Name: Une méthode Optogenetic pour contrôler et analyser les profils d’Expression génique dans les Interactions cellule-cellule (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Découvrez une méthode optogénétique pour contrôler et analyser les profils d'expression génique dans les interactions cellule-cellule. Cette technique permet d'observer le transfert d'informations oscillatoires entre cellules C2C12 avec une précision élevée.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par JST, PRESTO (par intérim), les recherches de base évolutif des sciences et technologies (JPMJCR12W2 (R.K.)), subventions pour la recherche scientifique sur les régions innovantes (ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT), Japon 26119708 (par intérim) et 16 H 06480 (R.K.)), scientifique (A) (société japonaise pour la Promotion de la Science (JSPS) 24240049 (R.K.)), de recherche et jeunes scientifiques (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)) et une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants « Fluorescence Direct d’imagerie » du MEXT, Japon et plate-forme pour des approches dynamiques au système vivant depuis le MEXT, Japon.

1. génération de lignées cellulaires stables par le système Tol2
<ol><li>
Transfecter des vecteurs de plasmide (Figure 1 a) des modules axés sur les Tol2 optogenetic ainsi que le vecteur d’expression transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) dans les cellules C2C12. Dans toutes les étapes, les cellules de culture avec un milieu DMEM additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et de la pénicilline-streptomycine à 37 ° C (tableau 1), en présence de 5 % CO2, notée dans le cas contraire.
	<ol>
<li>Compter les débris de cellules avec un compteur de cellules et plaque 5 x 104 C2C12 cellules / puits dans une plaque de 12 puits un jour avant la transfection.</li>
		<li>Transfecter Co 0,375 μg de vecteurs de base Tol2 optogenetic (pAI177 ou pAI218), 0,125 µg d’un vecteur de choix du médicament (pAI170) et 0,5 μg de pCAGGS-mT2TP vector à l’aide de lipofection réactif.</li>
		<li>Trypsinize cellules transfectées et leur plaque dans les récipients de culture de 100 mm, un jour après la transfection.</li>
		<li>Échange de milieu de culture pour les cellules transfectées de milieu de culture additionné de 100 mg/mL hygromycine.</li>
		<li>Cellules en culture pendant 3 jours pour éliminer les cellules non transfectées. Notez que le changement médiatique n’est pas nécessaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trypsinize cellules transfectées et purifier une population de cellules exprimant des protéines fluorescentes pour la sélection. Pour les cellules réceptrices transportant des pAI177, la valeur la porte triage canal vert-PE pour la purification de la population de cellules mCherry-positif. Pour les cellules photosensibles expéditeur transportant pAI218, réglé la tri porte sur APC canal pour la purification de la population de cellules iRFP713-positif.</li>
	<li>(facultatif) Établir une population clonale de cellules par les méthodes usuelles, telles que la dilution limitée ou unicellulaires Tri par FACS.</li>
</ol>2. evaluation de la Photo-la sensibilité des cellules modifiées au niveau des populations
NOTE : Cette partie décrit un protocole pour vérifier l’induction dynamique des protéines ligand Dll1 sur l’éclairage en lumière bleu par des tests biochimiques, comme qPCR et éponger occidental.
<ol><li>Mis en place deux types d’incubateurs avec ou sans sources lumineuses pour une maladie induite par la lumière ou une condition sombre, respectivement. Intensité lumineuse mise en place d’un bleu-trans-Illuminateur LED, comme le montre l' Figure 1 b, à l’aide d’un luxmètre. Programme horaires et durée de l’éclairement lumineux en chargeant un script de contrôle à un micro-contrôleur monocarte qui permet des horaires programmables pour l’éclairage (Figure 1).</li>
	<li>Comte trypsinisés cellules avec un compteur de cellules et transportant des pAI218 et pAI170 sur la vaisselle de culture en plastique de 35 mm de diamètre (plus de 12 plats pour l’état lège et 1 plat pour condition sombre) de cellules photosensibles expéditeur de5 plaque 1,0 x 10 et la valeur de la vaisselle séparer les incubateurs pour conditions de clair/sombre. Après avoir configuré les plats, garder les portes des incubateurs fermées jusqu’en collectant les lysats cellulaires.</li>
	<li>Un an et demi jours après l’ensemencement, commencer léger éclairage (cellules devraient être plus de 80 % confluentes). Ne pas exposer à la lumière pour éviter les indésirables de photo-stimulation des cellules. NOTE : Horaires d’éclairage dépend le but des expériences. Notez qu’une condition d’éclairage durable (e.g. intervalles de durée et 10 min 1 min avec 40 µmol/m2/s intensité lumineuse) est suffisant pour un simple contrôle du photo-induction et cette forte illumination lumineuse est nocif pour les cellules. Ainsi, vérifiez que les paramètres inoffensifs pour l’illumination sont sélectionnés.</li>
	<li>Environ 2 jours après l’ensemencement, préparer cellule-lysat avec intervalles de 30 min. Passer des plats échantillon d’incubateurs à sur la glace et commencer à préparer des lysats de cellules pour une analyse ultérieure.</li>
</ol>3. dynamique expéditeur-destinataire test au niveau des populations : surveillance en temps réel des réponses cellulaires lors de la Stimulation optique par PMT
<ol><li>Trypsinize et compter le nombre de l’expéditeur et les récepteur des cellules avec des méthodes standard. Préparer un volume total de 1 mL du mélange suspension de 2,5 x 104 récepteur et 1,25 x 105 cellules d’expéditeur (ratio de 1:5). NOTE : 2:1, 1:1 ou 1:2 expéditeur-destinataire ratios également travaillent avec un nombre total de cellules de 1,5 x 105. 10
</li>
	<li>Plaque mixé des cellules dans chaque cupule des plaques 24 puits noirs avec milieu de culture contenant luciférine de 1 mM.</li>
	<li>Analyser les cellules sur le lecteur de plaque pour l’analyse de luciferase et confirmer que les signaux de sortie ne sont pas trop élevés pour le système d’enregistrement. Remarque : Si des signaux de sortie sont supérieures à 1 x 106 photon compte/s, ils peuvent être saturés. Dans ce cas, réduire la concentration de luciférine aux valeurs optimales pour que les signaux de sortie sont inférieures à 1 x 106 photon compte/s.</li>
	<li>Mettre la plaque sur le système d’enregistrement et commencer un programme d’enregistrement (Figure 1). Par exemple, commencer léger éclairage à 18 h après le réglage de l’enregistrement. Remarque : Un filtrage temporel, comme le redressement de signaux avec le déplacement en moyenne et Savitzky-Golay, filtrage, sont utile pour la visualisation des formes d’ondes et détections de pointe.</li>
</ol>4. dynamique expéditeur-destinataire dosage au niveau unicellulaire : en temps réel d’imagerie des unicellulaires réponses sous le contrôle d’une Perturbation de la Optogenetic
<ol><li>Plaque de 0,5 x 105 récepteur et 2,5 x 105 cellules de l’expéditeur sur plats de diamètre 27 mm-diamètre-verre-base 35 mm. S’assurer que les rapports de ce mélange et un nombre total de cellules (une densité cellulaire) sont correctement ajustés.</li>
	<li>Un jour après l’ensemencement, échanger le milieu avec 2 mL de support d’enregistrement (milieu DMEM sans phénol rouge, additionné de 5 % FBS, pénicilline-streptomycine et luciférine de 1 mM) et placer le plat de verre-base sur le microscope. Si nécessaire, laver les débris de cellules mortes avec du PBS (-). NOTE : Il est préférable de faire cette étape dans des conditions sombres.</li>
	<li>Mettre en place un microscope inversé équipé d’une chambre à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Mettre en place une caméra CCD refroidie. Veiller à ce que la température du capteur CCD est refroidie à la valeur de destination (en général,-90 ° C).</li>
	<li>
Définir les paramètres de la fenêtre « Multi-Dimensional Timelapse » dans le logiciel d’acquisition automatique pour capturer des images avec des intervalles de 5 min et plus de 288 heures (plus d’un enregistrement au jour le jour).
	<ol>
<li>Ouvrez « Multi-Dimensional Timelapse » fenêtre, sélectionnez un canal de luminescence et un mode de lecture de 50 kHz lent dans le menu déroulant et définissez 4x4 binning bénéficiant d’une orientation de 4 min. Veiller à ce que la lecture est réglée sur le mode de 50kHz lente, ce qui est essentiel pour réduire les bruits de la lecture pour détecter bioluminescente faiblement émettant de la lumière.</li>
		<li>Ouvrez « Multi-Dimensional Timelapse » fenêtre, sélectionnez canaux fluorescence et un mode de lecture rapide 1 MHz dans le menu déroulant et définissez binning de 2 x 2 avec exposition de 400 ms. Veiller à ce que la lecture est réglée sur le mode rapide de 1 MHz à réduire le temps nécessaire pour l’imagerie de fluorescence.</li>
		<li>Commencez en Time-lapse enregistrement en cliquant sur le bouton « Acquérir ».</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraire des unicellulaires traces des canaux de la luminescence des films Time-lapse par logiciel analyse d’images, comme suit. Tout d’abord, faire des images de pile de luminescence et fluorescence en important les données de l’image au logiciel d’analyse image. Pour les images de la luminescence, supprimer les pixels chauds provenant des rayons cosmiques en comparant les intensités des pixels dans les images adjacentes dans le temps, remplaçant les valeurs de pixel à la moyenne temporelle des trames précédentes et suivante (implémenté comme « SpikeNoise filtre »), appliquer ces images traitées à un filtre de lissage dans l’espace et soustraire des valeurs de pixel de fond de répertorie vues de chaque image. Ensuite, déterminer une « région d’intérêt » (ROI) pour chaque cellule sur une image fluorescente à chaque instant, enduire le retour sur investissement des images lumineuses et mesurer l’intensité luminescente de chaque ROI.</li>
</ol>

<ol><li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li>
<li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li>
<li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock%3A+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li>
<li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li>
<li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li>
<li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li>
<li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141(2012).</li>
<li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li>
<li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li>
<li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).</li>
<li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3(2010).</li>
<li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li>
<li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons montré une méthode pour contrôler la dynamique d’expression de gène avec une périodicité de 2 à 3 h. Cette échelle de temps est plus courte que ceux dans d’autres systèmes conventionnels, y compris le système Tet et le système de LightOn original. Les paramètres clés pour atteindre les échelles de temps ultradiennes sont demi-vies de produits moléculaires photoinduit, ARNm et de protéines. Ces paramètres cinétiques peuvent dépendre des espèces et des types de cellules. Pour le réglage de la cinétique, remplaça...

Cellule-cellule communication joue un rôle crucial dans la structuration embryonnaire dans le processus de développement. Chez les embryons de vertébrés, les structures métamérique appelées somites sont forment le long de l’axe antéro-postérieur corps avec une précision temporelle sous le contrôle d’une horloge de chronométrage, appelée la segmentation horloge1. Au cours de ce processus, un groupe de cellules somitiques mésoderme (PSM) sont périodiquement convertis en somites de manière synchrone. Ce processus implique l’expression des gènes oscillatoire synchronisé et cellules PSM qui oscillent en phase forment les somites mêmes. La période de l’expression génique oscillatoire est environ 2 à 3 h chez la souris et environ 30 min chez le poisson zèbre. Lorsque dissociées, les cellules PSM perdent la synchronie2,3, mais quand ils sont re-agrégés, qu’ils puissent s’organiser et récupérer la population synchronie4, ce qui suggère que le couplage cellule-cellule est une clé pour la synchronisation oscillations.
Des efforts considérables ont révélé que des molécules de signalisation de la voie Delta-encoche sont correctement raccordés aux oscillations des gènes segmentation horloge synchronisées. Inhibiteurs pharmacologiques ou mutations génétiques de la signalisation Notch désynchroniser la population des oscillateurs. Chez le poisson zèbre, mutants de Notch signalisation composants, tels que DeltaC, DeltaD et Notch1a, affichent les oscillations asynchrone5,6. Chez les embryons de poulet ou de la souris, non seulement le ligand Notch Delta-like1 (Dll1), mais aussi l’encoche modulateur Lunatic fringe (LNFG) est nécessaire pour des oscillations synchronisées7,8,9. Cependant, il a été difficile à tester la capacité de telles molécules pour le transfert des informations dynamiques de cellule en cellule, parce que des résolutions temporelles des classique perturbation de la dynamique de règlement de gène n’étaient pas suffisantes pour enquêter sur les processus de délais de 2 à 3 h (rythme ultradien).
Nous avons récemment mis au point une méthode intégrée pour contrôler et surveiller profils d’expression génique dans les cellules de mammifères,10. Cette technologie permet l’induction d’impulsions d’expression de gène par une illumination lumineuse périodique sur des échelles de temps ultradiennes. Ce protocole représente les méthodes pour établir des lignées de cellules photosensibles et observer les réactions dynamiques des cellules journaliste par luminescence de cellules vivantes suivi dans les contextes de communication de cellule à cellule. Cette méthode est applicable à l’analyse des nombreuses autres voies de signalisation.

<table><tbody><tr><td>FACS</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>FACSAriaII Caméra SORP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>iKon M-934</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-81 ZDC</td><td></td></tr><tr><td>PMT appareil</td><td>Churitsu eletric corp.</td><td>CL24B-LIC/B</td><td></td></tr><tr><td>Illuminateur LED bleu</td><td>OptoCode</td><td>LEDB-SBOXH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>08459-35</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>KRYSTAL24 (plaque noire 24 puits )</td><td>Hi-tech</td><td>303012</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin Potassium Sel</td><td>Nacalai</td><td>20028-24</td><td></td></tr><tr><td>Posemètre</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>LI-250A</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-HA-Peroxydase</td><td>Roche</td><td>clone 3F10</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Actine-Peroxydase</td><td>Wako</td><td>clone 2F3</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode optogenetic pour contrôler et analyser les profils d’expression génique dans les interactions cellule-cellule

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cellules doivent répondre correctement à l’évolution dans le temps des environnements qui sont influencés par divers facteurs d’entourant les cellules. L’encoche voie de signalisation est l’une de ces machines moléculaires essentielles pour les communications de cellule à cellule, qui joue un rôle clé dans le développement normal des embryons. Cette voie implique un transfert de cellule à cellule d’informations oscillatoires avec rythme ultradien, mais malgré les progrès des techniques de biologie moléculaire, il a été difficile à élucider l’impact des interactions multicellulaires sur gène oscillatoire dynamique. Nous présentons ici un protocole qui permet le contrôle d’optogenetic et de surveillance en direct des modèles d’expression de gène de manière temporelle précise. Avec succès, cette méthode a révélé que les entrées périodiques intracellulaires et intercellulaires de signalisation Notch monter oscillations intrinsèques de réglage de fréquence et déphaseurs à la résolution de cellule unique. Cette approche est applicable à l’analyse des caractéristiques dynamiques des différentes voies de signalisation, fournissant une plate-forme unique pour tester une importance fonctionnelle des programmes d’expression de gène dynamique dans les systèmes multicellulaires.

Nous avons adapté la LightOn système11,12, qui permet l’expression des gènes photoinduit dans des cellules de mammifères, à l’étude des oscillateurs génétiques avec une périodicité de 2 à 3 h. Ce système se compose de deux parties : l’activateur de la transcription inductibles par photo hGAVPO et une cassette de SAMU-promoteur de transcription de lecteur des gènes arbitraires d’intérêt. Afin d’accélérer la cinétique pulsatile de l...

Nous présentons ici un protocole visant à analyser le transfert de cellule à cellule de renseignements oscillatoires par optogenetic contrôle et suivi de l’expression génique en direct. Cette approche constitue une plate-forme unique pour tester une importance fonctionnelle des programmes d’expression de gène dynamique dans les systèmes multicellulaires.

Une méthode Optogenetic pour contrôler et analyser les profils d’Expression génique dans les Interactions cellule-cellule

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

L’objectif global de cette expérience est d’observer le transfert d’informations oscillatoires de cellule à cellule par contrôle optogénétique et surveillance en direct de l’expression des gènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les cellules communiquent entre elles par la voie de signalisation Notch, en particulier sur la façon dont les cellules se transmettent l’information oscillatoire. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons contrôler et surveiller la dynamique de l’expression des gènes avec une très grande précision.La démonstration de la procédure sera assurée par Akihiro Isomura, un chercheur de mon laboratoire qui a développé cette nouvelle technologie. Pour transfecter des vecteurs plasmidiques de modules optogénétiques basés sur Tol2 avec le vecteur d’expression de la transposase dans des cellules C2C12, comptez d’abord les cellules trypsinisées à l’aide d’un compteur de cellules. Plaque 50 000 cellules C2C12 par puits dans une plaque de 12 puits un jour avant la transfection.Ensuite, co-transfectez 0,375 microgramme de vecteurs optogénétiques à base de Tol2, 0,125 microgramme d’un vecteur de sélection de méd

an-optogenetic-method-to-control-analyze-gene-expression-patterns

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Le développement récent des outils de neurosciences qui combinent la génétique et de l'optique, appelée "optogenetics", permet le contrôle de l'activité des circuits neuronaux avec un niveau de résolution spatiale et temporelle sans précédent. Ici, nous fournissons un protocole pour l'intégration dans l'enregistrement in vivo avec la manipulation de sous-ensembles optogenetic génétiquement définies de neurones pyramidaux du cortex préfrontal et subicular.

Une méthode pour High Fidelity optogénétiques contrôle de Pyramidal neurones individuels<em&gt; In vivo</em

L’optogénétique est devenue un outil puissant pour les expériences de neurosciences comportementales. Ce protocole offre un guide étape par étape pour la conception et l’installation de systèmes laser, et fournit un protocole complet pour la réalisation de stimulations optogénétiques in vivo multiples et simultanées compatibles avec la plupart des paradigmes de tests comportementaux de rongeurs.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

Ce protocole prévoit un flux de travail sur la façon de combiner artificielle induite sur les micro-ARN interférence d’ARN avec optogenetics pour stimuler spécifiquement présynaptiques boutons avec une expression réduite de sélectives ou des gènes au sein des circuits de neurones intacts.

Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts

Avec la manipulation optogénétique de populations neuronales spécifiques ou de régions du cerveau, le comportement peut être modifié avec une résolution temporelle et spatiale élevée chez les animaux en mouvement libre. En utilisant différents outils optogénétiques en combinaison avec des fibres optiques implantées chroniquement, une variété de modulations neuronales et de tests comportementaux peuvent être effectuées.

Manipulation optogénétique de l’activité neuronale pour moduler le comportement chez les souris en mouvement libre

Le contrôle fiable des cellules de mammifères sensibles à la lumière nécessite la normalisation des méthodes optogénétiques. Pour atteindre cet objectif, cette étude décrit un pipeline de construction de circuits géniques, d’ingénierie cellulaire, de fonctionnement de l’équipement optogénétique et de tests de vérification pour normaliser l’étude de l’expression des gènes induite par la lumière en utilisant un circuit génique optogénétique à rétroaction négative comme étude de cas.

Ingénierie et contrôle fiables des circuits génétiques optogénétiques stables dans les cellules de mammifères

La bioluminescence-lumière émise par une enzyme luciférase oxydant un substrat de petite molécule, une luciférine-peut être exploitée pour activer des protéines photosensorielles, ajoutant ainsi une autre dimension à la stimulation lumineuse et permettant la manipulation d’une multitude de fonctions médiées par la lumière dans les cellules à travers les échelles temporelles et spatiales.

Optogénétique bioluminescente 2.0 : Exploiter la bioluminescence pour activer les protéines photosensorielles in vitro et in vivo

Le contrôle optogénétique du métabolisme microbien offre un contrôle dynamique flexible des processus de fermentation. Le protocole montre ici comment mettre en place des fermentations régulées par la lumière bleue pour la production de produits chimiques et de protéines à différentes échelles volumétriques.

Fermentations contrôlées par la lumière pour la production de produits chimiques microbiens et de protéines

Ce protocole implique la transfection de capteurs d’AMPc et de bPAC-nLuc, une protéine optogénétique, pour suivre avec précision sa distribution cellulaire et sa réponse à la stimulation lumineuse. L’approche novatrice consistant à créer une carte de réponse à l’AMPc à l’aide d’un système de balayage ponctuel offre le potentiel de faire progresser la recherche sur les protéines optogénétiques dans différents domaines.

Cartographie de la distribution cellulaire d’une protéine optogénétique à l’aide d’une grille de stimulation lumineuse

La manipulation optogénétique des voies de signalisation peut être une stratégie puissante pour étudier comment la signalisation est décodée dans le développement, la régénération, l’homéostasie et la maladie. Ce protocole fournit des directives pratiques pour l’utilisation d’activateurs de signalisation nodaux et de protéines morphogéniques osseuses (BMP) basés sur le domaine de détection lumière-oxygène-tension dans l’embryon précoce du poisson-zèbre.

Activation de la signalisation optogénétique chez les embryons de poisson-zèbre

Ce protocole décrit l’application d’un domaine d’interrupteur allostérique activé par la lumière bleue (LightR) pour un contrôle spatio-temporel réversible de l’activité protéique. En utilisant la tyrosine kinase Src comme modèle, cette étude propose un protocole élaboré pour développer et caractériser la Src régulée par la lumière (LightR-Src). Il démontre la polyvalence de cette approche dans toutes les classes d’enzymes.

Contrôle spatio-temporel de l’activité des protéines par la régulation allostérique optogénétique

Cette étude décrit une méthode pour des expériences à haut débit utilisant un réseau de LED imprimées en 3D pour optimiser l’expression génique inductible par la lumière dans HEK293T cellules.

Optimisation rapide d’un système inductible par la lumière pour contrôler l’expression génique de mammifères

Découvrez une méthode optogénétique pour contrôler et analyser les profils d'expression génique dans les interactions cellule-cellule. Cette technique permet d'observer le transfert d'informations oscillatoires entre cellules C2C12 avec une précision élevée.

Une méthode Optogenetic pour contrôler et analyser les profils d’Expression génique dans les Interactions cellule-cellule

Explorer plus de vidéos