Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

Genetics

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Summary

Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Proben stellen eine wertvolle Quelle der molekularen Biomarker der menschlichen Krankheiten. Hier präsentieren wir ein Labor-basierte cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll, zunächst mit frisch gefrorene RNA entworfen und optimiert für die Analyse von archivierten Mikrornas aus Geweben bis zu 35 Jahre gespeichert.

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Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

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Abstract

– Archiviert, klinisch klassifiziert Formalin fixierten bieten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe Nukleinsäuren Retrospektive Molekulare Studien der Krebsentstehung. Durch die Verwendung nicht-invasive oder Pre-maligner Läsionen von Patienten, die später invasive Erkrankungen entwickeln, helfe Genexpressionsanalysen frühe molekulare Veränderungen zu identifizieren, die für Krebsrisiko prädisponieren. Es wurde gut beschrieben, dass Nukleinsäuren FFPE Gewebe erholt unterzogen haben, schwere körperliche Schäden und chemischen Veränderungen, die ihre Analyse schwierig und erfordert in der Regel angepasst Assays. Micro-RNAs (MiRNAs), jedoch die repräsentieren eine kleine Klasse von RNA-Molekülen überspannt nur bis zu ~ 18 – 24 Nukleotide, haben gezeigt, dass langfristigen Lagerung standhalten und wurden erfolgreich in FFPE-Proben analysiert. Hier präsentieren wir Ihnen ein 3' Barcode komplementäre DNA (cDNA) Bibliothek Vorbereitung Protokoll speziell optimiert für die Analyse von kleinen RNAs extrahiert aus den archivierten Geweben, die kürzlich unter Beweis gestellt wurde, robust und hoch reproduzierbare wenn mit archiviert klinische Proben bis zu 35 Jahre lang aufbewahrt. Diese Bibliothek Vorbereitung ist gut geeignet für die Multiplex-Analyse von Material beeinträchtigt/beeinträchtigt, wo RNA-Proben (bis 18) mit einzelnen 3' Barcode Adapter ligiert und dann gebündelt für nachfolgende enzymatische und biochemischen Vorbereitungen vor der Analyse. Alle Reinigungen erfolgen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), die Größe-spezifische Auswahl und Bereicherungen des Barcodes kleine RNA-Spezies ermöglicht. Diese cDNA-Bibliothek-Vorbereitung ist gut angepasst an winzige RNA-Eingänge, wie eine pilot Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Bestimmung eines bestimmten Verstärkung-Zyklus zur optimale Mengen an Material für Next Generation Sequencing (NGS) produzieren erlaubt. Dieser Ansatz wurde optimiert für den Einsatz von degradierten FFPE-RNA aus Proben, die bis zu 35 Jahre archiviert und hoch reproduzierbare NGS-Daten bietet.

Introduction

MiRNAs sind bemerkenswert gut in Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Exemplare1,2,3konserviert. Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass der Ausdruck dieser kurzen regulatorischen nichtcodierende einzelne gestrandeten RNA-Moleküle können erfolgreich mit Gesamt-RNS aus FFPE-Proben ausgewertet werden und liefern relevante Genexpressionsdaten im Vergleich zu den ursprünglichen frisch Gewebe4,5,6,7,8. Im Vergleich zu Großformat-Messenger-RNAs, die erwiesenermaßen FFPE Gewebe Verarbeitung (Formaldehyd, Hitze, Austrocknung, etc.), endogene RNases und das Alter der Proben, die geringe Größe der MiRNAs (~ 18 – 24 kritisch betroffen sein Nukleotide) wird angezeigt, damit sie resistent gegen Abbau und anfällig für langfristige Lagerung, auch durch MiRNA Ausdruck Studien, die Hochdurchsatz-mRNA Studien in archivierte Exemplare9übertreffen demonstriert. MiRNA Ausdruck Studien mit archivierten klinischen Proben, die vor allem in kleinen Analysen durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass einzelne oder Multiplex quantitative PCR-Assays, können verschiedene Arten von Microarray Technologien und zuletzt NGS verwendet werden, um den Ausdruck der erhaltenen MiRNAs nach der Optimierung von diesen Tests10,11,12,13,14bewerten.

Da die Dysregulation des MiRNA Ausdruck mit der Entwicklung einer Vielzahl von menschlichen Tumoren verbunden wurde und gibt es möglicherweise ein enormer Vorrat an klinisch Archivierte Exemplare kommentiert, klar geworden, dass diese kleine RNA Moleküle sind eine vielversprechende Quelle potentiellen Krebs Biomarker15,16,17,18. Die Verwendung einer Hochdurchsatz-Gen-Ausdruck-Technologie wie NGS hat den Vorteil, dass eine Gesamtbewertung aller MiRNA Transkripte im Vergleich zu gezielten Technologien wie PCR und/oder Microarrays19. Aus diesem Grund wurde eine optimierte, kostengünstige und leicht anwendbaren Protokoll für cDNA Bibliothek Vorbereitung der kleinen RNAs aus älteren Archivierte Exemplare auf NGS optimiert, um groß angelegte Retrospektive Studien20ermöglichen.

Wir zuvor etabliert eine gleichzeitige RNA/DNA Extraktion Protokoll für separate Wiederherstellung von RNA und DNA aus älteren Archivierte Exemplare, die wir gefunden, um zeitgenössischen kommerziellen Kits21übertreffen. Verwenden dieses Protokoll Extraktion, um total RNA aus FFPE Gewebe archiviert für längere Zeiten zu erhalten, haben wir optimiert die Vorbereitung der cDNA-Bibliotheken für NGS MiRNAs in klinischen Proben bis zu 35 Jahre lang aufzubewahren. Darüber hinaus in einer kürzlich veröffentlichten Studie, wo wir cDNA-Bibliotheken von klinisch klassifizierte duktalen Carcinoma in Situ (DCIS) Proben vorbereitet, identifizierten wir differentiell exprimierten MiRNAs, die durch quantitative PCR validiert wurden gekennzeichnet werden Veränderungen der spezifischen MiRNA nachweisbar bei DCIS Läsionen von Patienten, die an Brustkrebs im Vergleich zu DCIS Läsionen von Patienten, die nicht an Brustkrebs erkranken.

Betrachtet man die Kosten der kommerziellen Kits für die Zubereitung von kleinen RNA-cDNA-Bibliotheken, das Potenzial für ihre Einstellung, sowie die Verwendung von Copyright/patentrechtlich geschützte Reagenzien, die optimiert werden kann nicht, haben wir uns entschlossen ein zuvor veröffentlichten anpassen Labor-basierte und Kit-freie 3' Barcode cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll für NGS der kleinen RNAs archiviert in FFPE-Proben, Proben ermöglicht simultane Analyse von 1822. Dieses Protokoll bietet eine ideale und robuste schrittweise Prozedur mit optischen und technischen Bewertung Checkpoints, die entscheidend für die Anpassung an FFPE RNA-Proben waren, und hat ein starkes Potenzial für die Anwendung auf andere Quellen von gefährdeten oder schwer RNA-Material verwenden. Das ursprüngliche Protokoll Anwendbarkeit wurde verbessert, indem radioaktiv markierte Größe Marker mit Leuchtstofflampen (z. B.SYBR Gold) nachweisbar RNA-Größe-Markierungen, die bei der Auswahl der aufgespaltenen Bibliotheken auf große Polyacrylamid-Gel verwendet. Dieses optimierte Protokoll stützt sich auf die Unterbindung der Barcode Adapter 3' 18 einzelnen FFPE RNA-Exemplare, die sind dann gebündelt um 5' Adapter Ligatur zu unterziehen, Reverse Transkription und ein pilot PCR-Analyse für Verstärkung der endgültigen cDNA zugeschnitten Bibliothek vor großen PCR-Amplifikation, Reinigung und NGS auf einen hohen Durchsatz-Sequenzer.

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Protocol

1. Vorbereitung aller Reagenzien und Grundierungen

  1. Bestellen Sie alle Grundierungen und Adapter, wie in Abbildung 1beschrieben.
  2. Vorbereiten des Kalibrators cocktail bestand, die in jeder einzelnen Ligatur versetzt wird.
    1. Die Träger Oligonukleotid (Abbildung 1) bis 0,5 µM mit RNase-freies Wasser aufschwemmen. Aufschwemmen Sie 10 Kalibrator Oligonukleotide (Abbildung 1) bis 100 µM mit der 0,5 µM Träger Oligonukleotid-Lösung.
    2. Kombinieren Sie 10 µL der einzelnen 10 Kalibratoren in eine silikonisierte Microcentrifuge einen 100 µM cocktail Kalibrator bestand zu erhalten, und bereiten Sie eine 0,026 nM-Lösung zum Speichern von bei-20 ° C.
  3. Verdünnen Sie die 20 einzigartige, lyophilisiert, Adenylated 3' Adapter mit RNase-freies Wasser, eine Endkonzentration von 50 µM (Abbildung 1).
    Hinweis: Es wird empfohlen, zur Vorbereitung 2,5 µL-Aliquots von jedem Adapter in silikonisierte Einzelrohre und bei-80 ° C bis zu 2 Jahre lang aufbewahren.
  4. Aufschwemmen des entsalzten 19 nt-3 "Adapter und 24 nt-3" Adapter Größe Marker Oligonukleotide bis 250 ng/mL (Abbildung 1).
  5. Aufschwemmen des HPLC gereinigt 5' Adapters bis 100 µM mit RNAse-freies Wasser. Aufschwemmen der 5' und 3' PCR-Primer bis 100 µM mit RNase-freies Wasser (Abbildung 1).
    Hinweis: Aliquoten alle Oligonukleotide in Mengen notwendig für 1 – 2 Experimente und Speicher bei-80 ° C.
  6. Bereiten Sie die Denaturierung (PAA) Gel laden Farbstoff durch die Kombination von 98,8 % Formamid, 1 % (V/V) 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 und 0,2 % Bromophenol Blue Polyacrylamid, und legen Sie 1 mL Aliquote bei-80 ° C.
    1. Bereiten Sie 0,5 M Na2H2 EDTA Lösung durch Zugabe von 18,6 g Na2H2 EDTA Pulver, 50 mL Nuklease-freies Wasser zu. Fügen Sie NaOH Pellets um pH 8.0 zu erreichen. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 mL um 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0-Stammlösung zu erhalten.
    2. Wiegen Sie 15 mg Bromophenol blue in einer separaten 15 mL Tube. Fügen Sie 600 µL Nuklease-freies Wasser. 14,25 mL deionisiertes Formamid hinzugeben. 150 µL 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0-Lösung hinzufügen.
    3. Aliquoten die PAA endgültige Lösung 15 ml in 1 mL Aliquote bei-80 ° C.
  7. Bereiten Sie die 5 x Agarosegel beladen Farbstoff durch die Kombination von 0,2 % Bromophenol blau, 0,2 % Xylol Cyanol FF Na2H2 50 mM EDTA, pH 8.0 und 20 % Ficoll Typ-400.
    1. Aufschwemmen 1,86 g Na2H2-EDTA in 50 mL Nuklease-freies Wasser in ein 400-mL-Becherglas auf einen Magnetrührer bei Raumtemperatur (RT). Fügen Sie NaOH Pellets um einen pH 8.0 zu erreichen. Fügen Sie Nuklease-freie Wasser auf 100 mL zu einem 50 mM EDTA Lösung Na2H2 zu erreichen.
    2. Bromophenol blue Pulver 20 mg, 20 mg Xylol Cyanol FF Pulver und 2 g Ficoll Typ 400 Pulver wiegen, und in 5 mL 50 mM Na2H2 EDTA Aufschwemmen.
    3. Wirbel die Röhrchen mit den drei Farbstoffe und 5 mL 50 mM Na2H2 EDTA. 5 X agarose Gel laden Farbstoff mischen, 1 mL Aliquote vorzubereiten und bei-80 ° c Lagern

2. richten Sie die 3' Barcode-Adapter grundsätzlich mit 18 einzelnen RNA-Proben

  1. 18 einzelnen RNA-Proben zu identifizieren (Pre-regelmäñig bei 100 ng in 9,5 µL Nuklease-freies Wasser in Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL silikonisiert), und legen Sie die Rohre auf Eis für 10 min Auftauen.
  2. 10 x RNA Ligase Puffer (ohne ATP) frisch zubereiten.
    1. Verbinden Sie in einem 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch 343 µL RNase-freies Wasser, 500 µL Tris 1 M pH 7.5, 100 µL 1 M MgCl2, 50 µL von 20 mg/mL bovine Serum Albumin und 7 µL 14 M 2-Mercaptoethanol. Mix von flicking die Röhre, Zentrifuge für 2 s bei 2.000 x g und RT und auf Eis.
      Hinweis: Alle Schritte in diesem Protokoll, die angeben, "Zentrifuge für 2 s" erfolgt in einem Benchtop Microcentrifuge RT und eine Höchstgeschwindigkeit von 2.000 x g, um Lösungen zu sammeln, um den Boden der Röhrchen.
  3. Bereiten 50 % wässrige DMSO Lager durch Zugabe von 1 mL der RNase-freies Wasser zu 1 mL DMSO in einem 2 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch, Rohr in Alufolie wickeln und Lagerung bei RT
  4. Auftauen von 0,026 nM Kalibrator Cocktail auf Eis für 10 min. Vorbereitung der Ligation Master-Mix durch die Kombination in der folgenden Reihenfolge in einem 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch: 40 µL 10 x RNA Ligase Puffer und 120 µL von wässrigen DMSO 50 % mit einer 200 mL-Pipette , und fügen Sie 10 µL 0,026 nM Kalibrator cocktail mit einer 10 µL Pipette. Streichen Sie die 1,5 mL-Tube zu mischen, Zentrifugieren für 2 s und es auf dem Eis.
  5. Jeder der 18 individuell regelmäñig FFPE RNA-Proben 8,5 µL Ligation Master Mix hinzufügen, sanft flick die Rohre Zentrifuge für 2 s und Shop auf Eis.
  6. Tauen Sie 2,5 µL-Aliquots aus jedem der 18, Barcode Adapter 3' und legen Sie sie auf dem Eis für 20 min. auftauen.
    1. Verwenden Sie eine 3 µL Pipette 1 µL jeder Adapter auf die entsprechenden FFPE RNA-Proben mit RNA und Ligation Master Mix (d.h., 9,5 µL + 8,5 µL) übertragen.
    2. Pipette rauf und runter, einfach in die Flüssigkeit zu verzichten und nicht die Spitze herausziehen. Achten Sie darauf, zwischen FFPE RNA-Proben Spitzenwechsel. Schließen Sie jedes Rohr, flick zu mischen, Zentrifuge für 2 s und auf Eis.
  7. Denaturieren Sie die Reaktionen, indem Sie die 18 Röhren auf einem Heizblock bei 90 ° C für 1 min und dann sofort auf Eis.
  8. Bereiten Sie die Ligatur Enzymlösung durch Verdünnung 10 µL des abgeschnittenen K227Q T4 RNA Ligase 2 mit 10 µL RNase-freies Wasser zu einem frischen 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch.
  9. Verwenden eine 3 µL Pipette 1 µL des verdünnten Ligatur Enzyms in jeder der 18 RNA-Proben zu übertragen (keine pipette rauf und runter und Tipps zwischen jedes Rohr zu ändern). Die 18 grundsätzlich auf Eis stellen und legen in einem 4 ° C kalten Zimmer für eine Übernachtung Inkubation von 18 h.

3. Reinigung der aufgespaltenen kleinen RNAs

  1. Deaktivieren Sie die Ligatur Reaktionen zu, indem Sie die 18 Röhren für 1 min auf einem Heizblock bei 90 ° C, und kehren Sie um zu Eis für mindestens 2 min abkühlen lassen.
  2. Bereiten Sie den Niederschlag Master Mix durch Zugabe von 1 µL des blauen Farbstoff kovalent an Glykogen zu 26 µL 5 M RNase-freie NaCl zu einem frischen silikonisierte Microcentrifuge Schlauch verbunden.
    1. Übertragen Sie 1,2 µL des Niederschlag-Master-Mix in jedes der 18 Rohre. Fügen Sie 63 µL 100 % Ethanol zu jedem der 18 Röhren. Jedes Röhrchen verschließen, wechseln Sie zu mischen, Zentrifugieren für 2 s und Ort der Rohre auf dem Eis. Kombinieren Sie den Inhalt aller 18 Röhren in einer einzigen 1,5 mL silikonisiert Röhre.
    2. Das Röhrchen verschließen, dreimal, Mix, Zentrifuge für 2 s und Platz für 60 min zu überstürzen sich auf Eis zu invertieren.
  3. Seite eine große (16 X 20 cm2) 15 % Polyacrylamid-Gel vorbereiten.
    1. Gegossene zwei silikonisiert Glasplatten (behandelt mit eine sichere Alternative zu Silan-Beschichtungen) mit 0,1 cm Spacer.
    2. Kombinieren Sie 9 mL System Verdünnungsmittel, 18 mL System Konzentrat, 3 mL Systempuffer, 240 µL APS (9 %), und 12 µL TEMED in ein 50 mL-Tube.
    3. Übertragen Sie die Seite Gel Lösung zwischen Glasplatten mit einer 30-mL-Pipette, legen Sie einen 14-Well-Kamm (0,1 cm dick) und lassen Sie das Gel für 30 min bei RT zu festigen.
  4. Zentrifugieren Sie die 1,5-mL-Tube mit der gepoolten grundsätzlich auf 16.000 x g und 4 ° C für 60 min.
  5. Entfernen Sie den Kamm. Reinigen Sie die Brunnen reichlich mit RNase-freies Wasser mit einer Spritzflasche mit 200 µL Spitze an seinem Ende in den Brunnen zu erreichen und erzwingen UN polymerisierten Acrylamid (ein gut zu einem Zeitpunkt) über ein Waschbecken. Legen Sie die 15 % Seite auf einem Gel-Apparat, füllen Sie die Behälter mit 0,5 x Tris-Borat EDTA (TBE) Lösung, und führen Sie vorab das Gel für 30 min bei 450 V.
  6. Erholen Sie das Rohr mit gepoolten grundsätzlich aus der Zentrifuge zu und trocknen Sie sorgfältig die RNA-Pellet.
    1. Entfernen des Überstands mit einer 1-mL-PIPETTENSPITZE aber etwas Flüssigkeit an der Unterseite. Kippen Sie das Rohr und verwenden Sie eine 20-mL-Pipette, um den verbleibenden überstand zu entfernen, ohne das Pellet. Vakuum Saugrohr mit einer Pasteurpipette mit einer 10 µL Spitze hochkant, ohne Sie zu berühren das Pellet.
    2. Aufschwemmen der RNA-Pellets in 20 µL RNase-freies Wasser durch Streichen der Röhre. Fügen Sie 20 µL PAA Gel Laden Lösung Aufschwemmen der RNS, flick um zu mischen, Zentrifuge für 2 SA. RT, und legen Sie die Röhre bei 90 º c für 1 min und dann sofort auf Eis legen.
  7. Ersetzen der 0,5 X TBE des Apparates mit frisch 0,5 X TBE und Belastung der Leiter, Größe Marker und aufgespaltenen MiRNAs in der Mitte des Gels, Gel verlassen 2 leeren Brunnen auf beiden Seiten (Abbildung 2).
  8. Führen Sie das Gel bei 450 V (35 mA) für 60 min, unterbrechen den Lauf für 10 min abkühlen lassen, und führen Sie erneut bei 520 V (25 mA) für eine weitere 60 min. 15 % Uncast Seite durch einen der Glasplatten zu entfernen.
  9. Leicht das sitzen auf der Glasplatte Gel spray mit fluoreszierenden Farbstofflösung (10 µL) in 25 mL 0,5 x TBE, und lassen Sie es flach für 5 min im Dunkeln sitzen.
  10. Legen Sie das Glas mit dem Gel auf eine blaue Licht Transilluminator und richten Sie beide 19 nt und 24 nt Größe Marker mit einem Lineal, die Exzision der aufgespaltenen kleine RNAs (Abbildung 2) zu lenken. Verbrauchssteuern Sie das Gel.
  11. Legen Sie die ausgeschnittene Gel in eine 0,5 mL-Tube, entworfen, um Gel Scheiben, fest positioniert in einem 1,5 mL silikonisierte Microcentrifuge Schlauch fragment. Zentrifugieren bei 16.000 x g für 3 min bei RT Aufschwemmen der fragmentierten Gels mit 300 µL 400 mm NaCl-Lösung, das Röhrchen verschließen und versiegeln Sie es mit dem Paraffin-Film.
  12. Legen Sie das Rohr auf Erregung auf einem Thermomixer bei 1.100 u/min in einem 4 ° C kalten Zimmer für eine Übernachtung Inkubation (16-17 h).

4. Unterbindung des Adapters 5'

  1. Übertragen die Lösung und fragmentierten Gel zu einem 5 µm Filter sitzt in einem 1,5 mL silikonisiert Rohr Rohr, versiegeln mit Paraffin Film und Zentrifugieren für 5 min bei 2.300 x g und RT.
  2. Die filtrierte Lösung 950 µL 100 % Ethanol hinzu, das Röhrchen verschließen, kehren Sie zu mischen, Zentrifugieren für 2 s, versiegeln Sie das Rohr mit Paraffin Film, und für 1 h auf Eis legen.
  3. Bereiten Sie eine 12 % Seite gel wie unter Punkt 3.3 beschrieben, aber kombinieren Sie 12,6 mL Verdünnungsmittel, 14,4 mL Konzentrat, 3 mL Puffer, 240 µL APS und 12 µL TEMED in ein 50 mL-Tube. Bereits laufen die 12 % Seite Gel für 30 min bei 450 V (~ 35 mA) in 0,5 X TBE.
  4. Zentrifugieren Sie die gereinigte kleine RNA-Lösung bei 16.000 x g für 60 min bei 4 ° C.
  5. Pipette vorsichtig aus der Überstand mit einer 1-mL-Pipette zu den größten Teil der Lösung zu entfernen und eine 200-mL-Pipette verwenden, um die restliche Lösung zu entfernen, ohne Sie zu berühren das Pellet.
  6. Trocknen Sie mit Hilfe einer Pasteurpipette mit 10 mL Spitze an ihrem Ende mit einer Thermoskanne verbunden, sorgfältig die Pellets ohne es zu berühren.
  7. Aufschwemmen das Pellet in 9 µL RNase-freies Wasser ohne pipettieren rauf und runter, aber mit leicht streichen das Rohr, Zentrifugieren für 2 s und das Rohr auf dem Eis.
  8. Bereiten Sie die 10 x RNA Ligase Puffer (mit ATP) frisch durch die Kombination von 500 µL 1 M Tris pH 7,5, 100 µL 1 M MgCl2, 50 µL von 20 mg/mL acetyliert BSA, 200 µL 10 mM ATP, 7 µL 2-Mercaptoethanol 14 M , und 143 µL RNase-freies Wasser.
  9. 10 x RNA Ligase Puffer (ATP) durch Umlegen der Röhre mischen und Zentrifugieren für 2 s, die Lösung an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
  10. Einrichten der 5'-Adapter Ligatur durch Hinzufügen von 2 µL 10 x RNA Ligase Puffer (ATP), 1 µL 100 µM 5' Adapter und 6 µL 50 % wässrige DMSO, 9 µL, 3' Barcode small RNA-Lösung.
  11. Streichen Sie das Rohr leicht zu mischen, Zentrifugieren für 2 s, die Lösung zu sammeln legen das Rohr auf einem Heizblock bei 90 ° C für 1 min und wieder auf Eis für mindestens 2 min.
  12. Fügen Sie 2 µL T4 RNA Ligase 1 in die Lösung (nicht pipette rauf und runter), streichen Sie das Rohr, Zentrifuge für 2 s und sitzen die Röhre in schwimmenden rack im Wasserbad 37 ° C für 60 min.
  13. Gleichzeitig richten Sie zwei grundsätzlich zwischen den 19 nt-3 "Adapter und den Adapter 5' und zwei grundsätzlich zwischen den 24 nt-3" Adapter und die 5'.
    1. Kombinieren Sie 2 µL des 19nt-3 "Adapter (250 ng/µL) oder 24 nt-3" Adapter (250 ng/µL) mit: 2 µL der 5'-Adapter (100 µM), 2 µL 10 x RNA Ligase Puffer (ATP), 6 µL 50 % wässrige DMSO, 6 µL RNase-freies Wasser , und 2 µL T4 RNA Ligase 1 in einem 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch.
    2. Streichen Sie die Rohre zu mischen, Zentrifugieren für 2 s und die Röhrchen bei 37 ° C für 60 Minuten.
  14. Alle Verbindlichkeiten 20 µL PAA Denaturierung Puffer hinzufügen (gereinigt kleinen RNAs, 2 grundsätzlich mit 19nt-3 "Adapter und 2 grundsätzlich mit 24nt-3" Adapter).
    1. Mix von flicking die Rohre, Zentrifuge für 2 s, und inkubieren Sie die Rohre auf einem Heizblock bei 90 ° C für 1 min. Transfer alle Röhren zu Eis, und bereiten eine Leiter (3 mL Leiter mit 20 µL PAA).
  15. Leeren Sie das Oberbecken des Gel-Geräts mit dem Vorlauf 12 % Seite Gel, und fügen Sie frische 0,5 X TBE Lösung unter dem Niveau der Brunnen (Brunnen sind mit einer langen, dünnen Spitze Pipette geleert).
    1. Laden Sie die Proben mit einer dünnen PIPETTENSPITZE, wie in Abbildung 3beschrieben.
    2. Verwendung frischer 0,5 X TBE, individuelle Vertiefungen an der Spitze des Gels zu füllen.
    3. Fügen Sie frische 0,5 X TBE zum Stausee oberhalb der Brunnen und Start der Elektrophorese des 12 % Seite für 60 min bei 450 V (~ 35 mA).
    4. Anhalten der Ausführung durch das Abschalten des Generators für 10 min. abkühlen lassen, das Gel. Starten Sie den Generator und führen Sie das Gel für 60 min bei 520 V (~ 25 mA).
  16. Der Generator wird gestoppt, leeren die Stauseen durch invertieren das Gerät über ein Waschbecken und 12 % uncast Seite durch einen der Glasplatten zu entfernen.
  17. Setzen Sie das Glas mit dem flachen Gel, Sprühen Sie das Gel mit 10 µL der fluoreszierenden Farbstoff in 25 mL 0,5 X TBE, brüten im Dunkeln für 5 min. mit dem Gel auf eine blaue Licht Transilluminator das Glas legen und Ausrichten der beiden 19 nt und sowohl die 24 nt Größe Marker mit ein Lineal, um direkt die Exzision der aufgespaltenen kleine RNAs (Abbildung 3).
    1. Das Gel Verbrauchsteuern und die ausgeschnittenen Gel Stück in ein 0,5 mL Gel Breaker Rohr übertragen. Schließen Sie die Kappe des Gel Breaker Rohres, zu einem 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch Set und sicher mit Paraffin Film. Das Gel-Breaker-Rohr zu entfernen, die zerkleinerten Gel Stücke in einer 1,5 mL Tube 300 µL von 300 mM NaCl und 1 µL 100 µM 3' PCR Primer hinzufügen.
    2. Versiegeln Sie das Rohr mit Paraffin Film auf Erregung auf einem Thermomixer bei 1.100 u/min bei 4 ° C über Nacht (17 – 18 Uhr) in einem kalten Raum.

(5) reverse Transkription von 5' Ligiert und 3' Barcode gereinigt kleinen RNAs

  1. Abrufen der Schlauch aus dem Thermomixer und Filter reinigen die Lösung mit einem 5 µM Filter Schlauch.
    1. Verwendung einer 1-mL-Pipette, die Lösung auf eine 5 µM Filter Rohr eingeschoben 1,5 mL übertragen silikonisiert RNase-freie sammelröhrchen. Zentrifugieren Sie das Rohr für 3 min bei 2.300 x g und RT.
    2. Entsorgen Sie das Filter-Rohr und das 1,5 mL Microcentrifuge sammelröhrchen, die gefilterte Lösung enthält fügen Sie 950 µL 100 % Ethanol hinzu. Invertieren Sie das Rohr, Mix, Zentrifuge für 2 s und Platz für 60 min. Niederschlag die RNA pellet durch Zentrifugieren das Rohr auf 16.000 x g und 4 ° C für 1 h auf Eis.
  2. Trocknen Sie die RNA-Pellet.
    1. Öffnen Sie die Kappe und entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer 1-mL-Pipette etwas Flüssigkeit am Ende verlassen.
    2. Verwenden Sie eine 20 µL Pipette, um den verbleibenden überstand zu entfernen, ohne das Pellet. Kippen Sie das Rohr um eine Lösung auf der gegenüberliegenden Seite des Pellet-sitzen zu ermöglichen.
    3. Verwenden Sie eine Pasteurpipette mit einer 10 mL ungefiltertes PIPETTENSPITZE Aspirieren überstand und trocknen Sie die Pellets mit Vakuum.
  3. Die RNA-Pellet in 5,6 µL RNase-freies Wasser aufschwemmen.
    1. Auftauen der reversen Transkription Reagenzien auf dem Eis für 15 min. Set bis eine reverse Transkription Reaktion durch Zugabe von 3 µL 5 x Puffer, 4.2 µL 10 X deoxynucleotide triphosphat (dNTPs) (je 2 mM) und 1,5 µL Dithiothreitol (DTT), 5,6 µL RNase-frei resuspendierte Pellet.
    2. Streichen Sie sanft das Rohr um die Reaktion zu mischen, und Zentrifugieren für 2 s, die Lösung zu sammeln. Richten Sie die Reaktion auf einem Heizblock bei 90 ° C genau 30 s und übertragen Sie dann direkt auf eine Thermomixer bei 50 ° C.
    3. Lassen Sie das Rohr für den Thermomixer für 2 min, so dass die Temperatur ausgleicht. Fügen Sie 0,75 µL des Enzyms reverse Transkription direkt in die Lösung, Flick sanft zu mischen und der Schlauch wieder auf den Thermomixer bei 50 ° C für 30 min sofort-Set.
  4. Übertragen Sie nach 30 min das Rohr auf einem Heizblock bei 95 ° C für 1 min, reverse Transkription zu stoppen. Fügen Sie 95 µL RNase-freies Wasser der reversen Transkription direkt hinzu, wechseln Sie das Rohr zu mischen, und setzen Sie ihn direkt auf dem Eis für 2 min.
  5. Beschriften Sie das Rohr mit der cDNA Materialbibliothek und Bibliothek-ID.

6. pilot PCR und groß angelegte PCR Verstärkung

  1. Bereiten Sie frisch 10 X PCR Puffer durch Hinzufügen von 304 µL RNase-freies Wasser, 125 µL 2 M KCl, 50 µL 1 M Tris pH 8.0, 10 µL 1 M MgCl2, 5 µL 1 % Triton X-100 und 6 µL 1 M 2-Mercaptoethanol in einem silikonisierte Microcentrifuge Schlauch , und halten Sie bei RT
  2. Montieren die Pilot PCR-Reaktion durch die Kombination von 67 µL RNase-freies Wasser, 10 µL 10 x PCR-Puffer, 10 µL 10 X dNTPs, 0,5 µL 100 µM 5' PCR Primer, 0,5 µL 100 µM 3' PCR Primer, 10 µL cDNA Materialbibliothek und 2 µL 50 X Taq Polymerase.
    1. Richten Sie zwei PCR-Zyklen in einem Thermocycler folgendermaßen: Datei 1: 94 ° C für 45 s, 50 ° C für 85 s und 72 ° C für 60 s für 10 Zyklen zu halten, bei 4 ° C; Datei 2: 94 ° C für 45 s, 50 ° C für 85 s und 72 ° C für 60 s für 2 Zyklen, bei 4 ° c zu halten Einrichten der Pilot PCR-Reaktion in den Thermocycler und Datei 1.
    2. Am Ende der Datei 1 Öffnen Sie das PCR-Röhrchen, und mit einer 20 µL Pipette, Transfer 12 µL aus der Pilot PCR-Reaktion zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 3 µL 5 X gel laden Farbstoff, mischen, indem Sie auf und ab pipettieren, das Röhrchen verschließen , und beschriften Sie sie "10 Zyklen".
    3. Das Pilot-PCR-Röhrchen verschließen und File 2 an einem Thermocycler beginnen. Am Ende der Datei 2 Öffnen Sie PCR Tube und verwenden Sie eine 20-mL-Pipette, um 12 µL Lösung in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 3 µL 5 x Gel Loading Dye transfer, und beschriften sie "12 Zyklen".
    4. Wiederholen Sie die Schritte in den Schritten 6.2.2 und 6.2.3 12 µL PCR-Produkte aus der Pilot PCR-Reaktion bei PCR-Zyklen, 14, 16, 18 und 20 zu sammeln. Jedes der 12 µL PCR Aliquote 3 µL 5 x Gel laden Farbstoff hinzu, und an die 20 nt-Leiter, 3 µL der Leiter und 9 µL RNase-freies Wasser enthält.
  3. Bereiten Sie eine 2,5 % Agarose-Gel mit 0,5 X TBE.
    1. Gewicht 2,5 g Agarose in ein sauberes Becherglas und 100 mL 0,5 X TBE. Die Lösung in der Mikrowelle erhitzen Sie, bis es kocht. Entfernen Sie die Lösung aus der Mikrowelle, Wirbeln Sie die Flasche zum Mischen der Agarose, Hinzufügen von 4 μL der Interkalation Bromid (10 mg/mL) und übertragen Sie die Lösung auf einem 7 x 10 cm2 Elektrophorese Tablett, an beiden Enden mit Klebeband verschlossen.
    2. Legen Sie eine 8-Well-Kamm und lassen Sie das Agarosegel erstarren bei RT. Transfer erstarrten Agarose-gel in einer Elektrophorese-Apparatur gefüllt mit 0,5 X TBE.
  4. Laden Sie die Leiter und PCR-Proben auf dem Agarosegel, und führen Sie es für 30 min bei 120 V.
  5. Bewerten Sie das Gel auf einem UV-Box, die optimale PCR-Zyklus (Abb. 4A) zu identifizieren.
    Hinweis: Die Größe der erwarteten PCR Bands zeigt Abbildung 4 b.
    1. Die beiden PCR-Bands in jedem der verschiedenen Brunnen zu beobachten (obere Band: DNA-Bibliothek, unterband: Grundierung Dimere).
    2. Identifizieren die angemessene PCR-Zyklus für die cDNA-Verstärkung durch die Auswahl des Zyklus wo die cDNA-Bibliothek ist sichtbar, aber die Grundierung Dimere sind kaum zu beobachten.
      Hinweis: Im Allgemeinen ist die angemessene PCR-Zyklus zwischen 12 – 16 Zyklen ausgewählt. Abbildung 4Aleuchtet die entsprechende PCR-Zyklus für diese Bibliothek 14.
  6. Richten Sie die groß angelegte PCR-Reaktionen (6 x 100 µL) für Agarose-Gel-Bibliothek-Reinigung.
    1. Bereiten Sie eine frische Röhre 10 x PCR-Puffer nach Schritt 6.1.
    2. Bereiten Sie die groß angelegte PCR Master-Mix in einem 1,5 mL Röhrchen durch die Kombination 435.5 µL RNase-freies Wasser, 65 µL 10 X PCR Puffer, 65 µL 10 X dNTPs 3,25 µL des PCR-Primer 5' 3,25 µL des PCR-Primer 3' und pipettieren rauf und runter zu mischen.
    3. Übertragen Sie 88 µL des PCR-Master-Mix in sechs 0,5 mL PCR Rohre. 10 µL cDNA Materialbibliothek (gespeichert auf Eis) zu übertragen, fügen Sie 2 µL 50 X Taq Polymerase in jedes der 6 PCR-Rohre und pipette um zu mischen.
    4. Bereiten Sie eine negative PCR-Reaktionsgefäß durch die Kombination von 77 µL RNase-freies Wasser, 10 µL 10 X PCR Puffer 10 µL 10 X dNTPs, 0,5 µL des PCR-Primer 5', 0,5 µL des PCR-Primer 3' und 2 µL 50 X Taq Polymerase und Pipette zu mischen.
    5. Legen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler mit Hilfe der PCR-Zyklus im Schritt 6.2.1 beschrieben und die optimale Anzahl der Verstärkung Zyklen. Bereiten Sie eine 2,5 % Agarosegel mit 0,5 X TBE, wie unter Punkt 6.3 beschrieben.
  7. Übertragen Sie nach PCR Verstärkung 9 µL aus jedem PCR-Röhrchen in sechs 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 3 µL 5 x Gel laden Farbstoff enthält.
    1. Bereiten Sie 20 nt Leiter durch die Kombination von 3 mL der Leiter in 9 µL RNase-freies Wasser und Hinzufügen von 3 µL Gel Farbstoff in einem 1,5 mL-Tube laden.
    2. Laden Sie die Leiter, PCR Negativkontrolle und 6 PCR-Produkte auf das Agarosegel, und führen Sie das Gel für 30 min bei 120 V.
    3. Überprüfen Sie die Einheitlichkeit der PCR Vergrößerungen zwischen Fahrspuren auf eine UV-Box (nehmen Sie ein Bild).
    4. Kombinieren Sie 3 PCR-Reaktionen in zwei 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch (3 x 91 µL), 27 µL 5 M NaCl und 950 µL 100 % Ethanol. Invertieren Sie die Rohre zu mischen und setzte sie bei-20 ° C über Nacht, die PCR-Produkte auszufällen.

(7) cDNA Bibliothek Reinigung und Bewertung

  1. Zentrifugieren Sie beide Rohre mit dem PCR-Reaktionen bei 16.000 x g für 60 min bei 4 ° C.
  2. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1-mL-Pipette, dann kippen Sie das Rohr mit der Pellet auf der Oberseite und Flüssigkeit auf der unteren Seite und Verwenden einer Pasteurpipette, verbunden mit einer Thermoskanne mit einer Badewanne und Flüssigkeit mit 10 mL Spitze am Ende der Pasteurpipette abzusaugen.
  3. Richten Sie die PmeI verdauen.
    1. Aufschwemmen Sie eines PCR-Pellets mit 17,5 µL Nuklease-freies Wasser, und das zweite PCR-Pellet übermitteln Sie Pellet resuspendierte. Fügen Sie 2 µL 10-fach Puffer und 0,5 µL PmeI Enzym, und legen Sie den Digest in einem Wasserbad für 2 h bei 37 ° C.
    2. Bereiten Sie eine 2,5 % Agarosegel mit 0,5 X TBE (Schritt 6.3). Der Digest 6 µL 5 x Gel laden Farbstoff hinzufügen. Übertragen Sie 13 µL jeder Digest in zwei benachbarten Vertiefungen der Agarose-Gel, laden Sie 20 nt-Größe-Leiter am Ende Brunnen und führen Sie das Gel für 90 min bei 150 V (Abbildung 4 aus).
    3. Verbrauchsteuern Sie die oberen PCR-Bänder aus dem Gel auf die UV-Box, übertragen Sie die Gel-Stücke zu einem frisch wog 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und wiegen Sie die Gel-Stücke auf einer Skala.
  4. Reinigen Sie die ausgeschnittene PCR amplifizierten cDNA-Bibliothek mit einem Gel Extraction Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Quantifizieren der cDNA-Bibliothek mit Hilfe eines DNA-Quantifizierung Assay und Instrument, nach den Anweisungen des Herstellers.
  5. Bewerten Sie die Größe und Reinheit der cDNA-Bibliothek mit einem hochempfindlichen DNA-Chip auf einem Bioanalyzer (Abbildung 5). Reihenfolge der cDNA-Bibliothek mit einem Hochdurchsatz-System. Übertragen Sie die FASTQ-Datei an die RNAworld-Pipeline für Adapter Trimmen und Ausrichtung auf das menschliche Genom, die MiRNA-Sequenzen zu identifizieren.

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Representative Results

Wie in der Methode hier insgesamt 18 einzelnen FFPE RNA-Proben beschrieben (100 ng jeder) befinden sich in getrennten Röhren 3' Adenylated Barcode Oligonukleotid T4 Ligatur über Nacht zu unterziehen. Am nächsten Tag sind die enzymatischen Reaktionen Hitze deaktiviert, kombiniert und in einem einzigen Rohr ausgefällt. Die RNA-Pellet Nukleinsäuretablette und der aufgespaltenen RNA-Moleküle sind auf 15 % denaturierenden Polyacrylamid-Gel (Seite), wo RNA Oligonukleotid Größe Marker, die in benachbarten Brunnen des Gels Seite migriert werden verwendet, um die entsprechend dimensionierte 3' Barcodes wählen getrennt kleinen RNAs (Abbildung 2). Die ausgeschnittenen Gel-Stück wird in einem NaCl-Lösung über Nacht die aufgespaltenen RNA-Moleküle zu eluieren inkubiert. Am nächsten Tag die eluierten RNA wird ausgefällt und eine 5' Adapter Verbindung erfolgt. Dann sind die 5' Adapter ligiert kleine RNA-Moleküle migriert und getrennt auf einem 12 % Acrylamid-Gel, wo wieder migrierten RNA Größe Marker Oligonukleotide Größe Exzision des kleinen RNAs ermöglichen, enthält die Barcode Oligonucleotides 3' und 5' Adapter ( Abbildung 3). Die ausgeschnittene Gel ist in einer NaCl-Lösung ermöglicht Elution der RNA über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag die aufgespaltenen kleine RNA-Moleküle werden ausgefällt und das Pellet in RNase-freies Wasser, gefolgt von Reverse Transkription Nukleinsäuretablette ist; ein Aliquot der cDNA Moleküle durchläuft eine pilot PCR-Reaktion (Abb. 4A). Groß angelegte PCR-Reaktionen, die über den gleichen Eingang von cDNA-Bibliotheken sind eingerichtet und auf einem 2,5 % Agarose-Gel um sicherzustellen, dass alle Reaktionen angemessen PCR verstärkt (Abbildung 4 b), vor der Zusammenlegung und Übernachtung Ethanol Niederschlag wurden ausgewertet. Am nächste Tag, die verstärkte cDNA-Bibliothek, enthält alle 18 einzelne Bibliotheken für die 18 FFPE RNA-Unikate, wird auf eine 2,5 % Agarose-Gel und das obere PCR Band, bei 100 nt herausgeschnitten und gereinigt wird (Abbildung 4) migriert. Die cDNA-Bibliothek-Reinigung wird dann auf eine hohe Empfindlichkeit DNA-Chip (Abbildung 5) um festzustellen, dass die gereinigte PCR-Produkt kein Übermaß an Grundierung Dimere oder andere Nebenprodukte der PCR-Reaktion enthält ausgewertet. Das PCR-Produkt wird dann auf einem System von Hochdurchsatz-Sequenzierung analysiert. Der Adapter Trimmen und Generierung von 18 einzelne Dateien für jede der 18 Exemplare werden mit Hilfe der RNAworld-Pipeline durchgeführt (Zugang wurde uns zur Verfügung gestellten durch Dr. Thomas Tuschl). Biostatistische Analysen werden dann durchgeführt, um die MiRNA-Inhalte der Proteinkinase RNA-Proben zu bewerten.

Um dies zu überprüfen optimierte Verfahren abgestimmt frisch eingefroren und FFPE Brust Tumor Proben dienten die Analysen (Abbildung 6). Zwei ähnliche invasivem Brustkrebs Duktales Karzinom (IDC) Tumoren wurden ausgewählt, um die Empfindlichkeit des Verfahrens bewerten und festzustellen, wenn MiRNA Ausdruck Unterschiede zwischen den zwei frischen gefrorenen Geweben identifiziert auch bei nachgewiesen werden konnte die übereinstimmenden archiviert Proteinkinase RNA-Proben. Für dieses Experiment bewertet die Qualität des gesamten RNA die 2 frisch eingefroren und die aufeinander abgestimmten zwei FFPE RNA-Proben entnommen wurde (Abb. 6A). Wie erwartet, wurde die RNA-Größe und die Qualität der FFPE-Proben stark verringert, im Vergleich zu der übereinstimmenden frisch gefrorenen RNAs (Vergleiche die Bahnen 1 und 3 und die Bahnen 2 und 4). Eines der Proteinkinase RNA hatte wurde archiviert bei RT für 4 Jahre (Invasive Breast Cancer 1, (IBC1)) und die andere hatte bei RT für 8 Jahre (IBC2), archiviert wurden, während die frisch gefrorenen Gegenstücke bei-80 ° c gelagert wurden Die vier einzelnen RNA-Proben wurden in einer einzelnen Bibliothek mit 4 individuellen Barcodes und die MiRNA lesen Verteilung, die Grundstücke in Abbildung 6 bangezeigt werden analysiert. Die beiden oberen Platten anzeigen MiRNA Ausdruck Korrelation zwischen zwei frisch gefrorenen Tumor RNAs und ihre spezifische Proteinkinase RNA Probe Gegenstücke. Die Grundstücke abgestimmt zwischen frisch gefrorenen und FFPE MiRNAs zeigen, dass die cDNA-Bibliothek-Vorbereitung eine gute Reproduzierbarkeit bietet eine hohe Korrelation zwischen der MiRNAs erkannt in Proben unterschiedlich verarbeitet (Frozen vs. FFPE) beobachtet werden kann. Die zwei unteren Platten zeigt die Korrelation zwischen MiRNA Ausdruck Daten aus zwei verschiedenen gefrorenen Tumoren und zwischen zwei verschiedenen FFPE-Tumoren. Wie in Abbildung 6angegeben, wurden die MiRNA Ausdruck Unterschiede zwischen den zwei frischen gefrorenen Tumoren identifiziert mit den Unterschieden zwischen den zwei aufeinander abgestimmte FFPE Tumor Proben erkannt korreliert. Bedeutung MiRNA Ausdruck Unterschiede waren nachweisbar sowohl in frisch eingefroren und FFPE Tumoren.

Um die Empfindlichkeit dieser Methode weiter zu bewerten, MiRNA Ausdruck Daten aus 12 Archivierte FFPE-Proben und 4 frisch gefrorene RNA-Proben verwendet wurden (Abbildung 6). Die 16 verschiedenen RNA-Proben wurden einzeln 3' Barcode und alle für die Vorbereitung einer einzigen cDNA-Bibliothek verwendet. Die RNA-Proben, die in dieser Bibliothek enthalten zwei Brust-Zelllinien, die MCF10A verwendet (Normal-wie Zell-Linie) und der MCF7 (Brust-Krebs-Zell-Linie) mit RNA aus Frischzellen und ihre archivierten FFPE Pendants23, abgestimmt frisch eingefroren und FFPE RNA-Proben von den zwei Brustkrebs Proben analysiert selbständig (IBC1 und IBC2 in Abbildung 6A und 6 b) und abgestimmt, frisch eingefroren und FFPE RNA-Proben aus normalen zervikalen Proben (Cx). Darüber hinaus wurden die archivierten FFPE-Proben von Normal (normale Br1, normale Br2 und normalen Br3) und Krebs Brustgewebe (IBC 5, IBC 6 und 7 IBC), ohne ihre frisch gefrorenen Gegenstücke analysiert. Wie auf der Heatmap, unabhängig von frisch gefrorenen oder Proteinkinase RNA Herkunft, MiRNA expressionsprofile dieselben Zellen (MCF10 oder MCF7) oder das gleiche Gewebe (IBC1, IBC2 oder Cx) zusammen gruppiert. Zusätzlich, wie erwähnt auf dem unbeaufsichtigten Cluster, von links nach rechts, gruppierten normalen Brustzellen und Gewebe zusammen gruppiert, während Tumoren der Brust und Tumor-Zellen auf der rechten Seite. Zervikale Gewebe, das eine unterschiedliche MiRNA Expressionsprofil, auf der rechten Seite von der Heatmap gruppiert angezeigt.

Wenn man bedenkt, besitzen die meisten klinisch archivierten FFPE-Proben nicht frisch gefrorenen Gegenstücke, aber, dass sie nach verschiedenen Lagerdauer abgerufen werden können, es wurde gesucht, um festzustellen, ob das optimierte cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll anwendbar sei und mit immer älter werdenden FFPE-Proben reproduzierbar sind. Wie in Abbildung 7, MiRNA expressionsprofile von FFPE Gewebe für 18, 20, 22, 27, archiviert angezeigt wurden 30 und 35 Jahre erhalten. Die RNA wurde mit optimierten gleichzeitige RNA/DNA-Verfahren21extrahiert und Vierling RNA Aliquote aus jeder einzelnen FFPE-Probe am selben Tag vorbereitet und bei-80 ° C vor der Bibliothek Vorbereitungen gespeichert wurden. Insgesamt 9 verschiedene FFPE-Proben wurden in zweifacher Ausfertigung, wo jeder einzelne RNA aliquoten mit verschiedenen Barcode Oligonukleotide (insgesamt 18 Barcodes), innerhalb der gleichen Bibliothek ligiert wurde analysiert. Dieses Experiment wurde in zwei aufeinander folgenden Wochen (Woche 1 und Woche 2) wiederholt. Dies ermöglichte Bewertung der cDNA Bibliothek Vorbereitung Reproduzierbarkeit mit der gleichen RNA-Proben mit zwei verschiedenen Barcodes innerhalb einer einzelnen Bibliothek und zwischen zwei verschiedenen Bibliotheken mit einem Intervall von einer Woche. Wie auf Abbildung 7beobachtet, blieb der Korrelationskoeffizient über 0,96 unabhängig vom Alter der Probe oder der Bibliothek Vorbereitungswoche; daher das optimierte cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll bietet ein robustes Werkzeug für reproduzierbare Analyse der FFPE-Proben unabhängig von ihrer Archivierung Zeit, z. B. der 35 Jahre alte archivierte FFPE RNA hohe reproduzierbare Maßnahmen angezeigt (siehe Brust #9) gleichwertig mit der 20-Year-Old FFPE RNA-Proben (siehe Brust #3) zur Kenntnis genommen.

Figure 1
Abbildung 1: Oligonukleotide. Alle Oligonukleotid-Sequenzen, ihre entsprechenden chemischen Modifikationen und Konzentrationen verwendet werden in diesem Protokoll werden beschrieben. Die Arten von chemischen Modifikationen werden im Feld Änderung und die abgekürzten Änderungen angezeigt in den Oligonukleotid-Sequenzen beschrieben. Der Kalibrator cocktail zeigt die Liste der 10 einzelnen RNA Oligonukleotid Kalibratoren, die in einer Lösung, die den Träger Oligonukleotid (0,5 µM) Nukleinsäuretablette wurden. Die achtzehn 3' Barcode Oligonukleotid-Adapter sind mit grauen Schattierungen über den Barcode Reihenfolge aufgeführt. Die RNA-Sequenz des Adapters 5' und den DNA-Sequenzen der 3' PCR und 5' PCR Primer sind aufgeführt. Die RNA-Sequenzen von zwei Größe Marker Oligonukleotide, nämlich auf die verwiesen wird im Protokoll als 19 nt-3 "Adapter und 24 nt-3" Adapter Größe Marker werden zur Verfügung gestellt. Alle DNA- und RNA-Oligonukleotide wurden kommerziell erworben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Seite Reinigung der Barcode RNA Proben 3'. Nach der Zusammenlegung und Fällung 18 Barcode RNA-Proben, die resuspendierte RNA-Pellet wird migriert und getrennt durch Elektrophorese auf einem 15 % Acrylamid gel (siehe auch 8). Das rote Quadrat markiert den Bereich mit den 3' Barcode Micro-RNAs, die mit einer Skalpellklinge herausgeschnitten und in einem Nuklease-freie silikonisierte Microcentrifuge Schlauch übertragen wurde. Insgesamt vier Brunnen mit zwei mit den 19 nt-3 "Adapter und zwei mit den 24 nt-3" war Adapterset gut Weg, auf jeder Seite der Bibliothek (siehe Brunnen 5, 6 und 10, 11, beziehungsweise). Als Test für die T4-RNA-Ligase 1 und für die Reinigung der aufgespaltenen Größe Marker werden abgeschlossen, am nächsten Tag, Ligation Reaktionen mit den 19 nt-3 "Adapter Größe Marker mit dem 5'-Adapter und die 24 nt-3" Adapter Größe Marker mit dem 5'-Adapter wurden in Brunnen 2 laufen ein d 3, beziehungsweise. Die gelben Quadrate zeigen die ausgeschnittenen Bands aus der aufgespaltenen Größe Marker RNA-Oligonukleotide mit dem 5'-Adapter. Diese Bands sind gereinigt, ausgefällt und während auf 12 % Seite Reinigung laufen (siehe Abbildung 3 ). Brunnen 1 und 13 enthalten die 20 nt Größe Leiter, die halfen, die erwarteten Größen der aufgespaltenen Produkte bestätigen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Seite Reinigung der gereinigten Bibliothek nach der Unterbindung des Adapters 5'. Die gereinigte RNA-Bibliothek wurde mit dem 5'-Adapter ligiert und die erwarteten Produktgröße wurde von 12 % herausgeschnitten Seite mit der aufgespaltenen Größe-Markern (siehe rotes Quadrat). Die Produkte der T4 RNA grundsätzlich zwischen den 19 nt-3 "Adapter und die 5' (Brunnen 4 und 9) und zwischen den 24 nt-3" Adapter und die 5' (Brunnen, 5 und 10) waren laufen parallel auf jeder Seite, die gut mit der RNA-Bibliothek. Die höchsten Bands (siehe weiße Sternchen) sind die Produkte von der 5'-Adapter Ligatur und verwendet als Leitfaden für die Gel-Band-Exzision mit 5' Adapter ligiert RNA-Bibliothek. Die Ligatur Größe Marker Ligatur Produkte auf der vorherigen Seite gereinigt werden in gut 3 ausgeführt. Wie im Brunnen 1 und 12 feststellte, war 20 nt Größe Leiter führen auch nach der erwarteten Größe der RNA-Bibliothek zu validieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Pilot PCR und großflächige Verstärkung der cDNA Bibliothek. Die Größe und das Verhältnis der PCR-Produkte wurden auf einem 2,5 % Agarose-Gel in Anwesenheit von Interkalation Bromid ausgewertet. (A) nach der reversen Transkription der RNA Barcode Bibliothek, ein Aliquot der cDNA Bibliothek verstärkt wurde mit Hilfe der PCR-Primer 5' und 3' in einer einzigen Piloten PCR-Reaktion. Aliquote der pilot PCR-Reaktionen wurden bei 10, 12, 14, 16, 18 und 20 Zyklen und wanderten auf einem 2,5 % Agarosegel. Wie zwischen 1 und 7 Brunnen zu beobachten, war die Präsenz von cDNA-Bibliothek und Adapter-Dimere exponentiell zu beobachten (siehe grüne Rechtecke). Für diese Bibliothek wurde die PCR-Zyklus für die Verstärkung der cDNA Bibliothek ausgewählt 15. (B) dieser Schaltplan zeigt die Position und die Länge der verschiedenen Oligonukleotiden und die daraus resultierende RNA und DNA-Produkte, die auf die Seite und Agarose Gele erkennbar sind. (C) Aliquote der 6 großen PCR-Reaktionen (in Agekennzeichnet) analysierte separat auf einem 2,5 % Agarose-gel (siehe Brunnen 3 bis 8). Die zwei Arten der PCR-Produkte, sind nämlich die Bibliothek (obere Band) und der Primer Dimere (unterband) auf dieses Gel (siehe grüne Rechtecke) sichtbar. Die leere PCR-Reaktion ohne cDNA zeigt keine PCR-Amplifikation (siehe auch 2). Die 20 nt Größe Leiter ermöglicht die Überprüfung der Produkt-Größen (siehe auch 1). (D) Gel Bild auf einem blauen Licht Transilluminator von 2,5 % Agarose-gel, enthält die gepoolten PCR-Reaktionen lief in zwei benachbarten Brunnen. Wie beobachtet, ist die höchste Band in beiden Brunnen innerhalb der erwarteten bibliotheksgröße und die Adapter Dimer Band befindet sich unterhalb. Die oberen PCR-Bänder wurden ausgeschnitten und mit einem Gel Extraction Kit gereinigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Bewertung der gereinigten PCR verstärkt DNA Bibliothek. Eine kleine aliquoten (1 µL) der PCR amplifizierten cDNA Bibliothek wird analysiert, mit einer hohen Empfindlichkeit DNA-Chip auf eine Mikrofluidik-basierte Plattform. (A) dieses Panel zeigt die Migration der Größe Marker für die Kalibrierung des Instrumentes. (B) dieses Panel zeigt die Migration der gereinigten PCR amplifizierten cDNA Bibliothek. Der höchste Berg misst man bei einer Größe von 100 bp (siehe Sternchen) und vertritt die cDNA-Bibliothek. Die kleine Spitze bewertet bei 72 bp durch das Instrument stellt die Grundierung Adapter Dimere. Die 100 bp-Spitze erkannt von Mikrofluidik basierte Plattform zeigt die geschätzte Größe für die verstärkte cDNA-Bibliothek, enthält 18 individuelle Barcodes RNA-Proben für nachfolgende NGS auf einem Hochdurchsatz-Sequenzierung System. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: cDNA Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung der nächsten Generation mit frisch gefrorenen und Formalin fixiert Paraffin eingebettete Proben abgestimmt. (A) Gesamt-RNS extrahiert aus abgestimmt frisch eingefroren und FFPE invasives Duktales Karzinom (IDC) Tumoren wurde auf einem total RNA-Chip auf einer Plattform basierte Mikrofluidik analysiert. (B) Gesamt-RNS aus aufeinander abgestimmten frisch eingefroren und FFPE-Proben (IBC-1 und IBC2) erfuhr das cDNA-Bibliothek-Vorbereitung-Protokoll und die MiRNA Sequenzierungsdaten aufgetragen wurden. (C) DifferentialmiRNA Ausdruck zwischen IBC1/IBC2 Exemplare und Korrelation zwischen eingefroren und FFPE gepaart Proben. MiRNA Ausdruck wird im Protokoll die Anzahl pro million (CPM), von hoch bis niedrig liest (von rot nach blau Farbe). Die Bedeutung der Ausdruck Differenz zwischen den beiden Gewebe Paaren pro MiRNA, erscheint durch die grauen Kreise mit hohen und niedrigen Ausdruck MiRNAs in frischen und FFPE-Proben ermittelt. (D) Gesamt-RNS aus aufeinander abgestimmten frisch und FFPE RNA-Proben von Zelle Linien (MCF10A und MCF7), menschliche invasivem Brustkrebs Krebs (IBC-1 und IBC2), zervikale Brustgewebe (Cx), extrahiert archiviert normalen Brustgewebe (normale Br1, normale Br2 und normale Br-3) und Archivierte invasiven Brustkrebs (IBC 5, IBC 6 und IBC7) wurde die cDNA Bibliothek Vorbereitung innerhalb der gleichen Flucht. Die NGS-Daten von der MiRNAs nachgewiesen in den Bibliotheken sind in einer Heatmap Konfiguration angezeigt. Diese Zahl wurde von Loudig Et Al. modifiziert 20 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: cDNA Bibliothek Vorbereitung und MiRNA Ausdruck Korrelation zwischen Wiederholungen mit älteren archiviert FFPE-Proben. Gesamt-RNS von 18, 20, 22, 27, 30 und 35 Jahre alte archivierte FFPE Brust Gewebemustern erfuhr unsere optimierte cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll. Replicate RNA-Proben aus 9 verschiedenen FFPE-Proben wurden mit verschiedenen 3' Barcode Oligonukleotiden ligiert und innerhalb derselben Bibliothek in Woche 1 (w1) analysiert. Das gleiche Experiment wurde in einem Intervall von 1 Woche (Woche 2 oder w2) wiederholt. Reproduzierbarkeit Maßnahmen von duplizierten MiRNA Daten zwischen den gleichen Archivierte RNA-Proben erscheinen in der Heatmaps und mit Korrelationskoeffizienten zwischen 0,93 und 0,99 ausgewertet. Diese Zahl wurde von Loudig Et Al. modifiziert 20 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Ein hoch reproduzierbare und robuste cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll für NGS der kleinen RNAs in FFPE RNA-Proben archiviert wird in diesem Protokoll dargestellt, der eine modifizierte und optimierte Version des Verfahrens von Hafner Et Al. beschrieben ist 22

Alle Schritte dieses Protokolls wurden für den Einsatz mit älteren archiviert und kompromittierten Gesamt-RNS erholt aus FFPE-Proben optimiert. Der entscheidende Schritt dieses Protokolls für die Verarbeitung von Kleinmengen FFPE RNA, befindet sich in der Bündelung aller RNA-Proben (d.h. 18 einzelnen 100 ng FFPE RNA-Proben) nach einzelnen grundsätzlich mit den 18 einzigartige 3' Barcode-Adaptern. Dieser wichtige Schritt ermöglicht 18 FFPE RNA-Proben alle nachfolgenden biochemischen und enzymatische notwendigen Schritte für die Vorbereitung der kleinen RNA cDNA Bibliothek einheitlich zu unterziehen. Darüber hinaus dadurch maximiert die Menge an RNA in der Niederschläge und Gel-Reinigungen, indem der Träger Wirkung von kleinen RNA-Molekülen und erleichtert pellet-Beobachtung und gel-Auswahl. Ein weiteres wesentliches Merkmal dieses Protokolls, die weiter unterstreicht seine Vielseitigkeit bei der Arbeit mit geringen Mengen an FFPE RNA, ist, dass eine pilot PCR-Reaktion verwendet wird, um die optimale Verstärkung Zyklus der cDNA Bibliothek zu identifizieren. Dieser Schritt bietet auch Einblicke in die Dynamik der Bibliothek Verstärkung versus Grundierung Dimer Verstärkung, die entscheidend ist bei der Vorbereitung der großen PCR-Reaktion und die Reinigung der kleinen RNA-Bibliothek auf die Agarose-gel. Die Daten hinzugefügt, um dieses Protokoll zeigen die Reproduzierbarkeit dieser Ansatz zwischen abgestimmt gefrorenen und FFPE-Proben und auch Highlight seiner Anwendbarkeit auf ältere FFPE-RNA aus Proben Proben für bis zu 35 Jahren archiviert.

Dieses Protokoll wurde von seiner ursprünglichen Version geändert, so dass es und für die Zubereitung von kleinen RNA-Bibliotheken aus geringer Qualität und Quantität des Chemisch modifizierte und kompromittierten FFPE-RNA hergestellt optimiert. Ein Aspekt dieses Verfahrens, die geändert wurde, um erfolgreich verbinden und verstärken von kleinen RNAs aus FFPE-Proben bezieht sich auf die Höhe des Kalibrators cocktail versetzt während der ersten 3' Barcode Adapter Ligatur, für die Eingabe auf 0.026 reduziert nM zu verhindern Wettbewerb mit der Ligatur der niedrigen more präsentieren kleine RNAs in FFPE RNA-Proben. Eine weitere wichtige Änderung des ursprünglichen Verfahrens war die Entfernung aller radioaktiv markierte Größe-Marker verwendet, bei der Auswahl der aufgespaltenen kleinen RNAs auf die Seite-Gele. Verwendung dieser radioaktiven Marker-Größe beschränkt nicht nur die Anwendbarkeit dieses Ansatzes Labors zertifiziert für den Einsatz von Radio-Isotopen aber auch verhindert Beobachtung der RNA-Produkte auf die Gele. Stattdessen werden in diesem optimierten Protokoll Größe Marker in Brunnen neben der Bibliothek, auf der Seite Gel laufen und direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff Exzision der aufgespaltenen kleine RNAs direkt visualisiert. Wichtig ist, ist der Fluoreszenzfarbstoff leicht besprüht auf dem Gel, Verbreitung der RNA-Produkte zu verhindern und dann auf ein blaues Licht-Box visualisiert. Anschließend als Maßnahme der Vorsorge und Verbesserung der Diffusion von der aufgespaltenen kleine RNAs in den ausgeschnittenen Seite Gel-Fragmente enthalten sind Gel-Breaker Rohre verwendet, um das Gel vor der Inkubation in einer NaCl-Lösung über Nacht bei 4 ° C unter Rühren gleichmäßig zu vernichten. Alle diese Schritte wurden sorgfältig ausgewertet, um mit kleineren Mengen an Material zu arbeiten.

Dieses Protokoll wurde auf Proteinkinase RNA-Proben aus verschiedenen Quellen (Organe und Institutionen) angewendet, die unterschiedlich lange aufbewahrt wurden. Die Analysen zeigten die hohe Reproduzierbarkeit der Sequenzierung kleinen RNAs von frischen und gefrorenen Proben, wenn mit diesem Verfahren optimiert. Zusätzliche Analysen mittels ältere Archivierte FFPE-Proben, bis zu 35 Jahre lang aufbewahrt demonstriert weiter das Protokoll breite Anwendbarkeit in klinischen Proben. Die Proteinkinase RNA Eingabe Mindestanforderung für FFPE-Proben zeigte sich 100 ng. Diese niedrige Anforderung ermöglicht die Anwendbarkeit dieses Protokolls zu einer Vielzahl von Läsionen in verschiedenen Größen und Verfügbarkeit, aber es würde nicht erlauben, die Analyse der einzelnen Zelle FFPE-RNA. Wichtig zu beachten ist jedoch, dass das Protokoll optimiert ist auch verwendet worden mit Gesamt-RNS extrahiert aus zirkulierenden exosomen mit Eingängen von weniger als 1 ng und gezeigt, dass um hoch reproduzierbare kleine RNA expressionsprofile (Daten nicht gezeigt) zu bieten. Diese low-Input schlägt vor, dass kleine RNAs in FFPE-Proben, obwohl repräsentativ für das ursprüngliche frische Gewebe in viel geringeren Proportionen als in Gesamt-RNS von zirkulierenden exosomen vorhanden sind.

In den letzten Arbeiten, wo dieses optimierte Protokoll auf klinisch klassifizierte DCIS FFPE-Proben angewendet wurde, ergab, dass MiRNA Ausdruck Unterschiede von NGS der cDNA Bibliothek identifiziert durch quantitative PCR überprüft werden konnte. Dieser Arbeit gezeigt, die Machbarkeit der Verwendung von DCIS Läsionen von archivierten Gewebe aus verschiedenen Institutionen für groß angelegte Retrospektive Studien [20]. Diese Studie zeigte auch die Robustheit der cDNA Bibliothek Vorbereitung wenn zu unterschiedlichen Zeiten (in Abständen von mehreren Wochen) durchgeführt, ohne Kompromisse bei der Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit des Tests.

Angesichts der riesigen Menge von klinisch klassifizierte Archivierte FFPE-Proben bietet dieses optimierte Protokoll ein robustes Werkzeug für Herstellung von cDNA-Bibliotheken in groß angelegte retrospektive Analysen und der möglichen Identifizierung von Biomarkern miRNA im Zusammenhang mit Krebs Entwicklung21.

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Disclosures

Die Autoren Wünsche offen zu legen, dass eine Publikation enthält einige der Daten in dieser Handschrift von Loudig Et Al. International Journal of Molecular Sciences veröffentlicht wurde 21.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Thomas Tuschl, Leiter des Labors für Molekulare Biologie der RNA sowie Mitglieder von seinem Labor für ihre Unterstützung und für die gemeinsame Nutzung der Technologie entwickelt in seinem Labor und Zugriff auf die RNAworld-Pipeline. Wir danken auch Dr. Markus Hafner für sharing sein Protokoll und detaillierte Beschreibungen über alle biochemischen und enzymatische Schritte in seine ursprüngliche Verfahren verwendet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

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References

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