Forhøjet Plus labyrint Test kombineret med Video Tracking Software for at undersøge den angstdæmpende effekt af eksogene Ketogenic kosttilskud

Behavior
JoVE Journal
Behavior
AccessviaTrial
 

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at undersøge ændringer i angst niveau af gnaver dyremodeller. Den forhøjede plus labyrint (EPM) test, bruges sammen med en video, tracking software, giver en pålidelig metode til at dokumentere effekten af forskellige potentielle angstdæmpende behandlinger i prækliniske laboratorium scenarier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ari, C., D’Agostino, D. P., Diamond, D. M., Kindy, M., Park, C., Kovács, Z. Elevated Plus Maze Test Combined with Video Tracking Software to Investigate the Anxiolytic Effect of Exogenous Ketogenic Supplements. J. Vis. Exp. (143), e58396, doi:10.3791/58396 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det overordnede mål med denne undersøgelse er at beskrive metoden i forhøjet plus labyrint (EPM) test i kombination med en video tracking software. Formålet med metoden er at dokumentere effekten af forskellige potentielle angstdæmpende behandlinger på laboratoriet gnavere modeller. EPM test er baseret på gnavere hang mod beskyttede, lukkede mørke rum og ubetingede frygt for åbne rum og højder og deres medfødte intens motivation til at udforske nye miljøer. EPM-test er en udbredt adfærdsmæssige test for at undersøge de angstdæmpende eller anxiogenic svar af gnavere får lægemidler, der er kendt for at påvirke adfærd. Observation demonstrerer en faldt andelen af tidsforbrug på lukkede arme, en øget andel af tid brugt på åbne arme, en reduceret antallet af poster til lukkede arme og et forhøjet antal poster til åbne arme målt af EPM test kan afspejle nedsat angst niveauer. Brug denne metode, er effekten af eksogene keton kosttilskud på angst-relaterede adfærd testet i Sprague Dawley (SPD) rotter. Eksogene keton kosttilskud er kronisk fodret til rotter for 83 dage eller subchronically og akut mundtligt gavaged, dagligt i 7 dage, før du gennemfører EPM test. Indsamlingen af adfærdsmæssige data udføres ved hjælp af SMART video tracking system af en blindet observatør ved udgangen af behandlingerne. De vigtigste resultater viser, at EPM test er en effektiv metode til at registrere keton supplement-induceret angstdæmpende virkning og kan betragtes som et fintmærkende måleinstrument til at vurdere ændringer i angst adfærd forbundet med stof - eller metaboliske-baserede behandlinger.

Introduction

Målet med denne artikel er at beskrive metoden af EPM test i kombination med en video tracking software for at overvåge ændringer i angst-relaterede adfærd og roman behandlinger i laboratoriet gnavere modeller. EPM-testen er en forholdsvis enkel adfærdsmæssige vurderingsmetode, som blev udviklet til undersøgelsen af kvantificere angst adfærd niveauer og angst svar af rotter efter anvendelse af medicin behandlinger1. Ja, det er blevet påvist, at EPM test er en meget brugt og effektiv adfærdsmæssige assay for undersøgelse af ændringer i angst niveauer af gnavere1,2. Anvendeligheden af EPM test i gnavere (hovedsagelig rotter og mus) er baseret på deres hang mod lukkede, mørke rum (tilgang), en ubetingede frygt for åbne rum/højder (unddragelse) og deres høje niveau af medfødte motivation til at udforske roman miljøer. Derfor, EPM test er en veletableret metode baseret på en tilgang-undgåelse konflikt2,3.

EPM er et plus-formet apparat bestående af fire forhøjede arme, som er blevet beskrevet af Handley og Mithani4 (figur 1), og består af to modsatte våben, der er åbent til omgivelserne (åbne arme), mens de to lukkede modsatte arme (lukket våben) er udstyret med vægge. Efter behandling, hvis øget tidsforbrug på de åbne arme og/eller et øget antal åbne arm poster i forhold til kontrol (ubehandlet) dyr registreres på EPM, indikerer dette en angstdæmpende virkning2,3. Den mest robuste undgåelse svar er blevet påvist i de første 5 min efter start (placering af rotter i skæringspunktet mellem de fire arme af EPM'EN) af EPM assay5; Derfor, enhver adfærd efter en behandling er almindeligvis registreret i 5 min på EPM'EN. Som supplerende foranstaltninger af en angst niveau, antallet af hoved dips, stejler (lodret stående af gnaver på to bagben), fækal boli, såvel som samlede arm kan poster (spontan motorisk aktivitet) og forskellige arbejdsstillinger (strækker eller frysning), også registreres på EPM2. Således kan flere adfærdsmæssige parametre kompileres for at give en samlet vurdering af angst-relaterede adfærd.

For at øge validiteten af resultaterne, to til tre adfærdsmæssige assays er almindeligt anvendt sammen, såsom lys-mørke valg test, test social interaktion og EPM-test til at måle angst niveauerne af forskellige dyr modeller6. EPM analysen udføres alene på gnavere er også en passende metode til at undersøge den angstdæmpende eller anxiogenic effekt af forskellige lægemidler7. EPM test er følsomme over ikke kun for benzodiazepin-type angstdæmpende midler (fx, diazepam)8, men også blandt andre amino syre, monoamin, peptidergic og nucleosidergic forbindelser (f.eks., N-methyl-D-aspartat (NMDA) antagonist AP7, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) antagonist CNQX, µ-opioid-receptoren agonist morfin, NPY1 antagonist BIBP3226, substans P, ghrelin, oxytocin, serotonin receptor agonister og antagonister såsom 8-OH-DPAT og Way-100635 og B1-adrenerg antagonist betaxolol)9,10,11,12. EPM analysen på gnavere er derfor en velegnet og følsom metode til at undersøge indflydelsen af forskellige behandlinger, der påvirker hjernen områder involveret i angstdæmpende effekt (fx, amygdala, hippocampus og limbiske områder) og virkningsmekanismer (f.eks., at serotonerge, GABAergic og adenosinergic system) impliceret i angst2. Agenterne testet i disse EPM undersøgelser omfatter eksogene keton kosttilskud, der ændrer hjernen signalering i subtile måder, som kan kræve en følsom metode til at registrere adfærdsændringer.

I denne artikel vil beskrive vi EPM testen anvendes i kombination med en video, tracking software, som hjælper med at fjerne eksperimentelle bias og letter indsamling og analyse af adfærdsmæssige ændringer som reaktion på roman angstdæmpende behandlinger.

Protocol

Den behandling af animalsk og måle procedurer blev udført i overensstemmelse med University of South Florida institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) retningslinjerne (protokol #0006R). Alle bestræbelser var at reducere antallet af dyr, der anvendes.

1. præparater

Bemærk: Protokollen typisk kræver laboratorium-opdrættet rotter eller mus til EPM test. Dog har andre dyr, såsom marsvin, også blevet testet på EPMs13. Det er vigtigt at overveje farvekontrast mellem dyr i labyrinten og labyrint farve, når du bruger video tracking. Kontrasten er mindre vigtig for forskere ser dyr levende eller via video. Indstillingerne for video tracking software skal være konfigureret til at dokumentere, at dyrene er sort eller hvidt på enten sorte eller hvide labyrint. Problemer med konfiguration opsætning kan forekomme med en klar akryl labyrint, men en mat grå labyrint kan være optimal for både gnaver farver.

  1. Vælg dyr for eksperimentet, overvejer potentiale påvirke faktorer som stamme, sex, estrus cyklus, og alder samt kroppens vægt2.
  2. Baseret på den enkelte eksperiment, bestemme antallet af dyr pr. gruppe for testen.
    Bemærk: Gruppestørrelse vil være afhængig af effekt størrelse, der forventes med test behandling. Power analyser er generelt gjort inden forsøget igangsættes for at bestemme det minimum antal fag skal indgå givet variabiliteten i dyrets svar i en given opgave, samt antallet af forsøgsbetingelser grupper.
  3. Designe eksperimentet (hvor et batteri af forskellige adfærdsmæssige test, såsom open-field test, EPM test, hul-board test og tvunget svømning test vil blive brugt) omhyggeligt.
    Bemærk: Pre-eksponering af gnavere til en roman testmiljøet (f.eks. en åben-field test) umiddelbart før EPM tests kan ændre funktionaliteten af dyr på EPM1,2.
  4. Håndtere alle dyr på en lignende måde før EPM test.
    Bemærk: Det er påvist, at forskellige stressfaktorer, anvendelse af stoffer (fx, injektioner), shipping stress og håndtering kan ændre adfærd og adfærdsmæssige reaktioner af gnavere EPM16. Således tilvænning af dyr til et dyr hus (f.eks.efter levering, for 1-2 uger før EPM-test), eksperimentelle betingelser og behandlingsprocedurer (fx, gavaging) er nødvendige. Det er også vigtigt, at håndteringen af gnavere og nogen erfaring med forudgående stressfaktorer, særligt umiddelbart før testning, er konsistent på tværs af dyr og behandlingsgrupper.
  5. De adfærdsmæssige undersøgelser i nataktive dyr, som rotter og mus, ved hjælp af en reverse lys cyklus, således at de adfærdsmæssige vurdering kan udføres, når dyrene er i deres mørke, aktive fase.
    Bemærk: Virkningerne af forskellige boligforhold og lys cyklus/døgnrytmen rytmer på adfærd og deres indflydelse på EPM resultater blev vist tidligere17, da dyrenes hormoner er reguleret af lys cyklus.
  6. Brug de samme eksperimentatorer under procedurerne og bede dem om at undgå parfume eller sæber med en stærk lugt.
  7. Spørg eksperimentatorer ikke at tale i nærheden af dyret under eksperimentet eller flytte objekter i nærheden af EPM-miljø.
    Bemærk: Det er afgørende vigtigt, at observatøren gør minimal bevægelser og ingen støj, når indsamlingen af adfærdsmæssige data.
  8. Ren det hele EPM efter hvert forsøg at slette enhver lugter af tidligere dyr, som kan interferere med udforskning af test dyret.
  9. (Anbefales) Håndtere dyrene i flere dage før EPM test (afhente det forsigtigt af torso og holde det i et minut eller to) til at vænne dem til eksperimentatoren.
  10. Når du placerer dyrene på EPM, Sørg for at håndtere alle dyr på en ensartet måde og placere hver gnaver i EPM i den samme holdning over for den samme arm (f.eks.i byens vender ud mod den åbne arm fra eksperimentatoren).

2. anvendelse af eksogene keton kosttilskud

  1. Måle kropsvægt af dyrene før du starter alle behandlinger til at bestemme dosis beregning til behandling (f.eks., gastrisk sonde).
  2. Vænne dyrene til metoden gastrisk sonde (prøvetid) ved hjælp af vand af sonde til 5 d før keton kosttilskud (standard gnaver chow/standard kost [SD] + vand sonde; f.eks.2,5 g/kg legemsvægt af vand i døgnet). Udelukke brugen af alle dyr, som ikke tilpasser sig til metoden gastrisk sonde.
  3. Efter prøvetiden, dyrefoder, kronisk for 83 d og subchronically for 7 d med SD og sonde dagligt med enten vand (fx, 5 g/kg legemsvægt/dag; kontrolgruppe: n = 8), keton kosttilskud såsom keton ester (KE; 1,3 - butandiol-acetoacetate diester; f.eks.5 g/kg legemsvægt/dag; n = 8), keton salt (KS; Na+/K+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] mineral salt; f.eks.5 g/kg legemsvægt/dag; n = 8), eller KS + medium kæde triglycerid (1:1 ratio, KSMCT; n = 8)18,19,20.
    Bemærk: Dyr, der modtog gastrisk sonde blev testet på EPM 1 h efter behandling. Rotter fodres med standard gnaver chow og gavaged med vand (undtagen keton kosttilskud) fungerede som kontrolgrupper.

3. angst Assay

  1. EPM apparater
    1. Bruge samme apparatur på tværs af en undersøgelse for at standardisere resultater. EPM er et plus-formet apparat, som består af fire arme (f.eks.arme kan være 10 cm bred og 50 cm lang): to modsatte arme er åbnet, og de to lukket overfor våben er udstyret med høj (fx, 30 cm) vægge. Apparatet er hævet over gulvet (f.eks.ved 55 cm)2.
      Bemærk: De mest almindeligt anvendte parametre er den akkumulerede tid i de åbne arme og antallet af poster i de åbne arme; dog tid brugt i lukkede arme og center, og antallet af poster i lukkede arme og center er målt, samt afstanden rejste i hvert område.
    2. Lys op EPM ved hjælp af indirekte belysning (dvs.direkte lys kilde mod loft i stedet for direkte lysende EPM apparater) og sikre, at alle fire arme er ligeledes belyst (uden skygger, se figur 2).
      Bemærk: Ændringer i niveauet af lys ændre funktionsmåden for gnavere på EPM'EN. Derfor, lignende belysning er nødvendig i træk forsøgsdyr og dage (fx, 2.800 lumen i rummet)2.
  2. Video tracking system
    Bemærk: Brug en video tracking system med en computer interface og en video kamera til dataindsamling, som automatisk indsamler adfærdsmæssige data hos rotter (Figur 3). Video tracking system, en bred vifte af standard analog kameraer eller brugerdefineret billede kilder (infrarøde kameraer, videokamera, WIA-kompatibel USB-kamera, webcams,etc.) kan bruges. Når du analyserer den optaget video, understøtter bevægelse-tracking software alle almindelige videoformater, såsom .avi, .vob, .wmv, .asf, .mov, .qt, .mpg, .mpeg, .mp4, .3gp og .mkv. Hvis videoen ikke afspilles ikke korrekt, kræver det et bestemt codec; yderligere videoformater understøttes, hvis den tilsvarende codec er installeret i systemet. Bevægelse-tracking software kan også bruges til at analysere tidligere erhvervede videoer og behandle billeder fra forskellige kilder, såsom DVD/HD-optagere, digitale videofiler (.avi, .divx, .mpeg,etc.), webcams, DV-kameraer, og WIA-kompatibel billedenheder.
    1. Systemopsætning
      1. Tilslut installation nøglen af bevægelse-tracking software til en USB 2.0 port og starte installationsværktøjet.
      2. Ret kameraet over det eksperimentelle område og sikre, at det vil forblive immobile for varigheden af forsøget.
      3. Oprette et nyt eksperiment i bevægelse-tracking softwaresystem ved hjælp af instruktionsbogen. Vælg nyt eksperiment. Dobbeltklikke på ikonet i protokollen, den nye eksperiment skal følge (figur 3, supplerende fil 1).
      4. Indtast oplysninger til etiket/beskrive eksperimentet i dialogen Eksperimentere Info .
      5. Angiv kilden til de video sekvenser til at behandle.
      6. Define reglen om transformation til en korrekt afstande måling. Kalibreringsprocessen muliggør bevægelse-tracking software til at blive informeret om de faktiske dimensioner af det eksperimentelle område for at opnå pålidelige værdier for afstande og hastigheder.
      7. Bestemme regionerne af interesse (zoner) i arbejdsområdet.
      8. Justere parametrene for registreringsprocessen.
        1. I rækkefølge for bevægelse-tracking software til netop afsløre placeringen af dyret på billedet, skal nogle påvisning justeringer angives.
        2. Tracking proces kræver en klar og godt kontrast billede ved hjælp af en finjustering af de generelle lysstyrke og kontrast parametre i afsnittet lysstyrke & kontrast i panelet Indstillinger for registrering . Efter behov, justere disse indstillinger for hele billedet eller for bruger-definerede zoner.
      9. Sætte en rotte i hver arena til at teste registreringsprocessen.
      10. Tryk på knappen Start Test til at kontrollere, hvis registreringsprocessen kan identificere emnet korrekt. Bekræfte påvisning aktiveres ved udseendet af en prik på skærmen. Kalibreringsprocessen har at blive gennemstegt før testen påbegyndes.
      11. Registrering anses for bekræftet, da den kun sorte prik vist i afspilleren er dyret der spores. Den røde tracking linje skal nøje følge alle dyrets forskydninger. Korrekt sporing er også bekræftet med en hvid etiket notering animalske antallet og tilsvarende koordinater baseret på fordrivelse. Hvis sådan en registrering ikke er opnået, justere parametrene tærskel og erosioner til optimere opdagelse og sporing proces.
      12. Justere parametrene tærskel og Erosion for at få et skarpere og støjfri test billede.
      13. Hvis sporing stien er korrekt registreret, skal du trykke på knappen Stop Test (figur 4). Hvis disse tilpasninger skal anvendes til alle nye eksperimentelle fil, skal du trykke på knappen Gem som standard . Tryk på knappen Accepter for at gemme de nye indstillinger for registrering.
      14. Betingelserne tid af forsøgene.
      15. Hvis den eksperimentelle protokollen kræver track erhvervelse processen starte samtidig emnet er placeret i det eksperimentelle område, er det muligt at konfigurere den eksterne enhed, der følger med softwaren eller bruge en trådløs mus.
        Bemærk: Denne indstilling giver mulighed for at fjernstyre styre start og stop.
    2. Opsætning af emnerne i systemet
      1. Administrere eksperimenter emnet database. Hvis du vil oprette en database af eksperimenterende fag, skal du indtaste Fag Database manager ved at trykke på knappen emner i baren Eksperimenter assistent .
      2. Tryk på + for at tilføje nye emner til databasen.
      3. Med ét emne mulighed allerede er markeret, Angiv fagets kode.
      4. Udfylde resten af personens oplysninger i afsnittet Om egenskaber .
      5. Tryk på Opret -knappen for at tilføje det nye emne.
      6. Definere eksperimenter plan. Brug Opgavestyring til at definere de forskellige faser, sessioner, forsøg og fag planlagt skal udføres inden for det forsøgsprojekt. Retssagen er valgt automatisk som "den næste retssag" at blive henrettet. Denne egenskab er vist som et grønt kryds på venstre side af den retssag navn.
    3. Dataopsamling ved simultan optagelse og sporing
      Bemærk: Når en levende billede kilde vælges, panelet Player indeholder en integreret optagelse modul for nemt fange den video kommer fra det valgte kamera.
      1. Forberede bevægelse-tracking software til dataopsamling (kalibrering, zone definition, indstillinger for registrering, tidsindstillinger, scheduler).
      2. Åbne panelet dataopsamling .
      3. Starte optagelsen af videoen af eksperiment uden dyret ved at trykke på knappen Start optagelse tilgængelige i softwaren.
      4. Placere dyret i det eksperimentelle område.
      5. Starte data erhvervelse processen ved at trykke på knappen Start tid i kontrolpanelet. Sporing proces vil blive gennemført samtidig med optagelsen processen. Efter behov, spørge eksperimentatoren at optegne de adfærdsmæssige variable manuelt, som stejler, hovedet dips og falls (figur 5).
      6. Indsamle EPM data manuelt såvel som af en blindet observatør (separat observatør fra EPM af et gardin) i den test værelse.
      7. Vent indtil udgangen af tracking-processen optagelse eller tryk på knappen Stop tid i kontrolpanelet.
      8. Fjerne dyret fra det eksperimentelle område. Stop den video-optagelse proces ved at trykke på knappen stop tilgængelige på bevægelse-tracking software afspiller.
      9. Forberede det eksperimentelle område for det næste dyr ved vask og tørring det. Gentage cyklus igen.
    4. Dataanalyse
      1. Tryk på knappen analyse i baren Eksperimenter assistent adgang til værktøjet analyse .
      2. For at generere rapporter af de færdige forsøg, skal du vælge forsøg til at analysere. Konfigurere og marker analyserapporten. Indstille tidsintervaller der skal analyseres. Generere og gennemgå rapporterne. Eksportere resultaterne til et regneark eller billede formater (figur 6).
  3. EPM til måling af angst niveauer
    1. Udføre EPM eksperimenter på nonstress betingelser (i en svagt oplyste og rolige værelse) efter mundtlig sonde.
      Bemærk: Sørg for, at eksperimenterne, der køres i et snævert tidsinterval (f.eks.mellem 1200 og 1400) fordi døgnrytme kan påvirke gnavere adfærd på EPM15,17. Undgå unødvendige bevægelser og støj under eksperimentet.
    2. Før prøvens begyndelse Sørg for at EPM er rengjort og tørret og videoen tracking system er klar til brug.
    3. Overføre rotter i deres hjem bur til den eksperimentelle værelse 30 min før begynder eksperimentet.
    4. Placer en rotte i skæringspunktet mellem de fire arme af EPM, vender ud mod den åbne arm overfor eksperimentatoren.
    5. Kør video tracking software, samt manuelt registrere opførsel af dyr, i 5 min.
    6. Hvis dyret falder ud af EPM, samle den op og lægge det tilbage på det samme punkt i EPM, hvor det faldt ned. Udelukke de adfærdsmæssige data af dette dyr fra analysen.
      Bemærk: En høj lyd eller bevægelse kan immobilisere/fryse dyr på åbne arme. Hvis en kraftig støj er hørt under eksperimentet, udelukke de adfærdsmæssige data af dyret gennemgår eksperiment i øjeblikket fra analysen.
    7. I slutningen af 5 min test, stoppe videoen tracking software og fjerne dyret fra EPM'EN. Læg det tilbage i sit hjem bur.
    8. Før den næste eksperiment/dyr, rense EPM med et desinficerende rengøringsmiddel (f.eks.Quatricide) efterfulgt af vand fra hanen. Tørre apparater med papirservietter.

4. analyser af Data indsamlet af videoen Tracking System

  1. Baseret på de registrerede data, analysere mængden af tid, der bruges i de åbne arme og i de lukkede arme; antallet af poster i de åbne arme, lukkede arme, og zonen center; ventetid til indtræden i de lukkede arme; afstanden rejste i de åbne arme, lukkede arme, og i zonen center.
    Bemærk: Dyret er anset for at være i et område når midten af kroppen massen er i dette område.
  2. Fastslå virkningerne af behandlinger på adfærd ved hjælp af en variansanalyse (ANOVA) med Fishers mindst betydende forskel (LSD) test/Tukey flere sammenligninger test.

Representative Results

Den aktuelle eksperiment undersøger den hypotese, at eksogene keton tilskud gives enten kronisk (fodret for 83 dage) eller subchronically (oralt gavaged til 7 dage) har en angstdæmpende virkning på to måneder gamle mandlige Sprague-Dawley (SPD) rotter ( 250-350 g). Kronisk administration bestod af følgende keton kosttilskud: lav-dosis keton ester (LKE; 1,3-butandiol-acetoacetate diester, ~ 10 g/kg/dag, LKE), høj-dosis keton ester (HKE; ~ 25 g/kg/dag, HKE), beta-hydroxybutyrate-mineral salt (bHB-S; ~ 25 g / kg/dag, KS), og bHB-S + medium kæde triglycerid (MCT; ~ 25 g/kg/dag, KSMCT). For subkronisk eksperimenter, de følgende behandlingsgrupper blev brugt: KE, KS, og KSMCT (5 g/kg/dag). Kontrolgruppen indgår SD eller SD med vand sonde (kontrol). Alle data var repræsenteret som gennemsnittet ± standardafvigelse af middelværdi (SEM). Resultaterne blev betragtet som væsentlig når p < 0,05. Betydning var bestemt af en-vejs ANOVA med Fisher's LSD test.

Efter kronisk fodring, rotter i gruppen KSMCT brugt betydeligt mere tid i de åbne arme (p = 0.0094) sammenlignet med kontrolgruppen. Tiden i de lukkede arme var betydeligt mindre i grupperne LKE, KS og KSMCT (p = 0.0389, 0.0077 og 0.0019, henholdsvis), mens gruppen KS brugt betydeligt mere tid i midten (p = 0.0239) i forhold til kontrol (SD) gruppe ( Figur 7A) 18.

Rotter i KS og KSMCT grupper rejste væsentligt længere afstande i de åbne arme (p = 0,036 og 0.0165), mens rotter i LKE, KS og KSMCT grupper viste betydeligt mindre afstand rejste i de lukkede arme (p = 0.0252, 0.00041, og 0.0032, henholdsvis), sammenlignet med kontrolgruppen (SD) (figur 7B). Sammenlignet med kontrolgruppen, grupperne KS og KSMCT havde større afstand rejste i området center (p = 0.0206 og 0.0482, henholdsvis), mens i gruppen KSMCT ventetid til den første indgang til de lukkede arme var betydeligt større efter kronisk fodring (p = 0.0038)18 (figur 7C).

Tiden i de åbne arme var større i KE-koncernen (p = 0.0281) efter 7 dage af mundtlige mavesonde, mens i grupperne KE, KS og KSMCT tid brugt i byens faldt (p = 0.0005, < 0,0001, og = 0,023, henholdsvis), i forhold til contro l gruppe (figur 8A)18. I grupperne KE og KS antallet af poster til de lukkede arme var betydeligt lavere (p = 0.0436 og 0.0234, henholdsvis) efter 7 dage af administration (fig. 8B), mens rotter i KS Gruppen også angivet center mindre hyppigt (p = 0.0193), sammenlignet med kontrolgruppen (SD).

Figure 1
Figur 1: forhøjet plus labyrint (EPM) bruges til at teste rotter. Hver arm er 10 cm bred og 50 cm lang, med to modsatte arms åbnet med en ophøjet kant. De to lukkede overfor våben er udstyret med 30 cm høje vægge. Landingsbanen højden fra gulvet er 55 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: eksempler på direkte og indirekte belysning. Sikre lyskilden er spidst mod loftet, mens den direkte lys over det eksperimentelle område er blokeret. Det er vigtigt at bruge indirekte lys under EPM eksperimenter for at ligeledes belyse alle fire arme uden skygger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: eksperimenter assistent bar af bevægelse-tracking software. Det er designet til at give adgang til de vigtigste operationer. Knapperne svarer til opgave inden for typiske eksperimenter, mens kun de opgaver, der i øjeblikket tilladt er aktive. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: emne spor er markeret med en rød linje, der følger dyrets bevægelser. Ved at justere tærsklen, kan baggrunden faldt indtil kun dyret opdages og spores af den røde linje. Sporet følger midten af massen af emnet, og de aktuelle position koordinater er angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: forhøjet plus labyrint (EPM) med Sprague Dawley (SPD) rotte i den åbne arm. Et eksempel på den eksperimentelle set-up er påvist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: akkumulerede bevægelse styr på dyr under rettergangen. Som en del af analysen af data, kan de indsamlede bane spor af emnet i området tracking vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: adfærdsmæssige reaktioner af SPD rotter i EPM efter 83 dage af kronisk fodring af eksogene keton kosttilskud. Disse paneler viser repræsentative resultater indsamlet af EPM'EN og bevægelse-tracking system18. (A) gruppen KSMCT brugt en større procentdel af tid i de åbne arme, mens LKE, KS, og KSMCT grupper brugte mindre tid i lukkede arme, sammenlignet med kontrolgruppen (SD). (B) den KS og KSMCT grupper rejste mere afstand i de åbne arme, mens LKE, KS, og KSMCT grupper rejste mindre afstand i de lukkede arme, viser reduceret angst i forhold til kontrol (SD) gruppe. (C) KSMCT gruppe trådte de lukkede arme senere, med angivelse af reduceret angst i forhold til kontrol (SD) gruppe. Forkortelser: SD = standard gnaver chow + vand (25 g/kg legemsvægt (b.w.) af vand/dag); LKE = SD + LKE (1,3-butandiol-acetoacetate diester, 10 g/kg b.w./day); HKE = SD + HKE (25 g pr. kg b.w./day); KS = SD + beta-hydroxybutyrate-mineral salt (bHB-Sørensen, 25 g pr. kg b.w./day); KSMCT = SD + bHB-S + medium kæde triglycerid (MCT; 25 g pr. kg b.w./day); SPD = Sprague-Dawley rotte; EPM = forhøjet plus labyrint (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; *** p < 0,0001). Dette tal er blevet ændret fra Ari mfl. 18. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: adfærdsmæssige reaktioner af SPD rotter efter 7 dage af mundtlige sonde eksogene keton kosttilskud. Repræsentative resultater blev indsamlet gennem EPM'EN test, ved hjælp af en bevægelse-tracking software system18. (A) KE-koncernen brugt en større procentdel af tid i de åbne arme, mens KE, KS, og KSMCT grupper brugte mindre tid i midten (sammenlignet med kontrolgruppen [SD]), der således angiver reduceret angst. (B) i forhold til kontrol (SD) gruppe, mindre poster blev fundet i de lukkede arme fra rotter i grupperne KE og KS. Forkortelser: SD = standard gnaver chow + vand (5 g/kg b.w. vand/dag); KE = SD + keton ester (1,3-butandiol-acetoacetate diester, 5 g pr. kg b.w./day); KS = SD + beta-hydroxybutyrate-mineral salt (bHB-S, 5 g pr. kg b.w./day); KSMCT = SD + bHB-S + MCT (5 g/kg b.w./day); SPD = Sprague-Dawley rotte; EPM = forhøjet plus labyrint (* p < 0,05; *** p < 0,001; *** p < 0,0001). Dette tal er blevet ændret fra Ari mfl. 18. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Generelt er anvendte flere almindeligt tests, såsom lys-mørke valg test, den sociale interaktion test og EPM-test, der bruges til at måle angst niveau i forskellige dyremodeller. Men EPM analyse alene er en velegnet metode til at undersøge, for eksempel effekten af eksogene keton kosttilskud på gnavere angst niveauer18,20.

Den største fordel ved metoden EPM er, at det er afhængig af gnavere instinktiv hang mod mørke, indelukkede rum, ud over den ubetingede frygt for højder og undgåelse af åbne rum. På den anden side er andre metoder, der anvendes til at studere angst-lignende adfærd baseret på de adfærdsmæssige reaktioner på visse skadelige stimuli, såsom elektrisk stød, mad/vand afsavn, høje lyde, og eksponering for predator lugt3. Disse prøver resultere normalt i en betinget respons, mens EPM også repræsenterer et mere humant alternativ. Derudover EPM'EN kan være et nyttigt redskab til at undersøge inddragelsen af forskellige hjerneregioner (f.eks., limbiske regioner, hippocampus) og de underliggende mekanismer (f.eks., GABA, glutamat, serotonin, adenosin) af angst opførsel2.

Når du anvender behandlinger, der er ganske stressende for dyr (f.eks.den mundtlige sonde), det er vigtigt, at alle dyr håndteres på samme måde og af den samme person, især når vurderingen af potentielle, subtile angstdæmpende virkninger. Hvis det er muligt, kan indførelsen af stof/stof i drikkevand eller via en spiselig 'behandle' være en foretrukne metode. For at sikre, at samme beløb gives til hvert dyr, kan en mundtlig sonde anvendes. Baseret på de farmakokinetiske egenskaber af sammensat, er det normalt tilrådeligt at teste dyr på EPM'EN inden for 1 time efter gavaging. Når du vælger eksperimenterende fag, er det vigtigt at overveje deres stamme, sex, estrus cyklus, og alder, samt kropsvægt, overensstemmelse med målene og teste stoffer2. I henseende til alder, når designe EPM undersøgelser og fortolke data, er det vigtigt at overveje, at procentdelen af poster i åbne arm stiger lineært med alder21 og de aldersrelaterede ændringer i EPM adfærd er stamme-specifikke22.

Når der udføres en EPM-test, er der potentielle problemer, der skal løses. Undertiden dyr skal udelades fra analyse på grund af afvigende tendenser (f.eks.dyret aldrig forlader området hvor det var placeret, næsten falder ud i apparatet, er distraheret af en støj eller begivenhed uden for apparatet). Yderligere komplikationer med EPM test kan omfatte behandlinger som forårsager sedation eller hyperaktivitet, fordi disse typer af effekter skal være vurderet via EPM parametre.

Det er vigtigt at udsætte dyr på EPM prøve kun en gang fordi nedsat aktivitet på de åbne arme og en nedsat total tidsforbrug på den centrale platform blev demonstreret på den anden (gentagne) eksponering af gnavere i forhold til den første eksponering på EPM 14,15. En enkelt eksponering af gnavere til EPM test anbefales derfor kraftigt. Men hvis der er mindst tre uger mellem den første og anden eksponering til EPM og EPM set-up er flyttet til et andet rum (forskellige miljø), at dyrene kan blive undersøgt af EPM'EN test flere gange2.

EPM er tilgængelige i forskellige materialer, størrelser (fxmus eller rotte), og farver, der skal overvejes, når du vælger studere fag. Det er vigtigt at huske at lugte efterladt af den tidligere animalsk på apparatet kan ændre funktionsmåden for den efterfølgende dyr. Vi anbefaler derfor, ved hjælp af en EPM lavet af et materiale, der er let at rengøre, såsom akryl glas (ikke gennemsigtige), som ikke bevarer lugte efter vask. Undgå EPM apparater lavet af træ. Helst bruge en mat farve, der afviger fra farven på de dyr, der er testet på EPM (fx, sort, hvis hvide dyr er testet). Jo bedre kontrast mellem dyret og kabinettet, jo bedre påvisning af dyret og jo højere pålidelighed og præcision af resultaterne opnået (tilbagelagte, hastighed, opfølgning). EPM apparater lavet af mat grå materiale er nyttige med hvid, sort, og hvide og sorte dyr.

En yderligere fordel ved video tracking system er, at ud over EPM, det giver en fleksibel og nem måde at sætte det op med en bred vifte af adfærdsmæssige test, såsom vand labyrint, open-felt, plus/radial arm/T-Y labyrinter, sted præference, tvunget svømning , og hale suspension tests.

I Resumé er målet med denne artikel at beskrive EPM testen anvendes i kombination med en video tracking software til at indsamle og analysere adfærdsmæssige ændringer som reaktion på roman angstdæmpende behandlinger. De mulige anvendelser af EPM'EN omfatter prescreening af nyudviklede farmakologiske midler til behandling af angst-relaterede lidelser. Ud over de angstdæmpende og anxiogenic agenter, kan adfærdsmæssige effekten af forskellige hormoner og medicin misbrug også undersøges. Indflydelse af aldring, udsættelse for forskellige stressfaktorer kan også vurderes. Denne undersøgelse har konkluderet, at når der tages passende skridt, brug af EPM har vist sig for at være en følsom metode til vurdering af adfærdsmæssige ændringer forbundet med keton kosttilskud18,20.

Disclosures

D'Agostino, DP, Kesl, S., Arnold, P. kompositioner og metoder til fremstilling af forhøjet og vedvarende ketose. Internationale Patent # PCT/US2014/031237. University of South Florida.

Ari, C., D'Agostino, D.P., eksogene keton kosttilskud for at reducere angst-relaterede adfærd. Foreløbig patent #62289749. University of South Florida.

Dominic P. D'Agostino og Csilla Ari er medejere af firmaet keton Technologies LLC.

Disse interesser har gennemgået og forvaltes af Universitet i overensstemmelse med sine institutionelle og individuelle interessekonflikt politikker. Alle forfatterne erklærer, at der er ingen yderligere interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en ONR Grant N000141310062 og en GLUT1D Foundation Grant #6143113500 (til Dominic P. D'Agostino), nationale udvikling agenturet af Ungarns (under Grant nr. TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; til Zsolt Kovács) og af Department of Veterans anliggender (at markere Kindy). Forfatterne vil gerne takke Quest ernæring LLC for at støtte igangværende forskning om dette emne (til Csilla Ari).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elevated Plus Maze for mice and rats Coulbourn Instruments H10-35-EPM
SMART Video Tracking Software Harvard Apparatus SMART 3.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open : closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14, (3), 149-167 (1985).
  2. Walf, A., Frye, C. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2, (2), 322-328 (2007).
  3. Barnett, S. A. The rat: A study in behavior. University of Chicago Press. Chicago, IL. (1975).
  4. Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Archives. In Pharmacology. 327, (1), 1-5 (1984).
  5. Montgomery, K. C. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behavior. Journal of Comparative Physiology and Psychology. 48, (4), 254-260 (1955).
  6. Sarkisova, K. Y., Midzianovskaia, I. S., Kulikov, M. A. Depressive-like behavioral alterations and c-fos expression in the dopaminergic brain regions in WAG/Rij rats with genetic absence epilepsy. Behavioral Brain Research. 144, (1-2), 211-226 (2003).
  7. Jain, N., Kemp, N., Adeyemo, O., Buchanan, P., Stone, T. W. Anxiolytic activity of adenosine receptor activation in mice. British Journal of Pharmacology. 1116, (3), 2127-2133 (1995).
  8. Paslawski, T., Treit, D., Baker, G. B., George, M., Coutts, R. T. The antidepressant drug phenelzine produces antianxiety effects in the plus-maze and increases in rat brain GABA. Psychopharmacology (Berlin). 127, (1), 19-24 (1996).
  9. Florio, C., Prezioso, A., Papaioannou, A., Vertua, R. Adenosine A1 receptors modulate anxiety in CD1 mice. Psychopharmacology (Berlin). 136, (4), 311-319 (1998).
  10. Engin, E., Treit, D. The effects of intra-cerebral drug infusions on animals' unconditioned fear reactions: a systematic review. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32, (6), 1399-1419 (2008).
  11. Botton, P. H., et al. Aged mice receiving caffeine since adulthood show distinct patterns of anxiety-related behavior. Physiology and Behavior. 170, 47-53 (2017).
  12. Hughes, R. N., Hancock, N. J., Henwood, G. A., Rapley, S. A. Evidence for anxiolytic effects of acute caffeine on anxiety-related behavior in male and female rats tested with and without bright light. Behavioural Brain Research. 271, 7-15 (2014).
  13. Rex, A., Marsden, C. A., Fink, H. Effect of diazepam on cortical 5-HT release and behaviour in the guinea-pig on exposure to the elevated plus maze. Psychopharmacology (Berlin). 110, (4), 490-496 (1993).
  14. Almeida, S. S., Garcia, R. A., de Oliveira, L. M. Effects of early protein malnutrition and repeated testing upon locomotor and exploratory behaviors in the elevated plus-maze. Physiology of Behaviour. 54, (4), 749-752 (1993).
  15. Bertoglio, L. J., Carobrez, A. P. Behavioral profile of rats submitted to session 1-session 2 in the elevated plus-maze during diurnal/nocturnal phases and under different illumination conditions. Behavioural Brain Research. 132, (2), 135-143 (2002).
  16. Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. European Journal of Pharmacology. 463, (1-3), 163-175 (2003).
  17. Carobrez, A. P., Bertoglio, L. J. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on. Neuroscience & Biobehavioural Reviews. 29, (8), 1193-1205 (2005).
  18. Ari, C., et al. Exogenous ketone supplements reduce anxiety-related behavior in Sprague-Dawley and Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 137 (2016).
  19. D'Agostino, D. P., et al. Therapeutic ketosis with ketone ester delays central nervous system oxygen toxicity seizures in rats. American Journal of Physiology: Regulation Integration and Comparative Physiology. 304, (10), R829-R836 (2013).
  20. Kovács, Z., D'Agostino, D. P., Ari, C. Anxiolytic effect of exogenous ketone supplementation is abolished by adenosine A1 receptor inhibition in Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 29 (2018).
  21. Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Developmental Psychobiology. 52, (8), 731-739 (2010).
  22. Ferguson, S. A., Gray, E. P. Aging effects on elevated plus maze behavior in spontaneously hypertensive, Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley male and female rats. Physiology of Behavior. 85, (5), 621-628 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics