En Fluorogenic peptid Cleavage analysen til skjermen for proteolytiske: programmer for coronavirus pigge protein aktivisering

* These authors contributed equally
Biochemistry

GE Global Research must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi presenterer en fluorogenic peptid cleavage analysen som tillater en rask screening av proteolytisk aktiviteten til proteaser på peptider som representerer området spalting av viral fusion peptider. Denne metoden kan også brukes på noen andre aminosyren motiv i en protein sekvens til å teste protease aktiviteten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jaimes, J. A., Millet, J. K., Goldstein, M. E., Whittaker, G. R., Straus, M. R. A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation. J. Vis. Exp. (143), e58892, doi:10.3791/58892 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Innhyllet virus som coronaviruses eller influensa virus krever proteolytisk spalting av deres fusion protein kunne infisere vert cellen. Ofte virus viser celler og vev tropism og er tilpasset bestemte cellen eller vev proteaser. Videre kan disse virusene introdusere mutasjoner eller innsettinger i sine genom under replikering som kan påvirke cleavage, og dermed kan bidra til tilpasninger til en ny vert. Her presenterer vi en fluorogenic peptid cleavage analysen der en rask screening av peptider etterligne webområdet spalting av viral fusion proteiner. Teknikken er svært fleksibel og kan brukes til å undersøke proteolytisk aktiviteten til en enkelt protease på mange ulike underlag, og i tillegg gjør det også mulig utforskning av aktiviteten til flere proteaser på én eller flere peptid underlag. I denne studien brukte vi peptider mimicking cleavage nettstedet motiver av coronavirus spike protein. Vi testet menneskelige og camel avledet Midtøsten åndedretts Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) å demonstrere at enkelt- og dobbeltrom erstatninger i området cleavage kan endre aktiviteten til furin og dramatisk endre cleavage effektivitet. Vi har også brukt denne metoden i kombinasjon med bioinformatikk teste furin cleavage aktivitet av feline coronavirus spike proteiner fra ulike serotyper og stammer. Denne peptid-basert metode er mindre arbeid- og tid intensivt enn konvensjonelle metoder brukt for analyse av proteolytisk aktivitet for virus, og resultater kan oppnås en enkelt dag.

Introduction

Viral blanding med verten celle membran er et viktig skritt i livssyklusen til innhyllet virus og forenkler oppføring i cellen og replikering av viruset. Virus har vanligvis en spesialisert protein eller proteiner som binder seg til reseptorer på cellemembranen vert og utløser virus-celle membran fusion1. Viral fusion proteiner er gruppert i tre hovedgrupper (I-III)1. Et antall viruser som er svært viktig for folkehelsen, som influensavirus (representerer en langvarig zoonotiske fremveksten fra fugler) og Midtøsten åndedretts syndrom-coronavirus (MERS-CoV) (som representerer en nylig zoonotiske fremvekst fra kameler), utnytte den såkalte klasse I fusion proteiner, som krever proteolytisk behandling av verten proteaser, å utøve sine fusogenic aktivitet2. Tilsvarende feline coronavirus (FCoV), som representerer en stor sykdom trussel for vill og innenlands kattene, har en klasse jeg fusion protein. Klasse I viral fusion proteiner er vanligvis synthesized som en uncleaved forløper, og generelt består av to domener som er ansvarlig for reseptor bindende og utløser hendelsen fusion henholdsvis. Hittil er influensa hemagglutinin (HA) best forstått fusion protein og flere studier har beskrevet sin mekanistisk rolle i verten celle oppføring og fusion3. I dette tilfellet forekommer spalting av fusion protein på en bestemt sekvens eller cleavage område i HA, og i kombinasjon med pH-avhengig conformational endringer, resulterer i eksponering av viral fusion peptid1,2.

Fusion peptid og foregående protease anerkjennelse sekvensen er avgjørende for virusets og vert tilpasningen av viruset. Endringer i protease anerkjennelse rekkefølge kan endre cleavage betydelig med potensielt dramatiske konsekvenser for viruset og vert4. På den ene siden kan oppheve cleavage og dermed eliminere livet syklus av viruset. Men på den annen side, en mutasjon kan øke substrat spesifisiteten for en gitt protease og/eller tillate en "ny" protease deler fusion protein. Deretter kan dette også utvide ved celler og vev tropism som observert, f.eks med influensa virus subtyper5,6. Lav vanligvis virusets fugleinfluensa (LPAI) virus og mest menneskelig influensavirus er begrenset til den mage eller respiratoriske skrift på grunn av den begrensede lokaliseringen av proteaser aktivere dem. Vanligvis innledes fusion peptid slik HA proteiner med en fire-amino acid sekvens som består av 1-2 ikke grunnleggende aminosyrer, som er anerkjent av trypsin som serine proteaser som trypsin, matriptase eller TMPRSS27, 8. Når viruset kjøper innsettinger eller mutasjoner som endrer cleavage området til en polybasic nettsted, kan furin å aktivere HA og forårsake mye mer alvorlige systemisk infeksjon6,9. Disse virusene kalles høy virusets fugleinfluensa-viruset (HPAI), preget av H5N1 stammer.

I motsetning til influensa HA har mange coronaviruses, for eksempel MERS-CoV, to distinkte cleavage områder innenfor deres spike protein. S1/S2 området skiller N-terminal reseptor bindende domene (S1) fra C-terminalen fusion domenet (S2), med en andre cleavage nettsted, kalt S2', nedstrøms S1/S2 nettstedet på nærhet til fusion peptid10. Det ble foreslått at nettstedene er kløyvde sekvensielt, på S1/S2 etterfulgt av S2'. I motsetning til HA mest influensa viruset stammer, MERS-CoV S protein S1/S2 og S2' nettsteder kan bli gjenkjent av proteaser av proprotein konvertasene (PC)-familien, som furin. Medlemmer av denne familien cleave på sammenkoblede grunnleggende rester motiv R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Vanligvis kalles aminosyrer oppstrøms av cleavage området P1, P2, P3, etc. telle fra webområdet cleavage og aminosyrer nedstrøms er angitt som P1', P2', P3', osv. 11. FCoV stammer kan enten ha en enkelt eller et dobbelt cleavage område. Som MERS-CoV, noen FCoV stammer har to cleavage områder (S1/S2 og S2 ") i deres S protein. Men er denne karakteristikken eksklusive serotype jeg FCoVs (nyeste A). Derimot medlemmer av serotype II (nyeste B) grupperingen bare har et enkelt cleavage nettsted (S2')2,12. Flere proteaser er foreslått deler FCoV cleavage områder, inkludert furin, trypsin som proteaser og katepsin. Det har blitt foreslått at S protein av innstigning FCoV (også kjent som feline enteric coronavirus eller FECV) er sannsynlig å være kløyvde av furin i området S1/S2, og mutasjoner i dette området (i tillegg til S2 ") fører til endringer i protease krav. Disse mutasjonene har vært knyttet til endringer i tropism og virusets av disse virusene, slik at viruset bli systemisk og macrophage-tropic (også kjent som feline infeksjon peritonitis virus eller FIPV)13.

Virus naturlig presentere mutasjoner i deres genomer under hver replikering syklus og ofte nye subtyper og stammer av influensa, MERS-CoV og FCoV er beskrevet14,15,16. Som en del av en rask evaluering å vurdere folkehelsen trusselen av nye virus, er det viktig å undersøke endringer i webområdet cleavage og hvordan det påvirker omfanget av proteaser aktivere disse virusene. Her beskriver vi en peptid-baserte analysen der en svært rask vurdering av hvordan cleavage stedet endringer i MERS-CoV S protein påvirker substrat spesifisitet av en gitt protease og raskt skjermen ulike proteaser til å holde seg til en gitt eller flere sekvenser4. I et annet sett av eksperimenter brukte vi teknikken for å avgjøre furin cleavage aktiviteten over ulike FCoV serotyper og stammer.

Peptidene brukes i denne analysen er endret med fluorescens resonans energi overføring (bånd) paret, 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) på N-terminus og N-2,4-dinitrophenyl (DNP) på C-terminus. Under analysen, MCA er glade og avgir lys energi som er slukket av DNP som paret er i nærheten av hverandre. Hvis spalting, men DNP er ikke kunne slukke utslipp lenger og det kan leses av fluorescens plate leseren. Endringene i fluorescensen måles under eksperimentet å bestemme peptid cleavage pris og beregne hastigheten som protease kløyver de spesifikke peptid (også kjent som Vmax)17.

Utforme peptidene, genet av respektive fusion protein må ha blitt sekvensert og/eller gjort tilgjengelig i en database. Metoden er imidlertid mindre arbeid-intens og kostbart enn konvensjonelle metoder som vanligvis krever kloning av fusion protein genet i uttrykket vektorer til å uttrykke det i pattedyrceller analysere cleavage. Fra begynnelse til slutt, kan dette ta flere dager opptil et par uker mens peptid analyser presenteres her kan gjøres innen en dag så snart peptider og proteaser er tilgjengelig. Oppsettet av analysen tar mellom 5 og 30 min hvor mange eksempler runtime i fluorescens plate leseren er 1 h. analyse av dataene kan ta opptil 2 timer igjen avhengig av utvalgsstørrelsen.

Her, valgte vi to eksempler å presentere analysen. I det første eksemplet presenterer vi data som sammenligner i furin-mediert spalting av menneskelige og kamel-avledet MERS-CoV, å vurdere potensialet i den kamel-avledet stammer av aktiveres hos mennesker hvis de krysser arter barrieren. I det andre eksemplet, vi brukt en fluorogenic peptid analysen for å bestemme furin-mediert spalting av S1/S2 og S2' nettsteder eller S2 "siden av to serotype jeg og to serotype II FCoV stammer, henholdsvis. For disse eksperimentene brukte vi trypsin cleavage som en positiv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. design og forberede peptidene

  1. Få en rekke fusion protein av interesse fra en offentlig database som NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) eller virus patogen database (https://www.viprbrc.org). Velg protease anerkjennelse foregående fusion peptid og inkluderer 2-3 aminosyrer oppstrøms og nedstrøms denne sekvensen.
  2. Når du bestiller peptidene, endre dem med bånd par 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) på N-terminus og N-2,4-dinitrophenyl (DNP) på C-terminus.
    Merk: Flere leverandører disse endringene. Pris og leveringstid avhengig av leverandøren av valg. Imidlertid finnes alternative modifikasjoner som varierer i følsomhet og kreve justeringer av platen leseren i bølgelengder.
  3. Resuspend peptid ifølge produsenter anbefalinger av pipettering forsiktig opp og ned. For eksempel resuspend peptider i 70% etanol siste konsentrasjonen av 1 mM.
  4. Du kan eventuelt legge røret som inneholder peptid og løsemiddelet til et sonication bad før det er fullt resuspended hvis peptid ikke resuspend godt av pipettering.
  5. Aliquot peptid lys dempe eller motstandsdyktig rør for å beskytte peptid fra bleking. Holde aliquot størrelser liten å unngå flere fryse/tine sykluser (f.eks 100 µL). Lagre dele på 20 ° C.

2. forberedelser fluorescens Plate leseren

  1. Slå på plate leseren og vent til selvtesten er ferdig.
  2. Åpne operativsystemet programvare på vedlagt datamaskinen og kontroller at det er tilknyttet tallerken leseren.
  3. Åpne temperaturinnstillingen og 30 ° C (eller ønsket temperatur for optimal ytelse for protease).
  4. Klikk på Control | Instrumentoppsett sette opp eksperimentet.
  5. Velg Kinetic.
  6. Velg fluorescens.
  7. Angi eksitasjon og utslipp bølgelengder: 330 nm og 390 nm henholdsvis.
  8. Uegennyttig Auto Cut-off.
  9. Velg middels, normal følsomhet.
  10. Velger en kjøretid på 1 h for analysen og ett mål hvert 60 s.
  11. Sett 5 s blande før første mål og 3 før hver måling
  12. Velg brønner lese og starte analysen.

3. forberedelser analysen

  1. Forberede analysebuffer ved beregning av nødvendige antallet for hver ingrediens og legge den. For furin, gjør buffer som består av 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol, 5% Triton X-100. Trypsin, bruke standard fosfat bufret saltvannsoppløsning (PBS).
    Merk: Volumer på 10 mL eller mindre er tilstrekkelig. Bufferen variere avhengig av protease(s) som er brukt i analysen.
  2. Chill bufferen på is.
  3. Plass analysen platen på isen med en tynn metallplate under støtte kjøling og stabilitet. Bruk en solid svart polystyren 96-brønns plate med en flat bunn og ikke-behandlet.
    Merk: Det er viktig å bruke svart plater for å hindre fluorescerende "lekkasje" fra tilstøtende brønner.
  4. Beregne riktig mengde protease til for hver reaksjon basert på tidligere publikasjoner eller eksperimentelle data. Furin, bruke 1 enhet per reaksjon som tilsvarer 0,5 µL. Trypsin, bruke 0,5 µL av 160 nM TPCK trypsin.
  5. Forberede 3 teknisk gjentak per analysen i et totalt volum på 100 µL per prøve per prøve.
    Merk: Det ble eksperimentelt evaluert at det ikke gjøre en forskjell i pipettering utføres under normale lysforhold eller nedtonet lys. Imidlertid bør peptidene ikke utsettes for lys for en lengre periode.
  6. Pipetter riktig mengde analysebuffer (94.5 µL som beskrevet trinn 3.1) i hver brønn.
  7. Legg protease i hver brønn. Bruk 0,5 µL per prøve for både furin og TPCK trypsin. Legge til 0,5 µL buffer i stedet for den respektive protease 6 brønner (3 brønner for en tom kontroll) og 3 brønner for en peptid kontroll.
  8. Legg til peptid en siste konsentrasjon av 50 µM hver brønn unntatt tom kontrollen. I dette tilfellet Pipetter 5 µL peptid forberedt som beskrevet under trinn 1.3. Legge til 5 µL bufferen tom kontrollen i stedet for peptid.
    Merk: Flere konsentrasjoner av peptid ble opprinnelig testet med beskrevet enzym konsentrasjoner slik at enzymer ble mettet.
  9. Sett inn platen i fluorescens plate leseren og klikk start.

4. dataanalyse

  1. Lagre filen eksperiment.
  2. Klikk på Eksporter og eksporterer du filen som txt.
  3. Importere txt-filen til et regneark.
  4. For hver teknisk replikere per prøve, oppretter du en graf plotting de relative fluorescerende enhetene (RFU) på y-aksen mot tiden på x-aksen (supplerende figur 1).
  5. Velg dataområdet der grafen er i en lineær rekkevidde og nærmest starten av fluorescens økningen.
  6. Tegne inn de merkede dataene på en andre graf og legge til en lineær trendlinje.
  7. Velg trendlinjen alternativene Vis ligning på diagrammet. Formelen vises på v-Max.
  8. Beregn gjennomsnittet Vmax for hvert utvalg fra 3 teknisk replikerer.
  9. Gjenta eksperimentet to ganger mer for å få 3 biologiske gjentak.
  10. Beregn standardavviket basert på data fra 3 uavhengige biologiske replikerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den første delen av denne studien, har vi brukt peptider som representerer S2' cleavage området av tre distinkte MERS-CoV S proteiner: fra prototypiske EMC/2012 menneskelige belastningen (Genbank AFS88936.1) og to valgt kamel-avledet MERS-CoVs, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) og Mor215 (Genbank AVN89324.1) stammer, isolert i Egypt og Marokko, henholdsvis (tabell 1)16,18.

Sammenlignet med EMC/2012 belastningen, HKU205 S2' cleavage området har to mutasjoner i P2 og P1' posisjoner som potensielt kan påvirke anerkjennelsen av furin og endre cleavage effektiviteten (tabell 1). Dessuten, vi var interessert å undersøke om og hvordan hver individuelle mutasjonen funnet i HKU205 belastningen påvirker furin cleavage. Vi derfor inkludert to peptider hvor personlige erstatninger ble introdusert i EMC/2012 peptid sekvensen (EMC/2012 mutA-S S2 "og EMC/2012 mutS-jeg S2') (tabell 1). Furin klarte å holde seg til EMC/2012 peptid effektivt med en v-max 6.3 + 1.2 RFU/min, mens vi oppdaget nesten noen cleavage ved S2' peptid av den HKU205 stammen (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/min) (figur 1a). Når undersøke EMC/2012 mutA-S S2' peptid, fant vi at cleavage ble sterkt redusert sammenlignet med vill type sekvensen (Vmax 3.6 ± 1 RFU/min). Det var nesten ingen cleavage når testing EMC/2012 mutS-jeg S2' peptid (Vmax 1.1 ± 0,9 RFU/min) (figur 1a).

MERS-CoV isolerer fra Vest-Afrika ble nylig rapportert at phylogenetically skiller seg fra MERS-CoV finnes i de arabiske halvøy16. En nylig beskrevet isolert er Mor213 belastningen, som bærer en leucine i stedet for en arginin i P4 plasseringen av S2' nettsted (tabell 1), og som kan potensielt påvirke anerkjennelsen av furin og endre cleavage effektiviteten. Våre peptid analysen viste at det er bare minimal spalting av Mor213 S2' område sammenlignet med EMC/2012 området (figur 1b). Vmax for Mor213 peptid er 1,0 ± 0.1.

For den andre delen av denne studien brukte vi samme peptid analysen for å evaluere furin-mediert spalting av FCoV S protein cleavage. Vi brukte peptider etterligne webområdet S1/S2 spalting av to FCoV serotype jeg virus: FECV jeg og-4 (fra Whittaker lab) og FIPV jeg svart (Genbank AB088223.1). Vi brukte også peptider mimicking S2 "området av disse virusene, samt to FCoV serotype II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) og FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) stammer (tabell 1). Furin cleavage oppstår vanligvis når grunnleggende rester (arginin og lysin) finnes i P1 og P4 plasseringen av webområdet cleavage. Mutasjoner i P1 og P4 P1' posisjoner er foreslo for å påvirke furin cleavability, derfor endre protease kravene til protein. (Tabell 1). Furin cleavage ble observert i den prototypiske S1/S2 peptid FECV I og-4 S1/S2 (Vmax 100.36 ± 7.61 RFU/min), men ikke i den muterte S1/S2 peptid FIPV jeg svart S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1,29 RFU/min) (figur 2A). Tilsvarende furin klarte å holde seg den prototypiske S2' peptid FECV II 1683 S2' (Vmax 5.46 ± 0,97 RFU/min), men ikke den muterte S2' peptider FECV I og-4 S2' (Vmax 0.26 ± 0,11 RFU/min), FIPV jeg svart S2' (Vmax 0,30 ± 0.14 RFU/min) og FIPV II 1146 S2' (Vmax-0.36 ± 0,11 RFU / min) (figur 2B). Vi brukte trypsin som en positiv for peptid cleavage og vi observerte trypsin cleavage i peptider brukes (supplerende figur 2).

Table 1

Tabell 1. Peptider brukes og tilsvarende amino acid sekvenser. Peptidene brukes i analyser inneholder (7-methoxycoumarin-4-yl) acetyl/2,4-dinitrophenyl (MCA/DNP) bånd paret. P4 og P1 cleavage området plassert arginine (R) rester, som er anerkjent av furin, er i fet skrift. Rester i rødt tilsvarer mutasjoner i forhold til referanse sekvenser.

Figure 1
Figur 1 . Furin-mediert proteolytisk spalting av menneskelige og kamel-avledet MERS-CoV S2' nettsteder fluorogenic peptider. A. Furin cleavage analysen av menneskelig MERS-CoV EMC/2012 S2' nettsted og kamel-avledet belastning HKU205 (dobbel mutant), sammen med enkelt mutant varianter av EMC/2012 (mutA-S og mutS-jeg). B. Furin cleavage analysen av menneskelig MERS-CoV EMC/2012 S2' nettsted og kamel-avledet belastning Mor213. For paneler A og B, peptider ble inkubert med rekombinant furin og økningen i fluorescens på grunn av proteolytisk behandling ble målt ved hjelp av en fluorometer. Analyser ble utført i triplicates resultater som representerer gjennomsnitt av Vmax fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). Feilfelt viser SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Furin-mediert proteolytisk spalting av FCoV S1/S2 og S2' nettsteder fluorogenic peptider. A. Furin cleavage analysen av FECV I og-4 og FIPV jeg svart S1/S2 nettsteder. Peptider ble inkubert med rekombinant furin. B. Furin cleavage analysen av FECV I og-4, FIPV jeg svart, FECV II 1683 og FIPV II 1146 S2' nettsteder. Økningen i fluorescens på grunn av proteolytisk behandling ble målt ved hjelp av en fluorometer. Analyser ble utført i triplicates resultater som representerer gjennomsnitt av Vmax fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). Feilfelt viser SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Supplerende tabell 1: Vmax standardverdier for figur 1 og figur 2. Vmax verdier ble beregnet fra grafer som vist i supplerende figur 1 og som beskrevet i Seksjon 4-protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabell.

Ekstra figur 1: illustrasjon av rådata avledet fra platen leseren programvare. Økning av fluorescens over tid grafer som ble brukt til bestemmelse av den v-Max. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Ekstra figur 2: Trypsin-mediert proteolytisk spalting av FCoV S1/S2 og S2' nettsteder fluorogenic peptider. Trypsin cleavage analysen av FECV I og-4 og FIPV jeg svart S1/S2 nettsteder og FECV I og-4, FIPV jeg svart, FECV II 1683 og FIPV II 1146 S2' nettsteder. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterer her en fluorogenic peptid analysen som gir en rask screening av protein sekvenser for deres proteolytisk spalting av proteaser. I vårt første eksempel valgte vi forskjellige cleavage nettstedet motiver av MERS-CoV spike (S) protein å illustrere ett program for denne analysen. Flere innhyllet virus som har klasse jeg fusion proteiner som MERS-CoV, SARS-CoV (alvorlig akutt åndedretts syndrom) og influensa er store problemer for folkehelsen og nye subtyper stadig utvikling som har et potensial til å krysse arter barrierer fra deres naturlige verter til mennesker1,15,16. Isolere virus og dyrke dem i laboratoriet kan ikke alltid være mulig eller krever spesielle laboratorier som ikke finnes i hver forskning anlegget. Derfor er det behov for metoder for å vurdere potensielle folkehelsen trusselen om nye virus som kan utføres under vanlige laboratorieforhold. I tillegg til virus målretting mennesker, noen dyr virus som FCoV har samme klasse I fusion proteiner, derfor dele lignende egenskaper enn sine menneskelige kolleger. Isolere disse virusene kan også være en utfordring, gjør bruk av innovative verktøy å studere dem nødvendig.

Et avgjørende skritt i livet syklus av ovennevnte virus er vert celleoppføring og fusion formidlet av proteolytisk behandling av respektive fusion protein av host proteaser1,2. En standard måte å undersøke denne delen av viral levetid er å klone fusion protein genet til et pattedyr uttrykk vektor, transfect pattedyrceller som tillater protein uttrykk, ruge eller co transfect med protease interesse, isolere den protein og utføre en western blot analyse. Denne metoden har flere begrensninger: tilgjengeligheten av viral DNA/RNA for kloning, kostnader for å syntetisere genet hvis ingen DNA eller RNA er tilgjengelig, tilgjengeligheten av et antistoff å oppdage fusion protein og dens cleavage produkter, og det kan ta opptil flere uker før hele undersøkelsen er utført. Det blir enda mer tid, penger og arbeidsintensiv hvis interesse for studien er å undersøke flere mutasjoner i spalting området fordi det krever området-rettet mutagenese. Fluorogenic peptid analysen beskriver vi her har ikke disse begrensningene. Peptidene rundt kan utformes basert på offentlig tilgjengelig sekvenser, det er flere leverandører som tilbyr et bredt spekter av rekombinant proteaser som er relevante for slike studier og analysen inkludert analyse kan utføres innen en enkelt dag.

I vårt eksempel, undersøkte vi furin-mediert spalting av S2' protease anerkjennelse webområdet av MERS-CoV S protein avledet fra mennesker og kameler fra Egypt og Marokko. Både den menneskelige EMC/2012 og kamelen HKU205 S2' nettsteder inneholder et typisk RXXR furin cleavage motiv. Men ifølge PiTou 2.0 cleavage scoring algoritme HKU205 S2 "nettstedet er ikke spådd til å bli kløyvde av furin, som vi eksperimentelt bekreftet19. Grunnen hvorfor HKU5 S2' behandles ikke av furin kan være isoleucin i P1 "posisjon. Når vi testet to peptider som gjennomført den personlige mutasjoner i EMC/2012 S2' sekvens, kunne vi bekrefte at isoleucin i P1' hovedsakelig opphever cleavage mens alanin til serine substitusjon resultert i redusert cleavage. Mor213-S2 "området inneholder ikke en furin cleavage motiv og det var ikke overraskende å oppdage nesten noen cleavage. Vi også undersøkt hvordan furin innstiftet S1/S2 og S2' protease anerkjennelse områder av FCoV S protein. Vi var i stand til å observere furin spalting av både FECV-peptider (FECV I og-4 S1/S2 og FECV II 1683 S2 "), mens mutert sekvenser fra FIPV virus ikke var kløyvde av furin.

Når du sammenligner furin-mediert spalting av EMC/2012 S2' peptid (figur 1A) med FECV I og-4 S1/2 peptider (figur 2A), fant vi at det var en omtrentlig 26-fold forskjell i den v-Max. Dette kan forklares med furin cleavage motivet i begge sekvenser (tabell 1). Minimumskravet furin Kløv er en RXXR motiv, er en RXRR sekvens mye gunstigere2. Derfor EMC/2012 S2' peptid, som har en RSAR motiv, er kløyvde med mindre spesifisitet sammenlignet med FECV I og-4 S1/2 peptid som inneholder et RSRR furin cleavage område (tabell 1).

Ettall større begrensningen til analysen er imidlertid at peptidene ikke reflekterer tertiær strukturen av proteinet de vanligvis er innebygd i. Spalting av full lengde fusion protein eksponerer fusion peptid og utløsere vert celle oppføring1. Samspillet mellom protease og fusion protein kan også påvirkes av tertiær strukturen av proteinet blanding mens vi antar at peptidene er mer eller mindre lineær. Derfor cleavage oppdaget i peptid analysen kan være kunstig og gjenspeiler kanskje ikke situasjonen i vivo . Dette ble rapportert for spalting av influensa H3N2 HA undertype av matriptase. Mens flere grupper som matriptase i peptid analyser spalting av H3N2 HA, ble det også vist at inkubering av full lengde H3N2 HA protein og matriptase i cellekultur ikke resulterte i en fusogenic HA protein4,20, 21. Det er andre eksempler som viser at biologisk viktig regulering av proteolytisk cleavage er på nivå med protein bekreftelse. Den har blitt beskrevet at fusion proteiner noen ganger trenger en rekke pre fusion hendelser kunne utsette cleavage områdene på fusion. Semliki skog virus fusion protein, for eksempel krever strukturelle rearrangements under en rekke prefusion hendelser for å avsløre sin fusion protein og gjøre den tilgjengelig for proteolytisk aktivisering22. Derfor må resultatene i en fluorogenic peptid analysen godkjennes av cellen smelting analyser eller lignende eksperimenter. Peptid analysen kan imidlertid fortsatt en rask screening av flere protease/peptid kombinasjoner og redusere arbeidskraft og tiden følge opp eksperimenter siden kombinasjoner som ikke viser Kløv er svært sannsynlig vise den samme resultat i vivo.

Andre store begrensning av analysen gjelder proteaser. Så langt er det bare mulig å teste løselig proteaser men ikke transmembrane proteaser. Avhengig av hensikten med eksperimentet, kan dette være et problem. For eksempel aktiveres influensa har av en rekke transmembrane proteaser på cellemembraner8. Til en viss grad problemet kan circumvented med løselig proteolytisk aktive domener, men resultatene må tolkes med forsiktighet og skal valideres med konvensjonelle metoder. Vi skal se eksemplet beforementioned med matriptase og sin aktivitet mot H3N2 HA. I vivo matriptase ligger i cellemembranen men kommersielt tilgjengelig enzymet er løselig katalytisk domenet. Som diskutert med hensyn til fusion proteiner, kan det være mulig at det også krever full lengde protease å samhandle med full lengde protein underlaget cleavage og at testing bare én domener kan resultere i falske positiver.

Denne metoden har vist seg for å være effektivt å studere i spalting av bestemte amino acid sekvenser av furin. Men programmer teknikk utvidelser til alle tilgjengelige protease (f.eks, cathepsins, proprotein konvertasene), gjør den en nyttig metode for skjermen peptid kandidater for protease cleavage. Videre har det vært vist at denne analysen kan også brukes til å teste effekten av proteasehemmere, og derfor gir en rask og enkel verktøyet til skjermen protein hemmere23.

Fluorogenic peptid cleavage analysen beskrevet her representerer et tillegg til bioinformatic cleavage scoring algoritmer, som forutsier peptid spalting av en bestemt protease, basert på aminosyre egenskaper og rekkefølge. Disse to teknikkene, i kombinasjon med tradisjon vestlige blotting teknikker kan brukes som en effektiv måte for å studere protease cleavage i vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgements

Forskningsmidler for MERS prosjektet presenteres i dette manuskriptet ble levert av NIH gi R21 AI111085. Feline coronavirus studien ble støttet av forskningsmidler fra Morris dyr Foundation, Winn Feline Foundation og Cornell Feline Health Center. Vi ønsker også å takke Malik Peiris for å gi oss med Mor213 orden før det var offentlig tilgjengelig.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptides Biomatik N/A
Furin NEB P8077S
Trypsin, TPCK-treated Sigma-Aldrich 4352157-1KT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Triton-X100 Sigma-Aldrich X100
PBS Corning 21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices XPS
SoftMax Pro 6.5.1  Molecular Devices N/A
96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) Costar 3915
Light damping tubes Watson Lab 131-915BL or 131-915BR
Microsoft Excel Microsoft N/A
Prism 7 GraphPad N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Virology. 479-480, 498-507 (2015).
  2. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. (2014).
  3. Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion. Viruses. 4, (7), 1144-1168 (2012).
  4. Straus, M. R., Whittaker, G. R. A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site. PloS one. 12, (3), e0174827 (2017).
  5. Kawaoka, Y., Webster, R. G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, (2), 324-328 (1988).
  6. Abdelwhab, E. S. M., et al. A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens. Journal of Virology. 90, (1), 400-411 (2016).
  7. Steinhauer, D. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 258, (1), 1-20 (1999).
  8. Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. Pathogens and disease. 69, (2), 87-100 (2013).
  9. Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. Journal of Virology. 68, (9), 6074-6078 (1994).
  10. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (14), 5871-5876 (2009).
  11. Polgar, L. General Aspects of Proteases. Mechanisms of Protease Action. 43-76 (1989).
  12. Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species. mSphere. 3, (1), 1-8 (2018).
  13. Licitra, B. N., et al. Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 19, (7), 1066-1073 (2013).
  14. Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R. Viral Mutation Rates. Journal of Virology. 84, (19), 9733-9748 (2010).
  15. Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic? Vaccines. 3, (1), 172-185 (2015).
  16. Chu, D. K. W., et al. MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1-6 (2018).
  17. Caprioli, R. M., Smith, L. Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 58, (6), 1080-1083 (1986).
  18. Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging microbes and infections. 5, (12), e126-e129 (2016).
  19. Tian, S., Huajun, W., Wu, J. Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases. Scientific Reports. 2, (2012).
  20. Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities. Journal of Virology. 86, (19), 10579-10586 (2012).
  21. Beaulieu, A., et al. Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway. Journal of virology. 30, (878), 4237-4251 (2013).
  22. Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus. Journal of Biological Chemistry. 278, (9), 7189-7198 (2003).
  23. Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450, (2), 1070-1075 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics