Utilisation de capsules pour la coloration négative des échantillons viraux dans le cadre du suivi biologique

Published 7/19/2017
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Immunology and Infection

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Summary

Ce protocole fournit des instructions pour les échantillons de virus à coloration négative qui peuvent être facilement utilisés dans les laboratoires BSL-2, -3 ou -4. Il comprend l'utilisation d'une capsule de traitement innovante, qui protège la grille de microscopie électronique de transmission et fournit à l'utilisateur une manipulation plus facile dans les environnements les plus turbulents au sein du biocontainment.

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Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

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Abstract

La microscopie électronique par transmission (TEM) est utilisée pour observer l'ultrastructure des virus et d'autres agents pathogènes microbiens avec une résolution nanométrique. La plupart des matériaux biologiques ne contiennent pas d'éléments denses capables de diffuser des électrons pour créer une image; Par conséquent, une tache négative, qui place des sels de métaux lourds denses autour de l'échantillon, est nécessaire. Afin de visualiser les virus en suspension sous TEM, ils doivent être appliqués sur de petites grilles revêtues d'une surface transparente de seulement des nanomètres d'épaisseur. En raison de leur faible taille et de leur fragilité, ces réseaux sont difficiles à manipuler et facilement déplacés par les courants d'air. La surface mince est facilement endommagée, laissant l'échantillon difficile ou impossible à l'image. Les virus infectieux doivent être manipulés dans un cabinet de prévention des risques biotechnologiques (BSC) et certains nécessitent un environnement de laboratoire de biocontainment. La coloration des virus dans les niveaux de biosécurité (BSL) -3 et -4 est particulièrement difficile car ces environnements sont plus turbulents et des techniciens sont nécessaires tO porter un équipement de protection individuelle (EPI), ce qui diminue la dextérité.

Dans cette étude, nous avons évalué un nouveau dispositif pour aider à la coloration négative des virus dans le biocontainment. L'appareil est une capsule qui fonctionne comme une pointe de pipette spécialisée. Une fois que les grilles sont chargées dans la capsule, l'utilisateur élimine simplement les réactifs dans la capsule pour délivrer le virus et les taches à la grille encapsulée, éliminant ainsi la manipulation par l'utilisateur des grilles. Bien que cette technique ait été conçue spécifiquement pour une utilisation dans BSL-3 ou -4 biocontainment, elle peut faciliter la préparation des échantillons dans n'importe quel environnement de laboratoire en permettant une coloration négative facile du virus. Cette même méthode peut également être appliquée pour préparer des échantillons TEM colorés négatifs de nanoparticules, de macromolécules et de spécimens semblables.

Introduction

La microscopie électronique à transmission (TEM) est un outil efficace pour visualiser la morphologie et l'ultrastructure des spécimens biologiques trop petits pour être vus avec un microscope optique traditionnel 1 , 2 , 3 , 4 . Les TEM tirent des électrons à travers un spécimen très mince produisant une image à résolution plus élevée puisque les électrons ont une longueur d'onde beaucoup plus courte que la lumière. Les régions de l'échantillon qui se plient ou bloquent des électrons apparaissent sombres, alors que les régions électronucléaires apparaissent blanches.

Le manque de matière électronique dense rend les virus difficiles à voir sous un TEM car ils ne peuvent pas disperser les électrons. La coloration négative est la méthode la plus commune utilisée pour créer un contraste et afficher des virus avec TEM. La première procédure de coloration négative a été proposée par Brenner et Horne en 1959, sur la base d'une expérience où Hall (1955) et Huxley (1957) ont observéL'apparition de structures biologiques en contraste inverse lorsqu'elles sont immergées dans une substance densément électronique 5 . Le processus de coloration négative n'a pratiquement pas changé au cours du dernier demi-siècle. La coloration négative consiste à appliquer brièvement une solution de sel de métaux lourds à un échantillon sur une grille TEM afin d'entourer le virus avec un matériau dense sans infiltrer le virus 6 . Cela crée une bordure sombre et révèle la forme de la particule 5 . Cette étude utilise deux réactifs pour la coloration négative, l'acétate d'uranyle (UA) et l'acide phosphotungstique de potassium (PTA). Ces deux taches sont couramment utilisées pour tacher les petits échantillons biologiques, tels que les virus, les complexes protéiques et les nanoparticules 7 , 8 , 9 .

La technique de coloration négative classique est la technologie manuelle de coloration négative des gouttelettesNique 7 . Cette méthode nécessite une manipulation précise des grilles TEM petites et fragiles avec des pinces pour appliquer de petites quantités d'échantillons de virus, de taches et de rinçages. Le protocole de préparation typique implique l'application d'une gouttelette de suspension d'échantillon sur la surface d'une grille TEM revêtue de film ( figure 1A ). Après la fixation de l'échantillon sur la surface du film, la grille est rincée pour éliminer les virus non adhérents et colorée avec UA ou PTA pendant quelques secondes à une minute, selon le type d'échantillon. L'excès de liquide est méchant de la grille en touchant un morceau de papier filtre au bord de la grille.

La méthode manuelle de gouttelette exige que chaque grille soit faite individuellement. Si elles ne sont pas manipulées avec précaution, les grilles TEM revêtues sont facilement perforées, courbées ou contaminées. Le traitement de multiples échantillons peut entraîner des difficultés dans le suivi des grilles et une coloration uniforme pour chaque échantillon. Cette procédure de coloration manuelle est beaucoup plus dSi difficile lorsqu'ils sont effectués dans des laboratoires de biocotour (BSL) -3 et -4 biocontainment, en raison de l'équipement de protection individuelle nécessaire (EPI) requis pour ces environnements. L'EPI est lourd et l'environnement biocontainment est beaucoup plus turbulent par rapport à un laboratoire régulier. Le personnel travaillant dans les laboratoires de bioconfinement BSL-3 doit porter 2 paires de gants et travailler dans un cabinet de biosécurité (BSC). Cette double couche de gants réduit la sensibilité tactile et limite le mouvement du moteur. Le flux d'air du BSC qui protège l'utilisateur et contribue à prévenir la contamination de l'échantillon peut provoquer une séchage trop rapide des échantillons et des taches, ce qui affecte la qualité de la tache. Le fort flux d'air turbulent dans le BSC peut également épuiser rapidement une grille qui n'est pas bien sécurisée. Dans les laboratoires de biocontainment BSL-4, il existe des exigences de sécurité supplémentaires. Le personnel doit porter une combinaison de pression positive, ce qui limite davantage le mouvement physique et la capacité de visualiser et de manipuler clairementGrilles ulateuses. Le technicien travaillant dans BSL-4 porte également au moins 2 paires de gants, la paire extérieure étant un gant épais qui réduit considérablement la dextérité et la sensation tactile. Enfin, les pinces utilisées pour traiter les grilles TEM sont nettes, ce qui pose un risque pour le technicien en raison de leur capacité à perforer les gants. Avec des capsules contenant des grilles, les pinces ne sont pas nécessaires, fournissant ainsi une alternative sans danger pour la manipulation des grilles dans le biocontainment. Enfin, les capsules fournissent également un moyen efficace de stocker les grilles pendant le traitement, la décontamination de la vapeur d'osmium et pendant le stockage; Ce qui permet de garder les grilles organisées et à l'abri des dégâts.

Dans ce rapport, nous introduisons une nouvelle méthode pour les grilles TEM de coloration négative dans les laboratoires de biocontainment qui utilisent des capsules mPrep / g, un dispositif à base de capsules pour la manipulation du réseau et la coloration 10 , 11 , 12 . La capsule accomMode deux grilles de TEM, minimise la manipulation directe et réduit le risque de dégâts du réseau. La capsule s'attache directement à une pipette à une ou plusieurs canaux de la même manière qu'une pointe de pipette, ce qui permet l'application de divers liquides dans des grilles contenues à l'intérieur. Ceci permet la préparation simultanée d'échantillons multiples avec des réseaux en double ( figure 1B ). Pour une coloration négative avec des capsules, l'échantillon de virus est aspiré dans la capsule et maintenu pendant 10 minutes pour permettre aux virus d'adsorber sur les surfaces de la grille. Les grilles avec le virus adsorbé sont ensuite lavées avec de l'eau désionisée (DI) et colorées avec UA ou PTA pendant quelques secondes à 1 min. Ce processus utilise les mêmes étapes de protocole et réactifs que la méthode de gouttelettes manuelle; La différence étant que tous les travaux se produisent à l'intérieur de la capsule sans manipulation physique des grilles. ( Figures 1C , 1D ).

Le but de cette étude était d'évaluer les capsules commeUne nouvelle méthode pour la coloration négative des échantillons de virus dans les environnements de biocontainment. Cette étude a également examiné la qualité des images TEM produites à partir de deux procédures d'inactivation de virus différentes: 1) inactivation rapide, avec 1% de vapeur de tétroxyde d'osmium, et 2) une inactivation de 24 h avec 2% de glutaraldéhyde. Les deux ont été conduits en utilisant les capsules. Enfin, nous avons évalué deux taches négatives couramment utilisées, UA et PTA, pour une utilisation dans la capsule. 13

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Protocol

1. Préparation de l'expérience dans un environnement BSL-2 avant de travailler avec les échantillons de virus

  1. Préparez ou achetez des grilles de cuivre FORMvar et revêtues de carbone, habituellement 200-400 mesh.
  2. Insérez les grilles TEM revêtues en capsules.
    1. Utilisez un objectif agrandi pour rendre ce processus facile à réaliser. Une ou deux grilles peuvent être insérées dans chaque capsule. Des capsules préchargées peuvent être achetées pour éliminer cette étape si vous le souhaitez.
  3. Transférez les capsules avec des grilles revêtues TEM insérées, ainsi que d'autres fournitures et réactifs, au biocontainment où les virus seront colorés négativement.

2. La méthode de la capsule pour la coloration négative dans le développement biologique en utilisant du glutaraldéhyde aqueux et 1% d'inactivation de vapeur de tétraxyde d'osmium

  1. À l'intérieur du BSC de biocontainment, aspirer 40 μL de suspension de virus dans la capsule attachée à une pipette.
    REMARQUE: la pipette reste attachée à laE capsule jusqu'à ce que le processus soit terminé. La préparation des virus est conforme à notre publication précédente 14 .
  2. Placez la pipette sur le côté pendant 10 min avec des grilles orientées horizontalement. Il s'agit de favoriser une répartition uniforme des particules virales sur les grilles revêtues.
  3. Inactive le virus dans la capsule à l'intérieur du BSC biocontainment.
    1. Ramenez la pipette et appuyez sur le piston pour distribuer la solution de virus dans un récipient à déchets.
    2. Aspirer 40 μL de fixateur à 2% de glutaraldéhyde dans les capsules.
      Attention: Le glutaraldéhyde est un produit chimique dangereux et nécessite une protection appropriée. Le glutaraldéhyde peut être utilisé pendant de courtes périodes dans un BSC normal, mais le réactif ouvert étendu nécessite de travailler dans un BSC canalisé ou une hotte chimique.
    3. Placez la pipette sur le côté pendant 20 min. C'est pour s'assurer que les échantillons sont bien réparés.
    4. Expulser le fixateur et aspirer 40 μL d'eau DI dans les capsules à wCasser le fixateur. Répétez cette étape de lavage pour un total de 3 cycles de rinçage.
  4. Aspirer 40 μL de 1% d'acétate d'uranyle (UA) ou 1% d'acide phosphotungstique de potassium (PTA) dans les capsules et laisser reposer pendant 30 s.
    NOTE: Le temps de coloration peut varier de 10 s à 1 min en fonction de l'échantillon de virus.
    Attention: l'UA est un émetteur alpha et une toxine cumulative. Manipulez-le avec une protection appropriée.
  5. Retirez la capsule de la pipette et essorez les grilles en appuyant sur un morceau de papier filtre vers le bord des grilles pendant que les grilles restent dans la capsule.
  6. Osmium Tetroxide Procédure d'inactivation de la vapeur.
    1. Placez la capsule, avec le couvercle ouvert, dans un tube de centrifugation de 50 ml contenant du papier filtre trempé dans une solution de tétraxyde d'osmium à 1%.
      Attention: le tétroxyde d'osmium est extrêmement toxique avec une faible pression de vapeur. Il doit être utilisé dans un conduit BSC ou une hotte chimique. Manipulez-le avec une protection appropriée. Message d'alerteInformations dans la zone de travail.
    2. Sceller le tube de centrifugation de 50 ml pendant 1 h pour permettre une perméation complète de la vapeur de tétroxyde d'osmium. Ensuite, décontaminez ensuite et transférez le tube hors du biocontainment à l'installation de BSL-2 EM.
  7. Retirez les grilles EM de la capsule.
    1. Dans l'installation EM BSL-2, retirez la capsule du tube de la centrifugeuse et placez-la sur une pipette.
    2. Aspirer 40 μL d'eau DI dans la capsule et distribuer l'eau dans un récipient à déchets trois fois.
    3. Retirez la capsule de la pipette et nettoyez les grilles à l'aide de papier filtre pour toucher le bord des grilles.
    4. Après séchage à l'air, rangez les grilles pour l'imagerie TEM ultérieure.

3. La méthode de la capsule pour l'inactivation dans le développement biologique avec 2% de glutaraldéhyde, suivie d'une coloration négative dans un laboratoire BSL-2

  1. Procédure d'inactivation de virus.
      Attention: Le glutaraldéhyde est un produit chimique dangereux et nécessite une protection appropriée. Le glutaraldéhyde peut être utilisé pendant de courtes périodes dans un BSC normal, mais le réactif ouvert étendu nécessite de travailler dans un BSC canalisé ou une hotte chimique.
    1. Inactive les virus avec un fixateur pendant au moins 24 h avant l'emballage, la décontamination et le transfère à l'installation EM BSL-2.
  2. Dans l'installation EM BSL-2, aspirer le virus et le mélange fixatif dans la capsule, contenant deux grilles de TEM, attachées à une pipette.
  3. Placez la pipette horizontalement pendant 10 minutes avec les grilles orientées horizontalement.
    REMARQUE: il s'agit de promouvoir une répartition uniforme des particules virales sur les grilles TEM.
  4. Ramassez la pipette et appuyez sur le piston pour expulser le virus vers un conteneur de déchets. Aspirer 40 μL de dIL'eau dans les capsules et l'expulser dans le conteneur de déchets pour 3 cycles de rinçage.
  5. Aspirer 40 μL de 1% d'UA ou 1% de PTA dans les capsules pendant 30 s.
    NOTE: Le temps de coloration varie de 10 s à 1 min en fonction de l'échantillon de virus.
    Attention: l'UA est un émetteur alpha et une toxine cumulative. Manipulez-le avec une protection appropriée.
  6. Retirez la capsule de la pipette et essuyez les grilles en touchant le bord des grilles sur un papier filtre. Séchez à l'air les grilles et rangez-les pour l'imagerie TEM ultérieure.

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Representative Results

La méthode de la capsule produit une coloration négative de bonne qualité pour l'imagerie TEM:

Tout d'abord, nous avons évalué la qualité des images générées en utilisant à la fois la méthode de gouttelette manuelle et les méthodes de capsule pour la coloration négative du ebolavirus Zaire. Les ebolavirus sont membres de la famille Filoviridae , ainsi que le virus de Marburg. L'ebolavirus a généralement un diamètre de 80 à 100 nm et peut avoir plus de 1 000 nm de longueur. L'ebolavirus doit être manipulé dans un environnement de biocontainment BSL-4. La figure 2 montre les images générées en utilisant la méthode de gouttelette manuelle et la méthode de la capsule pour la coloration négative. La figure 2A (méthode manuelle de gouttelettes) et la figure 2B (méthode de la capsule) montrent des échantillons d'ebolavirus qui ont des détails clairement définis avec des structures de nucléocapside au centre du virion et une glycoprotéine d'ebolavirus visibleS sur la surface. Ainsi, les méthodes de capsule et de gouttelettes ont la capacité de produire des images TEM de qualité similaires.

Comparer et évaluer la qualité d'image EM après une inactivation rapide avec du glutaraldéhyde aqueux et 1% de vapeur de tétroxyde d'osmium par rapport à l'inactivation de 24 heures avec du glutaraldéhyde aqueux à 2%, en utilisant la méthode de la capsule:

Nous avons évalué la qualité des images TEM générées à partir de deux méthodes différentes d'inactivation de l'échantillon à l'aide du virus Chikungunya. Le virus Chikungunya est un membre du genre Alphavirus dans la famille des Togaviridae . Il est sphérique avec un diamètre de 60 à 70 nm. Le virion contient une enveloppe riche en glycoprotéines qui forment des pointes trimères sur la surface virale. Le virus Chikungunya doit être traité dans BSL-3. Une inactivation rapide est obtenue en utilisant 2% de glutaraldéhyde pendant 20 minutes suivie d'une exposition de 1 h à 1% de vapeur de tétroxyde d'osmium, avec l'intégralité du négatifProcessus de coloration active se produisant dans une capsule au sein d'un BSC dans le laboratoire de biocontainment ( figure 1C ). Toutefois, lorsque l'on utilise 2% de glutaraldéhyde pendant 24 h pour inactiver le virus, l'inactivation se produit dans un environnement de bioconfinement, mais la procédure de tache négative de 1% UA est effectuée en utilisant la méthode de la capsule dans un laboratoire BSL-2 ( figure 1D ). Ces procédures d'inactivation ne produisent pas les mêmes images de qualité ( Figure 3 ). Il ressort clairement de la figure 3 que la fixation dans le glutaraldéhyde sans présence de tétroxyde d'osmium ( figure 3A , 3B ) présente plus de détails ultrastructural que les échantillons préparés avec du glutaraldéhyde et du tétroxyde d'osmium ( figure 3C , 3D ).

La méthode de la capsule fonctionne bien en utilisant de l'acétate d'uranyle (UA) et du phosphoreL'acide otungstique (PTA) comme taches négatives pour les échantillons fixés en aldéhyde.

Des exemples de coloration négative de l'UA et de la PTA à l'aide de la méthode de la capsule sont présentés à la Figure 4 sur les particules de type virus apparentées aux aldéhydes (VLP). Les VLP sont des protéines assemblées dans des structures semblables à des virus, mais ne contiennent aucun matériau génétique viral. Ils sont généralement utilisés dans le développement de vaccins et pour la recherche virale de base. La coloration négative est un outil précieux pour évaluer l'assemblage et la morphologie du VLP. Nous avons utilisé à la fois l'UA et la PTA pour la coloration négative des VLP avec la méthode de la capsule. Les deux taches présentent des résultats de haute qualité avec des glycoprotéines frontières visibles et clairement définies des VLP Ebola 15 ( Figure 4A , 4B ) et VLP 15 de la leucémie murine ( Figure 4C , 4D ).


Figure 1: Aperçu des méthodes de coloration négative. ( A ) La méthode de gouttelette manuelle est réalisée en déplaçant séquentiellement les grilles TEM de la gouttelette à la gouttelette de l'échantillon, des rinçages et des taches. ( B ) Mise en place de la méthode de la capsule avec des grilles et application de suspension d'échantillon. ( C ) Procédure typique en utilisant la méthode de la capsule dans le biocontainment avec une inactivation à court terme avec 1% de vapeur de tétroxyde d'osmium. ( D ) Procédure recommandée en utilisant la méthode de la capsule dans le bioconfinement avec une inactivation à long terme avec 2% de glutaraldéhyde. La figure a été précédemment publiée et réutilisée avec les autorisations de la référence 13 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.


Figure 2: Comparaison de particules de Ebolavirus colorées négatives de PTA à 1%. ( A ) négatif avec la méthode de gouttelette manuelle. ( B ) Négatif coloré en utilisant la méthode de la capsule. La figure a été précédemment publiée et réutilisée avec les autorisations de la référence 13 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: 1% de coloration négative UA avec la méthode de la capsule du virus Chikungunya en utilisant différentes procédures d'inactivation. ( A , B ) inactivation pendant au moins 24 h avec seulement 2% de glutaraldéhyde. ( C ,D) Inactivation rapide avec 2% de glutaraldéhyde et 1% de vapeur de tétroxyde d'osmium. La figure a été précédemment publiée et réutilisée avec les autorisations de la référence 13 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Exemples d'acide phosphotungstique (PTA) et d'acétate d'uranyle (UA), négativement colorées par des particules semblables à des virus (VLP) en utilisant la méthode de la capsule. ( A ) Vue d'ensemble du grossissement inférieur de 1% de NVA-VLP ébolés colorés au PTA. ( B ) L'image TEM de haut grossissement montrant les détails structurels des Nano-VLP ébolés colorés au PTA. ( C ) Vue d'ensemble du faible grossissement de 1% de VLP à la tête de la leucémie tachée par UA. ( D ) image de TEM à haut grossissement montrant detLes lésions de VLP de la leucémie murine colorées avec la glycoprotéine d'ebolavirus sur leur surface. La figure a été précédemment publiée et réutilisée avec les autorisations de la référence 13 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La coloration négative est une technique TEM précieuse pour évaluer et dimensionner les virus, les complexes protéiques et les nanoparticules. La préparation des gouttelettes de ces éprouvettes par déplacement manuel des grilles du réactif aux taches négatives a été le protocole classique depuis plus d'un demi-siècle. C'est un processus simple, mais nécessite une expertise acquise grâce à la formation pour réussir. Une excellente coloration négative est toujours considérée comme un ensemble de compétences à la fine pointe de la technologie et hautement souhaitée dans de nombreux laboratoires TEM. La méthode de la capsule présente plusieurs avantages distincts par rapport à la méthode des gouttelettes manuelles, en particulier dans les laboratoires de biocontainment. Tout d'abord, la méthode de la gouttelette manuelle nécessite une formation et une expérience importantes avant qu'elle puisse être effectuée avec succès, tandis que la méthode de la capsule facile à utiliser peut être réalisée par des techniciens d'entrée par pipettage simple. Le plus grand défi avec la méthode de gouttelette manuelle est la gestion réussie des grilles TEM avec des pinces dans BSL-3 et BSL-4 PPE due tO la sensation tactile et la dextérité fortement réduite. Les grilles TEM revêtues fragiles sont facilement endommagées ou perforées par une pince. Les dommages causés à la grille TEM revêtue ne sont souvent pas révélés avant d'être visualisés avec un TEM. Un deuxième avantage des capsules est que les grilles TEM ne sont manipulées que lorsqu'elles sont insérées dans des capsules et lorsqu'elles sont retirées pour être introduites dans le microscope électronique. Que ce soit dans le laboratoire de biocontainment ou dans l'installation EM BSL-2, il n'y a pas de gestion directe du réseau. Un troisième avantage de la méthode de la capsule est que les deux côtés de la grille sont couverts de virus et de taches. Cela peut être utile lorsque la concentration de l'échantillon est faible; Cependant, cela pourrait causer trop d'échantillon si la concentration est élevée ou entraîner une dilution de l'échantillon avant l'utilisation.

La coloration négative de multiples grilles utilisant la technique de gouttelette manuelle prend du temps car chaque échantillon doit être préparé et coloré individuellement. Cela conduit à des difficultés obtaiUne coloration homogène et reproductible. En outre, garder un suivi de nombreux réseaux individuels est toujours un défi. Chaque capsule contient deux grilles et des capsules multiples peuvent être attachées à une pipette multicanaux, ce qui simplifie le processus. Par conséquent, les capsules garantissent que les grilles sont colorées en utilisant un processus très similaire, dans des conditions d'échantillonnage cohérentes, et en même temps. Les capsules peuvent être étiquetées pour faciliter l'organisation, ce qui réduit le risque de mélange ou d'identification erronée des grilles. Un autre problème commun rencontré lors de l'utilisation de la méthode manuelle de gouttelettes est la contamination du réseau. Cela peut se produire lorsque les grilles sont laissées à l'air libre pendant trop longtemps ou sont abandonnées. La capsule protège les grilles TEM de l'air libre et les retient en toute sécurité afin qu'elles ne soient jamais abandonnées. Les capsules offrent un plus grand contrôle expérimental et une répétabilité lors de la préparation et la coloration négative car la capsule est un environnement plus contrôlé.

Les capsules peuvent être achetées préchargées siSingerie. Le chargement manuel des grilles dans les capsules prend des précisions pour s'assurer que les grilles ne sont pas endommagées. La méthode de la capsule nécessite également un peu plus d'échantillon et de tache que la méthode manuelle de gouttelettes. La méthode de la capsule nécessite au moins 40 μl d'échantillon, par rapport à la méthode de gouttelette manuelle, qui peut être effectuée avec jusqu'à 8 μL.

L'inactivation de virus est une partie importante de la coloration négative dans BSL-3 et BSL-4, car elle permet de retirer le virus inactivé des laboratoires de biocontainment pour l'imagerie dans l'installation EM. L'inactivation utilisant les fixateurs a l'avantage supplémentaire de corriger le virus, en évitant la dégradation. Il existe deux façons différentes d'inactiver l'échantillon de virus, tous deux examinés dans cette étude. Le premier adhère au virus sur les grilles TEM revêtues, corrige les virus pendant 20 min dans une solution de glutaraldéhyde à 2%, suivie d'une exposition de 1 heure de la grille à la vapeur de tétroxyde d'osmium ( figure 1C ). Cette inactivationIon est avantageuse car elle permet d'économiser du temps en permettant à l'échantillon d'être retiré du laboratoire de biocontainment après 1 h et 20 min. Il empêche également la dilution du virus avant l'application sur la grille TEM revêtue, de sorte qu'il peut être nécessaire pour les échantillons soupçonnés d'être près de la limite de détection TEM. Cependant, 1% de vapeur de tétroxyde d'osmium réduit la qualité des images TEM, car l'osmium peut encore tacher l'échantillon ( figure 3 ). Les rapports précédents montrent qu'une exposition de 5 min à la vapeur de tétroxyde d'osmium fournit de grands résultats lorsque la coloration négative; Cependant, une exposition plus longue requise pour la désactivation virale absolue a généré un mélange de coloration positive et négative 17 . La deuxième méthode d'inactivation implique un minimum de 24 h dans une solution de glutaraldéhyde à 2% et ne nécessite pas de traitement par des vapeurs d'ions d'azote ( figure 1D ). Cette deuxième méthode prend plus de temps à compléter car l'échantillon n'est pas supprimé du laboureur biocontainmentPendant 24 h, mais peut être avantageux car il permet de réaliser la coloration négative en dehors du bioconfinement dans un environnement BSL-2 et élimine le besoin de tétraxyde d'osmium dangereux. Nos résultats démontrent que 24 h d'inactivation du glutaraldéhyde produisent des images TEM de meilleure qualité que lorsque les échantillons sont traités avec de la vapeur de tétroxyde d'osmium ( Figure 3 ).

Deux taches négatives ont été utilisées dans cette expérience: UA et PTA. Les deux taches sont utilisées comme solution à 1%. UA, le sel d'acétate d'uranium, fonctionne bien comme une tache négative parce que les atomes d'uranium dense dispersent les électrons 5 . PTA, un hétéropolyacide, fonctionne de manière similaire comme une tache négative due à des atomes de tungstène denses 5 . La PTA est parfois préférable à l'UA parce qu'elle est beaucoup moins toxique, et seulement un irritant léger si inhalé ou contacté. En cas de coloration négative des échantillons non fixés, le pH inférieur de l'UA doit être considéré car il peut causer des dommages tO l'échantillon. Les virus utilisés dans cette expérience nécessitent une fixation pour l'inactivation, de sorte que l'UA et la PTA ont obtenu des résultats similaires et aucun avantage distinct n'a pu être détecté pour l'une ou l'autre des taches. Les deux taches sont faciles à utiliser, et elles produisent toutes deux des images TEM de qualité similaires ( Figure 4 ).

Dans l'ensemble, la méthode de la capsule est plus facile à utiliser dans un environnement biocontainment et peut être utilisée comme alternative à la méthode des gouttelettes manuelles. L'utilisation de capsules facilite les défauts de manipulation de l'échantillon et produit des images TEM de bonne qualité. Les images produites en utilisant la méthode de la capsule sont comparables aux images produites en utilisant la méthode de gouttelettes manuelle. L'inactivation courte du virus avec le tétroxyde d'osmium améliore la vitesse, mais ne doit être utilisée que si une qualité d'image réduite est acceptable, ou il est soupçonné de diluer que le virus le placera sous la limite de détection TEM pour la procédure. L'UA et la PTA offrent des résultats similaires avec les échantillons de virus fixés utilisés dans cette étude; HoPar exemple, les résultats peuvent être différents lors de la coloration des virus non fixés.

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Disclosures

Les opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations énoncées dans l'article sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement approuvées par l'armée américaine ou le ministère de la Défense.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier le Dr John Carra et Rowena Schokman pour la fourniture de Nano-VLP Ebola purifiés, le Dr Rajini Mudhasani pour la fourniture du virus Chikungunya et le Dr Charles (Jason) Shoemaker pour la fourniture de VLP à la leucémie murine exprimant les glycoprotéines d'Ebolavirus. Nous tenons également à remercier MAJ Carl Soffler pour avoir facilité le programme de stages d'été (SIP) et le Programme d'apprentissage en sciences et en génie (SEAP) et la Dre Catherine Wilhelmsen pour la formation en sécurité de laboratoire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37, (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355, (9216), 1713-1717 (2000).
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