Fabrikasjon prosedyrer og Birefringence mål for utforme magnetisk forståelsesfull transisjonsmetall Ion chelaterande Phospholipid samlinger

Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fabrikasjon prosedyrer for svært magnetisk forståelsesfull transisjonsmetall ion chelaterande polymolecular samlinger presenteres. Magnetisk svaret er diktert av montering størrelsen, som er skreddersydd ved ekstrudering gjennom nanopore membraner. Samlingene magnetiske alignability og temperatur-indusert strukturelle endringer overvåkes av birefringence mål, en gratis teknikk kjernefysiske magnetisk resonans og liten vinkel neutron spredning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bicelles er tunable diskett-like polymolecular samlinger fra et stort utvalg av lipid blandinger. Programmer spenner fra membranen protein strukturelle studier av kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) nanoVT utviklingen inkludert dannelsen av optisk aktiv og magnetisk valgbar gels. Slike teknologier krever høy kontroll montering størrelse, magnetiske svar og termisk motstand. Blandinger av 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DMPC) og transisjonsmetall ion (Ln3 +) chelaterande phospholipid konjugert, 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), samle inn svært magnetisk forståelsesfull samlinger som DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molar forholdet 4:1:1) bicelles. Innføring av kolesterol (Chol-OH) og steroid derivater i bilayer fører til et annet sett med samlinger tilbyr unike fysikalsk-kjemiske egenskaper. For en gitt lipid komposisjon er den magnetiske alignability proporsjonal med størrelsen bicelle. Complexation av Ln3 + gir enestående magnetiske svar i både størrelse og justering retning. Thermo-reversibel sammenbruddet av disk-lignende strukturer i blemmer på oppvarming kan skreddersy samlingene dimensjoner ved ekstrudering gjennom membran filtre med definerte pore størrelser. Magnetisk alignable bicelles genereres av kjøling til 5 ° C, noe som resulterer i montering dimensjoner definert av vesicle forløpere. Her, denne fabrikasjon prosedyren er forklart og den magnetiske alignability for samlingene er kvantifisert ved birefringence målene under et 5,5 T magnetfelt. Birefringence signalet, som stammer fra phospholipid bilayer, kan ytterligere overvåking av polymolecular omveltningene i bilayer. Denne enkle teknikken er komplementære til NMR eksperimenter som brukes ofte til å beskrive bicelles.

Introduction

Bicelles er diskett-like polymolecular samlinger fra mange lipid blandinger. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 de er mye brukt for den strukturelle karakteristikken av membran biomolecules av NMR spektroskopi. 6 , 7 men siste innsats sikte på å utvide området mulige anvendelser. 5 , 8 , 9 mest studerte bicelle systemet består av en blanding av 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DMPC), utgjør de planar del av forsamlingen, og 1,2-dihexanoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DHPC) phospholipid dekker kanten. 1 , 2 , 3 molekylær geometri fosfolipider komponere bilayer diktere arkitektur selv montert polymolecular strukturen. 4 , 5 erstattet DHPC med DMPE-DTPA genererer svært magnetisk responsive og tunable bicelle systemer. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molar forholdet 4:1:1) bicelles forbinder med mange flere spinn transisjonsmetall ioner (Ln3 +) på det bilayer overflaten, resulterer i en utvidet magnetiske respons. 10 videre erstatte vannløselige DHPC molekyler med DMPE-DTPA/Ln3 + gjør dannelsen av fortynning-resistente bicelles. 11

Den magnetiske alignability av Plane polymolecular samlinger er diktert av sin samlede Magnetisk energi,

Equation 1(1)

hvor B er magnetisk feltstyrke, Equation 2 magnetisk konstant, n hvor aggregering og Equation 3 molekylært diamagnetic mottakelighet anisotropy av lipider komponere bilayer. Derfor er svaret av DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles magnetfelt skreddersydd etter deres størrelse (samlet antall n) og molekylær diamagnetic mottakelighet anisotropy Δχ. Sistnevnte er lett oppnådd ved å endre innholdet av sin natur chelated Ln3 +. 12 , 13 , 14 , 15 presenterer kolesterol (Chol-OH) eller andre steroid derivater i bilayer tilbyr muligheten for tuning både samlet mange n og magnetiske mottakelighet Δχ av samlingene. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 for en gitt lipid komposisjon, større samlinger inneholder flere lipider i stand til å bidra til Emag (større samlede nummer n), som resulterer i mer alignable arter. Størrelsen på DMPC/DHPC bicelles, for eksempel kontrollert konvensjonelt gjennom optimalisering av komponist lipid forholdet eller totale konsentrasjonen. 20 , 21 , 22 selv om dette er mulig i DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles, deres thermo-reversibel transformasjon fra bicelle til blemmer på oppvarming tilbyr lagt skreddersøm alternativer. Mekanisk betyr som ekstrudering gjennom membran filtre kan forme av blemmer. Magnetisk alignable bicelles genereres på kjøling til 5 ° C og deres dimensjoner er diktert fra vesicle forløpere. 11 Herein, vi fokus på potensialet til mekaniske fabrikasjon prosedyrer med DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) som referanse systemer. Prosessen fungerer analogt når du arbeider med andre Ln3 + enn Tm3 +. Det brede spekter av muligheter som tilbys av disse teknikkene er uthevet i figur 1 og mye diskutert andre steder. 23

Figure 1
Figur 1: skjematisk oversikt over mulig fabrikasjon prosedyrene. Studert magnetisk alignable Ln3 + chelaterande polymolecular samlingene er sammensatt av en DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5). Tørr lipid filmen er hydratiserte med en 50 mM fosfatbuffer på en pH-verdi på 7,4 totale lipid konsentrasjonen er 15 mM. En effektiv hydrering av lipid filmen krever enten fryse tiner sykluser (FT) eller oppvarming og kjøling sykluser (H & C). H & C sykluser er nødvendig å regenerere prøver etter siste fryse tining trinn, eller å regenerere prøver holdt frosne over en lengre periode hvis de brukes uten ytterligere ekstrudering. Disse trinnene er mye diskutert av Isabettini et al. 23 maksimalt alignable polymolecular samlinger er oppnådd, levere annen samling arkitekturer basert på lipid sammensetningen. Bicelle størrelse og magnetiske alignability er tunable ved ekstrudering (Ext) gjennom nanopore membran filtre. Presentert justering faktorer Af var beregnet fra 2D liten vinkel neutron spredning (San) mønstre av en DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) prøve ekstrudert gjennom enten 800, 400, 200 eller 100 nm porene. SANS målinger er en utfyllende måte å kvantifisere bicelle justering som ikke dekkes i mer detalj her. 11 , 16 the Af varierer fra -1 (parallell neutron spredning eller loddrett justering av bicelles med hensyn til magnetiske feltet retning) til 0 for isotropic spredning.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Strukturen på bicelles har blitt grundig studert av en rekke karakterisering teknikker. 13 justeringen av bicelles utsettes for et magnetfelt har vært kvantifisert med NMR spektroskopi eller liten vinkel neutron spredning (San) eksperimenter. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 men Skift og utvidelse av NMR toppene forekommer i nærvær av Ln3 + er alvorlige begrensninger for metoden. 15 , 26 , 27 , 28 men SANS eksperimenter lider ikke av denne begrensningen, alternative og mer tilgjengelig teknikker er ønskelig for rutinemessig kvantifisering av magnetisk induserte tekstjustering samlinger i løsningen. Birefringence mål er en levedyktig og relativt enkelt alternativ. Analogt til NMR eksperimenter avsløre birefringence målinger verdifull informasjon om lipid rearrangements og lipid fasene forekommer i bilayer. Videre geometriske transformeringer forekommer i samlingen polymolecular med endring av forhold som temperatur, overvåkes. 11 , 12 , 13 , 16 magnetisk indusert birefringence Δn′ har blitt brukt til å studere ulike typer phospholipid. 13 , 29 , 30 birefringence målinger basert på fase moduleringsteknikk i et magnetfelt er en levedyktig metode for å finne retningen på bicelles. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 muligheten for å undersøke bicelles med birefringence i høy magnetfelt til 35 T ble også demonstrert av M. Liebi et al. 13

Når polariserte lyset går inn i en Anisotrop materiale, vil det være brytes i en ordinære og ekstraordinære bølge. 11 to bølger har forskjellige hastigheter og er forskjøvet i fase en retardasjon ses. Graden av retardasjon ses måles og omgjort til et birefringence signal Equation 5 å kvantifisere graden av anisotropy i materiell hjelp

Equation 6(2)

hvor λ er bølgelengdeområdet av laser og d er tykkelsen på prøven. Fosfolipider er optisk Anisotrop deres optiske aksen sammenfaller med sine lange molekylær akser, parallelt hydrokarbon haler. 11 , 12 ingen retardasjon måles hvis fosfolipider er tilfeldig orientert i løsningen. Retardasjon måles når fosfolipider justeres parallell til hverandre. Magnetisk indusert birefringence Equation 5 kan ha et positivt eller negativt fortegn avhengig av retningen på molekylene i magnetfeltet; se figur 2. Fosfolipider linje parallell til x-aksen vil resultere i en negativ Equation 5 , mens de justert langs z-aksen medføre en positiv Equation 5 . Ingen birefringence er observert når den optiske aksen faller sammen med retningen av lys overføring som phospholipid justerer parallelt med y-aksen.

Figure 2
Figur 2: Justering av fosfolipider og tilsvarende tegn på magnetisk indusert birefringence Equation 12 . Tegnet av den målte Equation 12 avhenger av retningen på phospholipid i magnetfeltet. Stiplede linjer viser den optiske aksen molekylet. Lyset er polarisert på 45° og overfører i y-retningen. Det magnetiske feltet B er i z-retningen. Dette tallet er endret fra M. Liebi. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ved en isotropic kolloidalt suspensjon av bicelles gå retningen av ordningen med fosfolipider i bilayer tapt, nullstille retardasjon ses. Bicelles må også justere for å orientere de optisk aktive fosfolipider i deres bilayers, forårsaker en retardasjon ses polariserte lyset. Derfor er birefringence en følsom verktøyet å kvantifisere den magnetiske alignability av polymolecular samlinger. Bicelles justert vinkelrett på det magnetiske feltet vil gi en positiv Equation 5 , mens de justert parallell vil gi en negativ Equation 5 . Tegnet avhenger av oppsettet og kan kontrolleres med en referanse prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabrikasjon prosedyre for DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) og DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) polymolecular samlinger

  1. Foreløpig forberedelser
    1. Vask alle glass ved flushing gang med etanol stabilisert kloroform (> 99% kloroform) og tørt med trykkluft.
    2. Lage 2 forskjellige 10 mg/mL lager løsninger av DMPC og DMPE-DTPA i etanol-stabilisert kloroform (> 99% kloroform), en 10 mM lagerløsning Chol-oh i etanol-stabilisert kloroform (> 99% kloroform) og en 10 mM lagerløsning TmCl3 i metanol.
    3. Forberede en 50 mM fosfatbuffer ved pH verdien 7.4 ved å blande 0.121 g av natrium dihydrogen fosfat dihydrate og 0.599 g vannfri di natrium hydrogen fosfat i 100 mL ultrapure H2O.
  2. Utarbeidelse av tørr lipid filmen
    1. Veie den nødvendige mengden amphiphiles (DMPC DMPE-DTPA og eventuelt Chol-OH) og Ln3 + lager løsninger i separate 3 mL glass snapin-kopper med en 2,5 mL glass sprøyte.
      1. For et 3 mL eksempel volum av DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (molar forholdet 4:1:1, totalt lipid konsentrasjon av 15 mM), veie 3.6435 g av DMPC lager løsningen, 1.4731 g av DMPE-DTPA lager løsningen og 0.7126 g TmCl3 lager løsningen.
      2. For et 3 mL eksempel volum av DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5, totalt lipid konsentrasjon av 15 mM), veie inne 2.9148 g DMPC lager løsningen, 1.4731 g av DMPE-DTPA lager løsningen, 1.0749 g Chol-OH lagerløsning og 0.7126 g TmCl3 lager løsningen.
        Advarsel: Kloroform og metanol er giftig og flyktige ved romtemperatur. Arbeid under avtrekksvifte og raskt fortsette med masse målene.
    2. Overføre innholdet i snapin-kopper til en 25 mL rundt bunnen kolbe. Tøm hver snapin-cup i runde bunnen flasken ca 2,5 mL tilsvarende løsemiddel.
    3. Fjerne løsemiddelet under vakuum i en roterende fordamperen på 40 ° C. Angi innledende trykket til 30 000 Pa til de fleste løsemiddel er fjernet. Redusere presset til 100 Pa og tørr prøven under rotasjon for et minimum av 2 h. får en ensartet tørr lipid film på glassvegger av flasken.
    4. Plass tørr lipid filmen i 1 minutt under en jevn strøm av argon å unngå lipid oksidasjon i luften og lagre utvalget i fryseren før utvanning.
  3. Hydrering av tørr lipid filmen
    1. Legg til de 3 mL fosfatbuffer runde bunnen kolbe å nå en total lipid konsentrasjon av 15 mM.
    2. Gjennomføre en fryse-tining (FT) syklus av stuper kolbe under rotasjon i flytende nitrogen til det grundig frosset (de flytende nitrogen stopper koking), deretter varme tilbake opp til 60 ° C ved å plassere utvalget for 5 min i et vannbad, virvlende kolbe kontinuerlig til hjelpe smelteprosessen. Bruke 30 s av vortexing før hver frysing syklus når prøven er flytende å hjelpe hydrering av lipid filmen.
      Merk: Ingen lipid film bør være synlig på kolbe veggene etter andre fryse tiner syklus.
    3. Gjenta 1.3.2 totalt fem ganger. Lukk flasken med en cap å unngå unødvendige fordampning av fosfat bufferen når prøven er varmt. Protokollen kan pauses når prøven er fryst.
    4. To oppvarming og kjøling (H & C) sykluser for å stabilisere prøven kommer ut av siste frysing trinn, eller holde frosset i inntil to måneder. Varme prøve å 40 eller 60 ° C for DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar ratio 16:4:5:5), henholdsvis før kjøling til 5 ° C på 1 ° C/min. opprettholde prøven 5 min på maksimum og minimum temperaturer av syklusen.
    5. Nå, enten bestemme birefringence signalet på utvalget i en ekstern magnetfelt (trinn 2) eller ytterligere extrude prøven for å skreddersy bicelle dimensjoner og magnetiske alignability (trinn 1.4).
      Merk: DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) prøver hovedsakelig består av bicelles med en gjennomsnittlig etter diameter DH 70 nm som åpenbart av en antall distribusjon innhentet fra dynamisk lysspredning (DLS) målinger på 5 ° C. Disse prøvene inneholder også større polymolecular samlinger med en gjennomsnittlig DH 500 nm som av en intensitet fordeling. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) prøver er svært polydisperse i størrelse med typiske intensitet distribusjoner avsløre en mening DH på 700 nm, mens antall distribusjonene avsløre en befolkning dominert av mindre bicelles i området størrelse 200 nm. Mer detaljert størrelse distribusjoner og cryo overføring elektronmikroskop bilder av disse prøvene er rapportert av Isabettini et al. 23
  4. Utelukkelse av polymolecular samlingene.
    1. Samle extruder som vist i Figur 3. Bruk hansker og pinsett med beskytte silica rør for håndtering. Våt filter papir (5) med noen dråper buffer for å tillate en optimal plassering av membran filteret (6). Kontroller at papiret har ingen kaster etter plassering o-ring (7) på toppen.
      Merk: Ekstruderingsprosessen ble testet på membran filtre (6) med en pore diameter på 800, 400, 200 og 100 nm; se figur 7.
    2. Angi vannbad til 40 ° C for DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) prøver eller 60 ° C for DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) prøver å garantere dannelsen av extrudable blemmer.
    3. Koble extruder til en trykksatt nitrogen flaske med en høytrykks PVC-rør (> 4 MPa) utstyrt med serto adaptere og extrude flytende materialet gjennom membran. 1 MPa press er vanligvis nødvendig for ekstrudering gjennom membran filtre (6) med en pore diameter på 200 nm og over. 1.5-2.5 MPa kreves til mindre membran filtre (6) med en pore diameter på 100 nm.
      Merk: Endre membran hvis unormalt høyt trykk (> 2,5 MPa) er pålagt å extrude prøven (dette er det første tegnet på tilstopping).
    4. Åpne dekslet (10) og sett inn prøven med en 2 mL glass pipette. Deretter Lukk dekslet (10) og åpne trykket ventilen (12) mens du holder eksempel stikkontakt røret (2). Lukke trykket ventilen (12) etter ekstrudering syklusen er fullført, vent og fortsette med neste syklus.
      Merk: Ikke la prøven kontakt lenge med varme jacketed fartøyet (8) å unngå overdreven eksempel tap av fordampning.
30-60 s er nok tid for en 3 mL prøve å equilibrate i extruder før du åpner trykket ventilen (12).
  • Videre til 10 ekstrudering sykluser for en gitt membran pore dimensjon som vist i Figur 3. De fleste av de bicelle systemene heves 10 ganger gjennom membraner pore diameter 200 og en annen 10 ganger gjennom membraner pore diameter på 100 nm, garanterer eksempel sammenlignbarhet.
  • Nå, Bestem birefringence signalet på utvalget i en ekstern magnetfelt (trinn 2).
  • Figure 3
    Figur 3: laboratorium extruder brukes for bicelle og vesicle preparater. Extruder er montert fra bunnen opp: (1) mount, (2) prøve å samle plass med en 2,4 mm (indre diameter) plast stikkontakt rør og o-ring (3) og (4) store og små stabiliserende mesh, (5) filter papir, (6) membran filtre, (7) o-ring, (8) jacketed fartøyet, (9. ) topp dekk med vik og press, (10) dekker, (11) sommerfugl skruer, (12) trykket ventilen. En skisse av sammensatte extruder vises på høyre side. Nitrogen gassen (N2) angis av en trykktank og jacketed fartøyet (9) er koblet til et vannbad for temperaturkontroll. Prøven gjennomgår 10 ekstrudering sykluser for enhver gitt membran filter pore diameter (eksempel bane i blått). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    2. birefringence målinger av DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) og DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) polymolecular samlinger.

    1. Bygge og koble birefringence oppsettet som presenteres i Figur 4 og levere strøm til de respektive elektroniske elementene. Ikke plass PEM prøven og andre polarisatoren i laser banen på dette stadiet. Unngå oppdager tilbake-spredt laserlys ved å dekke reflekterende overflater, for eksempel aluminium speil holdere, med svart papir.
    2. Juster speilene å maksimere laser intensiteten på detektoren, som er representert av intensiteten av direkte gjeldende Equation 7 fra low pass-filteret i figur 4B.
      FORSIKTIG: Bruk passende vernebriller når du justerer speilene og kontakt med en laser sikkerhet instruktør hvis manipulere lasere for første gang.
    3. Slå første krysset lineær polarisatoren (vedlikeholdt vinkelrett på hendelsen laserstrålen) for å maksimere den Equation 7 .

    Figure 4
    Figur 4: skjematisk fremstilling av birefringence oppsett og tilkoblinger for optisk signalene. A) en superledende elektromagnet leverer et 5,5 T magnetfelt. Lyset fra en diode laser på 635 nm er polarisert av to kryssende polarisatorer. En photoelastic modulator PEM-90 opererer på 50 KHz med en amplituden0 av 2.405 rad og mellom de to polarisatorer. Prøven ligger i magneten mellom PEM og andre polarisatoren. Ikke-polarisert speil guide lyset gjennom de ulike elementene og er endelig oppdaget av en detektor. Den første og andre harmoniske Equation 10 og Equation 11 av AC signal er overvåket, tillater beregningen av birefringence gi informasjon om den magnetiske alignability av Ln3 + chelaterande polymolecular samlinger. Eksempel cuvette er koblet til en ekstern vannbad for temperaturkontroll (blå). Temperaturen på prøven overvåkes med en temperatur probe (rød). B) signalet fra bilde detektor mates inn et sekund bestille Sallen-Key low-pass filter (24 V AC strømforsyning) med cut-off frekvens på 360 Hz gjennom en ±12 V DC strømforsyning braded kabelen (3). Low pass-filteret ekstrakter komponenten DC Equation 7 og leverer den til PC-grensesnitt (4) gjennom en BNC 50 Ω kabel. Signalet fra bilde detektor leveres to låsbare forsterkere (som pakke ut den første og andre harmoniske Equation 10 og Equation 11 ) gjennom en BNC 50 Ω kabel (1) & (2). De harmoniske intensiteter er oppdaget av en fase-sensitive oppdagelsen. Følgelig brukes PEM signalet som referanse signal for de låsbare forsterkerne (1f-utdata fra PEM i første låsbare forsterkeren og 2f-utgang i andre, koblet med BNC 50 Ω kabler). Utsignaler leveres til den PC-grensesnitt gjennom BNC 50 Ω kabler. Analog oppkjøpet enheter cFP-AI-110 og cFP-CB-1 digital signal som overføres til datamaskinen via en RS-232 kabel for overvåking. Typen K temperatur probe er også koblet til PC-grensesnitt enheten der analog oppkjøpet enheter cFP-CB-3 og cFP-TC-120 digital signal før du overfører den til datamaskinen via en RS-232 kabel for overvåking. C) bilde av skjematisk oppsett i B. nøkler deler er identifisert med tilsvarende tall fra 1 til 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    1. Plass andre krysset lineær polarisatoren vinkelrett hendelsen laserstrålen, som vist i figur 4A. Minimere den Equation 7 ved å sette andre polarisatoren i 90° vinkel med hensyn til først.
    2. Sted photoelastic modulator (PEM) på 0° mellom de to kryssende lineære polarisatorer og vinkelrett hendelsen laserstrålen som vist i figur 4A. Justere PEM til en frekvens på 50 kHz og amplitude A0 til 2.405 rad som vist i figur 5A. Dette gjør komponenten DC uavhengig av birefringence og øker den Equation 7 .
      Merk: Den optiske aksen til PEM kan stilles noen grader å opprettholde en konstant Equation 7 i luften før måling enhver prøven.
    3. Vent 1 time etter at du slår på laser- og elektronisk utstyr å stabilisere signalet.
    Signalet er stabilt når auto-innfasing av låsbare forsterkere forblir konstant.
  • Plasser prøven i temperatur kontrollert kvarts søppel med en bane-lengde på 10 mm og koble den til en ekstern vannbad som opprinnelig er angitt 5 ° C.
  • Plass en 0,5 mm tykk type K thermocouple (temperatur probe) direkte i prøve å overvåke temperaturen på prøven. Kontroller at sonden ikke forstyrrer av laserlys ved å plassere en stortingsmelding i laser banen (etter cuvette) og leter etter skygger forårsaket av sonden.
    Merk: Det er en 2-3 ° C forskjell mellom temperatur innspillingen av vannbad og temperaturen på prøven.
  • Plass cuvette i bar av magneten, som vist i figur 4A. Laserlys er overføres vannrett gjennom utvalget, avledet av ikke-polarisert speil og oppdaget av en detektor.
    Merk: Laser er rettet ned gjennom utvalget og sikkerhetskopiere samme bane til kontoen for Faraday effekter (i.e. rotasjon av polarisering flyet lys forårsaket av det magnetiske feltet når går ned avbrytes når du kommer tilbake i motsatt retning).
  • Bruk en jevn luftstrøm av komprimert luft ved romtemperatur og 10000 Pa på cuvette å unngå kondens vann på cellen vegger, som ville redusere intensiteten av signalet og øke støy. Dette er spesielt viktig når du måler på 5 ° C.
  • Merker den første og andre harmoniske Equation 10 og Equation 11 av et AC signal med to låsbare forsterkere. Auto fase låsbare forsterkere ved å trykke på knappen (2) vises i figur 5B og justere følsomheten som vist i figur 5B (1). Kontroller at det ikke er mer enn fire røde stolper på forsterkere som vist i figur 5B (3) å unngå signal overbelastning. Notere næringsdrivende følsomheten for begge låsbare forsterkere i programmet Tesla_Magnet_Const_V092 som vist i figur 5C (8). Programmet leveres som utfyllende informasjon.
  • Rampen det magnetiske feltet til 5.5 T ved å forsyne strøm til magneten gjennom programmet Tesla_Magnet_Const_V092 som vist i figur 5C (5).
  • Få birefringence Equation 5 hjelp ligning 2, der retardasjon beregnes med
    Equation 13(3)
    der Equation 14 og Equation 15 er Bessel-funksjonene av første slag, med Equation 16 og Equation 17 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 plot retardasjon i programmet Tesla_Magnet_Const_V092, som vist i figur 5C (4).
    Merk: Retardasjon i programmet bør ikke brukes til å beregne birefringence signalet Hvis to låsbare forsterkere ikke opererer på samme følsomheten (se trinn 2.12). De loggede harmonisk intensiteter Equation 10 og Equation 11 må være mangedobbelt av sensitiviteten av låsbare forsterkere å få de riktige dimensjonene. Videre må birefringence signalet målt under en magnet-feltet være normalisert ved å trekke mener birefringence signalet på 0 T.
  • Overvåke prøvens birefringence signalet på konstant eller endre temperatur (1 ° C/min) ved å regulere temperaturen i vannbad koblet til cuvette vist i Figur 4.
  • Logg eksperimentelle data av fylling i eksperimentell beskrivelse i figur 5C (8), gir et filnavn i (9) og trykke knappen "START log" (10).
  • Figure 5
    Figur 5: illustrasjoner for næringsdrivende innstillingene og programmet skjermbilder. A) PEM innstillinger: retardasjon 2.405 rad, bølgelengde 635 nm, frekvens 50 Hz. White sirkler angir hvilke innstillinger aktiveres (USR = brukerdefinerte retardasjon, LOC = lokale Operasjonsmodus). B) bindingstid forsterker innstillinger. Følsomheten (1) må velges før hver måling som kreves i trinn 2.11. Det bør ikke være mer enn fire røde stolper på displayet (3) for å unngå et signal overbelastning. En overbelastning oppstår når den røde ledet i (1) slås på, gjør en måling umulig. Trykk på auto fase (2) før hver måling. C) skjermbilder av programmet Tesla_Magnet_Const_V092 som tilleggsinformasjon. Programmet lar kontroll av det magnetiske feltet og opptak av alle signalet utganger som en funksjon av tid. Magnetisk feltstyrke og prøve temperatur tegnes i (1). Den første og andre harmoniske Equation 10 og Equation 11 av AC signal målt ved de to låsbare forsterkerne tegnes i (2). Intensiteten av direkte gjeldende Equation 7 tegnes i (3). Retardasjon beregnes som beskrevet i trinn 2.13 og tegnet i (4). Magnetisk feltstyrke ligger i (5). Direkte måling av temperatur av typen K thermocouple er presentert i (6) og output signaler (Equation 23 og Equation 22 ) i (7). Flere eksempler kan settes inn i (8) som ansatt følsomheten forsterkere, eksempel navn, etc. Dataene kan være logget og eksporteres til en txt fil i (9). Starte og stoppe datainnsamling med knappen "START log" (10). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Birefringence signalet fra en ikke-ekstruderte DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) eksempel var overvåket under en 5.5 T magnetiske felt under en oppvarming og avkjøling syklus fra 5 til 40 ° C og tilbake med en hastighet på 1 ° C/min (figur 6). Birefringence resultatene bekreftet høy magnetisk justeringer på 5 ° C med en verdi av 1,5 x 10-5, dobbelt så sterk som rapporterte ekstrudert systemer. 6 , 7 , 23 nullstilling av birefringence over Tm av DMPC på 24 ° C skyldtes dannelsen av ikke-alignable blemmer. Bevegelse utseendet på flytende uordnede fase utløst store rearrangements i polymolecular samlinger. Disse rearrangements er thermo-reversibel. Alignable arter ble regenerert på kjøling under Tm og birefringence signalet fulgte den samme trenden på oppvarming. De forskjellige toppene oppstår rundt Tm merke utskifting av alignable samlingene ved ikke-alignable blemmer. 23 the langsom kinetics av de molekylære rearrangements når det gjelder anvendt oppvarming og kjøling frekvensen av 1 ° C/min forklare hvorfor toppene var ikke overlapper. I stedet startet begge topper på Tm av DMPC, antyder at bilayer lipider må ha en viss grad av for å favorisere dannelsen av alignable arter.

    Figure 6
    Figur 6: Birefringence signalet som en funksjon av temperatur for en ikke-ekstruderte DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) eksempel på oppvarming (rød) og kjøling (blå) på 1 ° C/min. Prøven ble utarbeidet etter protokollen trinnene 1 til 1.3.5. Birefringence målingene ble utført etter protokollen trinn 2. Magnetisk feltstyrke var ramped opp 5.5 T og prøven ble opprettholdt på 5 °, oppnå et birefringence signal på 1,5 x 10-5 før du fortsetter til oppvarming og kjøling syklus. Birefringence signalet flatlines ved temperaturer over 35 ° C der ingen justering ble observert som prøven var utelukkende består av blemmer. Kjøling, bicelles ble regenerert og et siste birefringence signal 7.2 x 10-6 ble oppnådd på 5.5 T og 5 ° C. Magnetisk feltstyrke ble trappet ned til 0 T og prøven ble opprettholdt på 5 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    En DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) prøve var hydrert etter oppvarming og kjøling prosedyren i trinn 1.3.4 og senere ekstrudert 10 ganger på 60 ° C gjennom membran filtre i ulike pore størrelser, se trinn 1.4. Ved 60 ° C samler lipid blandingen inn blemmer, som er formet av ekstruderingsprosessen. 16 , 35 , 36 , 37 etter endt byggesystemer, bicelles ble regenerert av kjøling til 5 ° C og etter diameteren DH ble målt ved DLS. Den magnetiske alignability av bicelles ble vurdert på 5 ° C ved databehandling A-f med SANS 8 T og måler birefringence signalet for 5.5 T; se figur 7. Birefringence signalet ble innhentet av gradvis feltet opp 5.5 T og tilbake ned 0 T som vist i figur 7A. Topp birefringence skjedde på 5.5 T der den høyeste graden av justering var ventet ifølge Formel 1. Etter diameter DH i bicelles ble redusert til 220, 190, 106 og 91 nm ved påfølgende profiler gjennom membraner med pore størrelser av 800, 400, 200 og 100 nm henholdsvis. En tilsvarende senkning i magnetiske justeringen ble bekreftet av synkende birefringence signalet og reduksjon i absolutt enf mens den nærmet seg null i figur 7B. Resultatene bekreftet mulighet å administrere bicelle størrelse og magnetiske justering gjennom skreddersøm av blemmer av ekstrudering på 60 ° C og kjøling tilbake til 5 ° C.

    Figure 7
    Figur 7: Magnetisk justering i en DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) utvalg ekstrudert gjennom membran filtre ulike pore dimensjoner. A) Birefringence signal Δn′ som en funksjon av magnetisk feltstyrke B når ramping opp og ned for prøven ekstrudert gjennom 800 nm porene. Topp birefringence nådde på 5.5 T i henhold til Formel 1. Maksimal birefringence verdien er rapportert i B). Samme prøven var ekstrudert gjennom 400 nm porene. Magnetisk justeringen ble vurdert av både birefringence målinger (svarte firkanter) på 5.5 T (analogt til hva som ble gjort for forrige ekstrudering trinn i A) og av beregning av justering faktorer enf (røde sirkler) på 8 T skal tegnes som en funksjon av den etter diameter DH ved DLS. Magnetisk justeringen ble evaluert analogt på samme prøven ekstrudert gjennom 200 nm porene, og en siste gang etter ekstrudering gjennom 100 nm porene. Alle mål ble utført på 5 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    En detaljert redegjørelse for hvordan birefringence-målinger ble brukt i kombinasjon med SANS eksperimenter for å evaluere metoder for å generere svært magnetisk forståelsesfull Ln3 + chelaterande fosfolipider samlinger er Isabettini et al. 23 de foreslåtte fabrikasjon protokollene gjelder også for samlinger består av de lengre DPPC og DPPE-DTPA fosfolipider eller de som inneholder kjemisk utviklet steroid derivater i deres bilayer. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 det eneste kravet er at prøven er oppvarmet til tilstrekkelig høye temperaturer i trinn 1.3.2, 1.3.3, 1.3.4 og 1.4.2. Temperaturene må tillate bilayer lipider inn en flytende uordnede fase, guarantying optimal hydrering av tørr lipid film eller prøve fornyelse. DPPC/DPPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) samlinger, for eksempel behøver å varmes over fase overgang temperaturen på DPPC på 42 ° C, mens det tilsvarende DMPC-systemet skal være oppvarmet over 24 ° C. En tilstrekkelig høy temperatur er også nødvendig for å garantere dannelsen av extrudable blemmer oppstår når lipid bilayer er overbeskattet uordnede i trinn 1.4. Fryse-tining sykluser i trinn 1.3.2 fullt kan erstattes av H & C sykluser. 23 men prøven trenger mer tid til fullt hydrat lipid filmen med denne prosedyren og må vortexed 20 min når på 5 ° C og 2 min når på 60 ° C. Ekstra H & C sykluser er foretatt hvis elementene i tørr lipid filmen fortsatt er observert på glassvegger av flasken.

    De Tm3 + chelaterande bicelles presentert i denne protokollen justere vinkelrett retning magnetfelt. Denne justering retning kommer fra de store positive magnetiske mottakelighet av Tm3 +. 11 , 14 andre transisjonsmetall ioner som Dy3 + og Yb3 + kan også brukes. 11 , 13 , 19 forskjellige magnetiske anisotropy av Ln3 + tilbyr flere typer skreddersy magnetiske justeringen av bicelles. For eksempel forbedrer Dy3 + egentlig negative magnetiske mottakelighet av bilayer fosfolipider, resulterer i en høy grad av justeringen av bicelles parallelt magnetfelt retning. 13 denne endringen i justering retning er oppdaget av en endring i tegn på både birefringence signalet og justering faktorene beregnet fra Anisotrop 2D SANS mønstre. Det er viktig å merke seg at magnetisk mottakelighet ikke er utelukkende diktert av kjemisk natur Ln3 + men chelate geometrien av Ln3 +-phospholipid kompleks. 19 , 38 magnetiske mottakelighet kan bli konstruert av syntetisere forskjellige Ln3 + chelaterande phospholipid headgroups, definere magnetiske responsen av resulterende samlingene. 38

    Hvert utvalg er optisk forskjellig avhengig av de konstituere lipider ansatt. Overvåking prøvens turbiditet som en funksjon av temperatur er en utfyllende metode for å vurdere temperatur-indusert strukturelle transformasjoner i samlingene. Selv om disse målingene er vanligvis gjennomført i fravær av et magnetisk felt i et spektrofotometer, overvåking intensitet av laser likestrøm Equation 7 med oppsettet foreslått, tilbyr den samme informasjonen i nærvær av en magnetisk feltet. 11 , 16 the DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) prøver er vanligvis mindre grumset enn sine Chol-OH inneholder DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) kolleger på 5 ° C. Prøver ligner vann på 5 ° C er vanligvis ikke alignable i et magnetfelt. I romtemperatur, både prøver se gjennomsiktig fordi DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) prøver er i overgangsfasen mellom bicelles og blemmer og store konsentriske hull vises i DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) bicelles. 11 , 16 , 23 overgangen til staten av bicelles til blemmer i DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) er også fulgt med en økning i prøvens viskositet ved romtemperatur. Denne temperaturen-avhengige-endringen i turbiditet gjør det vanskelig å velge passende lysfølsomhet i trinn 2.11. Hvis følsomheten justeres for høyt på et grumset utvalg på 5 ° C, føre mer gjennomsiktig natur prøven på oppvarming en overbelastning av forsterkerne. Videre svært grumset prøver vil vesentlig øke støy til signal ratio og kan ikke være egnet for birefringence-målinger. Laserlys må gå gjennom prøven for å bli oppdaget.

    Non-ekstrudert prøver er alltid mer grumset og har tendens til samlet på kort sikt lagring i kjøleskapet. Likevel magnetisk forståelsesfull prøvene genereres lett med en H & C syklus. Non-ekstrudert prøver kan også lagres i frossen tilstand og lett fornyet etter H & C sykluser. Ekstrudert prøver er holdt i kjøleskapet og vanligvis målt i en uke etter prøvens forberedelse. Ingen studier rapporterer om langvarig lagring av ekstruderte arter i en væske eller en frossen tilstand. Derfor garanteres størrelsesDistribusjon av samlingene fra ekstrudering over langvarig lagring.

    Analogt til noen bicelle system finnes disse magnetisk alignable planar samlinger bare i et definert område av lipid komposisjon og konsentrasjon. Endre prosenter lipid vil resultere i forskjellige montering arkitekturer, inkludert dannelsen av micelles, bånd og blemmer. 5 , 11 , 16 , 18 , 20 fosfat buffer konsentrasjonen og pH i trinn 1.1.3 spiller en avgjørende rolle i utformingen av bicelles og deres magnetiske respons. Bufferen definerer fysikalsk-kjemiske samhandlingene styrer hydrofile miljøet rundt polymolecular samlingene. Lavere buffer konsentrasjoner føre annen samling arkitekturer, mens høyere konsentrasjoner forårsake eksempel aggregering og nedbør på grunn av en overflødig kostnad screening.Sure forhold med pH-verdier mellom 3 og 4 er karboksylsyre moieties tjene som ligander i DMPE-DTPA/Ln3 + komplekse protonerte. Dette resulterer i ødeleggelse av magnetisk forståelsesfull polymolecular samlingene, observert av aggregering og nedbør i utvalget. Magnetisk forståelsesfull Ln3 + polymolecular samlingene har en rimelig motstand mot mer grunnleggende pH-verdier. Men DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) bicelles ble vist å bryte opp i micelles på pH-verdier av 12,9. 11 prøvene må aldri utsettes for vann eller andre salter. Noen andre ion vil forstyrre den Ln3 + chelaterande prosessen eller føre samling av samlingene på grunn av gratis screening. For SANS målinger, er bufferen utarbeidet som beskrevet i trinn 1.1.3 i D2O i stedet for ultrapure H2O. Merk at måleravlesning pH blir 7.0 (tilsvarende en pD verdi på 7,4).

    Strukturelle transformasjonene forekommer i polymolecular samlinger kan en oppvarming og kjøling syklus er thermo-reversibel. Derfor bør endelige birefringence signalet på 5 ° C være det samme som før temperaturen syklusen. 11 , 16 hvis birefringence signalet er høyere etter syklus, prøven var ikke riktig bli regenerert i trinn 1.3.4. Dette forekommer vanligvis i prøver lagret for en lengre periode. Et lavere birefringence signal når temperaturen syklus som observert i figur 6 indikerer et problem i eksperimentell oppsettet. Oftest ble laser lys banen forstyrret av tilbake spredning eller et annet objekt. Dette er spesielt problematisk med temperaturmåleren direkte inn prøven (se trinn 2.8) som plasseres som ikke forstyrre direkte av laserlys. En forstyrret lett bane forårsaker en nedgang i den Equation 7 , en støyende signal og/eller unormal toppene i birefringence temperatur kurvene. For eksempel ble toppen i varme på ca 35 ° C i figur 6 forårsaket av utvidelsen av vannkjølt rør til direkte av laserlys. Birefringence signalet kan ikke klareres fra det punktet og fremover. Selv om den generelle formen av kjøling kurven var normal, ble lavere birefringence signalet på 5 ° C forårsaket av forstyrrelser.

    Birefringence verdier Hentet fra etter denne protokollen er ikke absolutt, og brukes til å sammenligne prøver seg imellom. Det kreves en kalibrering med en referanse til sammenligning med litteratur verdier. For eksempel, tegnet av den målte retardasjon avhenger av oppsettet og kan kontrolleres med toluen, som har en bomull-Mouton konstant av 3,27 × 10−9 T2. 39 , 40

    Birefringence signalet fra endringer i prøvens magnetiske justering kan være skilt fra signalet forårsaket av molekylære rearrangements i bilayer. Justering faktorer beregnet fra Anisotrop 2D SANS mønstre innhentet under et magnetfelt påvirkes bare av bulk justeringen av polymolecular samlingene. De to metodene er komplementære og la frikopling av bidrag til birefringence signalet. Foreslåtte birefringence oppsettet kunne bli fullkommengjort ved å dele laserstrålen, tillater samtidig overvåking av prøver med og uten eksponering for eksterne magnetfeltet. Birefringence resultatene for prøven i magnetfeltet kunne normaliseres av signalet innhentet for eksempel 0 T, effektivt regnskap for bakgrunnen.

    Birefringence mål er ikke begrenset til kvantifisere magnetiske justeringen av bicelles. Mange myke-materialer generere en birefringence tapsfrie bestilling av deres interne strukturen. Foreslåtte oppsettet kan overvåke birefringence av slike materialer som en funksjon av temperatur med eller uten en ekstern magnetfelt. Anthracene organogel fiber, wormlike micelles under flyt, nanocrystalline cellulose og amyloid-Fe3O4 fibrils er noen eksempler som birefringence atferd ble vellykket evaluert med foreslåtte oppsett. 29 , 30 , 32 , 41

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne ikke avsløre.

    Acknowledgments

    Forfatterne bekrefter Swiss National Science Foundation for finansiering SMhardBi (prosjekt nummer 200021_150088/1). SANS forsøkene ble utført på sveitsiske spallation neutron kilden SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Sveits. Forfatterne takker hjertelig Dr. Joachim Kohlbrecher for hans veiledning med SANS eksperimenter. Birefringence måling oppsettet under høy magnetfelt var inspirert av det eksisterende oppsettet på høy-feltet magnetiske laboratorium HFML, Nijmegen, Nederland. Vi takker Bruno Pfister for hans hjelp utvikle elektronikk for birefringence, Jan Corsano og Daniel Kiechl for bygging av rammene tillater fine og lettvinte justering av laser og Dr. Bernhard Koller pågående kundestøtte.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
    2. Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 81, (4), 2163-2171 (2001).
    3. Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. "Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies. Naturwissenschaften. 92, (8), 355-366 (2005).
    4. Sanders, C. R., Prosser, R. S. Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure. 6, (10), 1227-1234 (1998).
    5. Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).
    6. Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).
    7. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method. J. Vis. Exp. (59), (2012).
    8. Barbosa-Barros, L., et al. Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications. Small. 6, 807-818 (2012).
    9. Lin, L., et al. Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery. RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).
    10. Beck, P., et al. Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides. Langmuir. 26, (8), 5382-5387 (2010).
    11. Liebi, M. Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material. ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).
    12. Liebi, M., et al. Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels. ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6, (2), 1100-1105 (2014).
    13. Liebi, M., et al. Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements. Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).
    14. Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).
    15. Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides. J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).
    16. Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions. Langmuir. 28, (29), 10905-10915 (2012).
    17. Liebi, M., et al. Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability. J. Phys. Chem. B. 117, (47), 14743-14748 (2013).
    18. Isabettini, S., et al. Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates. Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).
    19. Isabettini, S., et al. Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).
    20. De Angelis, A. A., Opella, S. J. Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins. Nat. Protoc. 2, (10), 2332-2338 (2007).
    21. Son, W. S., et al. "Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).
    22. Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation (2017).
    23. Isabettini, S., et al. Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies. Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).
    24. Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures. Biophysical Journal. 82, (5), 2487-2498 (2002).
    25. Watts, A., Spooner, P. J. R. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).
    26. Bleaney, B. Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions. J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).
    27. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies. Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).
    28. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes. Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).
    29. Shklyarevskiy, I. O., et al. Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers. Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).
    30. Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. Alignment of molecular materials in high magnetic fields. Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).
    31. Maret, G., Dransfeld, K. Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields. Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).
    32. Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures. Sci. Tech. Adv. Mater. 10, (1), 014601 (2009).
    33. Shklyarevskiy, I. O. Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields. Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).
    34. Fuller, G. G. Optical rheometry of complex fluids. Oxford University Press. NY. (1995).
    35. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
    36. Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation (2017).
    37. Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet (2017).
    38. Isabettini, S., et al. Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).
    39. Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73, (2), 209-221 (1977).
    40. Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules. Phys. Rev. E. 48, (1), 328-339 (1993).
    41. Zhao, J., et al. Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field. Biomacromolecules. 17, (8), 2555-2561 (2016).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics