Toewijzing metabolisme: Bewakingsactiviteit lactaat Dehydrogenase rechtstreeks in weefsel

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

We beschrijven een protocol voor het toewijzen van de ruimtelijke spreiding van enzymatische activiteit voor enzymen die nicotinatmide adenine dinucleotide-fosfaat (NAD(P)H) + H + rechtstreeks in weefselmonsters genereren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jelinek, D., Flores, A., Uebelhoer, M., Pasque, V., Plath, K., Iruela-Arispe, M. L., Christofk, H. R., Lowry, W. E., Coller, H. A. Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue. J. Vis. Exp. (136), e57760, doi:10.3791/57760 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Toewijzen van enzymatische activiteit in ruimte en tijd is van cruciaal belang voor het begrip van de moleculaire basis van cel gedrag in normale weefsels en ziekte. In situ metabole activiteit testen kunnen informatie geven over de ruimtelijke spreiding van de metabole activiteit binnen een weefsel. Wij bieden hier een gedetailleerd protocol voor het toezicht op de activiteit van het enzym lactaat dehydrogenase rechtstreeks in weefselmonsters. Lactaat dehydrogenase is een belangrijke determinant van of verbruikte glucose worden geconverteerd naar energie via aerobe of anaerobe glycolyse. Een oplossing met lactaat en NAD wordt verstrekt aan een bevroren weefselsectie. Cellen met hoge lactaat dehydrogenase activiteit zal omzetten in de meegeleverde lactaat pyruvaat, terwijl tegelijkertijd converteren verstrekt nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) NADH en een proton, die kan worden opgespoord op basis van de vermindering van de nitrotetrazolium blauwe naar formazan, die wordt weergegeven als een blauwe neerslag. Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor lactaat dehydrogenase bewakingsactiviteit in muis huid. Toepassing van dit protocol, vonden we dat lactaat dehydrogenase activiteit hoog in de cellen van de stam van het sluimerende haarfollikel in de huid is. Toepassing van het protocol aan gekweekte muis embryonale stamcellen, bleek hoger kleuring in gekweekte embryonale stamcellen dan muis embryonale fibroblasten. Onderzoek van vers geïsoleerde muis aorta bleek kleuring in zachte spiercellen loodrecht op de aorta. De methodologie die kan worden gebruikt om de activiteit van enzymen die het genereren van een proton in bevroren of vers weefsel ruimtelijk in kaart.

Introduction

Inzicht in de locaties binnen weefsels waarin enzymen hoge of lage activiteit hebben is essentieel voor de ontwikkeling van het begrip en fysiologie. Transcript of proteïne niveaus worden vaak gebruikt als surrogaten voor enzymatische activiteit. Hoewel dergelijke studies kunnen informatief, bieden ze geen gegevens die cruciaal worden kan voor het bepalen van een enzymactiviteit, zoals posttranslationele modificaties, de aanwezigheid van eiwitcomplexen, of van het enzym subcellular localisatie. Enzymatische activiteit rechtstreeks wordt gemeten, is het vaak gecontroleerd in gehomogeniseerde eiwit lysates die niet langer informatie over individuele cellen binnen het mengsel of de ruimtelijke spreiding van de cellen met hoge of lage activiteit binnen een weefsel bevatten.

Wij bieden hier een gedetailleerd protocol voor het toewijzen van de ruimtelijke spreiding van enzymatische activiteit binnen een weefsel monster. De methodologie is gebaseerd op eerdere onderzoeken die aantonen dat tetrazolium zouten kunnen worden gebruikt voor het lokaliseren van de activiteit van dehydrogenases, reductases en oxidasen in bevroren weefsel1. Met deze methoden wordt een water onoplosbare formazan gevormd wanneer protonen worden overgedragen aan een tetrazolium zout2,3. Glucose-6-fosfaat dehydrogenase genereert NADPH en een proton en met tetrazolium activiteit is geconstateerd. Glucose-6-fosfaat dehydrogenase heeft gevolgd in Europese bot hepatocyten4, in alveolaire type 2 cellen van de longen5 en nephrons van de nier-5. Tetrazolium zouten zijn ook gebruikt om transketolase activiteit in bevroren weefsel6te controleren. Een soortgelijke aanpak werd onlangs gebruikt om de activiteit van meerdere dehydrogenases in de dezelfde weefsel op aangrenzende dia's7te controleren.

Hier beschrijven we een methode om met behulp van tetrazolium zouten te controleren van de ruimtelijke spreiding van lactaat dehydrogenase activiteit (Figuur 1). Lactaat dehydrogenase kunt converteren pyruvaat gegenereerd door glycolyse te lactaat en de omgekeerde reactie. Lactaat dehydrogenase activiteit is bijgevolg een belangrijke determinant van pyruvaat de ingang in de tricarboxylic acid cyclus versus de secretie zoals lactaat. Lactaat niveaus in het bloed worden vaak gebruikt voor de diagnose van een aantal ziekten, waaronder kanker8,9,10, omdat het kan signaal dat ziekte of letsel heeft beschadigde cellen en het enzym is vrijgegeven.

Er zijn vier lactaat dehydrogenase genen: LDHA, LDHB, LDHC en LDHD11. LDHA en LDHB worden verondersteld te zijn ontstaan uit een vroege LDHA gen12dubbel. LDH is actief als een tetrameer en LDHA en LDHB kan homotetramers en heterotetramers met elkaar. LDHA wordt gemeld te hebben hogere affiniteit voor pyruvaat, terwijl LDHB aan hebben hogere affiniteit voor lactaat, en bij voorkeur converteren lactaat en pyruvaat13is gemeld. De promotor LDHA bevat bandplaatsen voor de HIF1α, cMYC en FOXM1 transcriptie factoren11. Bovendien, zoals vele andere glycolytic enzymen14,15, kan LDH worden gewijzigd door posttranslationele modificaties. Fibroblast groeifactor receptor 1 kan LDHA Y10, die bevordert tetrameer vorming, of Y83, die bevordert NADH substraat bindende16phosphorylate. Ook kan LDHA geacetyleerd17. Om deze redenen vereist een compleet begrip van LDH activiteit controle niet alleen LDH eiwitniveaus, maar van het enzym activiteit ook.

Naast de methode die we hier presenteren, zijn andere benaderingen gebruikt om lactaat dehydrogenase activiteit te controleren. Lactaat dehydrogenase activiteit kan spectrophotometrically worden gecontroleerd in gehomogeniseerde eiwit lysate. De generatie van NADH zoals lactaat wordt geconverteerd naar pyruvaat kan worden gemeten op basis van de absorptie bij 340 nm, terwijl de verdwijning van NADH kan worden gecontroleerd dat pyruvaat naar lactaat18is geconverteerd. Lactaat dehydrogenase activiteit heeft ook gevolgd met magnetische resonantie beeldvorming (MRI). 13 C-pyruvaat kan worden beheerd en de omzetting van pyruvaat naar lactaat kan worden gecontroleerd als de verhouding tussen [1 -13C] lactaat / [1 -13C] pyruvaat. Verhoogde ratio's van [1 -13C] lactaat / [1 -13C] pyruvaat zijn waargenomen in kanker weefsel19. Terwijl de MRI-gebaseerde benaderingen kunnen informatie geven over lactaat dehydrogenase activiteit in normale en ziekte weefsels, hebben de methoden niet de resolutie nodig voor het bepalen van het niveau van de activiteit in specifieke cellen. De methodologie die hier geboden kan informatie verstrekken over lactaat dehydrogenase activiteit in weefsel gebieden en zelfs in afzonderlijke cellen.

Met behulp van in situ activiteit testen, vonden we dat de activiteit van lactaat dehydrogenase hoog in de haarfollikel cellen van de stam van muis huid20 is. Wij ook gebruikt de methode aan de activiteiten van lactaat dehydrogenase in gekweekte embryonale stamcellen controleren en vond dat de activiteit is hoger in de cellen van de stam dan de feeder laag. Tenslotte, wij gecontroleerd van de activiteit van lactaat dehydrogenase in verse muis aorta en waargenomen vlekken in de zachte spiercellen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor lactaat dehydrogenase bewakingsactiviteit in bevroren muis huid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten beschreven werden goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier aan de Universiteit van Californië, Los Angeles.

1. het genereren van dia's van bevroren muis huid

  1. Euthanaseren muizen overeenkomstig het beleid van de instelling.
    Opmerking: Volg institutioneel beleid voor beschermende kleding. Alle protocollen waarbij dieren moeten worden goedgekeurd door de Commissie voor de institutionele zorg van dier.
  2. Verwijderen van de muis haar met een dierlijke tondeuse.
  3. Maak incisies in de huid met behulp van schaar. Met behulp van Tang, til de huid uit de buurt van de muis. Met behulp van schaar, het gedeelte van de huid weggesneden.
  4. Vul de cryomold met bevriezing reagens samengestelde (Zie Tabel van materialen).
  5. Plaats huid secties in gevulde cryomolds met behulp van naald-nosed tang. Oriënteren huid zodat weefsel segmenten een dwarsdoorsnede van de huid van de epidermis de dermis en de hypodermis spier (Figuur 2 genereert).
    Opmerking: indien mogelijk mount experimentele en controle van muizen samen in de zelfde cryomold zodat ze kunnen worden gesegmenteerd op dezelfde dia en samen verwerkt. Wees voorzichtig niet te maken van de bubbels.
  6. Plaats cryomold op het vlakke oppervlak van een blok van droog ijs in een ijsemmer en laat bevriezen. Blijven observeren van de oriëntatie van de huid. Pas indien nodig.
    Opmerking: Cryogene handschoenen dragen bij de behandeling van droog ijs.
  7. Pipetteer cryomolds in een vriezer-80 ° C voor opslag. Monsters kunnen worden gehandhaafd in de vriezer voor ongeveer 3 maanden zonder een significant verlies van enzymatische activiteit. Laat niet bevroren secties uitdrogen.
  8. Met behulp van een cryostaat bij-20 ° C, segment weefsel maken secties 7-10 µm dik voor de beste huid morfologie21.

2. voorbereiding van de dia's van de kleuring

  1. Stellen het aantal dia's die moeten worden getest. Omvatten een besturingselement dia waarop NAD zal worden ingehouden en een ander besturingselement dia waarop het substraat, lactaat, zal worden ingehouden. Omvatten een positieve controle dia uit een blok van de bevroren weefsel eerder onderzocht.
  2. Kort vast dia's met huid secties met 4% formaline voor 5 min hetzij door pipetting 1 mL 4% formaline in de dia verschijnt of bij de verwerking van meerdere dia's, door dompelen van dia's in een container met 4% formaline.
    Opmerking: De fixatie zorgt dat de huid doet niet schil af uit de dia's gedurende de volgende procedures en behouden de morfologie van de huid.
    Let op: Formaline is een kankerverwekkende stof en gevaarlijke; Draag handschoenen, laat niet het raken van uw huid en het uitvoeren van deze stap in een chemische zuurkast.
  3. Wassen dia's met ten minste 1 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7.4, per dia door pipetteren of dompelen.

3. voorbereiding van de kleurstofoplossing

  1. Vortex samen reagentia voor lactaat dehydrogenase activiteit kleuring (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM fenazine methosulfate (PMS), 600 µM nitrotetrazolium blauwe chloride en 30 mM lactaat) in een gepaste afmetingen buis afhankelijk van de hoeveelheid vlekken oplossing vereist.
    Opmerking: 1 mL is voldoende voor één dia volledig.
  2. Bereid een tweede oplossing waarin alle reagentia behalve NAD aanwezig zijn. Bereid een derde oplossing waarin alle reagentia behalve lactaat aanwezig zijn.

4. Incubeer dia's in de kleurstofoplossing

  1. Pipet zachtjes de kleurstofoplossing of besturingsoplossingen in de voorbereide dia's die betrekking hebben op het gedeelte in zijn geheel (1 mL is voldoende voor één dia). Als u meerdere dia's samen worden verwerkt, dompel u alle dia's in de kleurstofoplossing tegelijkertijd (zorg ervoor dat de container heeft genoeg oplossing voor het volledig bedekt de weefselsectie).
  2. Incubeer de dia's in een bevochtigde omgeving bij 37 ° C in het donker. Als kleurstofoplossing boven de dia wordt weergegeven, plaatst u de dia in een bevochtigde omgeving ter voorkoming van verdamping.

5. toezicht op de dia 's

  1. Toezicht op de omzetting van de kleurstofoplossing van duidelijk blauw door visuele inspectie. Wanneer de monsters hebt bereikt het gewenste niveau van blauwheid, zet de reactie stop doordat de kleurstofoplossing.
    Opmerking: Voor de huid, 10 min is voldoende. De tijd hangt af van het orgel en de enzymatische activiteit.
  2. Dia's met fosfaat gebufferde zoutoplossing te spoelen door pipetteren (1 mL is voldoende voor elke dia) of dompelen.
    Opmerking: Alle monsters die moeten worden vergeleken aan elkaar moeten worden gehandhaafd in kleurstofoplossing voor de zelfde hoeveelheid tijd.

6. counterstain en monteren

  1. Pipetteer een counterstain in de dia's wanneer de dia's een passend niveau van blauwheid hebt bereikt.
    Opmerking: Counterstains die de kernen rode of groene zorgt voor goed contrast met de blauwe gemaakt door de formazan precipitant.
  2. Monteren met waterige of niet-waterig medium22montage. Één tot drie druppels (40-50 µL) montage medium is voldoende is afhankelijk van de grootte van de cover slip.

7. het beeld van dia's en kwantificeren

  1. Dia's voor een afbeelding onder een lichte Microscoop. Neem foto's van experimentele en controlemonsters en alle negatieve controles op 10 X, 20 X en 40 X vergroting.
  2. Het bepalen van de intensiteit van de blauwe vlek in verschillende regio's met de software van de analyse van de afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaten voor in situ activiteit testen in muis huid20hebben we eerder gemeld. Zoals blijkt uit Figuur 3, vastgesteld we hebben dat hoge niveaus van lactaat dehydrogenase activiteit in de haarfollikel stamcellen aan de basis van de haarfollikel als hierboven de procedures beschreven werden gevolgd. Deze bevindingen werden bevestigd door fluorescentie geactiveerd cel sorteren van de huid voor de cellen van de stam van de haarfollikel en de bevestiging van de hoge lactaat dehydrogenase activiteit in het compartiment van de cel van de stam met activiteit testen op gesorteerde cellen.

Op basis van onze bevindingen hebben de cellen van de stam van de haarfollikel hoge lactaat dehydrogenase activiteit, we uitgebreid onze studies van gekweekte embryonale stamcellen. Muis embryonale fibroblasten bijeenkomen een feeder laag werden geanalyseerd afzonderlijk of in aanwezigheid van embryonale stamcellen. Om gekweekte cellen te analyseren, het medium was aanzuiging, en de cellen werden kort vast en geïncubeerd met lactaat dehydrogenase kleurstofoplossing zoals hierboven beschreven. We waargenomen hoge lactaat dehydrogenase activiteit in de embryonale stamcellen ten opzichte van de muis embryonale fibroblasten (Figuur 4).

We hebben ook het protocol van de kleuring toegepast op vers geïsoleerde weefsel. Muis aortas werden ontleed en open gesneden. De schepen werden geopend en geïmmobiliseerd zodat de binnenkant lumen van de aortas toegankelijk was. Monsters werden geïncubeerd met Henks evenwichtig zoutoplossing met 0,5% Triton-X voor 10 min, dan met de lactaat dehydrogenase kleurstofoplossing voor 10 min. lactaat dehydrogenase kleurstofoplossing werd toegepast op het verse weefsel. Na incubatie werden beelden verzameld, met vlekken in de zachte spiercellen (Figuur 5).

Figure 1
Figuur 1 : Chemische activiteit van lactaat dehydrogenase en opsporing van kanker. Lactaat dehydrogenase omgezet in melkzuur + NAD pyruvaat NADH + H+. Het proton dat wordt gegenereerd, vermindert nitroblue tetrazolium naar formazan, die een blauwe neerslag zal vormen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Schematische van oriënteren muis huid in cryomolds. Muis huid moet worden georiënteerd binnen cryomolds zodat elke gesneden sectie een dwarsdoorsnede van de gehele huid van de epidermis, de dermis, de hypodermis, en de spier bevat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Lactaat dehydrogenase verkleuring van de huid van de muis onthult hoogactieve in de cellen van de stam van de haarfollikel. Muis huid was bevroren in cryomolds en geïncubeerd met lactaat dehydrogenase lactaat kleurstofoplossing bevatten. Lactaat dehydrogenase activiteit was prominent in de cellen van de stam van de haarfollikel. (A, B) Twee afbeeldingen van lactaat dehydrogenase activiteit kwantitatieve analyse van de huid van de muis. (C, D) Twee afbeeldingen van besturingselement kleuring met het substraat lactaat ingehouden. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Hoge lactaat dehydrogenase activiteit in gekweekte muis embryonale stamcellen. Gekweekte muis embryonale stamcellen gekweekt op een bestraalde muis embryonale fibroblast feeder laag werden geanalyseerd voor lactaat dehydrogenase activiteit. Hoogactieve werd waargenomen in de cellen van de stam in vergelijking met de fibroblasten. Muis embryonale fibroblasten toonde vergelijkbare niveaus van kleuring met en zonder bestraling. Beelden werden genomen met een 20 X doelstelling. Schaal bar = 50 µm. (A, B, D, E) muis embryonale fibroblasten en cellen van de stam. (C, F) Muis embryonale fibroblasten alleen. (A-C) Beelden werden genomen na 7 minuten incubatie met kleurstofoplossing. (D-F) Beelden werden genomen na 20 minuten van incubatie met de kleurstofoplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Hoge lactaat dehydrogenase activiteit in de zachte spiercellen rondom de muis aorta. Aortas werden geïsoleerd van euthanized muizen. Schepen werden vastgesteld voor 2 minuten in 2% paraformaldehyde en gewassen 3 x 10 minuten in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing. Schepen werden geïncubeerd met Henks evenwichtige zoutoplossing met 0,5% Triton-X en gewassen 3 x 5 minuten in een fosfaatgebufferde zoutoplossing. Lactaat dehydrogenase kleurstofoplossing werd toegevoegd en monsters werden gedurende 10 minuten bij 37° C geïncubeerd en gewassen van 3 x 5 min met 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Monsters werden vervolgens vastgesteld gedurende 1 uur in de 2% paraformaldehyde, 3 x 5 min met 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing gewassen en beeld. (A) lactaat dehydrogenase oplossing met lactaat. (B) lactaat dehydrogenase oplossing zonder lactaat als negatieve controle. Voor elke sectie, er is een afbeelding met een lagere vergroting aan de linkerkant en een daarvoor aangewezen gedeelte met hogere vergroting aan de rechterkant wordt weergegeven. (A, B) Volledige lactaat dehydrogenase oplossing met lactaat werd gebruikt voor de kleuring. B is dat een vergroot beeld in het aangegeven gebied in de afbeelding A. (C, D) lactaat dehydrogenase oplossing zonder lactaat werd gebruikt voor de kleuring als negatieve controle. D is een vergroot beeld van het aangegeven gebied in C. A en C werden genomen met 20 X doelstellingen (schaal bar = 50 µm) en B en D werden genomen met een 40 X doelstelling (schaal bar = 20 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven methode kan worden gebruikt om de activiteit van lactaat dehydrogenase of andere metabole enzymen die resulteren in NADH of NADPH, verschillende soorten cellen binnen een weefsel of binnen verschillende gedeelten van een weefsel na verloop van tijd te controleren. Lactaat dehydrogenase is een belangrijk enzym voor het begrip van de biologie van stamcellen en tumoren, en de mogelijkheid om lactaat dehydrogenase activiteit in afzonderlijke cellen te controleren is waarschijnlijk belangrijk inzicht verwerven in de functie van dit enzym.

Een belangrijk voordeel van dit protocol in vergelijking met andere methoden is dat de mogelijkheid om monitor enzymatische activiteit, in plaats van gewoon eiwit overvloed, kan resulteren in meer overtuigende informatie over niet alleen waar lactaat dehydrogenase enzymen zijn aanwezig is, maar waar zijn ze daadwerkelijk functioneel. De hier beschreven aanpak kan worden gecombineerd met immunohistochemistry, zodat het niveau van een geselecteerde eiwit, bijvoorbeeld een cel lineage marker, wordt bepaald in de dezelfde weefselsteekproeven als lactaat dehydrogenase activiteit. Ten opzichte van de MRI-gebaseerde benaderingen voor de bewakingsactiviteit lactaat dehydrogenase, heeft het protocol geboden het voordeel dat het kan meer ruimtelijke resolutie bieden en helpen om te bepalen van de specifieke cellen binnen een weefsel met hoge enzymatische activiteit . Ten opzichte van de benaderingen van toewijzing metabolisme gebaseerd op fluorogenic ondergronden, wordt detecteert signaal met het protocol beschreven niet beperkt door autofluorescence1. Miller en co-auteurs uitgevoerd een soortgelijke analyse van de tijdafhankelijkheid en substraat afhankelijkheid van vijf verschillende enzymen door conversie naar formazan7toezicht. De reacties waren ontdekt stoichiometrische beginselen van enzymkinetiek. Miller en co-auteurs DN mitochondriale enzymen uit niet-mitochondriale enzymen door co lokalisatie met mitochondriale kleuring7. Ze 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium chloride (CTC) gebruikt als een reagens van de detectie gevolgd door confocale microscopie voor subcellular localisatie van mede analyse7.

De beschreven methode heeft ook nadelen. Terwijl MRI-gebaseerde benaderingen kunnen worden gebruikt in levende organismen, vereist de beschreven aanpak bevroren of vers weefsel. Bevroren weefsels zijn alleen geschikt voor een paar maanden, omdat de activiteit van de enzymen degraderen na verloop van tijd zelfs wanneer bevroren. Verder, omdat het substraat in overmaat wordt geleverd, de aanpak biedt informatie over "activiteit potentieel" uitgaande van substraat aanwezig is. Als de niveaus van het substraat beperken, dan is de verdeling van de activiteit waargenomen met deze test kan afwijken van de hoeveelheid activiteit die fysiologisch optreedt. Bovendien, als er verschillende isoforms van het zelfde enzym die dezelfde enzymatische activiteit uitvoeren, is de methode die hier gepresenteerd niet onderscheid kunnen maken tussen hen. Bijvoorbeeld, onderscheid de methode gepresenteerd geen tussen de activiteit van LDHA versus LDHB. Een benadering te pakken die dit probleem zou moeten gebruiken genetisch gemanipuleerde muizen waarin een isovorm één enzym genetisch geïnactiveerd is.

We hebben geëxperimenteerd met PMS, een fotochemisch stabiele elektron-vervoerder die elektron overdracht tussen NADH en tetrazolium bemiddelt kleurstoffen23. Terwijl sommige wetenschappers hebben gemeld dat de PMS glucose-6-fosfaat dehydrogenase activiteit remt en PMS nutteloze5gevonden, vonden we het PMS waardevol zijn voor enzym lokalisatie en opnemen in ons protocol. Sommige andere auteurs hebben gerapporteerd op basis van polyvinyl alcohol te beperken van de verspreiding van glucose-6-fosfaat dehydrogenase enzym1. In onze experimenten, we did niet vondst de polyvinyl alcohol nuttig en geëlimineerd het.

Een paar stappen zijn cruciaal voor het welslagen van de kleuring. Een belangrijke kwestie is ervoor te zorgen dat de weefselmonsters worden goed in de cyromolds geplaatst. Huid secties dienstig te plat zodat segmenten dwars door de huid. Bovendien, als meerdere secties worden voorbereid, is het ideaal als ze worden ingebed binnen de dezelfde cryomold zodat ze samen kunnen worden gesneden op dezelfde dia.. Dit zal bijdragen tot het elimineren van variatie toe te schrijven aan de dikte van de dia die wordt gesneden met de cryostaat. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat het weefsel enzymatische activiteit behoudt.

De beste tijd om het einde van de reactie moet empirisch worden bepaald. Het is noodzakelijk om de dia's blijven volgen gedurende de incubatieperiode en het bepalen van het juiste moment toe te voegen counterstain en monteren van de dia's op basis van de intensiteit van de blauwe vlek. Als de monsters zijn te licht gekleurd, is het niet mogelijk om te bepalen wanneer een activiteit is. Als de monsters zijn overstained, kan de formazan neerslag verspreiden, waardoor het moeilijk is om na te gaan van de specifieke gebieden die oorspronkelijk hoge activiteit waren.

Wij verwachten dat dit protocol zullen waardevol voor wetenschappers met een breed scala van vragen over de rol van het metabolisme. Toepassingen omvatten mede kleuring voor metabole activiteit en cel lineage markeringen of markeringen van de proliferatie, beoordelen van de bijdragen van verschillende enzymen met genetische modellen, beoordeling van subcellular localisatie van enzymatische activiteit, toezicht enzymatische activiteit in zieke weefsel of tijdens de ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende belangen openbaar te maken.

Acknowledgements

HAC was de Milton E. Cassel geleerde van de Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan HAC van nationale Instituut voor algemene medische wetenschappen R01 GM081686, R01 AR070245, Rijksinstituut voor algemene medische wetenschappen R01 GM0866465, de Eli & jongevrouw brede Center van regeneratieve geneeskunde & stamcelonderzoek ( Rose heuvels en Hal Gaba awards), de Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, de maatschappij van de leukemie lymfoom, Impact awards van de Jonsson uitgebreide Cancer Center WEL te HAC. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award nummer P50CA092131. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. HAC is een lid van de Eli & jongevrouw brede Center van regeneratieve geneeskunde & stamcelonderzoek, de UCLA moleculaire biologie-instituut en het UCLA Bioinformatics interdepartementale programma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical instruments For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm Fisher Scientific NC9511236 For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound Fisher Scientific NC9638938 For mounting cryomolds
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide Fisher Scientific 12-545-78
4% formalin Fisher Scientific 23-245-684 Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base Fisher Scientific 23-245-684
NAD Sigma-Aldrich N7004
Phenazine methosulfate Sigma-Aldrich P9625
Nitrotetrazolium blue chloride Sigma-Aldrich N6876
Lithium L-lactate Sigma-Aldrich L2250 Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain Anatech 861 Counter stain
Mounting medium Vector Laboratories H-5000 
Cover slips for slides Fisher Scientific 12-544D
Light microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
  2. Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
  3. Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. Bios. (1992).
  4. Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
  5. Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
  6. Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
  7. Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. (2017).
  8. Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
  9. Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
  10. Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
  11. Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
  12. Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
  13. Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
  14. Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
  15. Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
  16. Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
  17. Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
  18. Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
  19. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
  20. Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. (2017).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).
  22. Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
  23. Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics