gennemgå protokol og gruppe Resumé.
    4. Gem assay designskabelon.
    5. Videre til pre assay kalibrering når injektion porte er blevet indlæst med assay substrater. Overføre patron med nytte plade til ekstracellulære flux analyzer.
      Bemærk: Dette normalt afsluttes inden for 15-20 min og kalibrerer sensorer til at foretage OCR og ECAR målinger.
    6. Efter kalibrering af patronen, erstatte den nytte plade med pre varmede assay pladen som indeholder 3D spheroids og indlede analysen. Når målingerne er gennemført, eksportere data til regneark eller graftegning og statistisk software til at analysere data.

Representative Results

Den generelle arbejdsgang for magnetisk bioprinting og ekstracellulære flux analyse af 3D spheroids
Figur 1 viser et overblik over hele processen beskrevet i denne protokol. Kræft i bugspytkirtlen celler (Patu8902) og aktiveret Stjernehus celler (PS1) var kulturperler i vævskultur flasker der indeholder passende vækst medier til en confluency på 70-80%. Celler blev løsrevet fra 2D kultur fartøj og vasket, celle tæthed blev fastlagt og celler endelig genopslemmes i vækst medier på 1 × 106 celler/mL. NS, en nanopartikel forsamling bestående af guld, jernoxid og poly-L-lysin blev brugt til at magnetisere celler. Individuelt magnetiseret Patu8902 og PS1 celler blev derefter blandet og trykt på 96-brønd celle frastødende vækstzoner monteret på en magnetisk klumpformet drev. Vi har optimeret 15.000 for at være det samlede antal celler for såning en enkelt brønd (5.000 Patu8902 celler blandet med 10.000 PS1 celler til at generere en enkelt klumpformet). Efter inkubering på passende vævskultur betingelser for 5-7 dage, blev 3-dimensionelle spheroids indhentet, i hvilket tidsrum væksten af disse spheroids blev overvåget og registreret. Efter vask med assay medier, var spheroids fysisk overføres til en klumpformet mikrotiterplade at udføre metaboliske assays ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer samtidig måling af glykolyse og mitokondriel respiration.

Kultur og vækst af pancreas tumor-fibroblast spheroids
For at opnå funktionel og robust spheroids, epithelial kræftcelle line Patu8902 og aktiveret Stjernehus celler PS1 var kulturperler i RPMI-1640 suppleret med føtal bovint serum. Pat8902 og PS1 celler magnetisk med NS blev derefter blandet sammen i et forhold på 1:2, således at frø i alt 15.000 celler pr. brønd i en vækst plade. Inden for 24 timer af udskrivning celler på de magnetiske harddiske, celler focalized til midten af brønden præcis på toppen af hver magnetiske pin under hver brønd. Vækst i Patu8902-PS1 spheroids blev overvåget af imaging på dag 2, 4, 7 og 9 efter såning celler. Figur 2 viser kvantificering af repræsentative spheroids gennemsnitlig diameter på forskellige tidspunkter ovenfor. Diameteren af spheroids øges fra 414 µm på dag 2 til 596 µm på dag 7 post udskrivning. Der var ingen signifikant forskel mellem vækst på dag 7 og 9, og dermed alle yderligere forsøg var begrænset til 7 dage af klumpformet vækst. Vi bemærkede, at spheroids erhverve en skarpere morfologi især omkring de ydre kanter og NS er gradvis mere jævnt diffust i hele omfanget af sfæroide med flere dage i kultur. Vi vurderede også kugleform af 10 spheroids baseret på længden af deres overordnede og underordnede akser. Den gennemsnitlige kugleform er 0.92 ± 0,04 for Patu8902 alene (tumor), 0,95 ± 0,04 til PS1 (stromale) alene og 0,94 ± 0,02 for Co kultur spheroids.

Funktionel metaboliske assay af pancreas 3D spheroids ved hjælp af den ekstracellulære flux analyzer
For at teste funktionaliteten af spheroids vi ansat metaboliske og bioenergetik analyse at sonde energi veje i spheroids. Vi foretog en glykolyse stresstest på spheroids kulturperler som beskrevet ovenfor. Med henblik herpå, blev spheroids genereret fra enten Patu8902 eller PS1 celler ud over dem, der hidrører fra en fælles kultur for to celletyper udsat for analysen. Interessant, udstillet alle tre typer af spheroids, om stammer fra særskilt eller blandet celler, en biologisk funktionelle svar til GST assay. Efter indsprøjtning en mætte koncentration af glukose, testet spheroids typer Vis stigninger i de glykolytiske pathway, som det fremgår af en stigning i ECAR (figur 3). Når mitokondrie ATP produktion blev hæmmet ved hjælp af oligomycinets, energiproduktion skifter til glykolyse og skubbet celler til maksimal glycolytic kapacitet, set som yderligere stigning i ECAR. Hæmning af glykolyse ved hjælp af 2-GD, en glucose analog, der konkurrencemæssigt binder glukose hexokinase, resulterede i et fald i ECAR, bekræfter, at den forudgående stigning i ECAR skyldtes glycolytic aktivitet. Vi bemærkede, at spheroids testet i denne undersøgelse har reageret på denne måde, selvom PS1 alene spheroids (gennemsnitlig diameter 250 µm) havde en relativt lavere signal, muligvis på grund af deres mindre størrelse og lavere glycolytic kapacitet i forhold til Patu8902 kræften celler (gennemsnitlig diameter 600 µm). Generelt en højere ECAR signal fra tumor celle afledte spheroids sammenlignet med dem fra relativt mindre PS1 fibroblast afledt spheroids, kunne muligvis tilskrives kræftceller iboende metaboliske tilbøjelighed til glykolyse22, 23. Alle tre typer af spheroids blev afledt fra såning det samme antal celler, selvom vi bemærkede klumpformet størrelse variation blandt hver type, med PS1 alene spheroids bliver den mindste, efterfulgt af fælles kultur spheroids, og Patu8902 alene spheroids bliver den største.

Test mitokondrie funktion i 3D spheroids, udsættes vi fælles kultur spheroids for en MST assay. MST måler nøgleparametre af mitokondrie funktion ved direkte måling af OCR celler (figur 4A og 4B). En seriel injektion med forbindelser (oligomycinets, FCCP og en blanding af rotenon og antimycin A) blev brugt til at måle mitokondrie nøgleparametre som ATP produktion, maksimal respiration og ikke-mitokondrie respiration. Disse parametre og basal respiration satser blev yderligere brugt til at beregne proton lækage og reservedele respiratorisk kapacitet (figur 4 c). Et fald i OCR som svar på oligomycinets, en hæmmer af ATPsyntase (komplekse V) korrelerer til den mitokondrielle respiration tilknyttet cellulære ATP produktion. Spheroids blev inkuberet med oligomycinets til en længere varighed til at give maksimal penetration og effektiv responstid. En anden injektion med uncoupler FCCP stimulerer maksimal iltforbrug og en tilsvarende stigning i OCR. Den FCCP-stimulerede OCR blev brugt til at beregne ekstra respiratorisk kapacitet, en foranstaltning af cellen evne til at reagere på efterspørgslen efter øget energi. Den tredje indsprøjtning; en blanding af rotenon, (en kompleks jeg inhibitor), og antimycin A (en kompleks III hæmmer) blokerer mitokondrie respiration, set som en skarp nedgang i OCR (fig. 4BOng >).

Samlet set bekræfte vores iagttagelser funktionaliteten af kulturperler spheroids ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer som målestok for deres metaboliske fodaftryk/aktivitet både i de glykolytiske og mitokondriel potentiale som beskrevet ovenfor.

Figure 1
Figur 1 . Skematisk fremstilling af metodologien for kultur og analysen af kræft i bugspytkirtlen celler/fibroblast spheroids. Patu8902 og PS1cells var kulturperler, trypsinized, vasket og tælles. For såning hver sfæroide, Patu8902 (5.000 celler/brønd) og PS1 fibroblaster (10.000 celler/brønd) var magnetiseret ved hjælp af NS og trykt på en celle frastødende vækst plade på dag 1. Efter såning, var vækst plade monteret på en magnetisk klumpformet kørsel (med en magnet under hver brønd af 96 godt format vækst plade) og tilladt til kultur i 2-7 dage for at få 3D spheroids. De resulterende spheroids vasket og overført til klumpformet assay mikroplader til at udføre de metaboliske assays på det ekstracellulære flux instrument. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Vækst af pancreas tumor-fibroblast spheroids. (A) et repræsentativt billede af Patu8902-PS1 Co kultur klumpformet svarende til dag i kultur er vist på toppen og størrelse i diameter af sfæroide (µm) er kvantificeret nedenfor. Gradvis stigning i klumpformet størrelse og udbredelse af NS partikler (mørke prikker) i hele dets volumen er tydeligt mellem dage 2 og 7. Spheroids blev holdt i kultur for yderligere 2 dage efter dette, som ikke resultere i en betydelig stigning i klumpformet diameter. (B) repræsentative billeder af spheroids stammer fra tumorceller (Patu8902), stroma celler (PS1) og co kulturperler celler (Patu8902 + PS1) er vist. C kugleform data er afbildet fra 10 individuelle spheroids fra hver gruppe. Fejllinjer udgør standardafvigelse (SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Glykolyse stresstest (GST) med pancreas spheroids. (A) skematisk fremstilling af en typisk glycolytic funktion assay med forskellige assay parametre afbildet. (B) et eksempel på en GST test udført på pancreas spheroids kulturperler ved hjælp af den metode der beskrives. Glukose injektion ramper op glykolyse set en stigning i ECAR, med yderligere stigning på tilføjelsen af oligomycinets til at slukke mitokondrie respiration. ECAR falder i svar på 2-GD, en konkurrencedygtig analog af glukose, ved at blokere glykolyse. Alle spheroids er bemærket for at udstille en funktionel svar til GST assay. (C) en output af GST analysen ved hjælp af producentens rapport generator skildrer de tre store parametre for GST assay. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4Mitokondrie stresstest (MST) med Patu8902-PS1 spheroids. (A) skematisk fremstilling af en typisk mitokondrie funktion assay med forskellige assay parametre er afbildet. (B) et eksempel på en MST på pancreas tumor-fibroblast spheroids er vist. C fælles kultur 3D spheroids udviser et funktionelt svar på MST assay. Som forventet, var mitokondrie funktion måles som en tilbagegang i OCR bemærket når spheroids blev udfordret med oligomycinets, en ATP syntase hæmmer. Ved hjælp af FCCP at rampe op elektron flow resulterede i maksimal OCR, som straks kollapsede ved hæmning af mitokondrie respiration ved hjælp af en - cocktail af mitokondrie komplekse hæmmere. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Ved hjælp af bugspytkirtelkræft, de 3rd førende årsag til kræft dødsfald i USA24, som et eksempel og model, en hurtig og ensartet metode blev udviklet til at vokse og assay 3D spheroids ved hjælp af fælles kultur af kræft i bugspytkirtlen celler og aktiveret i bugspytkirtlen fibroblaster. Ved hjælp af magnetiske bioprinting, blev spheroids spænder i størrelse fra 400-600 µm i diameter indhentet. Disse blev udsat for metaboliske assays til korrekt teste funktionaliteten af de kulturperler 3D spheroids. Denne metode er simpel, ensartet og nemt kan tilpasses til andre celletyper.

Mens denne metode vil fremskynde og tilføje til translationel værdien af assays udført med 3D spheroids, kan det blive forbedret ved at udvikle teknikker, der tillade multiplexing af klumpformet manipulation og håndtering. Dette skal yderligere at reducere den samlede tid, omkostninger og arbejdskraft forpligtet til at udføre analysen. Derudover kan klumpformet diskenheder bruges til at normalisere OCR signaler som rapporteret af andre6. Klumpformet volumen normaliseret gennemsnitlige volumen af en celle kan bruges til at bestemme OCR per celle, men da vækst af spheroids ikke vil være identiske, beregning af en absolut OCR pr. celle kan være udfordrende. I øjeblikket, er denne metode begrænset af manglen på et effektivt redskab til at multiplex klumpformet håndtering og overførsel fra vækstzoner til assay miljø.

Den beskrevne metode er ændret og tilpasset fra den magnetiske bioprinting teknologi, og yderligere valideret for at vise den funktionelle relevans ved at anvende de kulturperler spheroids en downstream metaboliske assay. Metoden giver et vigtigt redskab til at generere robust, bæredygtig og funktionel spheroids, der indeholder de to store celletyper findes i de fleste tumor væv, kræftceller og kræft forbundet fibroblaster, der kan anvendes til andre investigational assays, såsom narkotika skærme. Den relative lethed og effektiviteten af metoden, NS er en stor forbedring over andre metoder25, såsom hængende drop metode2,26 klumpformet generation.

Robust spheroids genereret som sådan give en in vitro- tumor model, der indeholder stromale celler, som ofte er savnet af mange 3D kultur studier. Mulighederne for anvendelse af 3D klumpformet modeller genereret som sådan er enorme. For eksempel, kan sådanne modeller anvendes til at undersøge celle-celle interaktioner, bioenergetik forskydninger og teste genetiske modtagelighed og afhængighed af forskellige terapeutiske regimer. 3D spheroids, at sammenfatte i vivo tumor mikromiljø tjene som yderst relevant og nyttig værktøj til stof screening undersøgelser og dem undersøge virkningsmekanisme af nuværende og nye therapeutics. Metaboliske assays sondering energi veje ved hjælp af spheroids kulturer med muterede celler kan hjælpe kaste nyt lys ind i rollen som disse gener og relaterede veje i pathobiology i en relevant 3D model af kræft, som spheroids beskrevet i denne undersøgelse.

Vellykket anvendelse af denne metode er fremmest afhængig af celler kræves for magnetisk udskrivning, hvilket er grunden til celle vokser i logaritmiske fase bør høstes og magnetisk sundhed. Det er afgørende at bruge magnetisk klumpformet drevet til at udskrive magnetiseret celler og ikke den bedrift drive, som bør udnyttes kun under klumpformet vask og medier efterfyldning trin af den beskrevne metode. Den andre mest kritiske aspekt for vellykket udlæsning af metaboliske assays er at opretholde morfologi af spheroids under overførslen fra vækst plade til assay pladen.

Samlet set er denne protokol blevet etableret for generation af 3D spheroids, der indeholder både kræft og stromale celler, efter de efterfølgende metaboliske assay af spheroids ved hjælp af ekstracellulære flux analyzer. Nøglefunktioner af denne metode er at det er hurtig, let at tilpasse og sammenhængende, relevante og efterligner i vivo tumor mikromiljø, er forholdsvis billige og kan tjene som et nyt værktøj til at studere tumor biologi og udvikle kræft agenter.

Disclosures

Forfatterne George W. Rogers og Andrew Neilson er medarbejdere/aktionærer af Agilent Technologies, som producerer reagenser og instrumenter, der anvendes i denne artikel. Alle andre forfattere erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Samuel Zirbel for hjælp til at optimere dyrkningsbetingelserne og overvågning klumpformet vækst. Vi er taknemmelige for Agilent technologies leverer SeaHorse XFe96 analyzer, analysereagenserne og tekniske indsigt. Vi takker også Dr. Hemant Kocher på Barts Cancer Institute i Storbritannien for at levere PS1 celler. Dette arbejde blev delvist understøttet af Stig Magowitz Foundation for Pancreas Cancer Research og stå op til kræft-kræft Research UK-Lustgarten Foundation i bugspytkirtlen kræft Dream Team forskning tilskud (Grant nummer: SU2C-AACR-DT-20-16). Stå op til kræft er et program af underholdning industri Foundation. Forskningsbevillinger er administreret af American Association for Cancer Research, de videnskabelige partner af SU2C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA Sigma 25300-054
96 well cell repellant plate USA Scientific/ Griener Bio-One 655970 spheroid growth plate
Cellometry Cell counting slides Nexcelom  CHT4-SD100-002
D-Glucose Sigma D9434
DPBS Gibco 14190-144
Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103020-100
L-Glutamine Sigma 59202C
Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103015-100
n3D Magnetic Spheroid drive Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetic Spheroid holding drive Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL  Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit:  store at 4 °C
Patu8902 cells Laboratory Stock pancreatic ductal adenocarcinoma cells
PS1 cells Laboratory Stock activated pancreatic stellate cells
RPMI1640 Gibco 11875-093 growth media for cells, spheroids
SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer Agilent Technologies extracellular flux analyzer
Sodium Pyruvate Sigma S8636
XF Base media Agilent Technologies 102365-100 base media for metabolic assays on XFe96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies. J Cell Commun Signal. 5, (3), 239-248 (2011).
  2. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  3. Zhang, S. Beyond the Petri dish. Nat Biotechnol. 22, (2), 151-152 (2004).
  4. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, New York, N.Y. November 1708-1712 (2001).
  5. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 33, (4), 1837-1843 (2015).
  6. Jiang, L., et al. Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth. Nature. 532, (7598), 255-258 (2016).
  7. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Cell. 130, (4), 601-610 (2007).
  8. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, (10), 839-845 (2007).
  9. Souza, G. R., et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nat Nanotech. 5, (4), 291-296 (2010).
  10. Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 8, (10), 1940-1949 (2013).
  11. Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Sci Rep. 5, 13987 (2015).
  12. Tseng, H., et al. Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. Promega Corporation. Updated (Figure 1) 1-9 (2015).
  13. Tseng, H., et al. Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation. Tissue Eng Part C Methods. 19, (9), 665-675 (2013).
  14. Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Eng Part C, Methods. 19, (5), 336-344 (2013).
  15. Tseng, H., et al. A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation. Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).
  16. Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).
  17. Wang, R., et al. The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. J Biomol Screening. 20, (3), 422-429 (2015).
  18. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300 (2013).
  19. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
  20. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J Vis Exp. (117), e54918 (2016).
  21. Froeling, F. E. M., et al. Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells. Am J Pathol. 175, (2), 636-648 (2009).
  22. Kim, J. W., Dang, C. V. Cancer's molecular sweet tooth and the warburg effect. Cancer Res. 66, (18), 8927-8930 (2006).
  23. Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. Curbing cancer's sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect. Mitochondrion. 13, (3), 170-188 (2013).
  24. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2017. CA: Cancer J Clinicians. 67, (1), 7-30 (2017).
  25. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  26. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83, (2), 173-180 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics