Antimikrobielle Synergie Tests durch Tintenstrahldrucker-gestützte, automatisierte schachbrettartige Anordnung und die manuelle Zeit-Kill-Methode

Immunology and Infection
 

Summary

Antimikrobielle Synergie Prüfung dient zur Bewertung der Wirkung von zwei oder mehr Antibiotika in Kombination eingesetzt und erfolgt in der Regel durch eine von zwei Methoden: die schachbrettartige Anordnung oder die Zeit-Kill-Assay. Hier präsentieren wir eine automatisierte, Inkjet-Drucker unterstützt Schachbrett Array Synergie-Technik und eine klassische Zeit-Kill-Synergie-Studie.

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Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).

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Abstract

Da Preise von multiresistenten Erregern (MDR) steigen weiter, übertraf die Entwicklung von neuen Antibiotika, werden neuartige Ansätze zur Behandlung von MDR Bakterien zunehmend eine Notwendigkeit. Ein solcher Ansatz ist Kombinationstherapie, in denen zwei oder mehrere Antibiotika zusammen verwendet werden, um eine Infektion gegen die eine oder beide der Medikamente möglicherweise unwirksam allein. Wenn zwei Medikamente in Kombination, üben eine größere als additive Wirkung, sie gelten als synergistische. In-vitro-Untersuchung der synergistische Tätigkeit ist ein wichtiger erster Schritt bei der Bewertung der möglichen Wirksamkeit von Medikamenten-Kombinationen. Zwei wichtigsten Synergie in-vitro-Testverfahren entwickelt worden: die schachbrettartige Anordnung und die Zeit-Kill-Studie. In diesem Beitrag präsentieren wir einer automatisierte Schachbrett-Array-Methode, die nutzt Inkjet-Drucktechnologie zur Steigerung der Effizienz und Genauigkeit dieser Technik, als auch ein standard manuelle Zeit-Kill-Synergie-Methode. Automatisierte schachbrettartige Anordnung kann als Hochdurchsatz-Screening-Test dienen, während die manuelle Zeit-Kill-Studie zusätzliche, ergänzende Daten auf synergistische Tätigkeit und töten liefert.

Die schachbrettartige Anordnung ist eine Modifikation des standard minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) testen, in der Bakterien mit Antibiotika bei unterschiedlichen Konzentration Kombinationen inkubiert und bewertet für Wachstumshemmung nach der Inkubation über Nacht. Manuelle Leistung die schachbrettartige Anordnung erfordert eine aufwendige und fehleranfällige Reihe von Berechnungen und Verdünnungen. In die automatisierten Methode präsentiert hier die Berechnung und Abgabe der erforderlichen Antibiotika Stammlösung, die Bände durch den Einsatz von Inkjet-Drucker-Technologie automatisiert sind. Bakterien sind in der Zeit-Kill Synergie-Assay inkubiert mit den Antibiotika von Interesse, sowohl gemeinsam als auch einzeln und im Laufe von 24 h für quantitative Kultur in Abständen abgetastet. Die Ergebnisse können bestimmen, ob eine Kombination synergistische ist und ob es bakterizid und liefern Daten über Hemmung und Tötung von Bakterien im Laufe der Zeit.

Introduction

Die Ausbreitung der multiresistente (MDR) bakterielle Krankheitserreger, insbesondere MDR Gram-negativen Bakterien wie Carbapenem-resistente Enterobacteriaceae (CRE) hinterließ Kliniker mit zunehmend begrenzten Möglichkeiten für erfolgreiche Anti-infektive Therapie 1, ein Problem durch das schleppende Tempo der neuartige antibakterielle Drogen Entdeckung2,3verschärft. Antimikrobielle Synergie, in denen zwei Medikamente in Kombination ein größer als Zusatzstoff wirken, bietet die Möglichkeit bestehende Antibiotika für Behandlung von MDR Bakterien, Bergung, auch wenn diese Bakterien resistent gegen eines oder beider sind die Antibiotika individuell. Erlauben Sie in diesem Artikel beschriebenen Techniken bieten zwei komplementäre Methoden von in-vitro-Tests, die, wenn Sie zusammen, verwendet Synergien Ermittler effizient Bildschirm antimikrobielle Kombinationen von Interesse für Beweis der synergistische Tätigkeit (automatisierte Schachbrett-Array-Methode) und dann weiter bewerten die Kinetik der Hemmung und Tötung zeigt vielversprechende Kombinationen in der Screening-Phase (die manuelle Zeit-Kill-Methode) identifiziert.

Eines der am häufigsten verwendeten Testmethoden in-vitro-Synergie ist der Schachbrett-Array-Assay, eine Änderung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) Prüfung in dem isolieren die inhibitorische Aktivität von zwei verschiedenen Antibiotika gegen eine bakterielle getestet über einen Bereich von Konzentration Kombinationen4,5. Wenn die beiden Medikamente größer als Additiv Tätigkeit gemeinsam ausüben, gilt die Kombination synergistische6. Eine schachbrettartige Anordnung manuell einrichten beinhaltet jedoch eine Reihe von Berechnungen und verdünnen und Pipettieren Schritte, die umständlich und anfällig für menschliche Fehler sind. Diese Einschränkungen haben die Wirkung der Begrenzung der Nutzung von Synergie in erster Linie auf die Retrospektive Auswertung einer kleinen Zahl von Antibiotika-Kombinationen und bakterielle Isolate testen und Ergebnisse wurden nicht immer konsistent unter Studien7, 8,9,10,11. Darüber hinaus trug die Komplexität der Synergie Prüfung ihrer Nichtverfügbarkeit in klinischer Mikrobiologie Labor und praktisch keine in-vitro-Synergie Testdaten aus klinischen Studien Kombination Therapie12, 13.

Um die Effizienz und den Durchsatz der Schachbrett-Array-Methode zu erhöhen, haben wir konsequent verzichten Kleinmengen und nutzen eine automatisierte MIC Test zuvor entwickelte Technik in unserem Labor, die Inkjet-Drucktechnologie, genau verwendet der Antibiotika-Stammlösung in Vertiefungen in einem Mikrotiter-Platte-14. Die Plattform entfällt die Notwendigkeit für komplexe Berechnungen und mehrere Pipettieren Schritte. Die dazugehörige Software berechnet und verzichtet auf entsprechende Mengen von Antibiotika eine zweidimensionale schachbrettartige Anordnung erstellen, wenn der Benutzer einfach die gewünschte Konzentrationsbereich Eingaben und Stammlösung Konzentration der Antibiotika. Wir zunächst diese Methode gegen eine Sammlung von CRE Isolate15 getestet und anschließend auf Colistin-haltigen Kombinationen für Aktivität gegen Colistin-beständige Isolate16Tests konzentriert haben. Colistin ist ein Medikament der letzten Instanz in der Regel für die Verwendung bei der Behandlung von MDR gramnegative Erreger17,18und Colistin Widerstand reserviert bereits MDR Bakterien fast Pan-resistente19, wodurch sie ideal macht Kandidaten für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien mit Drogen, deren individuell unempfindlich sind. Wir fanden, dass die Kombination von Colistin und Protein-Synthese-Hemmer Antibiotika Minocyclin eine sehr hohe Rate der Synergie, sogar gegen Stämme, die resistent gegen jedes dieser Medikamente individuell, vermutlich waren weil Colistin eine subinhibitory ausübt permeabilizing Wirkung auf noch Colistin-resistente Bakterien. Wir haben diese Kombination als ein Beispiel in diesem Artikel verwenden ausgewählt. Der Hinweis Synergie Tests auch lässt sich für verbesserte Wirksamkeit der beiden Medikamente zu bewerten, die sowohl effektive individuell sind.

Die automatisierte Schachbrett-Array-Methode ermöglicht schnelle, Hochdurchsatz-Synergie zu testen. Die Schachbrett-Array-Methode muss jedoch Einschränkungen. Als eine modifizierte MIC-Assay es liefert Daten nur auf der Hemmung des Bakterienwachstums und nicht auf Tötung, und liefert keine Daten auf antibiotische Wirkung im Laufe der Zeit. Im Gegensatz dazu, manuelle Leistung von Zeit-Kill Synergie-Assays ist mehr arbeitsintensiv aber informiert über Hemmung und Tötung über eine 24 h Zeit Kurs20,21. Wir verwendet Zeit-Kill Analyse auf eine geringere Anzahl von Isolaten, um unsere Schachbrett Array Ergebnisse zu bestätigen und um festzustellen, ob die synergistischen Kombinationen, die wir identifiziert auch bakterizide waren.

Beide Schachbrett-Array und Zeit-Kill Synergie-Methoden liefern wertvolle Informationen über die Tätigkeit der Medikamenten-Kombinationen und sind besonders nützlich bei der Bewertung der potenziellen neuartige Therapieoptionen für bakterielle Erreger sehr widerstandsfähig. Die Methoden haben auch Einschränkungen. Die standard Microbroth-Verdünnungsmethode MIC hat vielfältige bekannten erwartete Fehler 1 zweifache Verdünnung22, der erhöht wird, wenn zwei Medikamente in eine schachbrettartige Anordnung zusammen getestet werden. Die Standarddefinition der Synergie, die Auffassung, dass eine synergistische Kombination nur, wenn die Medikamente zusammen auf ein Viertel ihrer jeweiligen Mikrofone6, sind dies berücksichtigt erwartet Variabilität, aber solche Variabilität (die vermutlich führen aus eine Kombination von biologischen und technischen Schwankungen23) zwangsläufig erzeugt unsicher über die Zuverlässigkeit der Synergie Ergebnisse. Der Mangel an etablierten Qualitätsstandards zu Testzwecken Synergie ist auch eine Strombegrenzung. Vielleicht ist die bedeutendste Einschränkung alle Synergie Testmethoden das Fehlen von etablierten Korrelationen zwischen in-vitro-Ergebnisse und klinische Ergebnisse bei Kombinationen sind zur Behandlung von Patienten24. Einfachere und schnellere Synergie Testmethoden wie die automatisierte Schachbrett-Array-Methode hier beschrieben wird, kann die Integration von in-vitro-Tests im Rahmen klinischer Studien oder andere Auswertungen der Ergebnisse für die Patienten um eine bessere Synergie erleichtern. charakterisieren Sie das Verhältnis zwischen in-vitro und in vivo Effekte in der Zukunft.

Die automatisierte Schachbrett Array-Methode, die wir hier präsentieren bietet eine Option für Hochdurchsatz-Screening von einer Vielzahl von Kombinationen und ermöglicht eine schnelle Auswertung von ungewöhnlichen, "hoch Risiko-hohe Belohnung" Kombinationen ohne eine große Investition von Zeit und Ressourcen. Die Zeit-Kill-Methode, die wir anschließend zu demonstrieren, kann zusätzliche Informationen unterstützend auf die synergistische Tätigkeit der Kombination und kann dazu beitragen, um seine bakterizide Aktivität und antibakterielle Kinetik zu charakterisieren.

Protocol

Vorsicht: Verwenden Sie geeignete Sicherheitsvorkehrungen bei der Arbeit mit Bakterien. Tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel zu allen Zeiten. Führen Sie arbeiten in eine biologische Kabinett Wenn Aerosole erzeugt werden oder bei der Arbeit mit hohem Risiko Krankheitserreger.

Hinweis: 20 bis 24 h vor Beginn der Experimente, Streifen, die bakterielle Isolate(s) (von einer Kolonie gereinigt, minimal passagiert bestand eingefroren bei-80 ° C im tryptic Soy Bouillon mit 50 % Glycerin Lager) auf einen Teller Blutagar geprüft werden. Inkubieren Sie die Platte bei 35 ° C in der Luft.

(1) Inkjet-Printer-gestützte automatisierte Schachbrett Array Synergie

  1. Antimikrobielle Stammlösungen (Colistin und Minocyclin) zu machen.
    1. Bestimmen Sie Antibiotika-Stammlösung Konzentrationen basierend auf Löslichkeit von Antibiotika und gewünscht Endkonzentrationen in schachbrettartige Anordnung. 10 mg/mL Bestände von Colistin und Minocyclin für dieses Beispiel zu machen. Mithilfe des CLSI M100-Dokuments geeignete Lösungsmittel für jedes Antibiotikum25bestimmen. Colistin und Minocyclin sind wasserlöslich; Da die D300-Inkjet-Drucker die Zugabe von Tensiden für richtige wässrige Flüssigkeit, die Handhabung erfordert, lösen sich die Antibiotika deionisiertes Reinstwasser mit 0,3 % Polysorbat 20.
    2. Antibiotikum Pulver mit einer Analysenwaage wiegen und Volumen des Lösungsmittels erforderlich, um Ziel Lager Konzentration berechnen.
      1. Wenn das Antibiotikum als Salz (z. B. Colistin Sulfat, Minocyclin Hydrochlorid) oder in hydratisierten Form (z.B. Meropenem Trihydrate) geliefert wird, oder wenn es vom Hersteller gemeldet wird, weniger als 100 % Reinheit, führen Sie eine Potenz Berechnung26 bis bestimmen Sie die Menge des Lösungsmittels erforderlich.
      2. Führen Sie dieses Beispiel von Minocyclin Hydrochlorid mit einer angegebenen Reinheit von 900 mg/mg:
        Assay Reinheit: 900 mg/mg
        Wasserinhalt: keiner
        Aktiven Anteil: 0,926 (ermittelt, indem das Molekulargewicht von Minocyclin (457.48 Da) durch das Molekulargewicht von Minocyclin Hydrochlorid (493.94 Da)).
        Potenz = (Assay Reinheit) * (1 – Wassergehalt) * (aktiver Teil)
        = (900 mg/mg) * (1) * (0,926) = 833,4 mg/mg oder 83.34 %
        Dann bestimmen Sie das Volumen des Lösungsmittels wie folgt erforderlich:
        Volumen (mL) = [Gewicht (mg) * Potenz (mg/mg)] ÷ [Konzentration (mg/mL)]
        Also, wenn 34,7 mg Minocyclin Hydrochlorid Pulver gewogen wird, z. B. die folgende Berechnung um das Volumen des Lösungsmittels erforderlich, um eine 10 mg/mL Lösung bestimmen:
        Volumen = (34,7 mg) * (833.4 mg/mg) = 2,89 mL
        10.000 mg/mL
    3. Antibiotikum Pulver in ein 15 mL konische Röhrchen und fügen Sie die entsprechende Menge Wasser plus 0,3 % Polysorbat 20. Wirbel, bis aufgelöst.
    4. Aliquoten Antibiotika Stammlösung in 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Store bei-80 ° C bis einsatzbereit.
  2. Führen Sie Qualitätskontrolle (QC) antimikrobielle Bestände für den Einsatz in Schachbrettmuster Array Experimente mindestens einen Tag vor dem Synergie zu testen, so dass QC Ergebnisse ausgewertet werden können, vor der Verwendung der Lager zu Testzwecken Synergie.
    HINWEIS:
    Die hier beschriebene QC-Technik ist identisch mit der Technik, die würde zu Testzwecken minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) der einzelnen Drogen verwendet werden und kann mit jedem Stämme von Interesse für die Ermittler als solche verwendet werden.
    1. Bakteriensuspension vorzubereiten.
      1. Nehmen Sie ein Aliquot der einzelnen Antibiotika Aktien aus dem-80 ° C Gefrierschrank zu starten, während der Vorbereitung Bakteriensuspension Auftauen. Wirbel um sicherzustellen, dass das Antibiotikum in Lösung einmal aufgetaut.
      2. Wählen Sie eine geeignete QC-Belastung und der zulässige Bereich der MIC für Drogen getestet anhand von Tabelle 5A-1 in CLSI M10025. Verwenden Sie für die Medikamente hier, E. Coli ATCC 25922; die MIC-Bereiche für diese Sorte sind 0.25-1 mg/mL für Minocyclin und 0,25-2 mg/mL für Colistin.
      3. Wählen Sie eine Reihe von Antibiotika-Konzentrationen zu testen, die die gesamte Palette der QC enthalten wird. Verwenden Sie den Bereich von 0,0156 mg/mL bis 8 mg/mL für Minocyclin und Colistin für ATCC 25922.
      4. Ein 12 x 75 mm Runde Glas Kultur Unterrohr 1 mL 0,9 % Natriumchlorid hinzufügen. Wählen Sie ein oder zwei Kolonien aus einer Übernachtung Platte von ATCC 25922 und Wirbel sanft auszusetzen.
      5. Überprüfen Sie die Konzentration der Bakterien mit einem McFarland Reader. Bedarf passen Sie indem weitere 0,9 % Natriumchlorid oder mehr Bakterien an, eine 0,5 McFarland Trübung lesen zu erreichen.
      6. Machen Sie eine Verdünnung von 1: 300 der 0,5 McFarland Suspension durch Zugabe von 100 mL der Suspension bis 30 mL kation risikoadjustierte Mueller-Hinton Brühe (CAMHB) in einem 50 mL konische Rohr, eine endgültige Zelldichte von 5 x 105 KBE/mL zu erreichen wie von CLSI27empfohlen.
      7. Mithilfe einer sterilen Impfkeimen Schleife, Isolierung Streifen ein Tropfen des Inokulums auf einen Teller Blutagar Inokulum Reinheit zu bestätigen, und Inkubation bei 35 ° C in der Luft ab.
    2. Ein flach-Boden, Platz-gut, klar, unbehandelte 384-Well-Platte mit der D300 fügen Sie Antibiotika hinzu. Führen Sie diesen Schritt sofort nach der Zubereitung Bakteriensuspension, so daß Aussetzung zu den Platten innerhalb von 15 Minuten Vorbereitung26hinzugefügt werden kann.
      1. Schalten Sie die D300-Inkjet-Drucker und den damit verbundenen Computer. Öffnen Sie das Softwareprogramm.
      2. Starten Sie eine neue Datei. Über dem Bild des Rasters Platte auf Platte 1 mit der rechten Maustaste und wählen Sie " Platte". Wählen Sie die entsprechende Plattentyp (384 gut) und zusätzliches Volumen (50 mL).
      3. Das Protokoll fügen Sie Flüssigkeiten (z. B. Antibiotika Bestände hinzu) durch Klicken auf das Pluszeichen neben Flüssigkeiten auf dem linken Panel. Fügen Sie zwei Flüssigkeiten (Colistin und Minocyclin).
        1. Mauszeiger über das Panel, das für Flüssigkeit 1 erschien, und klicken Sie auf den Bleistift zu bearbeiten. Die Flüssigkeit "Colistin" zu nennen, die Klasse zu ändern "wässrige + Tween 20", Konzentration auf 10.000 zu ändern, und ändern Sie Konzentrationseinheiten in mg/mL (beachten Sie, dass Lager Konzentration 10 mg/mL, d.h., 10.000 mg/mL). Dispense by bei Konzentration lassen Sie und die restlichen Felder auf ihre Standardeinstellungen. Klicken Sie auf "OK".
        2. Wiederholen Sie den Vorgang über Fluid 2 (Minocyclin).
        3. Klicken Sie auf die Registerkarte " Aktuelle Protokoll " am oberen Rand des Bildschirms und Konzentration (Masse) auf mg/mL für gut Antibiotika Endkonzentrationen verwendeten Einheiten zu bestimmen.
      4. Wählen Sie 10 Bohrungen im Raster durch Klicken und ziehen, klicken Sie auf Titration am oberen Rand des Bildschirms. Für angeben Titration mit wählen Sie höchste Konzentration, für Fluid Colistinwählen, für Höchste Konzentration geben Sie 8 (stellen Sie sicher, Einheiten sind mg/mL), und für den Vertrieb Wählen Sie 1:2 (50 %). Verlassen Sie Default Werte in legen Sie für den Rest des Fensters und klicken Sie auf "OK".
      5. Wiederholen Sie den Vorgang oben für Minocyclin, Minocyclin Titration zu generieren.
      6. Speichern Sie das Protokoll, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche " Ausführen " in der linken oberen Ecke.
      7. Klicken Sie auf die Schaltfläche " starten ". Laden Sie eine 384-Well-Platte (mit Deckel entfernt) in den Kennzeichenhalter und drücken Sie Loaded unter "Last Platte 1 – Synergie" Prompt.
        Hinweis: Diese Aufforderung wird von der Software ausgewählt und bedeutet nicht, dass Synergie Tests durchgeführt wird. T8 + Kassette in das Kassettenfach und drücken Sie Loaded unter der Last einer T8 + Kassette Prompt ein.
      8. Wenn Sie aufgefordert werden, fügen Sie Antibiotika-Stammlösung zu den angegebenen Stauseen auf der Kassette. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm für die ordnungsgemäße Beladung und verzichten Sie sorgfältig um zu vermeiden, Luftblasen in der Lösung zu. Nachdem jede Lösung hinzugefügt wurde, klicken Sie bitte auf gefüllt .
      9. Sobald die Inkjet-Drucker, dass Antibiotika Lager in entsprechenden Volumes zu jedem Bohrloch und Feld laufen abgeschlossen angezeigt wird hinzugefügt, klicken Sie auf Schließen, entfernen Sie die Platte, und schalten Sie die D300.
    3. 384-Well-Platte bakterielle Suspensionen hinzu und inkubieren Sie Platte.
      1. Gießen Sie die vorbereitete Bakteriensuspension in einen sterilen Reagenz-Stausee.
      2. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette alle Antibiotika-haltigen Brunnen 50 mL Bakteriensuspension hinzu. Geben Sie 50 mL CAMHB ohne Bakterien in eine leere; die negativ-Kontrolle werden auch zur Sterilität der Medien bestätigen.
      3. Platte in einem 35 ° C Umgebungsluft Inkubator und inkubieren Sie für 16-20 h26.
        Hinweis: Eine unterschiedliche Dauer der Inkubation kann erforderlich sein, wenn andere als Enterobacteriaceae Organismen getestet werden; Organismus-spezifische Empfehlungen finden Sie in der CLSI M10025 .
    4. Lesen Sie Platte auf einer Mikrotestplatte Leser bei einer optischen Dichte von 600 (OD600) zu und analysieren Sie die Ergebnisse.
      1. Mit einem Tabellenkalkulationsprogramm, Schattieren Sie Zellen mit einem OD-600 -Wert von ≥0.07 grün Wachstum und Zellen mit einem Wert von < 0,07 rot kein Wachstum.
        Hinweis: Diese Werte wurden ermittelt anhand der Sichtprüfung des Wachstums vs. kein Wachstum und Korrelation mit OD Lesungen für diese Experimente; OD600 Lesungen aus Brunnen mit Medien allein waren durchweg unter 0,07. Entsprechenden Cutoff können mit verschiedenen Platte Leser und Bakterien unterscheiden.
      2. Bestimmen Sie das Mikro für jedes Medikament. Das MIC ist die niedrigste Konzentration des Medikaments auf das Bakterienwachstum gehemmt wird. Wenn innerhalb des erwarteten Bereichs der QC nach CLSI M100 Dokument25, das Mikrofon der Stammlösung ist geeignet für den Einsatz ist.
  3. Schachbrettartige Anordnung Bakteriensuspension vorbereiten.
    1. Nehmen Sie ein Aliquot der einzelnen Antibiotika Aktien aus dem-80 ° C Gefrierschrank zu starten, während der Vorbereitung Bakteriensuspension Auftauen. Vortex einmal aufgetaut, um Antibiotika zu gewährleisten ist in Lösung.
    2. ~ 1 mL 0,9 % Natriumchlorid, ein 12 x 75 mm Runde untere Glasröhre Kultur hinzugeben. Wählen Sie ein oder zwei Kolonien aus einer Übernachtung Platte von Bakterien (in diesem Fall E. Coli -Stamm FDA-CDC 0494) und Wirbel sanft, diese in die 0,9 % Natriumchlorid auszusetzen.
    3. Überprüfen Sie die Konzentration der Bakterien mit einem McFarland Reader. Bedarf passen Sie indem weitere 0,9 % Natriumchlorid oder mehr Bakterien an, eine 0,5 McFarland Trübung lesen zu erreichen.
    4. Machen Sie eine Verdünnung von 1: 300 der 0,5 McFarland Suspension durch Zugabe von 100 mL der Suspension bis 30 mL des CAMHB in ein 50 mL konische Rohr, eine endgültige Zelldichte von 5 x 105 KBE/mL27zu erreichen.
  4. Ein flach-Boden, Platz-gut, klar, unbehandelte 384-Well-Platte mit der D300 fügen Sie Antibiotika hinzu.
    Hinweis:
    führen Sie diesen Schritt sofort nach der Zubereitung Bakteriensuspension, so daß Aussetzung zu den Platten innerhalb von 15 Minuten Vorbereitung26hinzugefügt werden kann.
    1. Inkjet-Drucker schalten Sie ein, starten Sie eine neue Datei, und das Protokoll wie in den Schritten 1.2.2.1-1.2.2.3 Fügen Sie Flüssigkeiten hinzu.
    2. Das Synergie-Raster zu generieren.
      1. Klicken Sie auf das Synergy -Symbol am oberen Rand des Bildschirms, und fahren Sie durch die Schritte. Wählen Sie für zwei oder mehrere Flüssigkeiten zusammen berücksichtigt. Für Platteist es nicht erforderlich, alle Brunnen auszuschließen; Klicken Sie auf weiter auf diesen Schritt ohne Änderungen.
      2. Geben Sie auf der Registerkarte Titration die antibiotische Konzentrationen und die Platzierung.
        1. Um Minocyclin in abnehmender Verdoppelung Verdünnungen von 32 bis 0,031 mg/mL, zusätzlich einen negativen Brunnen mit keine Antibiotika, die y Achse hinzufügen geben Sie 12 für Titration Ebenen auf der linken Seite. Wählen Sie unter geben Sie mittels Titrationhöchsten Konzentration; Wählen Sie für Flüssigkeit, Minocyclin; Geben Sie für höchste Konzentration32 (stellen Sie sicher, dass das Gerät befindet sich in mg/mL ist es nicht, die Synergy Dialogfeld zu schließen und ändern Sie unter der Registerkarte Aktuelle Protokoll ). Stellen Sie sicher, dass Feld enthalten 0 Wert aktiviert ist. Verteilung auf 1:2 (50 %) zu ändern.
        2. Wiederholen Sie diese Schritte für Colistin an der rechten Seitenwand, mit 12 Titration Ebenen und eine höchste Konzentration von 16. Klicken Sie auf weiter.
      3. Wählen Sie auf der Registerkarte " Layout " Titration ersten 2 Flüssigkeiten bestimmen die Anzahl der Zeilen und Spalten in einem Layoutraster. Klicken Sie auf weiter. Wenn das Raster wird angezeigt, wie erwartet, klicken Sie auf beenden.
    3. Das Protokoll speichern und klicken Sie auf die Schaltfläche " Ausführen " in der linken oberen Ecke.
    4. Klicken Sie auf die Schaltfläche " starten ". Laden Sie eine 384-Well-Platte (mit dem Deckel entfernt) in den Kennzeichenhalter und drücken Sie Loaded unter Last Plate 1 – Synergie Prompt. T8 + Kassette in das Kassettenfach und drücken Sie Loaded unter der Last einer T8 + Kassette Prompt ein.
    5. Wenn Sie aufgefordert werden, fügen Sie Antibiotika-Stammlösung zu den angegebenen Stauseen auf der Kassette. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm für die ordnungsgemäße Beladung und verzichten Sie sorgfältig um zu vermeiden, Luftblasen in der Lösung zu. Nachdem jede Lösung hinzugefügt wurde, klicken Sie bitte auf gefüllt .
    6. Sobald die D300 Dispenser, dass Antibiotika Lager in entsprechenden Volumes zu jedem Bohrloch und Feld laufen abgeschlossen angezeigt wird hinzugefügt, klicken Sie auf beenden, entfernen Sie die Platte, und schalten Sie die D300.
  5. 384-Well-Platte bakterielle Suspensionen hinzu und inkubieren Sie Platte.
    1. Gießen Sie die vorbereitete Bakteriensuspension in einen sterilen Reagenz-Stausee.
    2. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, 50 mL der Suspension in alle Vertiefungen in die schachbrettartige Anordnung hinzuzufügen. Geben Sie 50 mL CAMHB ohne Bakterien in eine leere; die negativ-Kontrolle werden auch zur Sterilität der Medien bestätigen. Brüten Sie in einem 35 ° C Umgebungsluft Inkubator für 16-20 h26.
  6. Platte auf einer Mikrotestplatte Reader OD600 lesen und Schachbrett Array Ergebnisse zu analysieren.
    1. Zuerst überprüfen Sie die Reinheit Platte zu und sicherzustellen Sie, dass die isolierte Kolonien eine einheitliche Morphologie aufweisen, die mit der erwarteten Morphologie des zu testenden Organismus entspricht.
    2. Mit einem Tabellenkalkulationsprogramm, Schatten Sie Zellen um Wachstum und kein Wachstum wie in Schritt 1.2.4.1. anzugeben.
    3. Bestimmen Sie das Mikro für jedes Medikament. Für ein Medikament, das hemmt nicht Bakterienwachstum in der höchsten Konzentration getestet, gilt das MIC off Maßstab sein.
    4. Für jedes gut in dem Wachstum gehemmt wird, bestimmen die gebrochene inhibitorische Konzentration (FIC) für jedes Antibiotikum basierend auf diesem Antibiotikum MIC (siehe Abbildung 1 b und 2 b).
      Hinweis: Der FIC ist das Verhältnis der Konzentration des Antibiotikums in einem Brunnen in dem Wachstum seiner MIC gehemmt wird; also für ein Medikament mit einem Mikrofon von 8 mg/mL, eine gut mit 8 mg/mL von diesem Medikament eine FIC 1, hat während eine gut mit 4 mg/mL eine FIC von 0,5.
    5. Berechnen Sie den gebrochene inhibitorischen Konzentration (FICich) Indexwert für jedes gut in dem Wachstum als die Summe der FICs jedes der Medikamente in das gut gehemmt wird.
    6. Bestimmen Sie die niedrigsten FICich an dem Wachstum ist gehemmt (minimale FICich). Wenn die minimale FICich £0,5 ist, betrachten Sie die Kombination synergistische; Wenn 0,5-4, betrachten die Kombination gleichgültig; und wenn > 4, betrachten die Kombination antagonistisch. Wenn die Kombination an einige Konzentration Kombinationen aber bei anderen antagonistischen synergistische ist, beachten Sie dieses Ergebnis aber betrachten Sie die Kombination insgesamt antagonistisch.

(2) Zeit-Kill Synergy testen

  1. Antimikrobielle Stammlösungen zu machen. Erfolgt dieser Schritt vor dem Experiment, frieren Sie Bestände bei-80 ° C bis einsatzbereit ein.
    1. Bestimmen Sie Antibiotika-Stammlösung Konzentrationen basierend auf Löslichkeit von Antibiotika und gewünscht Endkonzentrationen im Zeit-Kill Studien. Machen Sie in diesem Beispiel Colistin und Minocyclin Aktien bei einer Konzentration von 1 mg/mL. Mithilfe des CLSI M100-Dokuments geeignete Lösungsmittel für jedes Antibiotikum25bestimmen. Verwenden Sie Wasser, wie empfohlen, Colistin und Minocyclin.
    2. Antibiotikum Pulver mit Analysenwaage wiegen und Volumen des Lösungsmittels erforderlich, um Ziel Lager Konzentration berechnen. Bei Bedarf durchführen Sie eine Potenz Berechnung vor der Bestimmung der Menge des Lösungsmittels erforderlich, wie in Schritt 1.1.2.1 oben beschrieben.
    3. Gießen Sie Antibiotika Pulver in 15 mL konische Röhrchen und fügen Sie das entsprechende Volumen des Wassers. Wirbel, bis aufgelöst.
  2. Mit der beschriebenen CLSI M0726, manuelle Brühe Microdilution Methode durchführen QC antimikrobiellen Aktien für den Einsatz in der Zeit töten Synergie Experimente. Führen Sie diesen Schritt bis spätestens einen Tag vor der Synergie testen, sodass QC Ergebnisse überprüft werden können, vor der Verwendung der Lager.
    1. Wählen Sie eine geeignete QC-Belastung und der zulässige Bereich der MIC für Drogen getestet anhand von Tabelle 5A-1 in CLSI M10025. Verwenden Sie für die Medikamente hier, E. Coli ATCC 25922; die MIC-Bereiche für diese Sorte sind 0.25-1 mg/mL für Minocyclin und 0,25-2 mg/mL für Colistin.
    2. Bereiten Sie Antibiotika-haltigen Brühe Microdilution Platten.
      1. Wählen Sie die höchste Konzentration des Antibiotikums getestet werden, so dass das gesamte QC-Sortiment aufgenommen werden kann. Verwenden Sie eine Reihe von 0,016 bis 8 mg/mL für Minocyclin und Colistin für ATCC 25922.
      2. Verdünnen Sie die antibiotische Bestände, eine funktionierende Lösung in CAMHB zu zwei Mal die höchste Konzentration erforderlich (denn es wird 1:1 verdünnt mit der Aussetzung der Bakterien). In diesem Beispiel beide Bestände von 10 mg/mL bis 16 mg/mL zu verdünnen.
      3. Mit einer Multi-Kanal-Pipette, fügen Sie 100 mL aller 2 x Antibiotika Suspensionen zu einem Brunnen in der ersten Spalte einer klaren, Rundboden, unbehandelte 96-Well-Platte hinzu und geben Sie 50 mL einfache Brühe (d. h. ohne Antibiotikum) in jeder der nachfolgenden Spalten.
      4. Entfernen Sie 50 mL von Antibiotika-haltigen Brühe aus jedem gut in der ersten Spalte und in die Vertiefungen in der zweiten Spalte hinzufügen. Pipette nach oben und unten mehrmals, um den Inhalt, erzeugen eine antibiotische Konzentration Hälfte mischen, die Konzentration in der ersten Spalte.
      5. Wiederholen Sie Schritt 2.2.2.4 mit jeder Spalte, so dass eine Reihe von zwei-Fach-Verdünnungsreihen, jeweils mit einem Volumen von 50 mL, vorbereitet. Änderung Pipette Tipps zwischen jedem Verdünnungsschritt, falls gewünscht, die Möglichkeit einer antibiotischen Übertrag zu beseitigen. Beachten Sie, dass die resultierenden Konzentrationen aller noch 2 x die Endkonzentrationen sind, da sie anschließend 1:1 mit Bakteriensuspension verdünnt werden.
      6. Fügen Sie jedes Antibiotikum nicht zu den letzten beiden Spalten hinzu, wie diese werden die Spalten "negativ und" Wachstum Kontrolle.
    3. Bakteriensuspension vorzubereiten.
      1. Bereiten Sie eine 0,5 McFarland Suspension aus einer Übernachtung Platte von E. Coli ATCC 25922 in 0,9 % Natriumchlorid, wie in 1.2.1.5-1.2.1.6 Schritten beschrieben.
      2. Machen Sie eine Verdünnung von 1: 150 der 0,5 McFarland Suspension durch Zugabe von 50 mL der Suspension auf 7,5 mL CAMHB.
        Hinweis: Die endgültige Bakteriensuspension wird verdünnt 1: 300 sein, sobald es mit der antibiotischen Lösung, erreichen die CLSI empfohlen Zelldichte von 5 x 105 KBE/mL271:1 gemischt wird).
    4. Die Mikrotestplatte Bakterien hinzu und inkubieren.
      1. 50 mL der Bakteriensuspension in jede Vertiefung, außer in der 11th Spalte hinzugeben. 50 mL CAMHB zu den 11th (Negativkontrolle) Spalte hinzufügen.
      2. Inkubieren Sie Platte bei 35 ° C für 16-20 h.
        Hinweis: Eine unterschiedliche Dauer der Inkubation kann erforderlich sein, wenn andere als Enterobacteriaceae Organismen getestet werden; Organismus-spezifische Empfehlungen finden Sie in der CLSI M10025 .
      3. Lesen Sie Platte für das Wachstum, die visuell mit Durchlicht zu, und für jedes Antibiotikum bestimmen Sie die niedrigste Konzentration, in der gibt es kein Wachstum; Dies ist das Mikrofon. Konsultieren Sie das CLSI M07 Dokument für weitere Informationen über visuelle Interpretation von MIC26. Wenn das MIC innerhalb des erwarteten Bereichs QC, der Stammlösung ist geeignet für den Einsatz ist.
  3. Starten Sie die ursprüngliche Kultur.
    1. Machen Sie eine 0,5 McFarland Suspension der Testorganismen in steriler 0,9 % NaCl als oben beschrieben.
    2. Hinzugeben Sie 100 mL 0,5 McFarland Aussetzung bis 5 mL des CAMHB in einem Glas 25 x 150 mm Runde Kultur Unterrohr mit Edelstahl-Verschluß und Wirbel sanft zu mischen.
    3. Mithilfe einer sterilen Impfkeimen Schleife, Isolierung Streifen einen Tropfen der verdünnten Suspension auf einen Teller Blutagar bestätigen Inokulum Reinheit und Inkubation bei 35 ° C in der Luft.
    4. Schließung am Rohr zu ersetzen und brüten in einem Reagenzglas Gestell auf einem Schüttler bei 35 ° C in der Luft für mindestens 3 h bis logarithmischen Phase Wachstum erreicht ist (siehe Schritt 2.6.1). Fahren Sie mit Schritt 2.4, während die Kultur in den Inkubator ist.
  4. Bereiten Sie antimikrobielle Lösungen in 25 x 150 mm Kultur Glasröhren.
    1. Nehmen Sie antimikrobielle Lager Aliquote von-80 ° C Gefrierschrank zu tauen. Vortex einmal aufgetaut, um Antibiotika zu gewährleisten ist in Lösung.
    2. Während erste Kultur Inkubation ist, 10 mL CAMHB, fünf autoklaviert 25 x 150 mm Kultur Glasröhren dazugeben Sie und antimikrobielle Stammlösungen wie folgt.
      Hinweis: Für eine Synergie-Studie sollte mindestens ein Medikament in einer Konzentration, die nicht auf das Wachstum auswirkt Kurve einzeln28; Dies kann durch die Evaluierung der Auswirkungen der einzelnen Drogen Konzentrationen vor der Synergy-Studie ermittelt werden.
      1. Röhre 1: Fügen Sie entsprechende Menge Antibiotika #1 letzte Antibiotika Zielkonzentration zu erhalten. In diesem Fall fügen Sie 10 mL von 1 mg/mL Colistin Material, das eine endgültige Colistin-Konzentration von 1 mg/mL zu erhalten, da dies eine Konzentration, die gegen die Belastung in diesem Beispiel verwendeten unwirksam ist.
      2. Rohr 2: Fügen Sie entsprechende Menge Antibiotika #2 zu Antibiotika Endkonzentration getestet werden. In diesem Fall fügen Sie 10 mL von 1 mg/mL Minocyclin Material, eine Endkonzentration von 1 mg/mL, eine Konzentration zu erhalten, die gegen die Belastung wird in diesem Beispiel verwendeten unwirksam ist.
      3. Rohr 3: Fügen Sie die gleiche Menge an Antibiotika #1 und Antibiotikum #2 wie in Röhren 1 und 2 verwendet. In diesem Fall 10 mL von 1 mg/mL Minocyclin Lager und 10 mL von 1 mg/mL Colistin Brühe hinzufügen.
      4. Schlauch 4: Fügen Sie keine Antibiotika; Dies wird das Wachstum Kontrolle Rohr sein.
      5. Schlauch 5: Fügen Sie keine Antibiotika; Dies wird die Negativkontrolle Rohr sein.
  5. Verdünnungsreihen bereiten Sie 96 Tiefbrunnen Polypropylen Platten mit 2 mL Brunnen indem 900 µL steriler 0,9 % Natriumchlorid zu Stützenreihen B-H 1-5 mit einer Mehrkanal-Pipette vor.
  6. Bereiten Sie ab Inokulum und Rohre hinzufügen.
    1. Sobald die erste Kultur logarithmischen Wachstumsphase (~ 3 h für Klebsiella Pneumoniae, in diesem Beispiel verwendeten Organismus) erreicht hat, entfernen Sie das Kultur-Rohr aus dem Shaker übertragen Wirbel sanft, ~ 1 mL der Suspension auf einer Glasröhre Kultur 12 x 75 mm und Überprüfen Sie die Dichte mit einem Lesegerät McFarland.
      1. Wenn es weniger als 1,0 McFarland ist, den Shaker Rohr wieder und inkubieren Sie mehr. Wenn es größer als 1,0 McFarland, fügen CAMHB am Rohr Wirbel sanft, und probieren Sie erneut, den Vorgang wiederholen, bis die Suspension auf 1,0 McFarland ist.
    2. 100 mL der 1,0 McFarland Suspension Rohre 1-4 und Wirbel sanft hinzufügen.
  7. Probieren Sie Aliquote aus jeder Kultur und führen Sie seriell Zehnfache Verdünnungen.
    1. Zeitpunkt 0 (sofort nach dem Hinzufügen von Bakterien an den Rohren) und 1, 2, 4, 6 und 24 h entfernen Sie eine 150 mL aliquoten aus jeder Kultur-Schlauch durch das Rohr kippen, so dass nur die sterilen Pipettenspitze das Rohr und nicht die unsterilen Pipette Welle während der aliquoten Entzug tritt. Aliquote, bzw., in aufeinander folgenden Vertiefungen in der ersten Zeile der zuvor vorbereiteten 96 Tiefbrunnen Platte hinzufügen. Kapitalrendite Rohre zu einem Reagenzglas Rack einen Shaker in einem 35 ° C Umgebungsluft Inkubator sofort nach dem Entfernen der Aliquote zu jedem Zeitpunkt.
    2. Mit einer Mehrkanal-Pipette, Reihe A 100 mL entnehmen, Zeile B (enthält 900 mL 0,9 % Natriumchlorid) hinzu, und pipette rauf und runter 4-5mal Mischung, erstellen eine 01:10 Verdünnung. Tipps nach jedem Verdünnungsschritt Verschleppung von Bakterien, die verhindern, dass die fälschlich erhöhten Kolonie zählt zu verwerfen.
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.7.2 für Zeilen B-H mit neuen Pipettenspitzen für jede Zeile.
  8. Platte verdünnt Proben für Kolonie zählt mit der Drop Plate Methode29,30.
    1. Label Mueller-Hinton-Agarplatten mit den Antibiotika und Verdünnung überzogen werden.
    2. Mit einer Mehrkanal-Pipette und extra langen Spitzen (um sicherzustellen, dass die Tipps in Suspension zu erreichen), jede Vertiefung in Spalte eins 10 mL entnehmen und in Folge auf den entsprechend gekennzeichneten Teller sorgfältig zu verzichten. Wenn kleine (Durchmesser 100 mm) Platten verwendet werden, verzichten Sie 3 Reihen (jeweils bestehend aus Tropfen aus einer einzelnen Spalte Zeilen A-H) pro Platte; verzichten Sie auf großen (Durchmesser 150 mm) Platten 8 Zeilen pro Platte.
    3. Tropfen vollständig trocknen lassen (ca. 15 min).
    4. Geben Sie um 24 Uhr einen 10 mL-Tropfen genommen direkt aus der Tube negativ-Kontrolle in einem angegebenen Bereich einer der Platten, um Sterilität zu testen. Platten zu invertieren und Inkubation über Nacht bei 35 ° C in der Luft.
  9. Zählen Sie Kolonien und berechnen Sie Zelldichte zu. Markieren Sie Kolonien mit einem Fine-Tip-permanent-Marker auf der Rückseite der Platte um Doppelzählungen oder fehlende Kolonien zu vermeiden.
    1. Zuerst überprüfen Sie die Reinheit Platte zu und sicherzustellen Sie, dass die isolierte Kolonien eine einheitliche Morphologie aufweisen, die mit der erwarteten Morphologie des zu testenden Organismus entspricht.
    2. Identifizieren Sie für jede Verdünnungsreihen Tropfen mit 3-30 Kolonien (in der Regel einen Tropfen pro Verdünnungsreihe). Zählen Sie die Kolonien in diese Tropfen zu und zeichnen Sie der Graf zusammen mit dem Verdünnungsfaktor auf.
      1. Gibt es keine Tropfen in eine Verdünnungsreihe mit 3-30 Kolonien, zählen die Kolonien in den letzten Tropfen mit > 30 Kolonien und den ersten Tropfen mit < 3 Kolonien (diese sollte neben Tropfen).
    3. Für jede Verdünnungsreihen, Anzahl der Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/mL) in der Stichprobe anhand der Anzahl der Kolonien in der Drop-mithilfe der folgenden Formel berechnen: KBE/mL = n(1 /d) (100) wo n die Anzahl der Kolonien ist, d ist der Verdünnungsfaktor (1 für unverdünnte Probe (Reihe A), 0,1 oder 10-1 für die erste 01:10 Verdünnung (Zeile B), 0,01 oder 10-2 für die zweite 01:10 Verdünnung (Reihe C), und So weiter, und die konstante 100 Konten für die Tatsache, dass das Gesamtvolumen des Tropfens ich s 10 mL, während der letzte Wert in KBE/mL, d. h. KBE/1.000 mL zum Ausdruck kommt. Verwenden Sie eine Tabelle mit Formeln, die KBE/mL von Kolonie zählen zu diesen Vorgang vereinfachen zu berechnen.
      1. Durchschnittliche zählt für Verdünnungsreihen, wo mehr als ein Tropfen war zählbare (oder wo zwei Tropfen weil gezählt werden musste kein Tropfen fiel im Bereich) die endgültige KBE/mL für alle gezählten Tropfen.
      2. Da die untere Grenze der Erkennung 300 KBE/mL (3 Kolonien in der unverdünnten Tropfen), Record und Plot Kolonie als £300 KBE/mL für Verdünnungsreihen beträgt gibt es in dem < 3 Kolonien in der unverdünnten Tropfen.
    4. Überprüfen Sie den Sterilität Kontrolle Tropfen aus Zeit 24; Wenn kein Wachstum in dieser Rückgang beobachtet wird, sollten die Ergebnisse des Experiments nicht verwendet werden.
  10. Grafisch darstellen Sie und analysieren Sie die Ergebnisse.
    1. Wachstumskurven aus den drei Antibiotika-haltigen Kulturen und der Wachstumskontrolle im selben Diagramm geplottet. Plot-Zeit auf der x-Achse und KBE/mL, mit einer logarithmischen Skala, auf der y-Achse .
    2. Berechnen Sie die Differenz in KBE/mL die Kombination Röhre zur Zeit 24 und der einzigen Wirkstoff zur Zeit 24. Wenn der Unterschied ≥2 Log10, betrachten Sie die Kombination synergistische. Dann berechnen Sie die Differenz in KBE/mL zwischen die Kombination Röhre zur Zeit 24 und zum Zeitpunkt 0. Wenn der Unterschied ≥3 Log10, betrachten Sie die Kombination bakterizide.

Representative Results

Abbildung 1A zeigt ein Raster aus einem Schachbrett Array Synergie Experiment in welchem, die Minocyclin in einer Konzentration von 0-32 μg/mL in Kombination mit Colistin bei Konzentrationen von 0-16 μg/mL und gegen E. Coli -Stamm FDA-CDC 0494 getestet wurde. Die Werte stehen für photometrische Messungen bei optischen Dichte 600 nm (OD600). Brunnen mit OD600 Werte unterhalb von 0,07 (entspricht kein Wachstum durch Sichtkontrolle) sind rot, Brunnen mit OD600 Werte 0,07 (entspricht Wachstum durch Sichtkontrolle) grün schattiert. Für jedes Medikament ist minimale inhibitorische Konzentration (MIC; Fett) die niedrigste Konzentration des Medikaments, das Wachstum von Bakterien hemmt. Für Minocyclin Dies ist 32 μg/mL und für Colistin, ist es 8 μg/mL. Die Schattierung ist in Abbildung 1 bbeibehalten, aber Werte innerhalb der Brunnen in denen Wachstum gehemmt wird durch gebrochene hemmende Konzentration Index (FICich) Werte ersetzt werden. Diese werden wie folgt ermittelt: in jede Vertiefung der gebrochene hemmende Konzentration Index (FIC) jedes Medikament errechnet sich durch Division der Konzentration des Antibiotikums in so gut durch das Medikament MIC und die FICich errechnet sich durch Addition der beiden FICs. Brunnen mit einem FICich Wert von 0,5, welches die Cutoff für Synergie gilt, werden durch eine gebrochene Rahmenlinie angezeigt, und der Brunnen mit dem niedrigsten FICich Wert (0.094) ist Fett. Da die minimale FICich Wert im Bereich von synergistischen ist, gilt die Kombination synergistische.

Abbildung 2A und 2 b zeigen Netze analog zu denen in Abbildung 1A und 1 b Abbildung, aber in diesem Fall ist die Kombination nicht Synergie gegen das Isolat getestet (K. Pneumoniae Isolat BIDMC 4) zeigen, weil die minimale FICich an dem Wachstum gehemmt ist 1 > 0,5.

Abbildung 3 veranschaulicht die optische Dichte-Messwerte aus einem Schachbrett Synergie Raster, in dem mehrere übersprungene Brunnen (Enterobacter Weg komplexe Isolat BIDMC 27) aufgetreten ist. Übersprungene Brunnen sind Brunnen, bakterielles Wachstum trotz der Anwesenheit des Bakterienwachstums in benachbarten Brunnen mit höheren Konzentrationen von Antibiotikum gehemmt wird. Dieses Phänomen, das in MIC Standardtests sowie auftreten bekannt ist, dürfte aufgrund der biologischen Variabilität in Bakterienwachstum Merkmale von gut zu gut und die Empfindlichkeit einiger Antibiotika, kleine Unterschiede in der bakterielle Inokulum23 , 31 , 32. Wenn mehrere gut trat in eine schachbrettartige Anordnung übersprungen, wir die Ergebnisse verworfen und den Test wiederholt.

Abbildung 4 zeigt Beispiele für Zeit-Kill Synergie Ergebnisse drei Kombinationen getestet gegen K. Pneumoniae isolieren BIDMC 32. Kolonie zählt sind angegeben in einer logarithmischen Skala auf der y-Achse und die Uhrzeit in Stunden, auf das X-Achse. Der Unterschied zwischen Start Inokulum in der Röhre, enthält die Wirkstoffkombination und die Konzentration von Bakterien in diese Röhre um 24 Uhr ist durch den roten Balken und Zahl, während der Unterschied zwischen der Konzentration von Bakterien bei 24 h zwischen dem Rohr dargestellt. mit der Kombination und die Röhrchen mit den aktivsten Einzelsubstanz allein wird durch die blauen Balken und die Anzahl veranschaulicht. Abbildung 4A zeigt Ergebnisse aus der Kombination von Colistin und Minocyclin; Diese Kombination war synergistische (Differenz zwischen Konzentrationen von Bakterien ausgesetzt, Kombination und aktivsten Agent allein ≥2 Log10 KBE/mL in 24 h) und bakterizide (Rückgang ab Inokulum Konzentration bei 24 h ≥3 Log10 CFU/mL). Abbildung 4 b zeigt die Ergebnisse aus der Kombination von Colistin und Clindamycin, eine Kombination, die synergistische war, aber war nicht bakterizide. Diese Kombination verhindert Wachstum der Bakterien, die weder Drogen allein tat, aber nicht töten. Abbildung 4 zeigt, ergibt sich aus der Kombination von Colistin und Erythromycin, die weder bakterizide noch synergistische war.

Figure 1
Abbildung 1: Schachbrettartige Anordnung ergibt demonstrierende Synergie (Minocyclin + Colistin getestet gegen E. Coli Stamm FDA-CDC 0494). (A) spektralfotometrische auslesen und Wachstum Interpretation eine schachbrettartige Anordnung. Werte in Zellen sind Lesungen der Extinktion bei 600 nm (OD600). Zellen mit OD600 Werte unterhalb von 0,07 (entsprechend kein Wachstum durch Sichtkontrolle) sind rot, während Zellen mit OD600 Werten 0,07 (entsprechend Wachstum durch Sichtkontrolle) grün schattiert. (B) gebrochene inhibitorischen Konzentration (FICich) Indexberechnung. Schattierung angibt, Wachstum oder kein Wachstum wurde beibehalten. Werte für Colistin und Minocyclin entlang X- und y-Achsen, gebrochene inhibitorischen Konzentration (FIC) oder das Verhältnis der Konzentration des Medikaments in dieser Spalte oder Zeile zu der minimalen inhibitorischen Konzentration (bzw. jetzt darstellen MIC) von diesem Medikament allein. Der Wert in jeder Zelle ist die FICich, oder die Summe der FICs beider Medikamente so gut. Das große gebrochene Linie umrandete Feld umschließt Brunnen mit einem FICich von 0,5. Die dick umrandeten Feld gibt an, der Brunnen mit der niedrigsten FICich in dem Wachstum gehemmt wird, oder die minimale FICich. Da die minimale FICich 0,5 ist, ist die Kombination synergistische betrachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schachbrett Array Ergebnisse einer Kombination, die nicht Synergie (Minocyclin + Colistin getestet gegen K. Pneumoniae BIDMC 4 isolieren) nachweisen. (A) optische Dichtewerte bei 600 nm und Wachstum Interpretation der Schachbrett-Array Ergebnisse wie bei Abbildung 1Abeschrieben. (B) gebrochene inhibitorischen Konzentration (FICich) Indexberechnung für Abbildung 1Abeschrieben. Da die minimale FICich > 0,5, die Kombination ist nicht als synergistische. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Schachbrett-Array-Ergebnisse, die aufgrund nicht interpretierbar sind übersprungen Brunnen (Minocyclin + Colistin getestet gegen Enterobacter Weg komplexe isolieren BIDMC 27). Optische Dichtewerte bei 600 nm und Wachstum Interpretation der Schachbrett-Array Ergebnisse wie bei Abbildung 1Abeschrieben. Mehreren übersprungene Brunnen, in denen Bakterienwachstum, trotz der Anwesenheit des Wachstums im benachbarten Brunnen mit höheren Konzentrationen von Antibiotika gehemmt wird, werden demonstriert. Ergebnisse sind nicht interpretierbar und experimentieren muss wiederholt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Zeit-Kill Synergie Ergebnisse der drei Kombinationen gegen K. Pneumoniae isolate BIDMC 32 getestet. Kolonie zählt sind angegeben in einer logarithmischen Skala auf der y-Achse und die Uhrzeit in Stunden, auf das X-Achse. Der Unterschied zwischen der Konzentration von Bakterien in der Kombination bei 24 h und ab Inokulum in der Röhre wird durch den roten Balken und Anzahl veranschaulicht. Wenn der Rückgang ab Inokulum Konzentration bei 24 h ≥3 Log10 KBE/mL ist, gilt die Kombination bakterizide. Der Unterschied zwischen der Konzentration von Bakterien bei 24 h zwischen dem Rohr, enthält die Kombination und die Röhrchen mit den aktivsten Einzelsubstanz allein ist durch den blauen Balken und die Anzahl dargestellt; ≥2 Log10 KBE/mL Reduktion ist, gilt die Kombination synergistische. (A) Colistin (CST) + Minocyclin (MIN), eine Kombination, die sowohl synergistische und bakterizide. (B) Colistin + Clindamycin (CLI), eine Kombination, die synergistische aber nicht Bakterizid ist. (C) Colistin + Erythromycin (ERY), eine Kombination, die synergistische weder bakterizide. Diese Ergebnisse wurden zunächst im Rahmen einer Studie über die synergistische Tätigkeit von Colistin-haltigen Kombinationen gegen Colistin-beständige Enterobacteriaceae, in denen wir unter Beweis, dass Colistin gestellt war mit einer Reihe von synergistischen Antibiotika, die nur einzeln aktiv sind (z.B. Clindamycin) oder in erster Linie (z.B. Erythromycin) gegen grampositive Bakterien16. (Beachten Sie, dass Erythromycin synergistische von schachbrettartige Anordnung gegen den Virusstamm gezeigt war, aber nicht durch Zeit-Kill, also es ausgewählt wurde hier als ein Beispiel für eine nicht-synergistische Kombination.) Wir theoretisierte, daß Colistin, das bekannt ist, handeln von Permeabilisierung der äußeren Membran Gram-negativen, übt eine sub-inhibitory permeabilizing Wirkung auf Colistin-beständige gramnegative Bakterien, so dass Eintrag von Drogen wie Clindamycin, die Normalerweise kann nicht die Gram-negativen Zelle eindringen. Panel (A) dieser Figur verändert wurde, vom Brennan-Krohn, Pironti und Kirby 201816, Copyright © American Society for Microbiology, antimikrobieller Mittel und Chemotherapie, 62(10), 2018, Pii: e00873-18, Doi: 10.1128/AAC.00873-18. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die beiden hier beschriebenen Methoden informieren sowohl über die Aktivität von Antibiotika in Kombination im Vergleich zu ihrer individuellen Tätigkeit verwendet. Die automatisierte, Inkjet-Drucker unterstützt digitale Abgabe Methode ist eine Adaption der Methode in der klinischen Mikrobiologie Verfahren Handbuch33beschrieben, während der Zeit-Kill-Methode genauer das entsprechende Protokoll aus dem gleichen folgt 34zu verweisen.

In der Schachbrett-Array-Methode Berechnungen zur Ermittlung das nötige Volumen von antimikrobiellen Material, das in jede Vertiefung hinzufügen sowie die Abgabe von diesen Bänden ist automatisiert, wodurch einige der wichtigsten potentiellen Quellen der Fehler in einem Handbuch schachbrettartige Anordnung. Noch wesentlicher ist jedoch, dass der Prüfer bestimmt, dass die ursprünglichen Bestände bei der geplanten Konzentration erfolgen und Ziel Endkonzentrationen in die D300-Software korrekt eingegeben werden. Hinzufügen die antimikrobielle Federung, Brunnen in einem 384-Well-Platte kann am Anfang schwierig sein und erfordert Sorgfalt um sicherzustellen, dass Pipette Tipps geben Sie die entsprechenden Vertiefungen und der Flüssigkeit nicht spritzen bis die Kanten der Brunnen. Ein automatisierte liquider Handler kann anstelle einer handgeführten Mehrkanal-Pipette verwendet werden, erhöhen die Geschwindigkeit und Genauigkeit mit dem Brunnen der Bakteriensuspension hinzugefügt wird. Wie im Protokoll beschrieben, erfordert die D300 die Zugabe von Tensiden, Polysorbat 20 (P-20), für die ordnungsgemäße Handhabung von Flüssigkeiten. Ein anderes Tensid, Polysorbat 80, bei einer Konzentration von 0,002 % verzeichnen, Colistin Mikrofone für Organismen mit Colistin Mikros von senken < 2 µg/mL im standard Brühe Microdilution Assays. 35 , 36 unser Labor zuvor gezeigt, dass P-20 in Konzentrationen bis zu 0,0015 % hatten keine Auswirkungen auf D300-gestützte MIC Ergebnisse im Vergleich zu verweisen BMD14. Im hier vorgestellten Assay-Beispiel ist die maximale P-20 Konzentration 0.0014 %.

Ein Problem begegneten wir mit einigen Schachbrett Array Assays wurde eine große Anzahl der übersprungenen Brunnen. Dies geschah zu einem überproportional mit bestimmten Antibiotika. Insbesondere in einem Bildschirm-Kombinationen mit einer Sammlung von Carbapenem-resistente Enterobacteriaceaefanden wir, dass während 49 521 Studien (9,4 %) waren unbrauchbar aufgrund mehrerer übersprungenen Brunnen, 2 der 12 Antibiotika getestet (Fosfomycin und Hemmhof) entfielen 46 dieser Studien (94 %). So erhöhte Preise möglicherweise eher in Drogen, die besonders anfällig für das Inokulum Effekt31,32,37. Der Hinweis empfiehlt CLSI testen Fosfomycin in Brühe Verdünnung25 aufgrund von Bedenken über die Zuverlässigkeit der Ergebnisse mit dieser Methode, was, die unzuverlässigen Ergebnissen gesehen mit diesem Medikament erklären könnte nicht. Einige Änderungen können automatisierte Schachbrett-Methode je nach Prüfer vorgenommen werden. Antibiotika können in Platten bereits mit Bakteriensuspension anstatt in leeren Brunnen, verzichtet werden, wenn dies aus Gründen der Workflow innerhalb des Labors vorzuziehen ist. Während 384-Well Platten hier verwendet wurden, kann die Methode auch in 96-Well-Platte-Assays mit entsprechender Modifikation auch Volumen erfolgen. Die Verwendung des Formats einer 96-Well-Platte kann in reduzierenden übersprungenen Brunnen für Antibiotika helfen, die besonders empfindlich auf kleine Änderungen im Inokulum. Bei der Berechnung der FICichmöglicherweise Situationen, wo das MIC off-Skala (d. h. höher als getestet), einschließlich Situationen wo das Medikament getestet wird keine Aktivität einzeln gegen den Typ des Organismus getestet hat. In diesen Fällen kann die FIC berechnet basierend auf vorausgesetzt, das Mikrofon ist eine Verdünnung höher als die höchste Konzentration getestet. Dies ist der am meisten konservative Strategie, da es die maximalen möglichen FIC-Wert für jede Verdünnung übernimmt wo Hemmung während der Synergie Tests beobachtet wird. Beispielsweise würden die tatsächlichen MIC stattdessen zwei Verdoppelung Verdünnungen oben getestet, die höchste Konzentration, dann die entsprechenden FICs zweifach niedriger als die konservative Zuordnungen, und So weiter wäre.

Um die bakterizide Aktivität von Drogen in einem Zeit-Kill-Assay einschätzen zu können, ist es unerlässlich, dass Kulturen Zunahme der logarithmischen Phase sein, besonders wenn aktive Zellwand Antibiotika getestet28sind. Für die schnell wachsenden Bakterien verwendet in diesem Beispiel (K. Pneumoniae), 3 Stunden Inkubation mit schütteln war angebracht, diese Wachstumsphase zu erreichen, aber unterschiedlich viel Zeit können für verschiedene Organismen notwendig sein. Im Allgemeinen sollte die Kultur sichtbar aber nicht stark trüb erscheinen. Die entsprechende Menge an Zeit kann bestimmt werden, durch den Bau einer Wachstumskurs mit Kolonie zählt bei seriellen Zeit Punkte (z. B. alle 30 min. für 4-6 h)38genommen. Wichtig ist auch die beabsichtigte Start Inokulum in der Zeit-Kill-Studie. Die Zielkonzentration des Inokulums Start ist ca. 5 x 105 bis 1 x 106 KBE/mL. Die hier beschriebenen Verdünnung (100 μl einer 1,0 McFarland Suspension in 10 mL Medien) erzeugt dieses Inokulum für Klebsiella Pneumoniae und andere Enterobacteriaceae -Arten, auf die wir es getestet haben. Wenn die Dichte der Ausgangspunkt Impfkulturen in einem Experiment mit verschiedenen Organismen deutlich höher oder niedriger ist, kann eine andere Verdünnung erforderlich sein. (Die entsprechende Verdünnung erforderlich für eine bestimmte Tierart kann bestimmt werden durch Ausführen einer Keimzahl von 0,5 oder 1,0 McFarland Aussetzung wie viele Organismen bestimmen diese Trübung dann die Berechnung mit dem ersten aufgehängt werden müssen stellt, verdünnt, um die entsprechende endgültige Konzentration zu erreichen.) Wenn zur Überprüfung der Platte zählt der Synergy-Studie, Start Inokulum eines Antibiotika-haltigen Röhren gefunden wird, deutlich niedriger als der Ausgangspunkt Inokulum der Wachstumskontrolle gewesen zu sein, dies deutet entweder Antibiotika Übertrag oder sehr schnelle Tötung von Bakterien in der kurzen Zeit zwischen von Bakterien gegen Antibiotika-haltigen Rohr hinzufügen und Entfernen von den Aliquoten für Beschichtung. Ist die tatsächliche Anzahl der Kolonien in der unverdünnten Tropfen in einer Reihe niedriger als die Anzahl der Kolonien in nachfolgenden Verdünnungen, schlägt dies Übertrag antibiotische Wirkung. Verschiedene Optionen sind zur Verhinderung dieser Effekt, einschließlich Verbreitung einer einzigen aliquoten über eine ganze Platte38 oder Spinnen auf die Probe, überstand entfernen und erneut Aussetzung in steriler Kochsalzlösung vor dem Plattieren39beschrieben worden. Jedem Zeitpunkt in der Zeit-Kill-Methode ist es auch entscheidend für die Ermittler effizient aber genau eine Aliquote aus jeder Kultur Schlauch entfernen und Verdünnungsreihen durchführen. Verzögerungen während dieses Prozesses, besonders während der frühen Zeitpunkten, die in enger Folge auftreten kann einen längeren Zeitraum, während dessen Kulturen nicht sind, inkubiert und erschüttert, Verzicht auf unvorsichtige und Verdünnungsreihen zu ungenau Platte führen können zählt. Im Vergleich zu der Platte Verteilungsmethode Platte zu zählen, in denen 100 μL jeder Verdünnung sich über eine gesamte Agarplatte erstreckt, die Drop-Platte-Methode beschrieben ist weit mehr Rapid erfordert eine viel kleinere Anzahl von Agarplatten und ermöglicht eine schnellere zählen, als die maximale zählbare Anzahl der Kolonien für jeden Tropfen ist 30, während bis zu 300 Kolonien in der Regel von einer Ausbreitung Platte gezählt werden kann. Die Verteilungsmethode Platte ist jedoch auch eine Option, wenn Ermittler mehr mit dieser Technik vertraut sind. Wenn Tropfen verteilt nach der Entnahme mit einer Mehrkanal-Pipette ineinander, kann individuelle Anwendung mehr weit auseinanderliegende Tropfen mit einer ein-Kanal-Pipette stattdessen durchgeführt werden. Nach unserer Erfahrung schien Kühlplatten bei 4 ° C vor der Abgabe Tropfen übermäßige Verbreitung zu verringern.

Eine Einschränkung der hier beschriebenen Techniken ist, dass die Ergebnisse der zwei Arten von Synergie-Assay (schachbrettartige Anordnung und Zeit-Kill) nicht immer übereinstimmende sind, und da die meisten veröffentlichten Synergie Artikel eine Methode oder die andere, anstatt beide zusammen verwenden, sie können schwierig sein zu wissen, wie man Daten aus den zwei Arten von Tests zu integrieren. Da die automatisierte Schachbrett-Array-Methode, die wir entwickelt einfach ist und Hochdurchsatz-wir es in der Tat als eine Art Bildschirm habe, gegen eine größere Anzahl von Isolaten Kombinationen zu testen und zu bestimmen, welche Konzentration Kombinationen synergistische waren. Dann führten wir eine kleinere Anzahl von Zeit-Kill Studien, Auswahl von Kombinationen und Konzentrationen, die in die schachbrettartige Anordnung wirksam gewesen. Bemerkenswert, weil der Schachbrett-Test in der Regel auf einer Skala von Microbroth Verdünnung durchgeführt wird, während der Zeit-Kill-Assay (ähnlich wie bei einer macrobrodo Verdünnung), größere Mengen verwendet wir fanden, dass FICs manchmal anders zwischen den beiden Methoden mit höheren Konzentrationen in der Regel in der Zeit-Kill-Test erforderlich, um Aktivität zu demonstrieren. Dieses Phänomen wurde bereits festgestellt, beim Vergleich von macrobrodo und Microbroth Verdünnung MIC Untersuchungsergebnisse für gramnegative Bazillen26 und wenn größere Inokula (wie im Zeit-Kill Studien verwendet) mit den standard Inokulum verwendet verglichen werden Microbroth Verdünnung und Schachbrett Array assays32. Eine bestimmte Einschränkung die schachbrettartige Anordnung ist die inhärente Variabilität in Microbroth Verdünnung MIC Test22. Während FICich Abschaltungen für Synergy Konto für diese Variabilität mathematisch6 solche Variabilität wirft unweigerlich Bedenken hinsichtlich der Zuverlässigkeit und Konsistenz der Schachbrett-Array Ergebnisse.

Aufgrund der Einschränkungen, die alle in-vitro-Testverfahren (einschließlich der Kultivierung von Bakterien in einer künstlichen Wachstumsmedium, statische antibiotische Konzentrationen und einen begrenzten zeitlichen Verlauf) Synergie, Ergebnisse, die durch diese Methoden bestätigt werden müssen und mit ergänzenden Techniken weiter ausgewertet. Solche Methoden gehören in-vitro-Pharmakokinetische/pharmakodynamische (PK/PD) Studien (z. B. der Hohlfaser-Infektion Modell40), Tiermodellen und letztlich PK/PD und Wirksamkeit Studien am Menschen. Die automatisierte Schachbrett Array Methode beschrieben hier, indem Sie eine schnelle Methode mit dem auf Bildschirm-Kombinationen für potentielle synergistische Tätigkeit ermöglicht mehr gezielte Nutzung dieser Techniken. Weitere Automatisierung aller dieser Methoden als sowie mehr systematische Untersuchung der Beziehung zwischen in-vitro-Parametern und der klinischen Ergebnisse werden wichtig bei der Skalierung von oben die Nutzung von Synergie testen und die Erhöhung seiner klinischen Anwendbarkeit.

Disclosures

Die D300 digitale Dispenser und zugehörigen Verbrauchsmaterialien wurden von Tecan (Morrisville, NC) zur Verfügung gestellt. Tecan hatte keine Rolle beim Studiendesign, Sammlung/Dateninterpretation, Manuskript Vorbereitung oder Entscheidung zu veröffentlichen.

Acknowledgments

Thea Brennan-Krohn wurde unterstützt durch eine Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development pädiatrische Infektionskrankheiten Forschung Ausbildung Grant (T32HD055148), National Institute of Allergy und Ausbildung Zuschuss (Infectious Diseases T32AI007061), ein Boston Children Hospital Office der Fakultät Fakultät Karriereentwicklung Gemeinschaft und den National Institute of Allergy and Infectious Diseases Career Development Award (1K08AI132716). J.E.K. wurde durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases von den National Institutes of Health unter Prämiennummer R33 AI119114 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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