Detectie van virussen van Bioaerosols met behulp van Anion Exchange hars

JoVE Journal
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een anion wisselen hars gebaseerde methode, aangepast aan vloeistof impingement gebaseerde bioaerosol bemonstering van virussen is aangetoond. Wanneer gekoppeld aan downstream moleculaire detectie, zorgt de methode voor facile en gevoelige detectie van virussen van bioaerosols.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schaeffer, J. W., Chandler, J. C., Davidson, M., Magzamen, S. L., Pérez-Méndez, A., Reynolds, S. J., Goodridge, L. D., Volckens, J., Franklin, A. B., Shriner, S. A., Bisha, B. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (138), e58111, doi:10.3791/58111 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dit protocol wordt een aangepaste bioaerosol bemonsteringsmethode voor virussen. Anion uitwisseling hars is in dit systeem, in combinatie met vloeibare impingement-gebaseerde air sampling apparaten voor effectieve concentratie van negatief geladen virussen van bioaerosols. Dus, de hars fungeert als een extra concentratie stap in de werkstroom bioaerosol bemonstering. Nucleïnezuur extractie van de virale deeltjes wordt vervolgens rechtstreeks vanuit de anion uitwisseling hars, met het resulterende monster geschikt voor moleculair analyses uitgevoerd. Verder, dit protocol beschrijft een custom-built bioaerosol kamer geschikt voor het genereren van virus-beladen bioaerosols onder een verscheidenheid van milieu-omstandigheden en rekening houdend met de continue monitoring van omgevingsvariabelen zoals temperatuur, vochtigheid, windsnelheid en de massaconcentratie aërosol. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van dit protocol is verhoogde gevoeligheid van de detectie van virale, zoals beoordeeld via directe vergelijking met een ongewijzigde conventionele vloeibare impinger. Andere voordelen zijn het potentieel te concentreren divers negatief geladen virussen, de lage kosten van anion uitwisseling hars (~$0.14 per monster), en gebruiksgemak. Nadelen onder meer het onvermogen van dit protocol te beoordelen van de infectiviteit van hars-geadsorbeerde virale deeltjes, en potentieel de noodzaak voor de optimalisatie van de vloeistof bemonstering buffer gebruikt binnen de impinger.

Introduction

Het doel van deze methode is een zeer gevoelige bioaerosol bemonstering platform om moleculaire detectie van virussen negatief geladen bioaerosols te bieden. Micro-organismen, met inbegrip van virale deeltjes, kunnen overleven in bioaerosols voor langere tijd1. Bioaerosols kunnen reizen over relatief lange afstanden en onderhouden van levensvatbaarheid en infectiviteit, zoals blijkt uit een uitbraak van veteranenziekte die afkomstig van industriële koeltorens zijn, gelegen op een afstand van 6 km van de getroffen personen en resulteerde in 18 doden2. Indirecte overdracht van virussen bij de mens gemedieerd door bioaerosols kan voorkomen in meerdere instellingen en heeft aangetoond voor uitbraken van norovirus in scholen en restaurants3,4. Evenzo, bioaerosol transmissie van virussen kan optreden in agrarische instellingen zoals in varkens en pluimvee boerderijen, met deze transmissie route wordt beschouwd als een belangrijke factor in het verkeer van virussen tussen productie faciliteiten5, 6 , 7 , 8 , 9.

Effectieve bemonstering van virus-beladen bioaerosols zorgt voor verbetering in de snelle diagnostiek en paraatheid in geval van uitbraak preventie, zoals wordt weergegeven in de demonstraties in welke H5 influenza een virussen werden waargenomen van bioaerosols in levende dier in China markten en de Verenigde Staten10,11. Huidige bioaerosol bemonstering technologieën omvatten een aantal verschillende deeltje vangen beginselen, en in grote lijnen kunnen worden onderverdeeld in impingers, cyclonen, botslichamen en filters,12. Het valt buiten het toepassingsgebied van dit protocol uitputtend voor alle voordelen en nadelen van deze platforms voor bemonstering van virussen van bioaerosols; echter kan worden gesteld dat de meerderheid van deze bemonstering apparaten niet zijn geoptimaliseerd voor het verzamelen van virussen en bacteriofagen13. Infectiviteit van virale deeltjes is bovendien vaak negatief beïnvloed, met vloeibare impingers beschouwd als virale infectiviteit effectiever dan bemonstering van apparaten zoals solid botslichamen of filters14handhaven. Een nadeel van vloeibare impingement is echter het doel verwateringseffect, die optreedt omdat virussen verzameld in relatief grote hoeveelheden (meestal ≥20 mL) vloeistof in het vat van de collectie worden. Een ander belangrijk nadeel houdt de suboptimaal efficiëntie van vloeibare impingers te concentreren deeltjes < 0,5 µM in grootte15. Echter is dat de efficiëntie van de opname van deze apparaten kan worden verbeterd door immobilisatie op solide matrices, zoals immobilisatie met behoud van virale nucleïnezuren en virale infectiviteit16,17 verbeteren kan.

Wij hebben eerder aangetoond dat anion uitwisseling hars een doeltreffend instrument voor het afvangen en de concentratie van virussen van vloeibare matrices is, met inbegrip van F-RNA bacteriofagen, hepatitis A-virus, menselijke adenovirus en rotavirus18,19 ,20. Zoals omschreven door de fabrikant, is de anion uitwisseling hars gebruikt in dit werk een macroreticular polystyreen sterke base anion uitwisseling hars waarin matiemaatschappij quaternaire amine groepen bemiddelen attractie en de verovering van anionen in een vloeibaar medium21 . Bijgevolg, het anion uitwisseling hars wordt verwacht te vangen van de virussen met net-negatieve oppervlakte kosten, met inbegrip van vele darmen virussen, influenzavirussen en andere virussen die relevant zijn voor de volksgezondheid en diergezondheid.

Het huidige protocol omvat de toevoeging van een vloeibare impinger hars anion uitwisseling. In dit systeem fungeert de hars als een secundaire concentratie stap voor virale deeltjes gevangen in de impinger vloeistof. Nucleic zuren kunnen dan direct in kleine volumes, een geconcentreerde steekproef te voorzien van moleculair analyses worden uitgewassen. Dus, het belangrijkste voordeel van deze methode is de verbetering van de gevoeligheid van de virale detectie, voornamelijk door middel van vermindering van monstervolume. Bovendien, als gevolg van de inherente aspecifieke verovering van negatief geladen virussen, de methode is waarschijnlijk die van toepassing zijn voor de detectie van een groot aantal virussen van belang. Hier is de methode voor de vaccinstammen van type A en type B-influenzavirussen en het FRNA coliphage MS2 (MS2) aangetoond. Deze virussen zijn later ontdekt met behulp van standaard qRT-PCR-testen als eerder beschreven22. De eindpunt-gebruiker moet niet verwachten dat problemen bij het uitvoeren van deze methode, omdat wijzigingen in de momenteel bestaande apparatuur vormen geen grote verstoringen van de conventionele stroom van bioaerosol bemonsterings- en analysemethoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. installatie van de kamer van Bioaerosol (Zie Figuur 2)

  1. Pre-load van de vloeibare impingers met 20 mL 0,01 M fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7.5 (PBS).
    1. Voeg toe 0,5 g anion uitwisseling hars en schorten binnen de PBS van één van de vloeibare impingers, met een andere vloeibare impinger bijeenkomen van een besturingselement.
  2. Positie vloeibare impingers parallel in de kamer van de bioaerosol stands van de klem met aërosol inhammen geconfronteerd met de vernevelaar.
    Opmerking: Zie Figuur 2 voor verdere bijzonderheden.
  3. Samen Zoek een monitor direct lezen aërosol in de buurt van de vloeibare impingers voor het meten van massa concentratie (mg/m3) van de bioaerosol.
  4. Extra direct lezen instrumentatie (binnenlucht kwaliteit monitor en thermische anemometer) samen te vinden in de buurt van de vloeibare impingers om te controleren van de omgevingsvariabelen, zoals temperatuur, relatieve vochtigheid en wind snelheid, binnen de bioaerosol-zaal.
  5. Axiaalventilatoren worden uitgevoerd in de hoeken van de kamer van de bioaerosol om de vermenging van aërosol.
    Opmerking: Axiaalventilatoren draaien op een vaste snelheid en zijn niet verstelbaar.

2. model Bioaerosolization experimenten (Zie Figuur 3)

  1. Seriële poort, 10-fold verdunningen van MS2 bacteriofaag en influenza vaccin aan gewenste concentraties in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) uitvoeren.
    Opmerking: Om aan te tonen van de methode hier 103.5 FFU/mL van het type A en B virus vaccin influenzastammen en 105 PFU/mL van de bacteriofaag MS2 worden gebruikt. Om te bepalen titers voor het entmateriaal, zijn bacteriofagen doorgegeven in Escherichia coli HS (pFamp) R en opgesomd als eerder beschreven20. De commerciële vaccin bevat bekende hoeveelheden van de vier levende verzwakte influenza virusstammen, twee type een influenza-virussen en twee typeB influenzavirussen, uitgedrukt in eenheden van fluorescerende focus of FFU.
  2. Bereiden van entmateriaal binnen het glas vaartuig van een vernevelaar 6-jet botsing door het creëren van schorsingen van de gewenste concentraties van virale deeltjes in 100 mL PBS en installeren binnen de aangepaste bioaerosol-zaal.
  3. Initiëren van instrumentatie voor het meten van variabelen in de vergaderzaal van de bioaerosol, zoals temperatuur, % relatieve vochtigheid, CO2-concentratie, en windsnelheid (gegenereerd met behulp van een Axiaal ventilator). Een direct-lezen aërosol monitor gebruiken om bij te houden van de massaconcentratie binnen de bioaerosol kamer en om consistentie binnen en tussen de proeven.
  4. Zegel van de bioaerosol-zaal en purge voor 10 min met HEPA-gefilterd lucht.
  5. Gefilterde, gedroogde lucht leveren aan de vernevelaar op 6.9 kPa.
  6. Een concentratie van de doelgroep van virale bioaerosols (via vernevelaar) genereren in elke proef bioaerosol-zaal. Voor deze demonstratie vormt en worden bioaerosols met een concentratie van 5 mg/m3 gegenereerd.
  7. Zodra de massaconcentratie van de doelstelling van het aërosol is bereikt, stopt de nebulization.
  8. Werken een luchtpomp voor bemonstering voor elke vloeibare impinger die is gekalibreerd met een debiet van 12,5 L/min. gedrag kalibratie met een standaard primaire stroom vóór en na elke bemonstering evenement te zorgen voor samenhang in de bemonstering van volume. Levering verdunning lucht via een HEPA-gefilterd-lijn in de buurt van de vernevelaar en constante druk in de zaal blijven.
  9. Actief genieten van de sfeer van de kamer bioaerosol voor een periode van 40 min tot een volume van de bemonstering van 500 L per monster.
    Opmerking: Bemonstering voor 40 min op 12,5 L/min met twee pompen parallel maakt het mogelijk voor bemonstering van 1.000 L van de bioaerosol. Dus, aan het einde van het experiment verwacht wordt dat de meerderheid van de lucht in de bioaerosol zaal is bemonsterd en in het milieu via een systeem van HEPA-gefilterd vrijgegeven. Dit blijkt uit de afname van de concentratie van het deeltje. Na experiment, oppervlakken worden ontsmet met 10% huishoudelijk bleekmiddel en 70% ethanol. Indicatoren worden gebruikt in deze demonstratie; echter, indien bekend pathogene organismen worden gebruikt in dit systeem, extra bioveiligheid maatregelen kunnen worden uitgevoerd indien nodig.

3. nucleïnezuur extractie en qRT-PCR detectie

  1. Isoleren van nucleïnezuren rechtstreeks vanuit anion uitwisseling hars en, voor vergelijkingsdoeleinden, uit de vloeistof binnen de vloeibare impingers gebruikt. In dit voorbeeld een RNA isolatie procedure wordt beschreven, maar een vergelijkbaar protocol kan worden gebruikt voor DNA-virussen.
    1. Nucleïnezuur afscheiding van de anion uitwisseling hars.
      1. Alle van de anion uitwisseling hars-bevattende vloeistof van de vloeibare impinger overbrengen in een steriele 50 mL conische buis.
      2. Laat de hars te regelen, en langzaam decanteren in de vloeibare monster uit de hars van de uitwisseling anion. Gebruik een 1 mL pipet tip alle van de resterende vloeistof van het anion uitwisseling hars te verwijderen.
      3. Een virale RNA isolatie kit, voeg 560 µL van virale lysis-buffermengsel met vervoerder RNA rechtstreeks naar de anion uitwisseling hars en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met periodieke mengen.
      4. Met behulp van een 1 mL pipet tip, transfer de virale lysate (de virale lysis-buffermengsel) tot een steriele 1,5 mL conische buis en ga verder met RNA isolatie met behulp van een virale RNA-isolatie kit (Zie Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant, behalve dat RNA wordt geëlueerd in een totaal volume van 60 µL van elutie buffer.
    2. Nucleïnezuur afscheiding van vloeibare impingers.
      1. Pipetteer 140 µL van het vloeibare monster in een steriele 1,5 mL conische buis en het uitvoeren van RNA isolatie met behulp van de virale RNA isolatie kit overeenkomstig de instructies van de fabrikant, met uitzondering van eluerende RNA in een totaal volume van 60 µL van elutie buffer.
        Opmerking: 140 µL is het maximale monstervolume dat met de specifieke virale RNA isolatie kit hier tewerkgesteld in een-voor-stapmodus preparaat kan worden verwerkt.
  2. Uitvoeren qRT-PCR voor detectie van MS2 en influenza-A en B-virussen als eerder beschreven23,24. In deze demonstratie vormt en 5 µL van nucleïnezuur eluaten gebruikt voor qRT-PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont het beginsel achter kosten gebaseerde vangst van de virussen van bioaerosols via opneming van hars in vloeistof gebaseerde impingers. Figuur 2 toont de setup van de op maat gemaakte bioaerosol kamer. Figuur 3 beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het opzetten van het experiment van de aerosolization en de maatregelen om te zorgen voor kwaliteitscontrole. Figuur 4 toont amplificatie curven voor qRT-PCR detectie van negatief geladen virussen opgevangen uit bioaerosols. Tabel 1 toont de primers en sondes voor qRT-PCR voor de voorbeeld-virussen gebruikt in deze studie gebruikt.

Met behulp van MS2 en influenza virussen binnen het griepvaccin als modellen in de aangepaste bioaerosol-zaal, de vloeibare impingers bewerkt met anion uitwisseling hars toegestaan voor ongeveer 3 x 9 x verbetering detectie van virale, afhankelijk van de specifieke virus, in vergelijking tot het testen van de directe impingement vloeibare22. Zoals blijkt uit representatief qRT-PCR versterking curven (Figuur 4), detectie van een influenza-virussen kunnen worden bereikt tot 3.26 type cycli vroeg toen anion uitwisseling hars werd gebruikt in vergelijking tot het testen van de directe impingement vloeistof. Gezien het feit dat een qRT-PCR dat is 100% efficiënt, een winst van een Ct correspondeert met een 2-fold stijging van de concentratie van de doelgroep, is dit verschil gelijk aan een 9,58 x verbetering in de opsporing.

Figure 1
Figuur 1: vloeibare impingement gekoppeld anion uitwisseling hars. Elk van de gewijzigde bioaerosol bemonstering apparaten integreert een anion uitwisseling hars in het ontwerp. Elke kraal hars is een 0.5 tot 1.0 mm bol met een poreuze oppervlak, een kenmerk dat de oppervlakte van het anion uitwisseling toeneemt. Functionele quaternaire ammoniumzouten groepen kunnen voor het vastleggen van ionen in vloeibare media, bemiddelen vangen van virussen met net-negatieve oppervlakte kosten, met inbegrip van MS2, coliphages en influenza virussen, die worden gebruikt in dit protocol als modelorganismen (een staart bacteriofaag wordt getekend als een voorbeeld voor gevangen virussen). Isolatie van de nucleïnezuur gebeurt vervolgens rechtstreeks vanuit de hars (met behulp van commercieel beschikbare kits), met het monster geschikt voor meest moleculaire detectie strategieën (qRT-PCR hier werkzaam). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Afbeelding 2: aangepaste bioaerosol kamer schematische. A: 6-jet vernevelaar kopen met gefilterde en gedroogde lucht bij een genererende druk van 6,9 kPa; B: Axiaalventilatoren om uniforme bioaaerosol mengen; C: aerosol monitor om het identificeren van de relatieve bioaerosol concentraties; D: vloeibare impinger met hars. E: vloeibare impinger zonder hars. F: thermische anemometer voor het meten van de windsnelheid; G: lucht kwaliteit monitor voor het meten van andere omgevingsvariabelen zoals temperatuur, kooldioxide en percent relatieve luchtvochtigheid; H: actieve bemonstering pompen gekalibreerd naar 12,5 L/min; I: pneumatisch verzegelde handschoen poorten voor bemonstering apparatuur positionering binnen de vergaderzaal van de bioaerosol; J: kijkvenster. Dit cijfer werd hergebruikt uit eerdere werk met toestemming van de uitgever22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Workflow van het experiment bioaerosolization. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Anion uitwisseling hars verbetert qRT-PCR-gebaseerde detectie van virussen in bioaerosols negatief geladen. In dit voorbeeld, type A influenzavirussen bij een concentratie entmateriaal voor 103.5 FFU/mL waren aërosol in de aangepaste bioaerosol bedwelmingsruimte totdat de massaconcentratie van bioaerosol 5 mg/m3 bereikt. Vloeibare impingers met en zonder hars verrichtten gelijktijdig naar elk monster (500 L) van de bioaerosol. Virale RNA was verkregen uit de hars van de uitwisseling anion of uit de vloeistof van de impinger en vehiculumcontrolegroep door qRT-PCR. Het experiment werd herhaald in drievoud. Nucleic zuren verkregen uit hars monsters werden ontdekt op een gemiddelde Ct van 26.76, terwijl impinger vloeibare monsters werden ontdekt op een gemiddelde Ct van 30.02 (ΔCt van 3.26). Dit verschil in Ct is gelijk aan een 9,58 x verbetering van detectie met behulp van de anion uitwisseling hars. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Virussen De naam van de primer Primer volgorde Referentie
MS2 Geo-informatie Fwd 5'-ATCCATTTTGGTAACGCCG-3' 23
Geo-informatie sonde 5'-(6-FAM)-TAGGCATCTACGGGGACGA-(BBQ)-3'
Geo-informatie Rev 5'-TGCAATCTCACTGGGACATAT-3'
IAC Fwd (46F) 5'-GACATCGATATGGGTGCCG-3'
IAC sonde 5'-(Cy5) - CACATTCACCAGGGAGACGCATGAGA-(BBQ) -3 '
IAC Rev (186R) 5'-CGAGACGATGCAGCCATTC-3'
type een influenza-virussen CDC universele influenza-A virus voorwaartse primer 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3' 24
CDC universele influenza een virus reverse primer 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3'
CDC universele influenza-A virus sonde 5'-(FAM) - TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-(BHQ1) -3 '
type B-influenzavirussen CDC universele influenza B-virus voorwaartse primer 5'-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3' 24
CDC universele influenza B-virus reverse primer 5'-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3'
CDC universele influenza B-virus sonde 5'-(JOE) - CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-(BHQ1) -3 '

Tabel 1: Primers en sondes in deze studie gebruikt. Alle primers en sondes waren van Friedman et al. 201123 en Selvaraju & Selvarangan 201024.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een methode voor gevoelige virale vangen van bioaerosols met behulp van gemodificeerde vloeibare impingers. De methode is geoptimaliseerd voor de detectie en kwantificering van de virale lading in bioaerosols. De specifieke wijziging hier gedemonstreerd omvat de toevoeging van vloeibare deel uitmaakt van een gemeenschappelijke vloeibare impinger hars anion uitwisseling. Deze methode werd ontwikkeld voor zijn eenvoud in verwerking stroomafwaarts monster, terwijl andere verwerkingstechnieken monster zoals centrifugering, filtratie en neerslag gebaseerde methoden geen voordeel bieden. Extractie van nucleïnezuren wordt uitgevoerd vanuit de hars, het wegnemen van de noodzaak van omvangrijke elutions en meerdere monster voorbereiding stappen, uiteindelijk bij te dragen aan verbeterde detectie gevoeligheid van de methode via vermindering van het effectieve monster volume. Bovendien is gebleken dat immobilisatie van virale deeltjes op vaste oppervlakken kunnen bijdragen tot meer stabiliteit van virale nucleïnezuur of het behoud van virale infectiviteit17,25. Immobilisatie kan het verder bijdragen aan verhoogde opname efficiëntie door vermindering van de verliezen als gevolg van de reaerosolization16. De methode kan eenvoudig worden gekoppeld aan downstream moleculair analyses (qRT-PCR aangetoond hier). Het anion uitwisseling hars kan worden veld-geëxtraheerde en verzonden naar een referentielaboratorium voor analyse, terwijl air-sampling apparatuur gewijd blijven kan aan controle op het gebied van de bemonstering. Zoals het principe achter de procedure de aspecifieke vangst van de virussen impliceert, uitvoering van een net-negatieve oppervlakte lading, wordt de methode verwacht worden vatbaar voor de detectie van meerdere pathogene virussen van belang zijn voor de menselijke gezondheid en diergeneeskunde. Beoordeeld door Michen en Graule26, hebben een groot aantal virussen belangrijk voor de gezondheid van mens en dier net-negatieve oppervlakte kosten, met enkele bekende uitzonderingen na, zoals bepaalde stammen van Rotavirus en polioviruses.

Dit protocol doet niet rechtstreeks het evalueren van het effect van omgevingsfactoren op de gevoeligheid van de detectiemethode; Nochtans, wanneer lucht bemonstering wordt uitgevoerd in Veldinstellingen, is het denkbaar dat variabelen zoals de relatieve vochtigheid en temperatuur over meerdere soorten lucht samplers12collectie efficiëntie kunnen beïnvloeden. Dus, kunnen voorwaarden binnen de bioaerosol kamer om aan te passen deze Omgevings parameters zo nodig worden gewijzigd. Het anion uitwisseling hars methode is aangetoond dat het effectief concentreren meerdere virussen van watermonsters met een breed scala van fysisch-chemische eigenschappen, die aangeeft dat inmenging van fijnstof, bacteriën en andere milieu verontreinigende stoffen naar verwachting minimaal18. Bovendien kunnen de collectie buffers optimalisatie voor specifieke virussen, zoals in sommige gevallen is gebleken dat het optimaliseren van de collectie buffer tot betere retentie van virale stabiliteit27 leiden kunnenverlangen. Een nadeel van de methode zoals voorgesteld is het feit dat het virale infectiviteit niet bepalen. Een ander nadeel van dit protocol is het onvermogen om te beoordelen van de mogelijke negatieve gevolgen van nebulization en lucht bemonstering op virale stabiliteit, met inbegrip van uitdroging, schuintrekken en aspecifieke adsorptie aan oppervlakken22van de kamer van de bioaerosol.

De gewijzigde bioaerosol bemonstering apparaten kunnen worden vatbaar voor veld gebaseerde bemonstering in meerdere instellingen, met inbegrip van ziekenhuizen, scholen, landbouwacties en andere locaties. Omdat wijzigingen worden aangebracht in bestaande lucht bemonstering apparatuur, verwacht wordt dat de gewijzigde apparaten zou gemakkelijk adoptable door exploitanten momenteel bemonstering bioaerosols voor virussen. Het protocol is, blijkt hier in de zaal van een custom-built bioaerosol met behulp van MS2 en influenza virussen, die nuttige doelen voor de ontwikkeling van de methode wijten aan het feit dat zij voorbeelden van niet-gehuld en omhuld virussen vertegenwoordigen, MS2 is erkend als een surrogaat van darmen virussen en zijn vaak werkzaam in de evaluatie van impingers22,26,27,28,29.

Toekomstige werkzaamheden zal betrekken optimalisatie van bemonstering voorwaarden (d.w.z., bemonstering luchtsnelheid, collectie buffers) en de opneming van aanvullende relevante virussen in testprotocollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de financiering van het CDC/NIOSH High Plains Intermountain centrum voor landbouw en gezondheid (5U54OH008085) en de Colorado Bioscience Discovery evaluatie Grant programma (14BGF-16).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) American Type Culture Collection ATCC 15597-B1
FluMist Quadrivalent AstraZeneca Contact manufacturer Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195
Primers and probes Integrated DNA Technologies NA
0.2 µM sterile filter NA NA
1 L pyrex bottles or equivalent NA NA
1 mL pipet tips NA NA
1 mL pipettor NA NA
50 mL serological pipet NA NA
PCR tubes NA NA
Pipet-aid or equivalent NA NA
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
QuantiTect Probe RT-PCR Kit Qiagen 204443
Amberlite IRA-900 chloride form Sigma-Aldrich 216585-500G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK
Water (molecular biology grade) Sigma-Aldrich W4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher 13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes  ThermoFisher 14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher 05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX ThermoFisher 11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set SKC Inc. 225-9593
Vac-u-Go sample pumps SKC Inc. 228-9695
Collison nebulizer (6-jet) BGI Inc. NA
HEPA capsule PALL 12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 TSI Inc. NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A TSI Inc. NA
SidePak AM510 personal aerosol monitor TSI Inc. NA
Bioaerosol chamber NA NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10, (3), 733-748 (1991).
  2. Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can contaminated aerosols spread? The Journal of Infectious Diseases. 193, (1), 102-111 (2006).
  3. Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124, (3), 481-487 (2000).
  4. Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131, (1), 727-736 (2003).
  5. Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8, (8), e71444 (2013).
  6. Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214, (4), 537-545 (2016).
  7. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17, (2), 198-200 (2005).
  8. Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10, (5), e0125401 (2015).
  9. Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150, (26), 804-808 (2002).
  10. Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74, (1), 89-91 (2017).
  11. Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61, (9), 1355-1362 (2015).
  12. Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93, (3), 242-255 (2016).
  13. Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121 (2017).
  14. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72, (3), 413-444 (2008).
  15. Hogan, C. J. Jr Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99, (6), 1422-1434 (2005).
  16. Yu, K. -P., Chen, Y. -P., Gong, J. -Y., Chen, Y. -C., Cheng, C. -C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
  17. Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194, (1-2), 60-66 (2013).
  18. Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
  19. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
  20. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
  21. Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59, (1), 22-42 (2011).
  22. Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
  23. Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173, (2), 196-202 (2011).
  24. Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, (11), 3870-3875 (2010).
  25. Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31, (7), 1904-1910 (2010).
  26. Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109, (2), 388-397 (2010).
  27. Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80, (14), 4242-4250 (2014).
  28. Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
  29. Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L. 3rd, Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10, (8), e0134277 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics