माजी Utero Electroporation और Organotypic स्लाइस भ्रूण माउस दिमाग के लाइव के लिए संस्कृतियों-GABAergic न्यूरॉन्स पलायन की इमेजिंग

Neuroscience

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Summary

यहां, हम एक कम लागत और विश्वसनीय विधि प्रदान करने के लिए electroporated मस्तिष्क organotypic के लिए उपयुक्त फोकल माइक्रोस्कोपी और लाइव इमेजिंग तकनीक के लिए उचित भ्रूण से स्लाइस संस्कृतियों ।

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Eid, L., Lachance, M., Hickson, G., Rossignol, E. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons. J. Vis. Exp. (134), e57526, doi:10.3791/57526 (2018).

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Abstract

GABAergic न्यूरॉन्स (INs) न्यूरॉन नेटवर्क के महत्वपूर्ण घटक है कि ड्राइव अनुभूति और व्यवहार कर रहे हैं । आईएनएस प्रांतस्था को आबाद करने के लिए किस्मत में ventral telencephalon में मूल के अपने स्थान से tangentially प्रवास (औसत दर्जे का और caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) आंतरिक और cortical की एक किस्म के जवाब में पृष्ठीय बाह्य प्लेट को शामिल Cues. विभिंन तरीकों से वर्षों में विकसित किया गया है आनुवंशिक रूप से विशिष्ट रास्ते में हेरफेर और जांच कैसे वे गतिशील cytoskeletal प्रवास में उचित के लिए आवश्यक परिवर्तन को विनियमित । utero में electroporation बड़े पैमाने पर किया गया है जीन दमन या उपप्रकार में विशिष्ट में व्यक्त के प्रभाव का अध्ययन करते हुए आकृति विज्ञान और अंतिम स्थिति पर प्रभाव का आकलन । हालांकि, इस दृष्टिकोण आसानी से करने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि, यह और अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, जब यह लक्ष्य INs को लक्षित करने के लिए संशोधित करने के लिए । utero electroporation एक कम पिल्ले की कमी जीवित रहने की दर दी उपज उत्पंन करता है जब electroporation ई 14.5 से पहले आयोजित किया जाता है, के रूप में जब MGE का अध्ययन-INs व्युत्पंन कस्टम है । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में, MGE explants MGE करने के लिए आसान पहुँच प्रदान करते हैं और आनुवंशिक रूप से संशोधित आईएनएस के इमेजिंग की सुविधा. हालांकि, इन explants में, INs एक कृत्रिम मैट्रिक्स, अंतर्जात मार्गदर्शन cues और thalamic आदानों से रहित में स्थानांतरित । यह हमें प्रेरित करने के लिए एक तरीका है जहां भारतीय नौसेना पोत एक अधिक प्राकृतिक वातावरण में माइग्रेट कर सकते है अनुकूलन, जबकि utero दृष्टिकोण में की तकनीकी चुनौतियों को दरकिनार । इस पत्र में, हम भ्रूण माउस के पूर्व utero electroporation के संयोजन का वर्णन organotypic टुकड़ा संस्कृतियों के बाद आसानी से ट्रैक करने के लिए, छवि और आनुवंशिक रूप से संशोधित INs के जवाब में उनके प्राकृतिक रास्तों के साथ पलायन पुनर्निर्माण अंतर्जात cues । यह दृष्टिकोण दोनों समय के साथ प्रवास में गतिशील पहलुओं के ठहराव के लिए अनुमति देता है चूक फोकल इमेजिंग, के रूप में अच्छी तरह के रूप में विभिंन रूपात्मक तय immunolabeled ऊतक पर ंयूरॉन पुनर्निर्माण का उपयोग मापदंडों का विस्तृत विश्लेषण ।

Introduction

Cortical GABAergic न्यूरॉन्स (INs) के साथ विविध रहे है उनके जैव रासायनिक गुण, शारीरिक गुण और संपर्क करने का संबंध है, और वे परिपक्व नेटवर्क में विभिंन कार्यों मध्यस्थता1,2,3 ,4,5. cortical INs के विभिंन उपप्रकार के विनिर्देशन कसकर आनुवंशिक व्यापक है कि बड़े पैमाने पर1,2अध्ययन किया गया है के माध्यम से विनियमित है । cortical GABAergic INs के बहुमत (७०%) औसत दर्जे का ganglionic उभार (MGE), एक ventrally स्थित भ्रूण संरचना में progenitors से उत्पंन, और अपेक्षाकृत लंबी दूरी के पार माइग्रेट करने के लिए cortical प्लेट1तक पहुंचने चाहिए, 2 , 6. जबकि cortical पिरामिडीय कोशिकाओं रेडियल glia पाड़ के साथ cortical प्लेट के लिए वेंट्रिकुलर जोन (VZ) से रेडियल विस्थापित, भारतीय नौसेना पोत, जो इस तरह के एक पाड़ से जुड़े नहीं हैं के स्पर्श प्रवास, आंतरिक की एक किस्म की आवश्यकता है और बाह्य cues cortical प्लेट की ओर माइग्रेट ंयूरॉंस को आकर्षित करने के लिए, जबकि उंहें गैर से दूर मार्गदर्शक-cortical संरचनाओं2,7,8। सेल चक्र से बाहर निकलने के बाद, भारतीय नौसेना पोत MGE से chemo-प्रतिकारक MGE है, जो cortical प्लेट9,10की दिशा में स्पर्श प्रवास ट्रिगर के भीतर व्यक्त cues द्वारा पुनः चालित कर रहे हैं । माइग्रेट इन्स विभिन्न प्रतिकारक cues की सहायता से striatum से बचने11 और, cortical प्लेट तक पहुंचने के बाद, वे एक स्पर्श से एक रेडियल माइग्रेशन मोड में स्विच और उनके अंतिम लामिना स्थिति तक पहुँचने, आंशिक रूप से पिरामिड से cues के जवाब में कोशिकाओं12 और अंय सेलुलर आबादी13। भारतीय नौसेना पोत के प्रवास के रूप में अंय ंयूरॉन आबादी के लिए, विभिंन गतिशील रूपात्मक परिवर्तन शामिल है के लिए वास्तविक आंदोलन की अनुमति ंयूरॉन । यह तथाकथित न्यूरॉनी गतिवान तीन क्रमिक चरणों के दोहराव चक्र की विशेषता है: एक अग्रणी प्रक्रिया के बढ़ाव, नाभिक (nucleokinesis) के एक सक्रिय anterograde गति, और पीछे की प्रक्रिया14के पुनर्कर्षण... प्रवास में कई आंतरिक और बाह्य cues कि ड्राइव शाखा और सक्रिय अग्रणी प्रक्रिया के remodeling के लिए उचित दिशा में INs गाइड द्वारा विनियमित है, दोनों अभिविंयास और प्रवासन की गति का निर्धारण14,15 ,16.

माइग्रेशन में cortical को विनियमित करने वाले निर्धारकों को हाल के वर्षों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है1,2,7,17,18,19,20, और इन आणविक अभिनेताओं में से कुछ में व्यवधान neurodevelopmental विकारों के लिए नेतृत्व माने गया है, जैसे बाल चिकित्सा दुर्दम्य मिर्गी या autism स्पेक्ट्रम विकारों1,2,21, 22 , 23 , 24. इसलिए, विभिंन विट्रो में और vivo दृष्टिकोण में के विकास के लिए काफी हमारे इस गतिशील प्रक्रिया का अध्ययन करने की क्षमता अग्रिम के रूप में पहले25की समीक्षा की है पीछा किया गया है । इन विट्रो विधियों में , Boyden चैंबर परख और धारी पसंद परख सहित, आवश्यकता और कोशिका का आकलन करने का सबसे तेजी से reproducible साधन प्रदान करने के लिए, विशिष्ट जीन या प्रोटीन के ंयूरॉन प्रवास के दौरान स्वायत्त प्रभाव, अंय कारकों के प्रभाव के बिना25। इन परख विशेष रूप से उपयोगी है जब रहते है इमेजिंग8,26,27के साथ संयुक्त । इन तकनीकों के साथ, INs आसानी से ई 13.5 MGE से प्राप्त कर रहे है और एंजाइमी और यांत्रिक पृथक्करण द्वारा पृथक है, जिसके बाद अलग संकेतन रास्ते और मार्गदर्शन cues जांच की जा सकती है, जैसा कि पहले सचित्र8,28 . हालांकि, इन परख तीन आयामी ऊतक वास्तुकला के अभाव में एक कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स में जगह ले, जो न्यूरॉन व्यवहार और कोशिका संपत्तियों को बदल सकते हैं, संभावित सेल प्रवास को प्रभावित करने और/या अस्तित्व25। इन सीमाओं को दरकिनार, पूर्व vivo MGE explants एक वैकल्पिक उपकरण के रूप में गति और अभिविंयास14के रूप में मानकों के साथ साथ प्रवास के दौरान होने वाली गतिशील रूपात्मक परिवर्तन मात्रा के रूप में विकसित किया गया है, 29. सृजन MGE explants अपेक्षाकृत सरल है और बड़े पैमाने पर30कहीं वर्णित किया गया है । यह मिश्रित cortical कोशिकाओं के एक monolayer पर या आकर्षक या प्रतिकारक cues25की उपस्थिति में matrigel और कोलेजन का एक मिश्रण में MGE के एक छोटे से निकालने की चढ़ाना जरूरत पर जोर देता है, हालांकि बाद31वैकल्पिक हैं । MGE explants की अनुमति विरल लेबल कोशिकाओं के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए, intracellular प्रक्रियाओं के अध्ययन को सरल बनाने, जैसे अग्रणी प्रक्रिया के दौरान remodeling cytoskeletal के रूप में, पहले दिखाए गए के रूप में३२,३३ ,३४ और वर्तमान अध्ययन में । MGE explants सफलतापूर्वक एक 2d वातावरण में प्रवास में के दौरान गतिशील cytoskeletal परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, उदाहरण के लिए विशिष्ट औषधीय या chemotactic जोड़तोड़ के बाद (देखें, उदाहरण के लिए, Tielens एट अल. २०१६३३) . हालांकि, इस दृष्टिकोण के साथ, INs एक कृत्रिम मैट्रिक्स के भीतर माइग्रेट, और यह व्यवहार और reproducibility और प्रयोगात्मक परिणामों के महत्व में बदल सकता है ।

इसके विपरीत, utero electroporation में अपने पैतृक पर्यावरण में भारतीय नौसेना पोत के आनुवंशिक हेरफेर सक्षम बनाता है और तेजी से और कुशलता से लाभ और जीन समारोह के नुकसान के प्रभाव का आकलन करते हुए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है की सीमाओं को दरकिनार महंगा और समय लेने वाली नॉकआउट और दस्तक-रणनीतियों में25,३५utero electroporation में सेल प्रकार विशिष्ट प्रवर्तकों का उपयोग करके और MGE३६सहित ventromedial संरचनाओं की ओर इलेक्ट्रोड की स्थिति द्वारा progenitors में प्रति पक्षपाती किया जा सकता है । इसके अलावा, utero electroporation में 1-2 दिनों के भीतर प्रयोगात्मक constructs के समय पर अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है, के रूप में 7-10वायरल वैक्टर 25 का उपयोग कर अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक दिनों की तुलना में । हालांकि, में progenitors के utero electroporation में कम उपज हो जाता है । दरअसल, यद्यपि पृष्ठीय वेंट्रिकुलर क्षेत्र में स्थित हवामहल कोशिका progenitors को कुशलता से transfected utero electroporation में प्रयोग किया जा सकता है, अधिक ventrally स्थित संरचनाओं को लक्षित करना, जैसे MGE, अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से छोटे ई 13.5 भ्रूण में, और भ्रूण घातकता की उच्च दर आगे प्रयोगात्मक उपज25कम कर देता है ।

के साथ जुड़े कुछ तकनीकी सीमाओं को दरकिनार इन विट्रो MGE explant प्रयोगों और vivo in utero electroporation, ex vivo organotypic स्लाइस संस्कृतियों8विकसित किया गया है,३७, ३८,३९. मस्तिष्क organotypic स्लाइस संस्कृतियों vivo परिस्थितियों में नकल उतार का लाभ प्रदान करते हैं, जबकि कम खर्चीला और समय लेने वाले पशु मॉडल25पैदा करने की तुलना में जा रहा है । वास्तव में, इन तैयारियों MGE के लिए एक आसान पहुंच की अनुमति, के साथ भारतीय नौसेना पोत के विशिष्ट दृश्य के साथ, और फोकल electroporation के साथ संयुक्त आईएनएस में विशिष्ट आणविक रास्ते की जांच करने के लिए एक और अधिक शारीरिक वातावरण में पलायन कर सकते है8 , ३९ , ४० , ४१. हम इसलिए organotypic संस्कृतियों के लिए एक दृष्टिकोण अनुकूलित किया है३८, जो हम पूर्व utero electroporation और समय चूक फोकल इमेजिंग के साथ संयुक्त, आगे रूपात्मक और गतिशील प्रक्रिया का आकलन करने के लिए होने वाली MGE के स्पर्श प्रवास के दौरान-INs । वर्तमान प्रोटोकॉल अनुकूलित और दूसरों को, जो पूर्व utero का इस्तेमाल किया है या utero मस्तिष्क electroporation और organotypic स्लाइस संस्कृतियों में पिरामिड कोशिकाओं४२,४३ के प्रवास का अध्ययन करने के लिए और cortical INs३६,३९,४४. विशेष रूप से, माउस भ्रूण decapitated है और MGE प्रयोगात्मक plasmids के संवहन इंजेक्शन के बाद electroporated पूर्व vivo है, की अनुमति देता है और अधिक कुशल और सटीक लक्ष्यीकरण से MGE progenitors से क्या हासिल किया जा सकता है मे utero electroporation । दिमाग तो निकाले जाते है और पूरे मस्तिष्क में खोदी जाती है राज्याभिषेक स्लाइस है कि कुछ दिनों के लिए संस्कृतिित किया जा सकता है, इस प्रकार लगातार ट्रैकिंग और transfected INs इमेजिंग की अनुमति । यह दृष्टिकोण आम तौर पर लेबल 5-20 tangentially मस्तिष्क टुकड़ा प्रति भारतीय नौसेना पोत माइग्रेट, प्रयोगात्मक पुनरावृत्तियों की संख्या को ंयूनतम सांख्यिकीय महत्व तक पहुंचने के लिए आवश्यक है, जबकि एक पर्याप्त रूप से विरल ंयूरॉंस जनसंख्या लेबलिंग की आसान जुदाई सुनिश्चित करने के लिए पुनर्निर्माण और ठीक रूपात्मक आकलन के लिए व्यक्तिगत ंयूरॉंस । इसके अलावा, MGE explants की तुलना में, organotypic संस्कृतियों यह सुनिश्चित करते है कि पलायन भारतीय नौसेना पोत स्थानीय रूप से गुप्त chemokines और thalamic afferents से आदानों सहित एक और अधिक प्राकृतिक वातावरण के संपर्क में हैं । इस दृष्टिकोण इस प्रकार अच्छी तरह से transfected आईएनएस द्वारा अपनाया दिशात्मकता और प्रवासी पथ का अंदाजा लगाने के लिए अनुकूल है, जबकि इस तरह के अग्रणी प्रक्रिया शाखाओं के रूप में बेहतर गतिशील प्रक्रियाओं के लक्षण वर्णन की अनुमति देने के लिए पर्याप्त संरचनात्मक विवरण की पेशकश, nucleokinesis और पीछे की प्रक्रिया त्याग ।

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Protocol

सभी जानवरों को शामिल प्रयोगों Comité Institutionnel डेस बॉन Pratiques avec लेस Animaux de सभ्य (CIBPAR) चू सैंटर-जस्टिन अनुसंधान केंद्र में और पशु देखभाल गाइड पर कनाडा परिषद के अनुसार आयोजित किए गए द्वारा अनुमोदित किया गया प्रयोगात्मक जानवरों की देखभाल और उपयोग (Ed .2) ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित भ्रूण दिवस (ई) १३.५ में electroporation के लिए अनुकूलित किया गया था, एक समय था जब MGE-व्युत्पंन ins सक्रिय रूप से उत्पंन कर रहे हैं, CGE के शिखर से पहले प्राप्त ins उत्पादन४५,४६। इसके अलावा, GABAergic ins के प्रति electroporation पूर्वाग्रह के लिए, हम एक प्रवर्तक चुनिंदा ins में व्यक्त का उपयोग करें (उदाहरण के लिए अपनी ंयूनतम बढ़ाने के साथ Dlx5/ प्रमोटर)४७

1. Electroporation और Organotypic स्लाइस संस्कृतियों के लिए समाधान की तैयारी

  1. बाँझ संस्कृति मध्यम के १२५ मिलीलीटर तैयार करें ।
    1. नियमित रूप से ंयूरॉन के १२५ मिलीलीटर-विशिष्ट संस्कृति मध्यम (देखें सामग्री की तालिका तैयार करने के लिए) एक पहले से यूवी निष्फल में एक निष्फल बोतल में बाँझ-सुरक्षा कैबिनेट ७०% इथेनॉल के साथ छिड़काव. 50x सीरम मुक्त ंयूरॉन विशेष पूरक के २.२५ मिलीलीटर, 200 मिमी glutamine के १.७५ मिलीलीटर (०.५ मिमी की अंतिम एकाग्रता) और गर्मी निष्क्रिय घोड़ा सीरम के ६.२५ मिलीलीटर जोड़ें पहले बाँझ शर्तों के तहत aliquoted । अच्छी तरह से मिलाएं, 15 मिलीलीटर बाँझ शंकु ट्यूबों में aliquot, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      नोट: तैयार कल्चर मीडियम को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 हफ्तों तक स्टोर किया जा सकता है ।
    2. Botteinstein के एन-2 निर्माण४८ में १५० µ l aliquots में बाँझ शर्तों के तहत एक 100X स्टॉक समाधान विभाजित करें और उपयोग तक-20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर ।
  2. बाँझ कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) के 1 L तैयार करें ।
    1. 1 L चोंच में आसुत जल के ८०० मिलीलीटर उपाय । सोडियम क्लोराइड (NaCl) के सुक्रोज, ५.०८ ग्राम के २५.६७ ग्राम जोड़ें, सोडियम बिकारबोनिट की २.१८ ग्राम (NaHCO3), १.८० ग्राम ग्लूकोज की, ०.१९ ग्राम पोटेशियम क्लोराइड (KCl), ०.१५ ग्राम के monobasic निर्जल सोडियम फॉस्फेट (णः2पीओ4), 1m स्टॉक CaCl2 की 1 मिलीलीटर . 2H2o और 2 मि. 1m स्टॉक MgSO4. 7H2ओ. कमरे के तापमान पर भंग करने के लिए हलचल । आसुत जल जोड़ें 1 एल की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए ।
    2. एक ०.२२ µm फ़िल्टर का उपयोग करना, एक बाँझ की बोतल में एक निष्फल सुरक्षा कैबिनेट में समाधान फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 1 महीने.
  3. प्रत्येक प्रयोग से पहले ACSF में 4% agarose का एक ताजा समाधान तैयार करें ।
    1. एक ५० मिलीलीटर बाँझ शंकु ट्यूब में पहले से तैयार ACSF के 25 मिलीलीटर उपाय और कम पिघलने बिंदु agarose के 1 जी जोड़ें ।
    2. एक माइक्रोवेव ओवन में ४५ एस के लिए हीट । से बचने के लिए, हर 3-4 जब उबलते शुरू होता है हीटिंग बाधा, दबाव से बाहर जाने के लिए ट्यूब खोलने, यह फिर से बंद करो और agarose मिश्रण करने के लिए मैंयुअल रूप से आंदोलन । जब तक agarose समाधान सजातीय है दोहराएं । solidification से बचने के लिए प्रयोग के शेष के दौरान ४२ ° c पर agarose समाधान रखें ।
      नोट: उच्च तापमान मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान होगा ।

2. इंजेक्शन के लिए Plasmids की तैयारी

  1. एक गिलास microinjection पिपेट खींचो
    1. उचित मापदंडों के साथ micropipette खींचने सेट, प्रदान की अंतरिक्ष में कांच केशिका सुरक्षित और यह रेशा के साथ केंद्रित है सुनिश्चित करें ।
    2. पुल बटन दबाएँ.
    3. ध्यान से एक बॉक्स या साफ पेट्री डिश में गर्मी खींचने और जगह से नए बनाया microinjection पिपेट दूर करने के लिए टिप हानिकारक से बचने के लिए उपयोग करें ।
  2. इस प्रयोग के लिए आवश्यक सभी उपकरणों के साथ सेट अप-अप सुरक्षा कैबिनेट ( चित्र 1aदेखें), उदारता से ७०% इथेनॉल के साथ सुरक्षा के मंत्रिमंडल में सभी उपकरणों का स्प्रे और 15-20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ उपकरणों और पर्यावरण को निष्फल ।
  3. नसबंदी कदम के दौरान, बर्फ पर गल plasmids (4 डिग्री सेल्सियस) ।
  4. एक साफ १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में एक शेयर समाधान (4 µ जी/µ एल) से प्लाज्मिड के 10 µ एल उपाय । तेजी से हरी FCF के ०.०१% जोड़ें । धीरे से मिक्स, संक्षेप में स्पिन और उपयोग जब तक बर्फ पर रखो ।
    नोट: मैक्सी-तैयारी डीएनए एक endotoxin मुक्त मैक्सी-तैयारी किट का उपयोग कर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए । DNA को ते बफर या nuclease-फ्री एच2ओ में solubilized किया जा सकता है और डाई सॉल्यूशन के साथ प्लाज्मिड की तैयारी कर सकते हैं, लेकिन बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन करने की जरूरत नहीं है । मैक्सी-प्रस्तुतीकरण से Plasmids कई फ्रीज-गल चक्र से बचने के लिए aliquoted होना चाहिए । Aliquoted plasmids रंग के साथ मिलाया जाना चाहिए नहीं है कि 2 उपयोग से पहले एच और आगे उपयोग के लिए नहीं जम जाना चाहिए ।
  5. नसबंदी के बाद नैनो इंजेक्टर को निम्नानुसार तैयार करें ।
    1. एक साफ बॉक्स या पेट्री पकवान में संग्रहीत पहले से तैयार कांच microinjection पिपेट में से एक का चयन करें और मोटे तौर पर 15 µm के एक बाहरी व्यास को प्राप्त करने के लिए एक बेवल तरीके में पिपेट की नोक में कटौती करने के लिए छोटे चिमटी का उपयोग ।
      नोट: बाहरी व्यास यहां दिया एक अनुमानित उपाय करने के लिए उपयोगकर्ता क्या हम अपने प्रयोगों में उपयोग की एक विचार दे रहा है और आदेश में मस्तिष्क को नुकसान पहुँचाए बिना प्लाज्मिड इंजेक्शन के लिए खोपड़ी के भेदी की सुविधा के लिए अनुकूलित किया गया है, जबकि तरल पदार्थ के लिए अनुमति लोड हो रहा है और डीएनए की रिहाई । बाहरी व्यास एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत एक micrometric पैमाने बार करने के लिए कांच microinjection पिपेट apposed के कट टिप को देखकर मापा जा सकता है.
    2. एक सिरिंज का उपयोग करने के लिए अपनी खींचा अंत से खनिज तेल के साथ micropipette भरने (सभी हवा निष्कासित) ।
    3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए भरे हुए ग् micropipette को नैनो इंजेक्टर में डालें ।
    4. गिलास micropipette (हवा प्रवेश को रोकने के लिए पर्याप्त तेल रखने) के 3rds खाली 2/
  6. ध्यान से प्लाज्मिड/डाई समाधान युक्त ट्यूब में तैयार micropipette डालने और प्लाज्मिड/डाई समाधान के साथ कांच micropipette भरें ।

3. गर्भवती महिलाओं से माउस भ्रूण का संग्रह

  1. निगरानी प्रजनन महिलाओं दैनिक योनि plugging के लिए आकलन करने के लिए, अधिमानतः एक ही समय में दैनिक (जल्दी दोपहर) । दिन ई 0.5 पहले दिन से मेल खाती है जब एक योनि प्लग मनाया जाता है ।
    नोट: यहां वर्णित प्रयोगों जंगली प्रकार चूहों में आयोजित किया जा सकता है । हालांकि, MGE की पहचान को सुविधाजनक बनाने के लिए और सभी GABAergic भारतीय नौसेना पोत (या MGE-व्युत्पन्न आईएनएस जैसे विशिष्ट उप-सेट्स) को लेबल करने के लिए, ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग किया जा सकता है (उदा.: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre Cre-रिपोर्टर एलील, आदि४७,४९) के साथ । इस स्थिति में, प्रयोगात्मक प्लाज्मिड इंजेक्शन एक और fluorophore (उदाहरण के लिए mCherry या TdTomato) व्यक्त करने के लिए transfected भारतीय नौसेना पोत (पीला) है कि गैर transfected भारतीय नौसेना पोत (ग्रीन) के साथ तुलना की जा सकती के दृश्य की अनुमति चाहिए ।
  2. बलिदान भ्रूण दिवस ई 13.5 पर महिला, गर्दन अव्यवस्था से ।
    नोट: बलिदान के समय दिया संवेदनाहारी एजेंटों प्रवास और अस्तित्व५०,५१ में प्रभाव हो सकता है और बचा जाना चाहिए ।
  3. इस प्रकार के रूप में सी धारा द्वारा भ्रूण ले लीजिए ।
    1. उदारता से ७०% इथेनॉल के साथ महिला के पेट स्प्रे । पेट की त्वचा को निष्फल संदंश की एक जोड़ी के साथ ऊपर खींचो और, दूसरे हाथ से, त्वचा को पेट से काटने के लिए निष्फल शल्य कैंची का उपयोग करें ।
    2. निष्फल संदंश और कैंची की एक दूसरी जोड़ी के साथ, उदर प्रावरणी ऊपर खींच और ध्यान से गर्भाशय से परहेज करते हुए इसे काट ।
    3. निष्फल संदंश और कैंची की एक तीसरी जोड़ी का उपयोग करना, गर्भाशय सींग खींच और उंहें श्रोणि गुहा के बाहर काट । एक बाँझ ६०-mm पेट्री तंत्रिका आधारित संस्कृति माध्यम से भरे डिश में विच्छेदित गर्भाशय सींग प्लेस एमिनो एसिड, विटामिन और अकार्बनिक लवण के साथ पूरक ( सामग्री की तालिका व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पाद के लिए देखें) ।
  4. एक बाँझ सुरक्षा कैबिनेट में, ठीक चिमटी के दो जोड़े का उपयोग करें (प्रत्येक हाथ में एक) काटना के भ्रूण को अपरा से बाहर और decapitation द्वारा सिर को अलग ।
  5. बेवल-एक बाँझ 3 मिलीलीटर प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट की नोक कट, सिर महाप्राण और एक नया बाँझ ६० मिमी पेट्री डिश जम काले मोम के साथ स्तरित में स्थानांतरण और ऊपर के रूप में एक ही तंत्रिका आधारित पूरक संस्कृति के माध्यम से भर ।
    नोट: यह चरण दूषित पदार्थों (माउस बाल, रक्त) के हस्तांतरण को कम करता है । काले मोम विच्छेदन के दौरान सिर को स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कल्चर मीडिया को इन प्रक्रियाओं के दौरान oxygenated होने की जरूरत नहीं है ।

4. संवहन प्लाज्मिड इंजेक्शन और पूर्व Vivo Electroporation of the MGE

नोट: निम्न चरणों का पालन पहले से तैयार की गई सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.

  1. प्लेस ६०-mm पेट्री डिश काले मोम के साथ स्तरित और तंत्रिका में decapitated सिर से युक्त संस्कृति माध्यम आधारित पूरक के साथ-साथ रक्षा मंत्रिमंडल में दूरबीन ।
  2. सिर स्थिर, बाएँ हाथ से ठीक चिमटी के साथ ठीक है, rostral भाग का सामना करना पड़ रहा है और सही हाथ में प्लाज्मिड/डाई समाधान के 1-2 µ एल इंजेक्षन करने के लिए दाईं ओर नैनो इंजेक्टर का उपयोग करें ।
    नोट: सह-अभिव्यक्ति प्रयोगों को सह-electroporating एक बचाव प्लाज्मिड और plasmids सांद्रता पर दोनों equimolar को मिलाकर एक shRNA-व्यक्त प्लाज्मिड द्वारा आयोजित किया जा सकता है.
  3. Electroporate ने इंजेक्शन मस्तिष्क को दिए ।
    1. सिर को पृष्ठीय और सिर के समानांतर और MGE को लक्षित करने के लिए सिर के ventral पक्ष की ओर सकारात्मक इलेक्ट्रोड तैनात नकारात्मक इलेक्ट्रोड के साथ इलेक्ट्रोड के बीच रखें.
    2. एक बार इलेक्ट्रोड अच्छी तरह से तैनात हैं, ५० ms के लिए ५०० ms अंतर-पल्स अंतराल में ४० वी के 4 वर्ग दालों उद्धार ।
    3. पहले से ही सुरक्षा कैबिनेट में रखा चिमटी का उपयोग कर इलेक्ट्रोड से किसी भी अवशिष्ट ऊतक निकालें ।
      नोट: इन मापदंडों हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया electroporator के लिए विशेष रूप से अनुकूलित किया गया है. हम अनुशंसा करते है कि उपयोगकर्ताओं को ऑप्टिमाइज़ परीक्षण पहले यदि electroporator का एक भिंन प्रकार का उपयोग करते हुए ।
    4. सभी शेष दिमाग के लिए चरण ४.१ ४.३ करने के लिए दोहराएँ ।
      नोट: हालांकि इस प्रोटोकॉल एक मस्तिष्क के लिए आवश्यक जोड़तोड़ का वर्णन करता है, यह संभव है 4 दिमाग के लिए एक मस्तिष्क electroporating से पहले अनुक्रमिक, इस प्रकार उपज में वृद्धि । यह रणनीति विशेष रूप से लाभप्रद है जब 2 या अधिक अलग plasmids क्रमिक रूप से इंजेक्ट कर रहे है (जैसे नियंत्रण या प्रयोगात्मक प्लाज्मिड) एक ही प्रयोग के दौरान (littermates के बीच तुलना के लिए अनुमति) । इसके अलावा, यह इंजेक्षन करने के लिए संभव है और मस्तिष्क के दोनों पक्षों के एक साथ electroporate उपज को बढ़ाने के लिए, स्थिति से इलेक्ट्रोड पूरी तरह से मस्तिष्क की सतह के समानांतर.

5. मस्तिष्क विच्छेदन और Organotypic स्लाइस संस्कृतियों

  1. हालांकि अभी भी काटना के बाँझ वातावरण में हेरफेर, खोपड़ी के मस्तिष्क से बाहर है ।
    1. ध्यान से मस्तिष्क से परहेज करते हुए प्रत्येक आँख में एक सुई डालने के द्वारा काले मोम की परत पर सिर को स्थिर.
    2. गर्दन और ठीक चिमटी की एक दूसरी जोड़ी के बाईं ओर पकड़ करने के लिए ठीक चिमटी की एक जोड़ी का प्रयोग करें खोपड़ी से त्वचा आंसू, वापस सामने से ।
    3. जबकि एक हाथ में चिमटी के साथ बाद में सिर पकड़े, दूसरे हाथ में चिमटी की एक और जोड़ी का उपयोग करने के लिए ध्यान से brainstem के स्तर पर खोपड़ी में कटौती और धीरे खोपड़ी खींच । प्रत्येक नोचना के साथ, sagittal विमान (midline) में खोपड़ी को सामने की ओर काटें, और फिर incise बाद में खोपड़ी के टुकड़ों को मुक्त करने के लिए ।
    4. brainstem उठा और ध्यान से मेनिन्जेस और कपाल नसों में कटौती जब तक मस्तिष्क पूरी तरह से खोपड़ी से बाहर है ।
      नोट: सभी ५.१ में वर्णित कदम एक सुरक्षा कैबिनेट में कड़े बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए ।
  2. खंड के लिए 4% कम पिघलने बिंदु agarose में मस्तिष्क एंबेड ।
    1. ऊपर तैयार agarose समाधान के साथ एक ३५ मिमी पेट्री डिश भरें (४२ डिग्री सेल्सियस पर तरल रखा) ।
    2. जल्दी से पहले कटौती हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर agarose भरी डिश के लिए एक electroporated मस्तिष्क हस्तांतरण । डिश को कमरे के तापमान पर रखें ।
    3. एक धातु छड़ी के साथ agarose हलचल को अच्छी तरह के बीच में मस्तिष्क रखने के लिए (डूब को रोकने के लिए) और एक rostro-caudal विमान में मस्तिष्क की स्थिति पकवान के समानांतर । सरगर्मी बंद करो जब agarose जमना शुरू होता है, किसी भी मस्तिष्क क्षति से बचने के लिए ।
    4. एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करने के लिए मस्तिष्क के आसपास के agarose में कटौती के लिए एक आयताकार ब्लॉक फार्म का, मस्तिष्क के आसपास 1-2 मिलीमीटर का एक मार्जिन जा रहा है । यह सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क के rostral भाग को ब्लॉक की पूर्वकाल सीमा तक सीधा किया जाता है ताकि बाद के अनुभागीय चरणों के लिए अभिविन्यास की सुविधा हो सके.
    5. प्रत्येक मस्तिष्क के लिए दोहराएँ.
      नोट: यह अलग ऊंचाइयों पर प्रत्येक मस्तिष्क की स्थापना करते हुए अलग agarose ब्लॉकों को आकार देने के द्वारा एक समय (अधिकतम 3) में एक से अधिक मस्तिष्क में कटौती करने के लिए संभव है.
  3. Vibratome राज्याभिषेक वर्गों और स्लाइस संस्कृति ।
    1. गल एक aliquot 100X एन-2 अनुपूरक (१५० µ एल) बर्फ पर और 15 मिलीलीटर aliquoted संस्कृति माध्यम में बाँझ शर्तों के तहत जोड़ें ।
    2. स्थानांतरण ७५० संस्कृति मध्यम (1x N2 पूरक के साथ) के µ एल एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ।
    3. घुमावदार चिमटी के साथ, एक कोशिका संस्कृति डालने की जगह (30 मिमी व्यास, ०.४ µm ताकना आकार, PTFE) प्रत्येक माध्यम में अच्छी तरह से भरा ।
    4. vibratome स्नान को लगातार oxygenated ACSF के साथ भरें । नहाने के आसपास बर्फ के साथ 4 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत, या एक प्रशीतित vibratome का उपयोग करें ।
    5. ०.१५० mm/s और आवृत्ति ८० हर्ट्ज करने के लिए vibratome गति सेट करें ।
    6. गोंद vibratome प्लेटफार्म पर agarose ब्लॉक, rostral नीचे का सामना करना पड़ धार और ventral बढ़त का सामना करना पड़ उपयोगकर्ता ।
    7. २५० µm-मोटी वर्गों (4 डिग्री सेल्सियस से कम) प्राप्त करने के लिए राज्याभिषेक वर्गों में मस्तिष्क में कटौती ।
    8. के साथ निष्फल spatulas, MGE युक्त 2-3 वर्गों को इकट्ठा करने और एक ही 30 मिमी झिल्ली डालने पर एक जानवर से सभी मस्तिष्क वर्गों जगह है, ध्यान से वर्गों के बीच ओवरलैप से परहेज करते हुए । एक 6-अच्छी तरह से संस्कृति की थाली की अच्छी तरह से एक में डालें (पूरक संस्कृति माध्यम के ७५० µ एल युक्त, जैसा कि ऊपर वर्णित) । वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक अनुभाग में एक अलग 13 मिमी व्यास झिल्ली पर रखा जा सकता है एक 12-अच्छी तरह से संस्कृति ५०० µ एल पूरक संस्कृति माध्यम से भरा थाली । संस्कृति माध्यम की राशि की सिफारिश की एक अच्छी तरह से मस्तिष्क वर्गों जलमग्न होने के बिना मीडिया द्वारा पाला जा करने के लिए अनुमति देता है ।
      नोट: 5.3.6 और 5.3.7 में वर्णित कदम पूरी बाँझ शर्तों के तहत नहीं किया जाता है, जब तक vibratome निष्फल और एक सुरक्षा कैबिनेट में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसलिए, किसी भी संक्रमण से बचने के लिए सावधानी से इन चरणों का संचालन करने के लिए महत्वपूर्ण है । उपयुक्त सुरक्षात्मक उपकरण (साफ मुखौटा, सर्जिकल दस्ताने और लैब कोट) हर समय और शरीर के अंगों पर पहना जाना चाहिए, यहां तक कि इस तरह के बाल, चेहरे और हाथों के रूप में कवर, संस्कृति प्लेटों पर (के साथ या संस्कृति माध्यम के बिना) से गुजारें कभी नहीं करना चाहिए । यह भी दस्ताने और मस्तिष्क वर्गों को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया spatulas पर ७०% इथेनॉल अक्सर स्प्रे करने के लिए सिफारिश की है ।
    9. ३७ ° c में ६०% आर्द्रता और 5% सह के साथ एक हवादार बाँझ मशीन में संस्कृति प्लेट प्लेस2 के लिए ४८ या ७२ एच ।
      नोट: इन समय की मशीन बार-MGE की चूक इमेजिंग के लिए अनुकूलित INs और निश्चित स्लाइसें, क्रमशः फोकल इमेजिंग व्युत्पंन थे । इष्टतम मशीन बार प्रत्येक प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए पहले से परीक्षण किया जाना चाहिए । इसके अलावा, अगर चुना मशीन ७२ एच और के तहत है, वहां कोई संस्कृति माध्यम बदलने की जरूरत है । अब गर्मी के समय के लिए, संस्कृति माध्यम हर 2-3 दिन बदल जाना चाहिए ।
    10. वांछित मशीन समय के बाद, एक 8-चैम्बर्ड coverslip के लिए ब्याज की धारा स्थानांतरण और संस्कृति माध्यम के 3-5 µ एल जोड़ें । एक पर्यावरण चैंबर में coverslip प्लेस (३७ ° c, ६०% आर्द्रता, 5% CO2) एक औंधा कताई डिस्क से जुड़े एक कंप्यूटर की सहायता अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ सुसज्जित करने के लिए सेट अप समय चूक इमेजिंग सत्र ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, वर्गों 4% paraformaldehyde के साथ तय किया जा सकता है (रात में 4 डिग्री सेल्सियस या 2 ज पर कमरे के तापमान पर) और बाद में एक immunostained के तहत electroporated भारतीय नौसेना पोत के रूपात्मक सुविधाओं के दृश्य के लिए अलग एंटीबॉडी के साथ माइक्रोस्कोप. हालांकि eGFP और mCherry किसी भी काउंटर के बिना फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized किया जा सकता है प्रक्रिया धुंधला, हम GFP और mCherry के खिलाफ immunohistochemistry प्रदर्शन के लिए निर्धारण की प्रक्रिया प्रतिदीप्ति कम कर सकते हैं, के बाद से संकेत बढ़ाने की सलाह देते हैं, को कम करने भ्रूण न्यूरॉन्स के महीन घटकों का पता लगाने, जैसे अग्रणी या पीछे की प्रक्रियाओं में छोटी शाखाओं के रूप में.

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Representative Results

इस खंड में, हम प्रतिनिधि एक नियंत्रण प्लाज्मिड, या एक प्रयोगात्मक प्लाज्मिड ब्याज की एक जीन लक्ष्यीकरण, ई 13.5 माउस MGE स्लाइस संस्कृतियों के बाद भ्रूण के organotypic में के पूर्व utero electroporation निंनलिखित प्राप्त परिणाम प्रदान ४८ (समय-चूक इमेजिंग के लिए) या ७२ h (निर्धारण और immunohistochemical लेबलिंग के लिए) के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन (योजनाबद्ध प्रोटोकॉल के लिए चित्र 1b देखें). किसी MGE explant से माइग्रेट करने वाले भारतीय नौसेना पोत के प्रतिनिधि उदाहरण यहां वर्णित पद्धति की तुलना के रूप में (योजनाबद्ध प्रोटोकॉल के लिए चित्र 1C ) भी सचित्र हैं । MGE progenitors में एक प्लाज्मिड के electroporation को MGE और कल्चर टाइम से आईएनएस के निकलने में देरी होने लगती है तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए.

एक सफल प्रयोग में, organotypic स्लाइसें फोकल माइक्रोस्कोप के तहत स्वस्थ दिखाई देते हैं, यानी cortical परतों उज्ज्वल क्षेत्र मोड का उपयोग कर आसानी से भेद कर रहे हैं और वहाँ स्लाइस सतह पर कोई दिखाई संदूषण है (तीव्र द्वारा पहचानने योग्य autofluorescence और फ्लोरोसेंट epifluorescence के तहत दिखाई रेशा की उपस्थिति) । स्वस्थ जीर्ण organotypic स्लाइस में, लगभग 20% कोशिकाओं की संस्कृति में ७२ ज के बाद apoptosis से गुजरना (चित्रा 2), के रूप में पहले पुरानी organotypic संस्कृतियों में वर्णित (जैसे जन्मोत्तर संस्कृतियों)५२. बहरहाल, सकल cytoarchitectural मस्तिष्क संरचना अच्छी तरह से परिभाषित रहता है, के रूप में यहां DAPI धुंधला (चित्रा 2a) का उपयोग कर सचित्र । MGE के पूर्व vivo electroporation के लिए हमारा प्रोटोकॉल ५०-१०० transfected कोशिकाओं के प्रति स्लाइस (चित्र 3ए, बी), जिसमें से 5-20 कोशिकाओं को संस्कृति में ७२ एच के बाद पृष्ठीय माइग्रेट देखा जाएगा की एक औसत पैदावार । निर्धारण और immunohistochemical धुंधला के बाद, भारतीय नौसेना पोत cortical प्लेट की ओर tangentially पलायन आसानी से फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ की पहचान की जा सकती है के रूप में वे एक लम्बी/अंडाकार कोशिका शरीर, सामयिक पीछे चल रही प्रक्रिया, और एक अग्रणी प्रक्रिया वर्तमान मुखी tangentially । अग्रणी प्रक्रिया आमतौर पर एक या दो शाखाओं को जंम देता है और नाभिक के सामने एक सामयिक सूजन की उपस्थिति से पहचानने योग्य है (nucleokinesis से पहले centrosome आवास) और प्रत्येक शाखा के अंत में विकास शंकु । (चित्र 3सी-जी) ।

इस प्रोटोकॉल का अवलोकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था MGE-व्युत्पन्न INs एकल-सेल स्तर पर समय-चूक इमेजिंग का उपयोग कर । इस विशेष प्रयोग (चित्रा 4) के लिए, राज्याभिषेक organotypic मस्तिष्क स्लाइसें Dlx5/6Creसे उत्पंन किया गया; RCEEGFP भ्रूण ई 13.5 पर एक प्रयोगात्मक shRNA व्यक्त प्लाज्मिड के साथ electroporated (ब्याज की एक जीन लक्ष्यीकरण) और TdTomato कैसेट । स्लाइसें ४८ एच के लिए, एक 8-अच्छी तरह से चैम्बर्ड coverslip डिश (पूरक संस्कृति माध्यम की एक पतली परत पर चल चैंबर प्रति 1 स्लाइस) को हस्तांतरित और 6-8 एक 20x हवा का उपयोग कर एच के लिए हर 3 मिनट imaged (०.७० एनए) एक औंधा माइक्रोस्कोप पर उद्देश्य के लिए कर रहे थे सुसज्जित एक कताई डिस्क के साथ फोकल सिर, एक कंप्यूटर-अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और एक मंच-शीर्ष पर्यावरण चैंबर सहायता प्रदान की । इमेजिंग के दौरान, स्लाइसें ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था और पर्यावरण चैंबर में लगातार oxygenated और humidified थे (5% CO2 और ६०% H2O) । Electroporated MGE-व्युत्पन्न आईएनएस eGFP की उनकी अभिव्यक्ति, पहचान में उनके GABAergic की पुष्टि के रूप में इस तरह की पहचान की गई थी, और TdTomatoकी उनकी अभिव्यक्ति, पुष्टि की है कि वे प्रयोगात्मक प्लाज्मिड (चित्रा 4a, बी) व्यक्त करते हैं । Electroporated INs आसानी से पहचाने जाने योग्य है और अच्छी तरह से अलग कर रहे हैं, के रूप में चित्रा 4में देखा, इस तरह की गति और दूरी के रूप में प्रवास गतिशील मापदंडों, के महीन विश्लेषण के लिए अनुमति दी कूच । इसके अलावा, लेबल आईएनएस cortical थाली की ओर पलायन tangentially देखा जाता है, जबकि उनके प्राकृतिक वातावरण में, सक्षम करने के लिए हमें गतिशील रूपात्मक परिवर्तन की पहचान करने के लिए अग्रणी प्रक्रिया और nucleokinesis की शाखाओं के रूप में (चित्र 4c -च).

MGE-व्युत्पन्न आईएनएस के पूर्व vivo electroporation भी MGE explants के साथ संयुक्त किया जा सकता है गतिशील cytoskeletal माइग्रेशन के दौरान होने वाली प्रक्रियाओं की उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग, दिशात्मकता और प्रवासी गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक पूरक के रूप में सक्षम करने के लिए organotypic संस्कृतियों में । एक उदाहरण के रूप में, organotypic स्लाइस संस्कृतियों में भारतीय नौसेना पोत के स्पर्श प्रवास के दौरान होने वाली न्यूरॉन गतिवान के विभिन्न चरणों में देखा जा सकता है electroporated ins एक MGE explant ४८ ज से पलायन के बाद electroporation, जैसे अग्रणी neurite विस्तार और nucleokinesis (चित्रा 5B-ई) । विभिंन cytoskeletal प्रक्रियाओं तो अलग एक MGE explant से पलायन कोशिकाओं में उच्च संकल्प पर अध्ययन किया जा सकता है, उदाहरण के लिए phalloidin (चित्रा 6A) के साथ एफ actin संरचनाओं दाग द्वारा, जो organotypic स्लाइस में बेहतर नहीं प्राप्त किया जा सकता है उच्च सेलुलर घनत्व को देखते हुए (और इस प्रकार cytoskeletal तत्वों के) एक देशी वातावरण में । इन cytoskeletal प्रक्रियाओं, और विशेष रूप से एफ actin remodeling में, आगे समय के साथ Lifeact अभिव्यक्ति के संयोजन द्वारा गतिशील अध्ययन किया जा सकता है चूक इमेजिंग । उदाहरण के लिए, हम एक MGE explant से प्राप्त एक में एक के उच्च संकल्प समय चूक इमेजिंग का एक उदाहरण दिखाने के लिए एक nkx 2.1Cre; RCEEGFP माउस मस्तिष्क INs में ब्याज की एक जीन का एक लक्षित विलोपन ले । इस में सीएमवी प्रमोटर (माइकल डेविडसन से उपहार) के नियंत्रण के तहत mCherry-Lifeact-7 प्लाज्मिड के साथ transfected था, चित्रा schematizedमें विधि 1C का उपयोग कर, एफ के ट्रैकिंग के लिए अनुमति-actin वास्तविक समय में होने वाली remodeling (चित्रा घमण्ड). इस प्रकार है, जबकि organotypic संस्कृतियों ठीक से दिशात्मकता या आनुवंशिक रूप से संशोधित INs के प्रवासन पथ का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं, MGE explants के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अलग कोशिकाओं को बेहतर पहुंच प्रदान करके ऐसे अध्ययनों के पूरक कर सकते है गतिशील cytoskeletal प्रक्रियाओं ।

तकनीकी नुकसान ऊपर वर्णित प्रयोगों की विफलता में परिणाम हो सकता है । उदाहरण के लिए, एक agarose समाधान ४२ डिग्री सेल्सियस से गर्म में दिमाग embedding ऊतक विनाश और ंयूरॉन मौत में परिणाम कर सकते हैं, मस्तिष्क या स्लाइसें, जो अपारदर्शी हो के translucency का नुकसान से पता चला । हालांकि, तापमान बहुत कम नहीं रखा जाना चाहिए, के रूप में एक जमना agarose समाधान embedding प्रक्रिया के दौरान नाजुक भ्रूण मस्तिष्क को नष्ट कर सकते हैं । दूसरे, संदूषण यहां वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों की उपज को काफी कम कर सकते हैं । इस प्रकार, सभी कदम की देखभाल के साथ किया जाना चाहिए, कड़े बाँझ शर्तों के तहत के रूप में ज्यादा संभव के रूप में । सभी समाधान और उपकरणों का उपयोग करें और उपकरण अक्सर ७०% इथेनॉल के साथ या तो बैक्टीरिया या मोल्ड से संक्रमण से बचने के साथ छिड़काव किया जाना चाहिए से पहले निष्फल किया जाना चाहिए । संदूषण संस्कृति के कुओं में सीधे दिखाई जा सकती है, क्योंकि संस्कृति माध्यम पीला या अपारदर्शी हो जाता है । संदूषण का ध्यान नहीं जा सकता है जब संस्कृति मध्यम स्पष्ट और द्रव रहता है । हालांकि, स्लाइस सतह पर मोल्ड की एक परत आमतौर पर देखा जा सकता है या स्लाइसर निर्धारण और धुंधला कदम के दौरान अधिक नाजुक हो । जब इस तरह के स्लाइस माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना कर रहे हैं, संदूषण autofluorescence की एक परत के रूप में प्रकट हो सकता है पर लेबल ंयूरॉंस या लंबे फ्लोरोसेंट रेशा की उपस्थिति से पता चला । प्रदूषित कुओं में रखे Organotypic स्लाइस बाहर फेंके जाने चाहिए, लेकिन एक ही प्लेट के दूसरे कुएँ में बने स्लाइसों को आगे के कदमों के लिए रखा जा सकता है. बैक्टीरियल संदूषण काफी दुर्लभ है, लेकिन गंभीरता से लिया जाना चाहिए, जिसका अर्थ है कि साझा मशीन सहित सभी उपकरण, और संस्कृति कक्ष मैंयुअल रूप से साफ किया जाना चाहिए और निष्फल ।

Figure 1
चित्रा 1: पूर्व utero electroporation के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध निरूपण organotypic स्लाइस संस्कृति या MGE explants द्वारा पीछा किया । यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक सभी निष्फल उपकरणों के साथ एक सुरक्षा कैबिनेट सेटअप का एक उदाहरण । B. ex utero electroporation और organotypic स्लाइस संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. संक्षेप में, भ्रूण decapitated हैं, प्रयोगात्मक प्लाज्मिड पार्श्व निलय (1) और electroporated में MGE (2) में इंजेक्शन है । मस्तिष्क खोपड़ी से बाहर microdissected है (3) और agarose (4) में एंबेडेड । Organotypic वर्गों एक vibratome पर उत्पन्न कर रहे हैं (5) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति में रखा (6) समय चूक माइक्रोस्कोपी (७.१) या सेल पुनर्निर्माण के लिए ७२ एच के लिए ४८ एच के लिए (७.२). C. मायर्स एट अल. २०१३५३ से अनुकूलित प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और MGE explants की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया । संक्षेप में, dorsolateral cortices पहले ई 12.5 से ई 14.5 जंगली-प्रकार माउस भ्रूण (1) और असंबद्ध यांत्रिक पूरक संस्कृति मध्यम (2) में बाहर विच्छेदित कर रहे हैं । Cortical कोशिकाओं ५.२५ x 105 Cortical कोशिकाओं के घनत्व पर चढ़ाया जाता है और एक कोलेजन/पाली-एल-lysine-लेपित 8-coverslip (3) में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए संस्कृति । तब, e 13.5 Dlx5/6Cre; RCEEGFP भ्रूण MGE के पूर्व utero electroporation के लिए संसाधित कर रहे हैं (4, 5), और MGE मैन्युअल रूप से मस्तिष्क से अलग है और १०० µm2 टुकड़ों (6) में कटौती. इन explants तो पहले से तैयार cortical फीडर परत के शीर्ष पर रखा जाता है, संस्कृति मध्यम और सह समय चूक इमेजिंग (7) से पहले ४८ ज के लिए संस्कृति के साथ कवर किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: स्वस्थ organotypic स्लाइस में संरक्षित cytoarchitecture । organotypic स्लाइस संस्कृतियों की पीढ़ी पूर्व vivo electroporation के बाद nkx 2.1Cre; RCEEGFP माउस भ्रूण (एक) महत्वपूर्ण ऊतक नुकसान में परिणाम नहीं है, के रूप में संरक्षित cytoarchitecture (DAPI (नीला) और Cre रिपोर्टर (GFP)), जब एक से 18 µm-मोटी cryosection की तुलना में एक nkx 2.1Creसे पता चला; RCEEGFP भ्रूण transcardially perfused के साथ 4% पीएफए ई 15.5 पर । डी और एम संकेत dorso-ventral और लातेरो-औसत दर्जे का अक्ष, क्रमशः । (). उच्च इज़ाफ़ा एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप के साथ एक 63x/1.4 तेल उद्देश्य से सुसज्जित के साथ लिया एक विरोधी के साथ दाग-सट-Caspase 3 एंटीबॉडी (सीएल-cas3) पता चलता है कि cortical प्लेट में कोशिकाओं के लगभग 20% से गुजरना apoptosis (white ऐरोहेड) के बाद संस्कृति में ७२ ज, जबकि GFP-पॉजिटिव आईएनएस स्वस्थ रहना (सफेद तीर), के रूप में उदाहरण में photomicrographs में सी-सी ''. तुलना करके, सेलुलर apoptosis एक perfused पशु (डी डी '' ' ') से पतली cryosection से लगभग पूरी तरह से अनुपस्थित है । स्केल बार्स: २५० µm (A-B) और 15 µm (C-D '') । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: चूहों मस्तिष्क भ्रूण और electroporated ंयूरॉंस की उच्च आवर्धन photomicrographs के Organotypic स्लाइस (INs) । a. एक Dlx5/6Creसे एक organotypic स्लाइस संस्कृति; RCEEGFP माउस ब्रेन (जिसमें सभी आईएनएस हरा हो) electroporated के साथ एक Dlx5/6:: shRNAतले-आयरेस- TdTomato प्लाज्मिड । स्लाइस 4% पीएफए के साथ संस्कृति में ७२ ज के बाद तय किया गया था, और GFP और mCherry के लिए immunostained । Electroporated INs 3 डी में imaged थे (५०-६० µm-मोटी जेड हर ०.५ µm लिया वर्गों के साथ ढेर) एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक 63x के साथ सुसज्जित/ पृष्ठीय pallium के उप-वेंट्रिकुलर क्षेत्र में tangentially माइग्रेट करना (लाल, खुला तीर) आसानी से पहचाना जा रहा है । डी और एम संकेत dorso-ventral और लातेरो-औसत दर्जे का अक्ष, क्रमशः । ख. एक प्रतिनिधि organotypic एक wildtype (WT) एक नियंत्रण के साथ भ्रूण electoporated से संस्कृति स्लाइस Dlx5/6:: shRNAतले-आयरेस- TdTomato प्लाज्मिड, ७२ पर तय की ज और immunostained केवल mCherry के लिए । Electroporated आईएनएस (लाल) cortical प्लेट की ओर पृष्ठीय पलायन देखा जाता है । Electroporated आईएनएस TdTomato और EGFP में उनकी सह-अभिव्यक्ति की पहचान Dlx5 6Creमें की गई है; RCEEGFP चूहों (सी-डी), या केवल WT चूहों (ई एच) में TdTomato की उनकी अभिव्यक्ति द्वारा, और उनके ठेठ आकृति विज्ञान, यानी एक अंडाकार कोशिका शरीर, एक शाखा में अग्रणी प्रक्रिया (सफेद ऐरोहेड, डी एच), एक सामयिक ट्रेलिंग प्रक्रिया (सफेद तीर, सी-डी) और प्रमुख प्रक्रिया के एक सामयिक सूजन आवास centrosome से पहले nucleokinesis ( सी-सी ' और जीमें सफेद सितारा) । स्केल बार्स: २५० µm (A-B) और 25 µm (C-H) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: organotypic स्लाइस में electroporated INs के समय चूक लाइव-इमेजिंग ४८ ज के लिए संस्कृतिया । INs electroporated एक प्रयोगात्मक प्लाज्मिड के साथ ई 13.5 पर TdTomato कैसेट और एक shRNA लक्ष्यीकरण ब्याज की एक जीन एक organotypic मस्तिष्क एक Dlx5 से प्राप्त टुकड़ा में स्पर्श प्रवास में देखा जाता है के साथ एक / RCEEGFP माउस भ्रूण के बाद ४८ संस्कृति के एच (एक, सफेद वर्ग) । में, उसी electroporated में (white स्क्वायर) nucleokinesis की प्रक्रिया में देखा जाता है, जबकि प्रांतस्था में tangentially पलायन, pial सतह के समानांतर अर्थात्, और समय-चूक इमेजिंग में पीछा किया जाता है 8 के लिए हर 3 मिनट में एक 20x/0.85 ना हवा का उपयोग उद्देश्य (बढ़े हुए बक्से, सी-एफ). ंयूरॉन शुरू में एक लंबी कोशिका शरीर (nucleokinesis की प्रक्रिया में खुला तीर) (), साथ ही साथ एक पीछे की प्रक्रिया (सफेद तीर) और एक शाखा में अग्रणी प्रक्रिया (सफेद ऐरोहेड) प्रदर्शित करता है । लाइव इमेजिंग के 3 ज के बाद, nucleokinesis पूरा हो गया है, पीछे की प्रक्रिया मुकर गया है, और अग्रणी प्रक्रिया दो लंबी शाखाओं का विस्तार है (डी, व्हाइट ऐरोहेड) । 5 ज 30 मिनट के बाद, अग्रणी प्रक्रिया शाखा में से एक (सफेद ऐरोहेड) वापस ले लिया है और ंयूरॉन कोशिका शरीर (खुला तीर) के बारे में आगे बढ़ गया है 10 µm (E) । अंत में, इमेजिंग के 8 घंटे के बाद, प्रवासन रुका हुआ है, ंयूरॉन अपनी अग्रणी प्रक्रिया फिर से बढ़ा दिया है और एक पीछे की प्रक्रिया (सफेद तीर) दिखाई दिया है, लेकिन नाभिक (खुला तीर) अभी तक आगे नहीं ले जाया गया है () । स्केल बार्स: २५० µm (A), ७० µm (B) और 30 µm (C-F) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5:४८ ज के लिए एक MGE explant कल्चरल से व्युत्पन्न आईएनएस की समय-चूक इमेजिंग. INs एक nkx 2.1Creसे प्राप्त explant MGE से बाहर पलायन देखा जाता है; RCEEGFP माउस (जिसमें सभी MGE-व्युत्पन्न INs एक्सप्रेस EGFP) electroporated के साथ सीएमवी :: mCherry-LifeAct-7 प्लाज्मिड ई 13.5 पर, मायर्स एट al. २०१३५३ और schematized से रूपांतरित विधि का उपयोग करते हुए चित्रा 1C, और ४८ एच () के लिए संस्कृति । आईएनएस 5 एच (बी-ई) के लिए समय चूक लाइव इमेजिंग का उपयोग कर visualized थे. इस उदाहरण में, एक सह व्यक्त eGFP और LifeAct में शुरू में nucleokinesis (खुला तीर) की प्रक्रिया में देखा जाता है और दो प्रमुख प्रक्रिया शाखाओं का विस्तार (सफेद ऐरोहेड; ) । इस में 1 के बाद nucleokinesis पूरा करता है (खुला तीर देखें), के रूप में सेल शरीर आगे बढ़ गया है और एक पीछे की प्रक्रिया कोशिका शरीर के पीछे (सफेद तीर) में दिखाई दिया है, और अभी भी एक प्रमुख प्रक्रिया को दिखाता है के साथ दो शाखाओं (सफेद ऐरोहेड; C). एक दूसरे nucleokinesis 2 ज 30 मिनट (खुले तीर) के बाद रास्ते में है और अब दो प्रमुख कोशिका शरीर से उत्पंन प्रक्रियाओं और एक लंबा पीछे की प्रक्रिया (सफेद तीर के साथ संपंन है; D) । अंत में, 5 घंटे के बाद, में एक neurite reमुकर जबकि translocating शेष अग्रणी प्रक्रिया शाखा में centrosome (सफेद arrowhead) एक तीसरे nucleokinesis के लिए तैयारी में, एक पीछे की प्रक्रिया के साथ (सफेद तीर) अभी भी वर्तमान के पीछे सेल बॉडी () । स्केल बार्स: ७० µm (A) और 20 µm (B-E) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: उच्च संकल्प समय-चूक actin की इमेजिंग एक MGE explant के लिए संस्कृति के साथ भारतीय नौसेना पोत में remodeling के ४८ एच. ए. एक nkx 2.1Creसे एक organotypic स्लाइस; RCEEGFP माउस ब्रेन ई 15.5, Alexa-५९४ Phalloidin के साथ सना हुआ, रेशा actin के दृश्य के लिए अनुमति में तय हो गई है । INs एक 63x/1.3 NA तेल उद्देश्य का उपयोग कर एक फोकल माइक्रोस्कोप पर imaged हैं । स्वस्थ आईएनएस में, रेशा actin nucleokinesis (सफेद तीर, A'-ए '') के पूरा होने के बाद पीछे की प्रक्रिया के कर्षण के बाद कोशिका शरीर के पीछे cupping देखा जाता है । B. एक MGE explant एक nkx 2.1Creसे ऊपर के रूप में प्राप्त होता है; RCEEGFP माउस मस्तिष्क ब्याज की एक जीन का एक लक्षित विलोपन ले जाने और एक प्लाज्मिड mCherry प्रमोटर के नियंत्रण में Lifeact-सीएमवी-7 व्यक्त करने के साथ electroporated । समय चूक लाइव इमेजिंग संस्कृति के ४८ ज के बाद किया जाता है, और electroporated INs 3 एक 40x/0.85 एयर उद्देश्य का उपयोग कर एच के लिए हर 3 मिनट का पालन कर रहे हैं । actin cytoskeleton के सक्रिय remodeling में LifeAct के साथ transfected में होता है, लाल के आंदोलन से उदाहरण के रूप में (काले और सफेद छवियों में सफेद) अग्रणी प्रक्रिया और विकास शंकु के भीतर फ्लोरोसेंट डॉट्स (सफेद ऐरोहेड) और के पीछे में nucleokinesis के दौरान सेल शरीर (बी-बी '', सफेद तीर). स्केल बार्स: 7 µm (a-a '') और 10 µm (b-b '' ') । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस अनुच्छेद में, हम ई 13.5 पर और भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस की organotypic संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए माउस MGE के ex utero electroporation प्रदर्शन के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करते हैं । हालांकि इन विट्रो तरीकों में , जैसे Boyden चैंबर परख, प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं और अन्य कारकों के हस्तक्षेप के बिना विभिन्न जीन और प्रोटीन की विशिष्ट भूमिकाओं का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वे में की जांच बाधा प्रवास गतिशीलता के साथ दिशात्मकता और माइग्रेशन पथ25का संबंध है । MGE explants एक उपयोगी गतिशील cytoskeletal प्रवास में के दौरान होने वाले परिवर्तनों का अध्ययन करने का साधन प्रदान करते हैं, जैसा कि हम यहां दिखाते हैं, लेकिन वे सबसे अंतर्जात cues से रहित है और अक्सर मार्गदर्शन cues के अलावा की आवश्यकता को बढ़ावा देने के लिए ंयूरॉंस प्रवासन (हालांकि यह है काफी सुधार जब MGE explants cortical फीडर परतों पर संस्कृति रहे हैं)25,५४। बहरहाल, परख MGE explants के आधार पर आणविक ऐसे विशिष्ट दिशात्मकता या INs29के प्रवास पथ मार्गदर्शक के रूप में और अधिक सूक्ष्म तंत्र में शामिल cues के निहितार्थ का पता लगाने में विफल कर सकते हैं । इस समस्या को अंततः utero electroporation25है, जो MGE-व्युत्पंन INs अपने पैतृक पर्यावरण13,29,४१में प्रवास के विशिष्ट लेबलिंग के लिए अनुमति देता है में से दरकिनार कर दिया गया था । हालांकि, कि तकनीक कौशल को चुनौती दे, शामिल शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के कारण है, और इसकी उपज भ्रूण के कम जीवित रहने की दर और तथ्य यह है कि MGE मुश्किल है utero मेंलक्ष्य करने के लिए, अक्सर कई कूड़े के उपयोग की आवश्यकता द्वारा सीमित है करने के लिए पहुंच महत्व५५। इसलिए, चूहों मस्तिष्क भ्रूण की organotypic संस्कृति द्वारा पीछा MGE के पूर्व utero electroporation एक कम लागत, समय कुशल, और विश्वसनीय विधि माइग्रेशन गतिशीलता और MGE की आकृति विज्ञान की जांच के लिए उनके प्राकृतिक में प्राप्त आईएनएस प्रदान करता है पर्यावरण, जबकि utero electroporation और MGE explants में मार्गदर्शन cues के लिए की जरूरत की शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को दरकिनार । इसके अलावा, इस तकनीक MGE है, जो सीधे गर्दन के तहत सकारात्मक इलेक्ट्रोड और सिर के शीर्ष पर नकारात्मक एक apposing द्वारा लक्षित किया जा सकता है के लिए एक आसान पहुँच की अनुमति देता है, एक विन्यास अधिक मुश्किल utero मेंअपनाने के लिए. वैकल्पिक रूप से, MGE को फोकल इंजेक्ट किया जा सकता है और organotypic स्लाइस पैदा करने के बाद सीधे electroporated13,25,29, लेकिन वह तकनीक हमारे हाथों में अधिक कठिन और कम प्रभावी साबित हुई है यहां वर्णित प्रोटोकॉल से । इस आलेख में वर्णित चरणों का पालन करके, एक प्राप्त होगा ५०-१०० electroporated MGE-व्युत्पंन organotypic स्लाइस, 5-20 जिनमें से tangentially के बाद MGE से बाहर माइग्रेट देखा जाएगा के बाद ७२ h. Transfected आईएनएस समय-चूक इमेजिंग के साथ लाइव visualized किया जा सकता या छवि निर्धारण और immunohistochemical लेबलिंग के बाद खंगाला ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित माइग्रेशन पूर्व vivo में अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया था और विभिंन प्रकाशित MGE के utero electroporation में वर्णित प्रोटोकॉल से प्रेरित था-प्राप्त INs, पूर्व vivo MGE इंजेक्शन और electroporation, या क्रोनिक organotypic ब्रेन स्लाइस संस्कृतियों की पीढ़ी३६,३८,३९,४२,४३,५६,५७,५८. हमारे दृष्टिकोण कम पल्स तीव्रता (४० वी) का उपयोग करके MGE progenitors के लिए संभावित नुकसान को सीमित करता है और उच्च वोल्टेज दालों के साथ इंट्रा MGE इंजेक्शन के बजाय संवहन प्लाज्मिड इंजेक्शन (१०० v), कहीं और वर्णित के रूप में३९,५६ ,५७,५८. इसके अलावा, जबकि दूसरों के एक संयोजन का उपयोग पेनिसिलिन, streptomycin और गेन्तमयसीं जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए३९,५६,५७,५८, हम एंटीबायोटिक दवाओं से बचने के लिए चुना है हमारी संस्कृति माध्यम में से वे सैद्धांतिक रूप से प्रवास में प्रभावित कर सकते हैं । विशेष रूप से, पेनिसिलिनएक रिसेप्टर के एक विरोधी है५९,६०, और गाबाएक रिसेप्टर सक्रियण सक्रिय करता है और बाद में intracellular क्लोराइड ढाल और KCC2 के आधार पर प्रवास में बंद हो जाता है माइग्रेशन६१के विभिंन चरणों में व्यंजक । हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल में कहा विभिंन सावधानियों का उपयोग, संक्रमण प्रभावी रूप से भी एंटीबायोटिक दवाओं के अभाव में बचा जा सकता है ।

हमारे हाथों में इस दृष्टिकोण की कुशलता के बावजूद, माजी utero electroporation भी इसके नुकसान हैं. जबकि कोशिकाओं को विस्थापित करने के लिए एक प्राकृतिक तीन आयामी वातावरण प्रदान करने, यह प्रवास में के संदर्भ में organotypic स्लाइस में औषधीय परख प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो सकता है । दरअसल, MGE के प्रवासन-व्युत्पंन ज्यादातर extracellular cues2,13,19 और organotypic स्लाइस पर औषधीय अवरोधकों या उत्प्रेरक के आवेदन पर निर्भर करता है सटीक अनुमति नहीं है समग्र स्लाइस स्वास्थ्य या गतिविधि पर वैश्विक प्रभावों से सेल स्वायत्त प्रभाव के पृथक्करण । ऐसे प्रयोगों के लिए, MGE explants मिश्रित असंबद्ध cortical कोशिकाओं पर उगाया organotypic स्लाइस संस्कृतियों के लिए बेहतर हो सकता है, के बाद से भारतीय नौसेना पोत explant से बाहर पलायन और अधिक आसानी से अलग किया जा सकता है और चुनिंदा विशिष्ट यौगिकों६२को उजागर । इसके अलावा, हालांकि पूर्व utero electroporation के utero electroporation में से प्रदर्शन करने के लिए आसान है, यह अभी भी तकनीकी रूप से भ्रूण की उंर और भ्रूण दिमाग के छोटे आकार और नाजुक राज्य दिया यहां सचित्र पर चुनौतीपूर्ण हो सकता है ई 13.5. जांचकर्ताओं को कुशलतापूर्वक मस्तिष्क की सतह को नुकसान पहुंचाए बिना ई 13.5 पर electroporated दिमाग निकालने के लिए कुछ परीक्षणों की आवश्यकता होगी । इसके अलावा, के रूप में जन्मोत्तर स्लाइस का विरोध किया, भ्रूण organotypic स्लाइसें समय की लंबी अवधि में संस्कृति में नहीं रखा जा सकता है । हालांकि भ्रूण organotypic स्लाइस संस्कृतियों के लिए रखा जा सकता है कम 7 दिनों में इन विट्रो६३, यह electroporation के साथ संयुक्त नहीं किया गया था और यहाँ वर्णित प्रयोगों विश्वसनीय परिणामों के साथ इन विट्रो में 3 दिनों के लिए परीक्षण किया गया है हमारे हाथ में । इसलिए, जांचकर्ताओं अनुकूलन परीक्षण पहले से प्रदर्शन करना चाहिए अगर अब मशीन समय की जरूरत है । इसके अलावा, देर से भ्रूण या जल्दी जन्मोत्तर चरणों में विकास की जांच इस तकनीक के साथ अनुशंसित नहीं है जब ई 13.5 भ्रूण25का उपयोग कर, लेकिन के साथ utero electroporation में प्राप्त किया जा सकता है, जहां सफलतापूर्वक electroporated भ्रूण वापस गर्भाशय गुहा में डाल रहे है और पैदा किया जा सकता है और बाद में विश्लेषण21चरणों में,६४। अंत में, भूतपूर्व utero electroporation द्वारा फ़ॉलो किया गया organotypic स्लाइस संस्कृतियों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है दोनों आकृति विज्ञान और विकासशील आईएनएस के प्रवास की गतिशीलता. हालांकि, के रूप में यह पहले से बाहर के लिए बताया गया है utero electroporation तकनीक३६ में , पूर्व utero electroporations उपज ५०-१०० मस्तिष्क टुकड़ा प्रति electoporated कोशिकाओं और इस प्रकार जनसंख्या विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं । इस तरह की जांच बेहतर या तो एक पूर्ण या सशर्त विलोपन (या दस्तक में) ब्याज की जीन के ले जाने के पशु मॉडल में आयोजित की जाती हैं । जब उपलब्ध है, ऐसे मॉडल तो कुशलतापूर्वक organotypic स्लाइस संस्कृतियों या MGE explants उत्पंन करने के लिए प्रवास में वास्तविक गतिशीलता कल्पना, के रूप में यहां का प्रदर्शन किया जा सकता है ( चित्रा 5 और चित्रा 6) देखें ।

इस प्रोटोकॉल में कई कदम ध्यान से किया जाना चाहिए ताकि इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए । उदाहरण के लिए, यह मौलिक है कि सभी कदम कठोर बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है के रूप में संदूषण काफी आसानी से हो सकता है । दस्ताने और उपकरण के बाहर का उपयोग किया है कि सुरक्षा के मंत्रिमंडल के साथ छिड़काव किया जाना चाहिए ७०% इथेनॉल अक्सर पूरी प्रक्रिया के दौरान । इसके अलावा, इस तरह के संस्कृति मीडिया और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव के रूप में समाधान बाँझ और ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) रखा जाना चाहिए, और हर 2-3 सप्ताह ताजा बना दिया । MGE-व्युत्पन्न भारतीय नौसेना पोत अधिक विशेष रूप से लेबल करने के लिए, plasmids कि इस तरह के प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा एक में विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण के तहत क्लोन किया जाना चाहिए (उदा: Dlx5/6४९, Lhx6६५), के बजाय बस संरचनात्मक पर निर्भर MGE का लक्ष्यीकरण । organotypic स्लाइस की पीढ़ी को जिंदा रहने के लिए मस्तिष्क की आवश्यकता होती है । इस प्रकार, सेल स्वास्थ्य और अस्तित्व को बनाए रखने के लिए, इस प्रयोग के समय से कम 3 घंटे में आयोजित किया जाना चाहिए कि भ्रूण organotypic स्लाइसें जब तक प्राप्त कर रहे है संस्कृति में डाल रहे हैं । समय-दक्षता के लिए, संस्कृति प्लेटें बस प्रयोग शुरू करने से पहले घर का बना संस्कृति माध्यम से पूर्व भरा जा सकता है और उपयोग करने तक ३७ ° c सेल संस्कृति मशीन में डाल दिया । इसके अलावा, दिमाग सावधानी से cortical सतह को किसी भी क्षति के बिना खोपड़ी से बाहर किया जाना चाहिए ताकि agarose समाधान और बाद में vibratome-अनुभाग में उचित embedding प्राप्त करने के लिए । उदाहरण के लिए, cortical सतह को नुकसान भी कम, agarose जेल आसपास से या vibratome के दौरान वर्गों के क्षरण में २५० µm-मोटी वर्गों की टुकड़ी में परिणाम हो सकता है । न्यूरॉन्स अस्तित्व के लिए, यह भी महत्वपूर्ण है कि agarose समाधान तापमान ४२ डिग्री सेल्सियस के करीब रहता है, के रूप में उच्च तापमान ऊतक क्षति और कोशिका मृत्यु के लिए सीसा, जबकि कम तापमान मस्तिष्क के उचित embedding बाधा होगा (या यह के दौरान नुकसान एंबेडिंग प्रक्रिया) । संस्कृति में एक बार, अंय संदूषण स्रोतों से बचने के लिए, स्लाइस जब तक वे इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप को हस्तांतरित कर रहे है हेरफेर नहीं किया जाना चाहिए । इन कदमों को एक निष्फल वातावरण और ध्यान में किया जाना चाहिए इन जोड़तोड़ के बाद प्लेटें दूषित नहीं भुगतान किया जाना चाहिए, खासकर अगर वे बाद में पुनः इमेजिंग के लिए संस्कृति में वापस डाल की जरूरत है । अंत में, हम recuperating एक डीएनए aliquot भविष्य के उपयोग के लिए पिछले प्रयोग से डाई लोड करने के साथ मिश्रित के रूप में हम ऐसी सामग्री के साथ electroporated ंयूरॉंस की उपज में काफी कमी देखा की सिफारिश नहीं है ।

अंत में, पूर्व utero electroporation और organotypic स्लाइस संस्कृति प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित MGE के विशिष्ट लेबलिंग के लिए अनुमति देता है एकल सेल स्तर पर भारतीय नौसेना पोत व्युत्पंन और आनुवंशिक रूप से विशिष्ट आणविक रास्ते में हेरफेर किया जा सकता है रूपात्मक परिवर्तन और tangentially माइग्रेट इंस की माइग्रेशन गतिशीलता को विनियमित करने में उनकी भूमिका का अध्ययन करें । इस विधि में तेजी से और कम लागत उपंयास उंमीदवार के माध्यम से की पहचान की जल्दी कार्यात्मक जांच के लिए अनुमति देता है एक सेल की आरएनए अनुक्रमण प्रवासी भारतीय नौसेना पोत६६,६७ या के साथ रोगियों की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के माध्यम से पहचाना neurodevelopmental विकार६८,६९,७०. इस तकनीक को बड़े पैमाने पर प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस७०,७१,७२,७३में हवामहल कोशिकाओं सहित अन्य कोशिका आबादी में प्रवास अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । एक बार महारत हासिल की, यह संभवतः के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है रिसाइकिलिंग और झिल्ली प्रोटीन की तस्करी, ऐसे रिसेप्टर्स और GFP का उपयोग कर चैनल-प्रोटीन टैग के रूप में; विशिष्ट सेलुलर संकेत करने वाले झरने के सक्रियण का उपयोग कर७४ या यहां तक कि निगरानी और सेलुलर गतिविधि के हेरफेर कैल्शियम cortical INs में optogenetics करने के लिए युग्मित इमेजिंग का उपयोग कर, लेकिन यह भी अंय मस्तिष्क क्षेत्रों में, जैसे हिप्पोकैम्पस, प्रमस्तिष्कखंड या यहां तक कि striatum ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है । इस के साथ साथ व्यक्त विचार जरूरी स्वास्थ्य मंत्री या कनाडा की सरकार के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते ।

Acknowledgments

यह काम Savoy फाउंडेशन और इलाज मिर्गी फाउंडेशन से और उपकरण अनुदान द्वारा नवाचार के लिए कनाडा की नींव से ई. आर (फोकल माइक्रोस्कोप) और जी. एच (कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप) से ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । ेा शौकीनों de सभ्य du Québec-Santé (FRQ-S से कैरियर पुरस्कार प्राप्त करता है; चिकित्सक-वैज्ञानिक पुरस्कार) के रूप में अच्छी तरह से के रूप में स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा के संस्थानों से (CIHR; यंग जांचकर्ता पुरस्कार) । G.H. FRQ-एस के वरिष्ठ विद्वान हैं । एल ई Savoy फाउंडेशन, चू सैंटर-जस्टिन फाउंडेशन postdoctoral प्रशिक्षण पुरस्कार और FRQ-एस postdoctoral प्रशिक्षण पुरस्कार से Steriade-Savoy postdoctoral प्रशिक्षण पुरस्कार के प्राप्तकर्ता है, सितारों की नींव के साथ साझेदारी में । यह परियोजना कनाडा ब्रेन रिसर्च फंड के माध्यम से मस्तिष्क कनाडा द्वारा संभव बनाया गया है, स्वास्थ्य कनाडा के वित्तीय सहायता के साथ, L.E. को संमानित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103049 Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplement ThermoFisher Scientific 17504044 50X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11415064 Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Horse serum, heat inactivated Millipore-Sigma H1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100X Wisent 305-016 Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mL VWR 89132-062
Class II Type A Biosafety Cabinet Nuaire NU-540
Sucrose BioShop SUC700.1
Sodium Chloride BioShop SOD001.1
Sodium bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
D+ glucose Millipore-Sigma G7528-250G
Potassium Chloride ThermoFisher Scientific P217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous BioShop SPM400.500
Calcium chloride dihydrate  ThermoFisher Scientific C79-500
Magnesium sulfate heptahydrate BiosShop MAG522
Agarose BioShop AGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.547.004
1.5 mL centrifuge tubes Sarstedt 72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube Drummond scientific 1-000-800/12
Ethanol VWR E193
5 mL syringe Becton Dickinson & Co 309646
Mineral Oil (heavy) Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5 World Precision Instruments 504511 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7 World Precision Instruments 504504 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC Tweezers World Precision Instruments 504617 11 cm, Straight, flat
Operating scissors World Precision Instruments 501225 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing Forceps World Precision Instruments 501217 12.5 cm, straight, serrated
Iris Forceps World Precision Instruments 504478 10.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501996 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded ends FisherScientific 21-401-5 You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond scientific 3-000-204
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901 60-mm dish
Tissue culture dish Sarstedt 83.1800 35-mm dish
Black Wax FisherScientific S17432
Transfer pipettes  Ultident 170-CTB700-212 3 mL, small bulb
Stereo Microscope Leica Biosystems Leica M80 In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square Porator BTX Harvard Apparatus ECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm BTX Harvard Apparatus 45-0487
25G 1 1/2 Becton Dickinson & Co 305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1000S
GEM, Single edge razor blade Electron Microscopy Sciences 71952-10 Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 well Ibidi 80827 Pack of 15
Millicell cell culture insert Millipore-Sigma PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscope Leica Microsystems N/A
Spinning disk confocal head Ultraview Vox Perkin Elmer N/A
Volocity 6.0 acquisition software Improvision/Perkin Elmer N/A
LiveCell Stage top incubation system Pathology devices LC30030 Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscope Leica
mCherry-Lifeact-7 Addgene 54491 Gift from Michael Davidson
Fast Green FCF Millipore-Sigma F7258-25G 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

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