Cuantificación de microorganismos a bajas concentraciones usando microscopia holográfica Digital (DHM)

Bioengineering

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Summary

La microscopia holográfica digital (DHM) es una técnica volumétrica que permite muestras de 50-100 X más gruesa que la microscopía brightfield en resolución comparable, con enfoque realizado post-processing. Aquí DHM se utiliza para identificar, contar y microorganismos en muy bajas densidades y en comparación con las mediciones de densidad óptica, gérmenes y conteo directo.

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Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). J. Vis. Exp. (129), e56343, doi:10.3791/56343 (2017).

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Abstract

Detecta y cuenta escasas muestras bacterianas tiene muchas aplicaciones en los alimentos, bebidas y la industria farmacéutica, diagnóstico médico y para la detección de vida por las misiones robóticas a otros planetas y lunas del sistema solar. En la actualidad, se cuentan escasas muestras bacterianas por microscopia de la galjanoplastia o epifluorescencia de cultura. Placas requieren largos tiempos de incubación (días a semanas) y microscopía de epifluorescencia requiere extensa de tinción y concentración de la muestra. Aquí, demostramos cómo se utiliza la microscopia holográfica digital fuera del eje (DHM) para enumerar bacterias en cultivos muy diluidas (100-104 células/mL). En primer lugar, se discute la construcción de la DHM personalizado, junto con instrucciones detalladas sobre la construcción de un instrumento de bajo costo. Se discuten los principios de la holografía, y se utiliza un modelo estadístico para estimar cuánto deberían videos para detectar células, basadas en las características de rendimiento óptico del instrumento y la concentración de la solución bacteriana (tabla 2) . Video detección de células a 105, 104103y 100 células/mL se demuestra en tiempo real utilizando hologramas no reconstruidos. Reconstrucción de imágenes de amplitud y fase se demuestra utilizando un paquete de software de código abierto.

Introduction

Determinación de la exacta conteos bacterianos en muestras muy diluidas es crucial en muchas aplicaciones: algunos ejemplos son alimentos y agua calidad análisis1,2,3; detección de patógenos en sangre, líquido cefalorraquídeo o esputo4,5; producción de productos farmacéuticos, incluyendo agua estéril6; y análisis de la comunidad ambiental en ambientes oligotróficos como en el abierto océano y los sedimentos7,8,9. Existe también un creciente interés en la detección de posible vida microbiana existente en las lunas heladas de Júpiter y Saturno, particularmente Europa10,11 y Encélado12,13, 14, que son conocidos por tener océanos líquidos subsuperficiales. Porque ninguna misión desde Viking en 1978 ha intentado encontrar existe vida en otro planeta, se ha limitado el desarrollo de tecnologías e instrumentos para la identificación bacteriana y conteo durante misiones de espacio15.

Los métodos tradicionales de gérmenes encuentran solamente las células cultivables, que pueden representar una minoría de la especie en las cepas ambientales, a veces < 1%16. Las placas requieren días o semanas de incubación para el máximo éxito, dependiendo de la cepa. Microscopía de epifluorescencia ha substituido en gran parte placa cuenta como estándar de oro para el recuento microbiano rápido y preciso. Etiquetado de ácido nucleico tintes fluorescentes como 4′, diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), SYBR Green o naranja de acridina que se unen a los ácidos nucleicos son los típicos colorantes usados17,18,19 , aunque muchos estudios utilizan indicadores fluorescentes de Gram muestra20,21,22,23,24. Utilizando estos métodos sin previa concentración conduce a límites de detección (LoDs) de ~ 105 células por mL. Mejoras en LoD son posibles mediante filtración. Una muestra de líquido es filtrado a vacío sobre una membrana, generalmente policarbonato e idealmente negro para reducir el fondo. Bajo fondo colorantes tales como las manchas de ADN mencionadas pueden aplicarse directamente al filtro25. Para cuenta exacta por el ojo, ~ 105 células requiere por filtro, lo que significa que para las muestras más diluidas que ~ 105 células por mL, volúmenes de muestra significativa deben ser recogidos y filtrados. Dispositivos de escaneo láser se han desarrollado con el fin de explorar sistemáticamente todas las regiones del filtro y así reducir el número de células necesario para contar, empujando los límites de detección hasta 10 ~2 células por mL26. Sin embargo, estos no están disponibles en la mayoría de los laboratorios y requieren sofisticado hardware así como software que permitan la confirmación de expertos que observó las partículas es bacterias y no desechos.

Para referencia, adultos con sepsis generalmente comienzan con síntomas en < 100 células/mL de sangre y los bebés en < 10 células/mL. 10 mL, lleva un empate de sangre de un adulto y un niño, 1 mL. Métodos basados en PCR son inhibidos por la presencia de flora no patógena humana ADN y componentes inhibidores de PCR en la sangre de27,28. A pesar de una variedad de técnicas emergentes, las culturas siguen siendo el gold standard para el diagnóstico de infecciones del torrente sanguíneo, especialmente en las zonas más rurales o países en desarrollo. Para la detección de vida en otros planetas, cálculos termodinámicos pueden estimar el presupuesto de energía para la vida y por lo tanto la biomasa esperada posible. 1 - 100 células/mL se espera que sean termodinámicamente razonable en Europa29. Se puede fácilmente ver desde estos números que la detección de muy pequeñas cantidades de células en grandes cantidades de solución acuosa es un importante problema sin resolver.

En este trabajo demostramos la detección de marcescens del Serratia y Shewanella oneidensis (mutante de tipo salvaje y no-motile) en concentraciones de 105104103y 100 células/mL mediante un eje digital microscopio holográfico (DHM). La ventaja clave del DHM por microscopía óptica tradicional es la proyección de imagen simultánea de un volumen grueso de la muestra a alta resolución: en esta implementación, la cámara de la muestra fue de 0,8 mm de espesor. Estas cámaras de muestra fueron construidas por la litografía suave de polidimetilsiloxano (PDMS) de un molde de aluminio de precisión con una tolerancia de ± 50 μm. Esto representa una mejora de aproximadamente 100-fold en profundidad de campo sobre microscopía de luz de alta potencia. DHM también proporciona información de la fase cuantitativa, que permite las mediciones de la longitud del camino óptico (producto del índice de refracción y el espesor). DHM y técnicas similares han sido utilizadas para el control bacteriano y ciclo celular de la levadura y cálculo de masa seca bacteriana30,31,32; las diferencias de dispersión pueden utilizarse incluso para diferenciar cepas bacterianas33.

El instrumento que utilizamos es a la medida específicamente para uso con microorganismos, previamente publicados34,35, y su diseño y construcción se demostró y se discuten. Soluciones acuosas son suministradas continuamente a una cámara de muestra de volumen 0.25 μl a través de la bomba de jeringa; el caudal está determinado por la velocidad de fotogramas de la cámara para asegurar la proyección de imagen del volumen muestra todo. Un cálculo estadístico predice el número de volúmenes de muestra que debe ser reflejada con el fin de detectar un número significativo de células a una concentración dada.

Para aplicaciones de detección celular, reconstrucción de los hologramas en amplitud y fase de imágenes no fue requerida; Análisis fue realizado en el holograma crudo. Esto ahorra importantes recursos computacionales y espacio en disco: un holograma de 500 Mb video será 1 a 2 Tb cuando reconstruido. Sin embargo, discutir la reconstrucción a través de la profundidad de la muestra para confirmar que los hologramas representan la especie deseada. Una característica importante de DHM es su capacidad para monitorear la intensidad y fase de las imágenes. Organismos que son casi transparentes en intensidad (como la mayoría de las células biológica) aparecen claramente en fase. Como es una técnica libre de etiqueta, no tintes se utilizan. Se trata de un undvantage para aplicaciones de vuelo espacial posible, ya que los tintes no pueden sobrevivir las condiciones de una misión y — más importante — no puede ser asumido para trabajar con organismos extraterrestres, que no pueden usar ADN o ARN para codificar. También es una ventaja para el trabajo en ambientes extremos como el Ártico y el Antártico, donde los tintes pueden ser difícil de llevar a la ubicación remota y pueden degradar al almacenamiento. Reconstrucción de imágenes en fase y amplitud se realiza utilizando un paquete de software de código abierto que hemos hecho disponibles en GitHub (champú) o ImageJ.

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Protocol

1. crecimiento y enumeración de bacterias

Nota: esto es aplicable a casi cualquier cepa bacteriana en el medio adecuado 36. En nuestro ejemplo, utilizamos tres cepas: Serratia marcescens como una cepa de laboratorio común, fácil identificación; y una cepa ambiental más pequeña, altamente móvil, Shewanella oneidensis MR-1. Para comparar la detección de móviles frente a las células no-motile, un no-motile Shewanella mutante, Δ FlgM, también se utiliza para comparación 37. Todas las cepas se cultivan en caldo de lisogenia (LB).

  1. Prepare medio estéril de LB (por litro de agua destilada: 10 g bacto triptona, 5 g de bacto levadura, 10 g de NaCl; filtro o autoclave). Preparación estándar de 100 mm diámetro LB-agar placas (misma receta como medio más agar 15 g por litro, autoclave (121 ° C, 20 min) para esterilizar y servir cuando esté fría para manejar). Almacenar medio y placas en el refrigerador.
  2. El día antes del experimento de la semilla 5-6 mL de " amo " medio de cultivo de una colonia bacteriana fresca, utilizando técnica estéril y bioseguridad correcta. Incubar en un agitador (120 rpm) a 30 ° C tiempo de incubación de ~ 12 h. será dependiente de la cepa y tasa de crecimiento. En nuestros experimentos, las cepas de Shewanella se incuban durante 12 horas; sin embargo, Serratia se cosecha después de 8 horas, para asegurar la cultura expondrá crecimiento medio logarítmicos.
  3. El día del experimento, tomar una lectura espectrofotométrica (OD 600) de las bacterias dominar la cultura, que se espera que en el rango de 0.6 a 0.7. Debe estar en la fase de crecimiento logarítmico (según lo determinado previamente). Si no, el subcultivo 100 μl a 5 mL de medio y crecimiento de la célula a la fase de registro medio.
  4. Toma una muestra del maestro de la cultura y contar las células de la cámara directamente a través de un recuento de Petroff-Hausser. Esta enumerar las células vivas y muertas.
    1. Extraer una muestra de 10 μl de la cultura sin diluir con una micropipeta y transferencia en la cámara de.
    2. Imagen bajo un microscopio objetivo alto seco (40 X ó 63 X, NA 0.7 - 0.8) con contraste de fase.
    3. Contar las bacterias en menos de 20 plazas y media.
      Nota: Contar sólo las bacterias que están enteramente dentro de una plaza y sólo ésos cruzando la parte superior y límites izquierdos (o parte inferior y derecha, si lo prefiere). Si las plazas están separadas por varias líneas, elegir uno como un límite de.
    4. Concentración de calcular como el promedio de 20 plazas x factor de dilución. Nota que cuenta no funcionan bien para las concentraciones de < 10 7 / mL.
  5. Hacer diluciones seriadas de la cultura para el recuento de Colonia formando unidades (UFC). Esto enumerar células vivas solo. Solución
    1. hacer una dilución seriada de cada una de las muestras bacterianas seleccionadas con solución salina 0.9% estéril. Transferir 20 μl de la solución bacteriana y diluir con solución salina μl 180. Repita hasta que la concentración más baja es ~ 10 3 células/mL.
    2. Tomar 100 μl de por lo menos dos diluciones sugeridas es 10 3 y 10/ml 4 — y la placa en una placa de medio sólido adecuado. Extienda con un esparcidor estéril. Realizar al menos 3 réplicas de cada dilución.
    3. Incubar a una temperatura adecuada para sus bacterias durante la noche o hasta que las colonias crecen.
    4. Contar las colonias y calcular colonias formando unidades (UFC) según (Nº de colonias x factor de dilución) / volumen plateado = UFC/mL. Promedio de UFC en las repeticiones.

2. Preparación de muestras altamente diluido para DHM

  1. hacer diluciones seriadas del maestro de la cultura para DHM y post-DHM recuento de unidades formadoras de colonias en placas de medio LB (ver 1.4.1 - 1.4.4). Realizar esta doble ciego para que la persona que realiza las grabaciones no es consciente de la concentración en cada muestra medido.
    1. Diluir las bacterias en 10-15 mL de un medio mínimo que estimular la motilidad (según corresponda) sino que inhiben la división celular, por lo que la concentración de células no cambia apreciablemente durante el experimento. Esto puede ser solución salina al 0.9% o un medio de movilidad más específico. Por ejemplo, si utiliza Escherichia coli, medio para motilidad debe contener EDTA 38. Para estos ejemplos, se utiliza solución salina al 0.9%.

3. Grabar Videos de DHM

  1. utilizando una jeringa estéril, tire unos 10 ml de la dilución de interés.
  2. Conectar la jeringa a la cámara de la muestra de la DHM usando los accesorios estériles y tubos.
    Nota: Una cámara de microfluidos por encargo fue construida para permitir el flujo constante de muestra a través de la trayectoria óptica del instrumento. Consulte la sección resultados para más detalles. Antes del experimento, todos los componentes de la cámara de muestras deben esterilizarse en autoclave.
  3. Flujo de la muestra de la jeringa a través de la cámara de muestra continuamente utilizando una bomba de jeringa.
    Nota: Las tasas de flujo apropiado varían dependiendo dimensiones canales fluídicos, rendimiento deseado, así como limitaciones de adquisición de datos.
  4. Como la muestra se atraviesa la cámara de muestras, adquisición de hologramas consecutivamente a una velocidad de fotogramas adecuada. Se creará un archivo de sello de tiempo que registros el tiempo de cada imagen de captura para ser utilizado más adelante durante el análisis de datos (Protocolo de la sección 4). Obtener los hologramas a temperatura ambiente (23° C). Grabar hologramas ejecutando un archivo ejecutable del C++ escrito previamente proporcionado por el fabricante de la cámara.
    Nota: Marco apropiado varía según el caudal elegido. Para este experimento, se recomienda utilizar una velocidad de fotogramas que una bacteria sería reflejada > 2 veces como viajó a través del instrumento ' s campo de vista.
  5. Permitir tiempo suficiente para la entera 10 mL de muestra a ser atravesado el DHM.
  6. Para garantizar que las bacterias no están creciendo o muriendo durante los experimentos, inoculan enriquecido las placas de los medios de comunicación con 100 μl de la captura de imagen gastado media post-DHM. Con un esparcidor estéril e incubar a temperatura adecuada por 24 horas; contar las colonias presentes.

4. Cálculo de la densidad celular y límites de detección

  1. con los videos de holograma adquirido, analizar los datos de presencia de bacterias.
    1. Calcular el valor del píxel mediana de una serie de hologramas de tiempo luego reste este valor medio de cada píxel correspondiente para eliminar artefactos fijos en el holograma. Esto se puede hacer en ImageJ realizando los siguientes pasos:
      1. convertir a 32-bit (bit de imagen-tipo-32)
      2. calcula la mediana (imagen-pila-Zproject-mediana)
      3. reste el promedio del resto de la pila ( Process-ImageCalculator-Subtract)
    2. cuenta el número de Anillos luminosos visibles y las células en el foco manualmente. En ImageJ, esto se hace apuntando a los objetos con la herramienta punto.
    3. Cada serie de hologramas irá acompañado de un archivo de sello de tiempo (registrado en el momento de la adquisición del holograma). Uso el archivo de sello de tiempo para calcular la cantidad total de muestra bombeado al tiempo la imagen fue capturado.
  2. Calcular la densidad de la célula dividiendo el número total de células detectadas por el volumen total de la muestra fotografiada. Promedio de 5-10 cuadros de estadísticas precisas.

5. Amplitud y fase de la reconstrucción de la imagen

  1. elegir representante videos de 10-200 células por cuadro. Crudo (no restar mediana) hologramas de la carga en el software de reconstrucción (ejemplos: propagación numérica ImageJ 39; CHAMPÚ [GitHub]).
    1. Utilizar ImageJ, ir a difracción de propagación numérica numérica OD.
    2. En el símbolo del sistema, dibujar una máscara de Fourier para elegir la real o la imagen virtual y eliminar cualquier características de ruido sinusoidal.
    3. Reconstrucción de amplitud y fase en z-medidas adecuadas introduciendo la distancia reconstrucción.
  2. Mediana restar los datos de amplitud para reducir el ruido en 4.1.1.
  3. Datos 3D cubo o proyección. Ir a Plugins — volumen espectador.

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Representative Results

Los resultados deben indicar la capacidad para detectar las bacterias vivas y muertas en niveles muy bajos de DHM. El número de bacterias contadas debe ser coherente con los resultados obtenidos utilizando las cuentas Petroff-Hauser cuentas cámara y placa. Estándar métodos estadísticos proporcionan información sobre la exactitud de los métodos de detección distintos a diferentes concentraciones bacterianas.

La figura 1 muestra la cámara de Petroff-Hausser cuenta utilizada así como la microestructura de la cámara de cuenta que se utiliza en la enumeración directa de las células. Figura 2A muestra una placa de cultivo enriquecido típico que le ha permitido suficiente tiempo para S. marcescens creciendo las colonias (16 horas a temperatura ambiente). Figura 2B muestra las curvas de crecimiento para todas las cepas utilizadas. Mientras que las medidas del espectrofotómetro exactas varían, la relación entre el OD600 y Colonia la cuenta debe ser lineal dentro de la gama confiable del espectrofotómetro; medimos ~ OD600 = 0.1 como ~ 108/ml. Cuenta con la directa Petroff-Hausser y recuentos de colonias deben aceptar dentro del 10% hasta las células comienzan a morir por rotación en la curva de crecimiento.

La figura 3 muestra el diseño de las salas de la muestra medida. Cámaras personalizadas microfluídicos fueron utilizados para este experimento para permitir el flujo continuo de muestra a través del campo de visión del microscopio holográfico. Materiales y técnicas de microfluidos estándar se utilizaron en la construcción de las salas de la muestra. Blunt con punta de acero inoxidable agujas con accesorios Luer-Lok macho fueron insertadas en el dispositivo de microfluidos para proporcionar los puertos de entrada y salida a la cámara de muestra. La geometría del canal microfluídico fue establecida por la litografía suave de polidimetilsiloxano (PDMS) utilizando un molde maestro de aluminio mecanizado, que fue comprimido, a través de marcos de aluminio, entre dos ventanas de cristal de calidad óptica. El PDMS geometrías de canal de flujo establece como asegura agujas hipodérmicas, que proporcionan transporte fluido hacia y desde los canales de flujo. Estas cámaras de muestra usan PDMS únicamente a establecer la geometría del canal de flujo y por lo tanto no contienen PDMS en la trayectoria óptica del instrumento. Tenga en cuenta que por la naturaleza óptica de un microscopio holográfico fuera de eje, dos canales de micro fueron moldeados paralelas entre sí en la cámara de muestras. Esto se piensa para igualar longitudes de trayectoria óptica entre ambos brazos del interferómetro (denominado la 'referencia' y 'muestra' los brazos). El canal de referencia sólo debe contener medios estériles y no debe ser objeto de flujo.

La figura 4 muestra un esquema y las imágenes del microscopio holográfico digital en su aplicación de laboratorio. Es operado por el software suministrado con la cámara. La figura 5 muestra datos DHM representativos para la enumeración bacteriana y su correspondencia con los números previstos de células por campo de visión. De los hologramas crudos, sin reconstrucción, es posible ver y contar las células por sustracción de mediana y seguimiento manual. Esto reduce considerablemente la carga computacional en comparación con la reconstrucción de todos los planos de z, como los hologramas de crudo muestran las células a lo largo de la profundidad de la cámara. La aparición de las culturas a diferentes concentraciones y su correspondencia con la cuenta de placa y de recuento de Petroff-Hauser se indican. Recuento total se determinó promediando el número de células que se ven en cada volumen de la muestra sobre el número total de volúmenes de imágenes. El límite de detección se determina por el número total de volúmenes de la muestra fotografiada. En este experimento, establecemos un límite máximo de este valor, con un máximo total de 10 mL de muestra reflejada en 0,25 incrementos μl (un total de 40.000 imágenes por muestra). Las grabaciones se detienen antes de que el volumen total máximo se obtiene si las células se observan claramente en cada marco una serie de 20 cuadros. En el anterior documento, nos informó de una fórmula para estimar el número de volúmenes de muestra necesarios para detectar las bacterias a un nivel de confianza de 50% en concentraciones que van desde 1-105 células/mL (tabla 1). Según esta estimación, un examen de todos los marcos de 40.000 debe permitir la detección de células 1/ml, aunque este cálculo es computacionalmente intensivo.

La figura 6 muestra el uso de reconstrucción software (Fiji)39. Un holograma solo es abierto y el software se ejecuta "OD-numérico numérico de propagación de difracción". Se dan los parámetros de proyección de imagen en el cuadro de diálogo; amplitud, intensidad y fase pueden ser reconstruidos. Un plano de z solo puede ser elegido o reconstrucciones de lote pueden utilizarse para reconstruir toda la profundidad.

La figura 7 muestra reconstrucciones de amplitud y fase de imágenes a diferentes profundidades en una muestra seleccionada. La máscara de Fourier para generar las reconstrucciones se muestra, junto con una imagen de resta de mediana intensidad, una imagen de fase, una máxima proyección a través de la pila de fase y una proyección de volumen de la pila de intensidad.

Figure 1
Figura 1: dirigir el recuento de células bacterianas. Concentración bacteriana en las células/mL se calcula contando el número total de bacterias en la cámara de conteo y ampliar ese número que representa el hecho de que la cámara de Petroff-Hauser sólo contiene 20 nL de muestra. (A) la Petroff-Hausser cámara de conteo. (B) imagen de la cuenta del compartimiento microestructura bajo 10 X de contraste de fases, mostrando cajas de diversos tamaños útiles para enumerar las células de diferentes tamaños. (C) aparición Serratia marcescens del S. dentro de las cajas más pequeñas de cámara cuenta; Contraste de fase de 40 X. (D) método de conteo excluye las células en los bordes superiores y derecho (N), pero no el inferiores izquierdos los bordes y (Y). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: conteo de células por crecimiento de la Colonia y la densidad óptica. (A) S. marcescens se incubó a temperatura ambiente durante 16 horas. En la dilución correcta, deben placastienen 20-200 colonias por cuenta exacta y estadísticas. La placa que se muestra es un poco demasiado llena para conteo confiable. Curvas de crecimiento (B) para las 3 cepas utilizadas. Densidad óptica de 0.1 corresponde a ~ 108 células/mL, pero valores exactos varían según el instrumento. Conteo directo de Petroff-Hauser de acuerdo con la cuenta de placa para dentro del 10% dentro de la gama de crecimiento lineal. Barras de error representan la desviación estándar de 5 muestras independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: diseño de la cámara de la muestra. Microfluídica (A) esquemático (muestra y referencia microcanales etiquetados). (B) cámara de muestra completamente montado. (C) explotó CAD ver muestra los elementos constitutivos de la cámara de muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: esquema e imágenes de microscopio holográfico digital. (A) esquema que muestra los cuatro elementos principales: la fuente, la muestra (camino de muestra se etiqueta espec. y trayectoria de referencia se denomina Ref.), el microscopio y el sensor. (B) modelo sólido del hardware. La Asamblea de la fuente de alimentación fibra es en la parte inferior, y la cámara es en la parte superior. La óptica del microscopio – conformada por las dos lentes asféricas y el lente de relé – están contenidos en el tubo largo 300 mm. La etapa tres ejes entre la fuente de la óptica del microscopio proporciona fácil manipulación manual de la muestra bajo estudio. (C) fotografía del instrumento en el laboratorio. La barra de escala en la parte inferior de la imagen representa 1 pulgada. Los esquemas nuevamente provienen de Wallace et al. 34. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: curvas de crecimiento y datos representativos de la DHM. (A) pronosticado de las células por campo de visión basado en un volumen de muestra de μm μm x 365 365 x 1 mm. El rango óptimo para la enumeración de DHM se muestra en el rectángulo, y muestras reales se indican como (B) y (C). (B) DHM holograma de un Shewanella cultura en 8 x 105 células/mL medido por Petroff-Hauser y 7,7 x 105 células/mL según lo medido por cuenta de la placa; Esta imagen muestra las 110 células, un excelente ajuste a la predicción. (C) DHM holograma de una cultura de Shewanella 2.0 ±0. 1 x 105 células/ml medido por Petroff-Hauser y 2.0 ±0. 3 x 105 células/mL según lo medido por cuenta de la placa; Esta imagen muestra las 27 células. Barra de escala = 35 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: realización de reconstrucciones. (A) abrir un holograma en Fiji. (B) ejecutar la propagación numérica y especifique el tamaño de la longitud de onda y la imagen. Elija una distancia z cerca de 0 para comenzar. (C) dibujar una máscara de Fourier cuando se le pida para seleccionar el real o la imagen virtual. Baño (D) procesamiento permite reconstrucciones a lo largo del volumen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: aspecto de reconstrucciones. Imágenes de la cultura de la Serratia en ~ 106 células/mL. Holograma crudo (A). (B) de Fourier. El área dentro del círculo es el área que se utilizará; el resto se enmascara. (C) reconstrucción de amplitud en un solo plano de z. (D) fase de reconstrucción en un solo plano de z; la barra de escala muestra el desplazamiento de fase en grados. (E) máxima proyección de intensidad a través de los planos de z en la pila de fase. Ve el volumen (F) de la pila de amplitud completa (365 x 365 x 800 μm). Barra de escala = 35 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Concentración [células por mL] Marcos necesitados
1.00E + 00 6.686
1.00E + 01 669
1.00E + 02 67
1.00E + 03 7
1.00E + 04 1
1.00E + 05 1

Tabla 1: Número mínimo de volúmenes de muestra requeridos para detectar bacterias por DHM (confianza de detección del 50%).

Propiedad Valor Unidad
Longitud de onda de operación 405 nm
Apertura numérica objetiva 0.3 -
Ampliación de sistema 20 -
Resolución lateral 0,7 Μm
Volumen de la proyección de imagen de muestra 360 x 360 x 800 Μm x μm x μm
Longitud del instrumento 400 mm

Tabla 2: Especificaciones ópticas y rendimiento para el microscopio holográfico digital.

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Discussion

Reconstrucción numérica de hologramas: la reconstrucción numérica de hologramas, se utiliza el método de espectro angular (ASM). Se trata de la circunvolución del holograma con la función de Green para el DHM. El frente de onda compleja de la imagen en un determinado plano focal se puede calcular empleando el teorema de la circunvolución de Fourier como sigue:

Equation 2(1)

Donde Equation 3 es el operador de Fourier, Equation 4 es la matriz del holograma, y Equation 5 es la función de Green de la DHM, que se define como:

Equation 6(2)

Donde Equation 7 es la distancia, a lo largo del eje óptico, del plano focal deseado a ser reconstruido, Equation 8 es la longitud de onda de iluminación, Equation 9 y Equation 10 son el número de píxeles en la x y y, respectivamente, y Equation 11 y Equation 12 son los tamaños de pixel (en el plano del detector) en x y y direcciones,40respectivamente.

Desde el frente de onda complejo, puede calcularse la intensidad de la magnitud al cuadrado de Equation 13 , y la fase puede obtenerse por el arco tangente del cociente entre las partes imaginarias y real de Equation 13 .

Modificaciones y la resolución de problemas
Experimentos con la enumeración de escasas concentraciones bacterianas son altamente susceptibles a la contaminación, falsos positivos y falsos negativos. Por esta razón, el crecimiento y enumeración de bacterias, así como la preparación de las muestras altamente diluidas para DHM son pasos críticos en este experimento. Debe tenerse cuidado para evitar la contaminación en este experimento controlando cuidadosamente el medio ambiente donde las bacterias son cultivadas y enumeradas. Técnicas de correcta esterilización, incluyendo autoclave, ayudar a prevenir contra la contaminación, así como falsos positivos. Para previene contra falsos positivos, las bacterias fueron seleccionadas para este experimento que presentan características relativamente únicas (por ejemplo, marcescens del S. tiene un color rojo muy distinto cuando cultivadas). Para prevenir contra falsos negativos, la bacteria elegida para este experimento se seleccionaron tal que sean capaces de crecer en placas de cultivo enriquecido, así como tienen formas características y patrones de movilidad para ser identificados a través de DHM. Es importante comprobar periódicamente para contaminación o crecimiento celular inesperado por platear las muestras y cuantificar las bacterias por gérmenes.

En la realización de este experimento, se espera un tamaño de datos de aproximadamente 2,4 GB por 1 mL de muestra. Este número, por supuesto, depende de la cámara y archivo formato utilizado. El tamaño de los datos registrado es el uso de un detector de Mpx 4 y un formato de archivo TIFF estándar. El post-processing de los datos requiere aproximadamente 6 min de cómputo por 1 mL de muestra. Este tiempo fue observado durante el uso de un procesador de 8 núcleos de Intel i7 a 3,5 GHz y 32 GB de memoria RAM. Estos cálculos se pueden paralelizar a la GPU grandemente reducido tiempos de procesamiento, pero no se ha hecho aquí.

Limitaciones de la técnica
Mientras que usando DHM para detectar concentraciones muy bajas de bacterias es posible, este método no es específica. Morfología sola no es una forma concluyente de identificar las cepas bacterianas. Usos de diagnóstico presenta retos específicos debido a la presencia de células no-Diana y agregados. Sin embargo, la ventaja del instrumento de doble haz presentada aquí es que es capaz de bacterias imagen en muestras relativamente turbias. La capacidad para detectar bacterias en muestras clínicas y el grado de tratamiento previo de las muestras que se requiere, aún determinarse.

Pasos críticos en el protocolo
Paso 2: Obtención de diluciones exactas es esencial a la enumeración cuantitativa. Cualquier diluciones hechas deben respaldarse por gérmenes. Paso 3: elección de velocidad de flujo y la correspondiente debe hacerse cuidadosamente para asegurar que todas las células se ven. Ajuste de los parámetros de la bomba debe ajustarse cuidadosamente antes de realizar un límite del experimento de detección. Paso 4: para muy bajas concentraciones bacterianas, es crucial capturar datos suficientes para estar seguro de detección. Puede ser necesario reconstruir algunos datos para asegurarse de que las células y no la ruina, se ven. En casos extremos, más de 10 mL de solución puede ser necesario. Cepas no-motile suelen ser ambiguos de cepas mótiles. Paso 5: si hay alguna ambigüedad en los datos, reconstrucción puede ayudar a demostrar que hologramas representan las células y no desechos. Reconstrucciones de alta resolución muestran morfologías celulares clásicos y motilidad puede verse claramente en las pistas de cepas mótiles.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores reconocen el Gordon y Betty Moore Foundation Becas 4037 y 4038 a la California Institute of Technology para la financiación de este trabajo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast BD Biosciences 212750
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7710 Many options for purchase
Bacto Agar BD Biosciences 214010
10 cm Petri dishes VWR 10053-704
15 mL culture tubes Falcon (Corning Life Sciences) 352002 Loose-capped
Petroff-Hauser chamber Electron Microscopy Sciences 3920
10 mL syringes BD Biosciences 309604 Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting McMaster-Carr 51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow Nalgene 8000-0004 Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000
Sample Chamber Custom n/a See Materials Section
Holographic Microscope Custom n/a See Wallace et al.
Open-source software Custom https://github.com/bmorris3/shampoo

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References

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