Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Cancer Research

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Summary

Optische Kohärenztomografie (OCT), eine dreidimensionale imaging-Technologie, wurde verwendet, um zu überwachen und zu charakterisieren, die Wachstum Kinetik der vielzelligen Tumor Sphäroide. Präzise volumetrische Quantifizierung der Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie abgestorbenes Gewebe-Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung dagegen wurden demonstriert.

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Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).

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Abstract

Tumor-Sphäroide wurden als eine dreidimensionale (3D) Kultur Zellmodell in der Krebs-Forschung und Anti-Krebs-Wirkstoffforschung entwickelt. Jedoch Hochdurchsatz-bildgebende Modalitäten Verwendung von hellen Feld oder Fluoreszenz-Detektion, derzeit nicht in der Lage, die insgesamt 3D-Struktur des Tumor-Sphäroid aufgrund begrenzter Lichtdurchlässigkeit, Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen zu lösen und Tiefe-Abwicklungsfähigkeit. Vor kurzem, unser Labor demonstriert die Verwendung der optischen Kohärenztomographie (OCT), ein markierungsfreie und zerstörungsfreie 3D bildgebende Modalität, um längs Charakterisierung von mehrzelligen Tumor Sphäroide in eine 96-Well-Platte auszuführen. OCT war in der Lage, 3D morphologischen und physiologischen Informationsbeschaffung der Tumor Sphäroide wächst bis zu ca. 600 µm in der Höhe. In diesem Artikel zeigen wir eine Hochdurchsatz-Okt (HT-Okt) Image System, die scannt die gesamte Multi-well-Platte und OCT 3D-Daten der Tumor Sphäroide automatisch erhält. Wir beschreiben die Details der HT-OCT-System und Bau Richtlinien im Protokoll. Aus den 3D-Daten OCT einer visualisieren die Gesamtstruktur der Sphäroid mit 3D gerendert und orthogonale Scheiben Längenwachstums Kurve von der Tumor-Sphäroid morphologische anhand von Größe und Volumen zu charakterisieren und überwacht das Wachstum von die toten Zellen Regionen in der Tumor-Sphäroid basierend auf optische intrinsischen Dämpfung Kontrast. Wir zeigen, dass HT-OCT als Hochdurchsatz-bildgebende Modalität für Drug screening sowie die Charakterisierung von Biofabricated Proben verwendet werden kann.

Introduction

Krebs ist die zweithäufigste Ursache des Todes in der Welt1. Medikamente gegen Krebs zu entwickeln, ist von entscheidender Bedeutung für die Patienten. Jedoch wird es geschätzt, dass mehr als 90 % der neue Anti-Krebs-Medikamente in der Entwicklungsphase wegen mangelnder Wirksamkeit und unerwartete Toxizität in klinischen Studien2scheitern. Der Teil des Grundes lässt sich zurückführen auf die Verwendung von einfachen zweidimensionalen (2D) Kultur Zellmodelle für zusammengesetzte Screening, die Ergebnisse mit begrenzten Vorhersagewerte der zusammengesetzten Wirksamkeit und Toxizität für die folgenden Phasen des Drug Discovery2 , 3 , 4. vor kurzem, dreidimensionale (3D) Tumor Sphäroid Modelle wurden entwickelt, um klinisch relevante physiologische und pharmakologische Daten vorsehen, Anti-Krebs-Medikament Entdeckung3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Da diese Sphäroide Gewebe-spezifische Eigenschaften von Tumoren in Vivonachahmen können, können wie Nährstoffe und Sauerstoff gradient, hypoxische Kern sowie Medikament Widerstand19, die Verwendung dieser Modelle potenziell Drug Discovery Fristen zu verkürzen, reduzieren Sie Investitionskosten zu, und bringen Sie neue Medikamente für Patienten noch effektiver. Ein kritischer Ansatz zur Bewertung zusammengesetzte Wirksamkeit in 3D Tumorentwicklung Sphäroid ist zur Überwachung der Sphäroid Wachstum und Wiederauftreten nach Behandlungen9,26. Um dies zu tun, sind quantitative Charakterisierung der Tumor Morphologie, mit seinen Durchmesser und Volumen, mit hochauflösender bildgebender Verfahren zwingend notwendig.

Konventionelle bildgebende Verfahren, z. B. Hellfeld Phase Kontrast7,9,22,24und Fluoreszenz-Mikroskopie8,9,16, 18,22 kann eine Messung des Durchmessers der Sphäroid bieten aber nicht die allgemeine Struktur der Sphäroid im 3D-Raum lösen. Viele Faktoren tragen zu dieser Beschränkungen, einschließlich Eindringen von bohrenden Licht in den Sphäroid; Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in den Sphäroid; emittierenden Leuchtstoff Signale von aufgeregt fluoreszierende Farbstoffe im Inneren oder auf der gegenüberliegenden Fläche des Sphäroids aufgrund der starken Absorption und Streuung; und Tiefe-Abwicklungsfähigkeit dieser bildgebende Modalitäten. Dies führt häufig zu einer ungenauen Volumenmessung. Entwicklung des nekrotischen Kerns in Sphäroide imitiert Nekrose in in Vivo Tumoren6,10,15,19,25. Diese pathologische Funktion dürfte in 2D Zelle Kulturen19,25,27,28reproduziert. Sphäroid größer als 500 µm im Durchmesser, eine Dreischicht-konzentrische Struktur, einschließlich eine äußere Schicht der proliferierenden Zellen, eine mittlere Schicht von ruhenden Zellen und einem nekrotischen Kern in der Sphäroid6,10 zu beobachten ,15,19,25, aufgrund des Mangels an Sauerstoff und Nährstoffe. Lebende und tote Zelle Fluoreszenz-Bildgebung ist die Standardtherapie, die Grenze des nekrotischen Kern zu kennzeichnen. Allerdings behindern Durchdringungen dieser fluoreszierende Farbstoffe und sichtbares Licht wieder, das Potenzial, die Sonde in den nekrotischen Kern, seine Entwicklung in seiner eigentlichen Form zu überwachen.

Eine alternative 3D bildgebende Modalität, ist Optische Kohärenztomografie (OCT) eingeführt, um den Tumor Sphäroide charakterisieren. OCT ist eine biomedizinische bildgebendes Verfahren, die für den Erwerb markierungsfreie, zerstörungsfreie 3D-Daten von bis zu 1-2 mm Tiefe in biologischen Geweben29,30,31,32,33 ,34. OCT beschäftigt Low-Kohärenz Interferometrie zurückgestreute Signale aus verschiedenen Tiefen der Probe zu erkennen und rekonstruierten Tiefe gelöst Bilder bei Mikron-Ebene räumliche Auflösungen im lateralen und vertikalen Richtungen bietet. OCT ist weit verbreitet in der Augenheilkunde35,36,37 und Angiographie38,39angenommen worden. Frühere Studien haben OCT zu beobachten die Morphologie von in-vitro- Tumor Sphäroide Basalmembran Matrix (z.B.Matrigel) und evaluieren ihre Reaktionen auf die photodynamische Therapie40,41verwendet. Vor kurzem hat unsere Gruppe eine Hochdurchsatz-OCT Image Plattform, um systematisch zu überwachen und zu quantifizieren, die Wachstum Kinetik der 3D Tumor Sphäroide im Multi-well-Platten42. Präzise volumetrische Quantifizierung der 3D Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie nekrotischen Gewebes Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung Kontrast wurden demonstriert. Dieses Papier beschreibt die Details wie die OCT-Bildgebung-Plattform wurde konstruiert und eingesetzt, um hochauflösende 3D-Bilder von Tumor Sphäroide zu erhalten. Schritt für Schritt Quantitative Analysen der Kinetik von 3D Tumor Sphäroide, genaue Messungen der Sphäroid Durchmesser und Volumen, einschließlich Wachstum wird beschrieben. Darüber hinaus wird die Methode der zerstörungsfreien Detektion des nekrotischen Gewebes Regionen mit OCT, basierend auf der inneren optische Dämpfung Kontrast präsentiert.

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Protocol

1. Vorbereitung der Zellen

  1. Ein qualifizierter Lieferant Zelllinien einzuholen.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Zellen von der Zell-Linien von Interesse Sphäroid in den Kultur-Medien oder mit Hilfe eines Substrates (Basalmembran Matrix wie Matrigel) bilden können. Schauen Sie in der Literatur-9 oder durchführen Sie einer Runde eines Pre-Experiment für einen Check.
  2. Tauen Sie die gefrorenen Zellen nach dem spezifischen Verfahren von der Zelllinie Anbieter zur Verfügung gestellt. Ein allgemeines Verfahren finden Sie ebenfalls43.
  3. Kultur der Zellen für 1-2 Durchgänge in 25 cm2 Kulturflaschen. Die Zellen sind dann bereit für 3D Zellkultur verwenden.
  4. Überwachen Sie der Gesundheitszustand der Zellen jeden Tag zu und pflegen sie im Brutkasten unter Standardbedingungen (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2). Aktualisieren Sie die Medien, je nach Bedarf.
    Hinweis: Das Kulturmedium besteht aus DMEM (4,5 g/L Glukose), 1 % Antibiotikum Antimykotikums fötalen Rinderserum 10 %. Subkultur Zellen bevor sie Zusammenfluss in der Kultur-Kolben erreichen. Folgen Sie der Zelle Kultur Leitlinie des Anbieters. Ein allgemeines Verfahren finden Sie in Elsehwhere44.
  5. Führen Sie 3D Zellkultur im Multi-well-Platten anhand der folgenden allgemeinen Protokolls9.
    1. Entfernen Sie die Nährmedien aus der Kultur-Flasche zu und waschen Sie ihn mit sterilisierten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, auf 37 ° C erhitzt).
    2. Aufschwemmen der Zellen durch Zugabe von 1 mL Trypsin Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA, 0,5 %) in den Kolben 3 Minuten lang. Fügen Sie dann Kultur Medien um die Trypsin zu verdünnen.
    3. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 5 min bei 500 X g und Raumtemperatur.
    4. Entfernen des Überstands und Zellen mit 4 mL vorgewärmten Kulturmedium aufzuwirbeln. Pipette einen Tropfen der Probe auf eine Hemocytometer für die Zellzählung Zellkonzentration ermitteln. Verdünnen Sie die Zellen, die entsprechende Konzentration für die Aussaat (z.B.3.000 Zellen/mL).
      Hinweis: Optimieren Sie die erste Zelle Konzentration der Sphäroid für jede Zelllinie und jede Art von Multi-well-Platte (96-Well, 384-Well oder 1536-Well).
    5. Samenzellen in eine extrem niedrige Anlage (ULA) Runde Talsohle Multi-well-Platte. Fügen Sie 200 µL Zellen Suspension in jede Vertiefung in der Konzentration von 3.000 Zellen/mL, so dass jeder gut etwa 600 Zellen hat.
    6. Zentrifugieren Sie bei RT die ganze Platte mit einem Teller-Adapter für 7 min., gleich nach der Aussaat, bei einer Geschwindigkeit von 350 x g oder die niedrigste Geschwindigkeit zur Verfügung.
      Hinweis: Die Zentrifuge hilft Zellen in die Mitte des Brunnens zu erleichtern, bilden ein einheitliches Sphäroid zu sammeln. Die Zentrifuge Schritt erfolgt nur einmal am Anfang, um den Tumor Sphäroide bilden. Es wird nicht wiederholt werden, wenn der Tumor Sphäroide beginnen zu wachsen.
    7. Pflegen Sie die Multi-well-Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem Inkubator Kultur und aktualisieren Sie die Nährmedien alle 3 Tage.
      Hinweis: Wachstumszeit kann für verschiedene 3D Kulturbedingungen variieren. In unserer Studie ist 3.000 Zellen/mL für u-87 MG und HCT-116 Zelllinien in 96-Well-Platten verwendet, so dass das Sphäroid, ~ 500 μm in 4\u20127 Tage für die HCT-116 Zellen wachsen kann. Erwägen Sie, Medien-Ergänzungen und Wachstumsfaktoren für verschiedene Sphäroid Modelle, basierend auf der allgemeinen 3D Culture-Protokoll.
    8. Durchführen Sie OCT-Bildgebung der Tumor Sphäroide alle 3\u20124 Tage für eine Längsschnittstudie ihres Wachstums.
      Hinweis: Empfohlene Zeitpunkte für die OCT-Bildgebung wäre Tag 4, Tag 7, Tag 11, Tag 14, Tag 18 und Tag 21.

2. High-Throughput OCT Imaging Plattform

Hinweis: Siehe verwiesen Arbeit29,30,31,32,33,34 für eine gründliche Überprüfung der Prinzipien und Anwendungen der OCT. Siehe Abbildung 1 und Huang Et al. 42 für Details des imaging-System in dieser Studie verwendeten benutzerdefinierten OAT.

  1. Wählen Sie eine geeignete Breitband-Lichtquelle für das OCT-System für Tumor Sphäroid Bildgebung.
    Hinweis: Hier eine Superlumineszenz Diode (SLD, Abb. 1A,B) mit einer zentralen Wellenlänge ~ 1.320 nm und ~ 110 nm Bandbreite wurde als Breitband-Lichtquelle verwendet.
  2. Konstruieren Sie die Referenzarm und Probe Arm des OCT-Systems nach der Schaltpläne (siehe Abb. 1A,B für Details). Sehen Sie Tabelle der Materialien für eine Liste der optischen Komponenten der OCT-System zu errichten. Stellen Sie sicher, dass die optische Weglänge der Referenzarm und Probe Arm sind eng aufeinander abgestimmt.
  3. Konstruieren Sie das Spektrometer, darunter ein Kollimator, ein Gitter, eine F-Theta-Objektiv und eine Zeilenkamera (siehe Abbildung 1 für Setup34) für Details der Spektrometer-Design von Okt. alternativ eine kommerzielle Spektrometer auswählen, entspricht die Zentrum-Wellenlänge der Lichtquelle. Stellen Sie sicher, dass das Spektrometer korrekt ausgerichtet ist, um die gesamte Laser-Bandbreite, zu hohe Photon Abscheidegrad zu erreichen und zur langsamen Auswaschen der das Interferenzmuster zu decken.
  4. Die Leistung des Systems der OCT, namentlich die folgenden Metriken wie Probe Arm macht, total imaging tiefenabhängige Empfindlichkeit, axiale Auflösung, Tiefe, Tiefe des Fokus und laterale Auflösung zu charakterisieren. Legen Sie einen schwachen Reflektor (z.B., ein Spiegel mit einem Graufilter) als eine Probe, die tiefenabhängige Empfindlichkeit, axiale Auflösung und Schärfentiefe zu messen. Legen Sie einen USAF Auflösung Test Chart Ziel wie die Probe, die laterale Auflösung zu überprüfen.
    Hinweis: Siehe Referenzen34,45 für Definitionen von Kennzahlen der OCT Leistung und Protokolle zu charakterisieren diese Metriken45. Siehe Tabelle 1 für eine Liste der gemessenen Parameter für das benutzerdefinierte OCT-System in unserer Studie verwendet.
  5. Wählen Sie eine motorisierte Verschiebetisch, horizontale Bewegung von Multi-well-Platte zu Bild Tumor Sphäroide in verschiedenen Brunnen (siehe Abbildung 1 b) bereitzustellen. Verwenden Sie eine Bühne mit einem größer als 108 x 72 mm Stellweg, um sicherzustellen, eine volle scannen alle Brunnen von Multi-well-Platte. Verwenden Sie eine 2D oder 3D motorisierte Verschiebetisch mit Softwaresteuerung, um genaue Lage der einzelnen Brunnen und Automatisierung der OCT-System für Hochdurchsatz-Bildgebung zu ermöglichen.
  6. Verwenden Sie einen Adapter Platte oder entwerfen ein Kennzeichenhalter (3D-Druck), um die Multi-well-Platte in einer festen Position zu halten.
  7. Korrigieren Sie die Neigung und Drehung der Multi-well-Platte mit einem 2D kippen, Bühne und einem Drehtisch montiert auf der translationalen Bühne (siehe Abbildung 1-D), vor der Durchführung OCT-Bildgebung zur Minimierung von Variation der Fokusebene aus verschiedenen Brunnen. Wenn ihre relativen Position in der OCT-Bildern (Abbildung 1A) Überwachung verwenden Sie D2, D11, B6, D6, G6 als leitenden Brunnen.
  8. Passen Sie die Drehung der Platte um sicherzustellen, dass die Kanten der Platte parallel mit der Richtung der Bewegung sind, so dass die Vertiefungen an den gleichen horizontalen Positionen in der OCT-Bildern (Abbildung 1E) bleiben. Stellen Sie die Neigung der Platte parallel zum optischen Tisch, so dass die Brunnen für OCT-Bildgebung (Abb. 1F) auf den gleichen vertikalen Positionen bleiben.
    Hinweis: Einstellung der kippbare Winkel und Fokus helfen die OCT-Bildqualität für die Brunnen zu optimieren. Variationen der Höhe des Kulturmedien in verschiedenen Brunnen führen Änderungen im optischen Pfade jedoch zur Defokussierung des Sphäroid Bildes führen. Auto-Fokus kann durchgeführt werden, zur Steuerung der Brennebene des OCT-Bildgebung um optimale Bildqualität zu erzielen. Die Anpassung Schritt löst nicht armen OCT Bildqualität des Tumor-Sphäroid aufgrund der folgenden Probleme: der Sphäroid Dezentrierung durch anfängliche seeding Lage; Sphäroid Höhe eingebettet in Biofabricated extrazellulären Matrizen; schlechte Platte Qualität mit großen Schwankungen der Höhe gut Böden. Zusätzliche Software-Steuerung mit Autofokus oder Selbstausrichtung Funktionen kann zur Optimierung der Leistung des Office-Anpassungstools imaging-System implementiert werden.
  9. Verwenden Sie eine benutzerdefinierte Computerprogramm, um OCT-Bildaufnahme und der Tischbewegung nun nacheinander von jeder Datenerhebung zu kontrollieren.

3. OCT scannen und verarbeiten von Tumor Sphäroide

  1. Am Tag der OCT-Bildgebung der Tumor Sphäroide statt die Multi-well-Platte aus dem Inkubator. Die Multi-well-Platte unter Office-Anpassungstool imaging-System zu übertragen. Legen Sie es auf die Platte-Adapter.
    Hinweis: OCT-Bildgebung der Tumor Sphäroide kann mit dem Polystyrol Platte Deckel ein- oder ausschalten durchgeführt werden. Jedoch können die Wasser Verdichtungen auf dem Deckel durch Verdunstung aus den Brunnen Lichtdurchlässigkeit beeinflussen und verzerren den Lichtweg, weniger optimale OCT-Bilder aus der Sphäroide nachgeben.
  2. Passen Sie die Höhe der Platte durch Verschieben entlang der Z-Richtung der Übersetzung Stufe an. Pflegen die Brennebene Position bei ca. 100 – 200 μm unterhalb der Oberseite jedes Sphäroid, zur Minimierung der Auswirkungen der ungleichmäßigen Betonbewehrung focal Profil.
  3. Einen richtigen OCT Tastbereich (z.B. 1 x 1 mm) inmitten einer Individualsoftware zur Deckung der ganze Tumor Sphäroid nach seinen Entwicklungsstufen. Klicken Sie auf Speichern Parameter um die Einstellung zu speichern.
  4. Verwenden Sie die benutzerdefinierte Software OCT 3D-Bilder von Tumor Sphäroide eins nach dem anderen für die Brunnen der Platte mit Sphäroide zu erwerben. Klicken Sie auf Vorschau , um das Vorschaubild anzuzeigen und klicken Sie auf erfassen , um das OCT-Bild zu erwerben.
    Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die OCT Sphäroid Daten erhoben werden, wenn die Bühne nicht in Bewegung ist. Das Sphäroid befindet sich in der Regel in der Mitte des U-Boden gut. Jedoch kann das Sphäroid in den Kulturmedien verschoben werden, wenn die Bühne beschleunigen oder Abbremsen wegen der Trägheit der Sphäroid in den Kultur-Medien.
  5. Prozess-3D OCT Datasets von Tumor Sphäroide, OCT strukturelle Bilder mit eine benutzerdefinierte Verarbeitung der C++-Code zu erzeugen. Siehe Abbildung 2A für ein Flussdiagramm der Nachbearbeitung von OCT Daten.
    Hinweis: Siehe Abbildung 4A für die generierten 3D OCT strukturelle Bilder.
    1. Siehe Kapitel 5 Drexler und Fujimoto34 und Jian Et al. 46 für Detail-Beschreibungen der Nachverarbeitungsschritte OCT Daten. Die Pixelgröße in allen drei Dimensionen zu kalibrieren. Neu skalieren Sie die OCT strukturelle Bilder auf korrigierte Skalen.
      Hinweis: Der Abstand in axialer Richtung (Z-Richtung) von OCT-Bildern ist ein Maß der optischen Gangunterschied zwischen dem Referenzarm und Probe-Arm. Der Brechungsindex der Stichprobe (n) muss daher berücksichtigt werden, wenn die Pixelgröße in axialer Richtung für Skalierung zu kalibrieren. Wir verwenden in unserer Studie, n = 1,37 als der Brechungsindex der Tumor Sphäroid42.
  6. Generieren Sie die Collage der Sphäroid Bilder mit OCT 2D-Bilder in drei Cross-sectional XY, XZ und YZ-Ebenen über den Schwerpunkt der Sphäroid. Abbildung 3E für die repräsentativen Ausgabe von Collagen Sphäroid Bilder zu sehen. Führen Sie Bild-Registrierung für alle Sphäroide, mit Hilfe der MATLAB-Funktion Dftregistration47, um sicherzustellen, dass die Zentroiden der Sphäroid etwa an der gleichen Stelle befinden.
  7. Erhalten Sie 3D-Rendering des Sphäroids mit einem kommerziellen oder benutzerdefinierte Software.
    Hinweis: Die folgenden Schritte zeigen, wie das 3D-Rendering des Tumors Sphäroide mit einer kommerziellen Software zu erhalten.
    1. Laden Sie die 3D OCT-Daten in die Software.
    2. Klicken Sie auf die Surpass -Panel. Klicken Sie auf Neues Volume hinzufügen. Wählen Sie die Füllmethode für 3D-Rendering verwenden .
    3. Passen Sie den Betrachtungswinkel durch das Bild mit dem Mauszeiger ziehen.

4. morphologische Quantifizierung der 3D Tumor Sphäroide

Hinweis: Ein benutzerdefinierte geschriebenen Code in MATLAB verarbeitet diese Quantifizierung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um den Vorgang zu starten. Siehe Abb. 2 b für das Flussdiagramm der Schritte der morphologischen Quantifizierung der Sphäroide.

  1. Sphäroid Durchmesser, Höhe und Durchmesser-basierte Volumen zu quantifizieren.
    1. Wählen Sie OCT 2D-Bilder in drei Cross-sectional XY, XZ und YZ-Ebenen, die den Schwerpunkt der Sphäroid kreuzen.
    2. Messen Sie den Durchmesser und die Höhe von der Sphäroid in XY und XZ Ebenen, beziehungsweise.
    3. Durchmesser-basierte Sphäroid Volume verwenden zu berechnen: Equation 1 , mit eine Vermutung für die sphärische Form des Tumors.
  2. Voxel-basierte Sphäroid Volumen zu quantifizieren.
    1. Wenden Sie einen 3D durchschnittlichen Filter auf OCT Strukturdaten der Sphäroid, Flecken zu entfernen.
    2. Segment Tumor Sphäroide mit dem Canny Rand Erkennung48 Filter, Bild für Bild, mit einer richtigen Schwelle der Tumorregion Sphäroid von unten gut zu trennen.
    3. Verbindende Voxel für 3D-Daten zu gruppieren (siehe integrierte Funktion: Bwconncomp).
    4. Berechnen Sie die mittlere Entfernung zwischen jeder Bindegewebe Voxel in der Gruppe und der Sphäroid Zentroid (manuell gewählt), für jede Gruppe. Identifizieren der Sphäroid-Region als die Gruppe mit der mittleren Mindestabstand.
    5. Die Anzahl der Voxel innerhalb der Sphäroid-Region und multiplizieren dann durch das tatsächliche Volumen der eine einzelne Voxel (Volumen/Voxel), das Gesamtvolumen der Sphäroid nachgeben.

(5) tot-Cell Region Erkennung von 3D Tumor Sphäroide

Hinweis: In einem homogenen Medium, OCT zurückgestreute Intensität als Funktion der Tiefe (ich(Z)) erkannt kann beschrieben werden durch die Bier-Lambert Gesetz49: Equation 2 , wo z die Tiefe entspricht, μ ist die optische Dämpfung Koeffizient, und ich0 ist die einfallende Intensität auf die Probe. Daher der abgeleiteten optische Dämpfung Koeffizient ausgedrückt werden kann: Equation 3 . Seit OCT Bilder oft auf einer logarithmischen Skala dargestellt werden, kann die Steigung der OCT Intensität Profil abgerufen werden, um die optische Dämpfung Koeffizienten ableiten. Ein Flussdiagramm der Generation der optische Dämpfung Karten finden Sie unter Abbildung 2 .

  1. Führen Sie Segmentierung um unerwünschte Regionen außerhalb der Sphäroid zu entfernen. Führen Sie 3D durchschnittliche Filter, um das Speckle-Rauschen zu unterdrücken, das OCT-Bildern innewohnt.
  2. Pixelweise erhalten optische Dämpfung Koeffizienten durch lineare Montage der logarithmischen Skala OCT Intensität Profil über einen bestimmten Tiefenbereich (bewegliches Fenster), seine Neigung zu extrahieren und den Hang mit-1 multiplizieren/2.
    Hinweis: Der Koeffizient der Dämpfung bei jedem Voxel innerhalb der segmentierten Sphäroid Region basiert auf dem Hang des OCT Intensität Profil in einem 10-Voxel tiefe Fenster (~ 40 μm in der Tiefe), mit der Voxel befindet sich in der Mitte des Fensters berechnet.
  3. Wenden Sie die Methoden oben (Schritt 5.1 und 5.2) zu jedem axiale Scan in einem Frame und jeden Frame in einem 3D Dataset mit der segmentierten Sphäroid Region bis optische Dämpfung Koeffizienten für alle Voxel der segmentierten Sphäroid Region berechnet werden.
  4. Führen Sie die binäre Schnittstellenüberwachung um die hohe Dämpfung Region hervorzuheben.
    Hinweis: Siehe Huang Et al. 42 für die Bestimmung der Schwelle der Histogramm-Analyse mit hoher Dämpfung Region.
  5. Markieren Sie die binarisierten optische Dämpfung-Karte auf das Originalbild die Toten-Zell-Region (blending) beschriften. Generieren Sie das 3D-gerenderte Bild der gemischten Dämpfung Karte, um die 3D Verteilung der Toten Zelle Region visualisieren.

(6) Histologie und Immunhistochemie

Hinweis: Histologie und Immunhistochemie (IHC) gefärbten Bilder von Tumor Sphäroide ergeben sich um mit der entsprechenden OCT Ergebnisse korrelieren.

  1. Wählen Sie zu ausgewählten Zeitpunkten 1-2 Tumor Sphäroide aus Multi-well-Platte für Histologie und IHC beflecken. Mithilfe einer Pipette mit 1 mL-Pipettenspitzen der Sphäroid aus dem Brunnen zu einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen übertragen.
    Hinweis: Schneiden Sie die Pipettenspitze 1 mL vor der Übertragung zu gewährleisten, dass die Öffnung der Spitze größer als die Größe des Tumor-Sphäroid zu beschädigen die Struktur des Sphäroids ist.
  2. Jeder Tumor Sphäroid in einem einzigen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch gefüllt mit 10 % Formaldehyd und Fix für 48 h zu sammeln.
  3. Führen Sie die Histologie und IHC Prozesse für jedes Sphäroid, mit standard Paraffin einbetten Techniken.
    Hinweis: Fleck 5 μm dicke Abschnitte des Tumors Sphäroide für Hämatoxylin und Eosin (H & E) und terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick Ende Kennzeichnung (TUNEL) Apoptose-Erkennung. Eine Gegenfärbung Hämatoxylin wird TUNEL. Eine digitale Dia-Scanners wurde verwendet, um Scannen die gefärbte Probe und erhalten hochauflösende histologische und IHC Bilder.

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Representative Results

Hoher Durchsatz optische Kohärenz Tomographie Bildgebung der Sphäroide in eine 96-Well-Platte

Abbildung 3 zeigt das Ergebnis der HT-OCT Abtastung einer 96-Well-Platte mit HCT-116 Tumor Sphäroide am 3. Tag. Sequentielle Scan der gesamten Platte beginnt aus dem rechten unteren Brunnen (H12). Abbildung 3 b zeigt das Flussdiagramm der Software-Implementierung des Systems der HT-OCT. Nachdem ein Sphäroid Daten erhoben und verarbeitet wurden, würde die Platte weiter gut, ~ 2 warten, bewegen s erlauben das Sphäroid zum Ausruhen, und die nächsten Sphäroid Daten sammeln. Jedes ÜLG bestehen Daten von 400 x 400 x 1024 Voxeln, die eine tatsächliche Volumen von 1,0 x 0,84 x 2,3 mm3entsprach. Abbildung 3 zeigt eine Collage aus En-Face OCT Bilder von HCT-116 Sphäroide aus verarbeiteten Daten generiert. Das Ergebnis ist vergleichbar mit Bildern von anderen 2D Hochdurchsatz-imaging System22. Angesichts der bildgebende 3D-Fähigkeit des Office-Anpassungstools, könnte auch generieren wir die Collage von 2D Cross-sectional Sphäroid Bilder aus 96 Wells (Abbildung 3D) Sphäroid Höhen zu überwachen und visualisieren Sphäroid Inhomogenität in vertikaler Richtung. Eine Collage aus Bildern 3D-gerenderte Sphäroid ist auch aus einem beliebigen vordefinierten Winkel (Abbildung 3E) insgesamt 3D-Form zu visualisieren und Auswerten der Rundheit des Sphäroids möglich. Beachten Sie, dass die insgesamt OCT-Bildgebung und Prozess Zeit für die gesamte 96-Well-Platte wäre ~ 21 min und ~ 25 min, wenn die Zeilenkamera mit einer Geschwindigkeit von 92 kHz und 47 kHz bzw. ausgeführt wird. Ein Beispiel finden Sie unter Video 1 .

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der Tumor-Sphäroid

Nachdem wir die OCT strukturelle Bilder der Tumor Sphäroide von der Platte zu mehreren Zeitpunkten abgerufen, könnten wir diese Daten weiter zu analysieren durch Quantifizierung der morphologischen und physiologischen Informationen des Tumors Sphäroide. Abbildung 4 zeigt die verschiedenen Ansätze zur Tumor-Sphäroide zu charakterisieren und längs morphologischen und physiologischen Informationen von ihnen erhalten.

Abbildung 4 b zeigt verschiedene Wege, um den Tumor Sphäroid zu visualisieren. Mit Hilfe von kommerziellen oder kostenlose Software, könnten wir die 3D Daten in die Software laden und erstellen Sie ein "Volume" Tumor-Sphäroid (3D-Rendering), welche zeigt die allgemeine Struktur der Tumor Sphäroid im 3D-Raum. Mit richtigen Schnittstellenüberwachung könnten wir ein Oberflächendiagramm Tumor Sphäroid (Abbildung 4 b), generieren, die verwendet werden könnten, zu segmentieren der Sphäroid und Messen Sie das Volumen. Wir könnten auch generieren die orthogonalen Folien (ortho-Folien) aus anderen Querschnitt Flugzeuge in verschiedenen Ausrichtungen (Abbildung 4 b, XZ, YZ und XY) und Messen Sie den Durchmesser und die Höhe von Tumor-Sphäroid aus diesen ortho-Folien.

Datensammlung der OCT der gleichen Sphäroid von mehrere Zeitpunkt, könnten wir die morphologische Informationen zu quantifizieren und generieren die Wachstumskurve der Sphäroid um seine Längsachse Veränderungen zeigen. Abbildung 4 zeigt repräsentative Daten von einer HCT-116-Tumor-Sphäroid überwachten für 21 Tage. Aus den segmentierten Daten und ortho-Folien haben wir gemessen Durchmesser, Höhe und Voxel-basierte Volumen der Sphäroid für alle Zeitpunkt, die in der Tabelle aufgeführt waren. Wir berechnen auch das Durchmesser-basierte Volumen für einen Vergleich. Die Wachstumskurven in Größe und Volumen wurden bzw. geplottet. Von Wachstumskurven konnten wir sehen, dass diese HCT-116-Tumor-Sphäroid eine lineares Wachstumsmuster in Volumen vor dem 11. Tag gefolgt. Vor diesem Zeitpunkt das Sphäroid wuchs und eine relativ einheitliche Form beibehalten. Jedoch nach dem 11. Tag wurde der Sphäroid gestört, abgeflacht und voll stürzte am 21. Tag. Die Wachstumskurve der Voxel-basierte Bände zeigt deutlich den Trend, mit einem allmählich verringerte Mengen nach Tag 11.

Basierend auf den OCT-Daten, auch erhalten die physiologische Informationen über die Verteilung der toten Zellen im Tumor Sphäroide wir durch die Analyse der Pixel für Pixel optischen Dämpfung von 2D Querschnittsbilder. Nach den Methoden, dargestellt in Abbildung 2 und Protokoll Nr. 5 könnten wir quantitativ bestimmen die Toten-Zell-Regionen und überwachen das Wachstum dieser Regionen als Funktion der Zeit. Abbildung 4 zeigt ein repräsentatives Ergebnis Längs-Tracking des Anstiegs der Toten Zellbereiche in der Tumor-Sphäroid. In rot, die hohe optische Dämpfung, markierten Bereiche zeigen die beschrifteten nekrotischen Bereiche. Von der 3D gerendert optische Dämpfung Karte während der 14-tägigen Entwicklung konnten wir den roten Bereich erweitert, zeigt die Zunahme der nekrotischen Regionen sehen. Als der Prozentsatz der nekrotischen Bereiche erhöht konnte der Tumor-Sphäroid seine perfekten Form nicht halten. Daher würde sie eher stören und Zusammenbruch, die waren in der Längsrichtung Überwachung von Tumor Morphologie in Abbildung 4zu sehen.

Die vorgeschlagenen zerstörungsfreien abgestorbenes Gewebe Region Erkennung Technik wurde durch den Vergleich OCT optische Dämpfung Karte von HCT-116 Tumor Sphäroid mit entsprechenden Bildern durch die Histologie und IHC überprüft. Abbildung 4 zeigt einen solchen Vergleich mit ein Tag 14 HCT-116-Sphäroid. Eine gute Übereinstimmung zwischen den OCT-Dämpfung zuordnen und entsprechend H & E und TUNEL Scheiben gefunden wurden, die angegeben wurde, durch die Analyse der Funktionen innerhalb der Regionen in H & E und TUNEL Scheiben gekennzeichnet durch Bindestrich Linien abgeleitet von der Kontur der OCT hohe Dämpfung Regionen. H & E Scheiben wurden abgestorbenes Gewebe Regionen durch weniger dicht und aggregierten Struktur befindet sich innerhalb der gestrichelten Linie Region angezeigt. In TUNEL Scheiben wurde eine gute Übereinstimmung zwischen hohe Dämpfung und TUNEL-Label Apoptotic Zellen Region beobachtet.

Figure 1
Abbildung 1: Bau einer Hochdurchsatz-optische Kohärenz Tomographie (HT-OCT) für Tumor Sphäroid Bildgebung. (A) Schaltpläne der HT-OCT-System. Neben der OCT-System ist ein Diagramm der 96-Well-Platte aufgetragen. Fünf Brunnen (D2, D11, B6, D6, G6) in gelb beschriftet werden für die Feineinstellung der Etappen (D) verwendet. (B) die aktuelle Konfiguration des HT-OCT-System. Sehen Sie Tabelle der Materialien für optische Komponenten, die für jeden Teil des Systems verwendet. (C) Spektrometer design für das HT-OCT-System. (D) Bühne für das HT-OCT-System einrichten. Korrekte Ausrichtung der 6-achsigen Bühnen- und Synchronisation zwischen den OCT-Erwerb und die Tischbewegung sind für Hochdurchsatz-Bildgebung erforderlich. (E) und (F) die Auswirkungen der Rotation und Kippen auf endgültige Bild von verschiedenen Brunnen zeigen. Rotation bewirkt, dass die OCT-Bilder von verschiedenen Brunnen, horizontal zu verschieben, während Kippen zu vertikale Verschiebung von verschiedenen Brunnen führen wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Datenverarbeitung für OCT-Bilder von Tumor Sphäroide. (A) Flussdiagramm des allgemeinen Nachverarbeitungsschritte für OCT-Daten. (B) Flussdiagramm der morphologischen Quantifizierung der Tumor-Sphäroid. (C) Flussdiagramm der tote Zelle Region Nachweis von Tumor-Sphäroid. Maßstab: 100 µm für alle Subfigures. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Hochdurchsatz-OCT Scan von einem 96 gut Platte mit 87 MG Tumor Sphäroide. (A) die eigentliche Einrichtung mit der 96-Platte auch im Rahmen des Ziels. (B) Flussdiagramm der Software-Implementierung des HT-OCT-System. Collagen von 96 En face (C), Querschnitt (D) und 3D gerenderten Beihilfehöchstintensität Projection (MIP) (E) OCT Bilder von Tag 3 HCT-116 Sphäroide aus verarbeiteten Daten generiert wurden. Maßstabsleiste: 200 µm für alle Subfigures. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Longitudinal morphologischen und physiologischen Quantifizierung der Tumor Sphäroide mit 3D-Daten OCT. (A) abgerufen 3D OCT strukturelle Bilder von einer Tumor-Sphäroid nach allgemeinen OCT Nachbearbeitung. Aus den OCT-Daten erzeugen wir 3D Oberflächendiagramm und YZ, XZ und XY orthogonal Scheiben, um die Struktur des Tumors Sphäroid in eine beliebige Richtung (B) zu visualisieren. Wir können längs Überwachung von einem einzelnen Tumor-Sphäroid (C), Charakterisierung der Durchmesser, Höhe und Voxel-basierte Volumen (aufgeführt in der Tabelle der Materialien) und Plotten der Wachstumskurven in Größe und Volumen während der 21-Tage durchführen. Entwicklung. Im Beispiel als das Sphäroid entwickelt wurde es am Tag 11 gestört und voll stürzte am 21. Tag. Wir können den physiologischen Status ein Tumor Sphäroid längs basierend auf die optische intrinsischen Dämpfung Kontrast (D) weiter überwachen. 3D gerenderte Bilder von einem Tumor Sphäroid zeigte die Erscheinung und das Wachstum des Toten Zelle Regionen von Tag 7 bis Tag 14. Die hohe Dämpfung beschriftet Toten-Zellbereiche in rot wurden abgestimmt mit histologische und immunhistochemische (IHC) führt. OCT-Dämpfung-Karte, H & E und TUNEL Ergebnis in Abbildung 4 sind ab dem REF 42 geändert. Skalieren Sie Bars: 100 µm für alle Subfigures. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Video 1
Video 1: Hochdurchsatz-OCT-Bildgebung der Tumor Sphäroide. Ein Workflow OCT 3D-Bildgebung, grundlegende OCT Verarbeitungs-und Bewegung wurde in dem Video mit einer Geschwindigkeit von 5 X vorgestellt. Vorschau der bearbeiteten OCT strukturelle Bilder der Sphäroide wurden ebenfalls vorgestellt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

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Discussion

Tumor-Aktivität ist für seine morphologische Struktur äußerst relevant. Ähnlich wie bei der Überwachung der charakteristischen Wachstumskurve für 2D Zellkulturen, ist tracking die Wachstumskurve für 3D Tumor Sphäroide auch einen konventionellen Ansatz für das langfristige Sphäroid Wachstum Verhalten für verschiedene Zelllinien zu charakterisieren. Insbesondere können wir die Droge Antwort charakterisieren, durch die Analyse von Tumor-Abbau oder Tumor Regrowth spiegelt sich direkt in der Wachstumskurve. Quantitative Bewertung der 3D Tumor Sphäroide, einschließlich die Größe und das Volumen der Wachstumskurve ableiten deshalb von großer Bedeutung für die Charakterisierung des Tumors Sphäroide und die Auswertung der Verbundwirkung. Derzeit, imaging-Plattformen basierend auf Hellfeld, Phasenkontrast oder Fluoreszenz-Bildgebung für routinemäßige Bildgebung und Analyse der Morphologie oder Funktionen des 3D Tumor Sphäroide8,9,18festgestellt, 22. Sie sind jedoch nicht in der Lage, die ganze, große Tumor Struktur aufgrund der begrenzten Eindringtiefe sowie mit niedriger Auflösung Tiefe Abwicklungsfähigkeit zu lösen. In die repräsentativen Ergebnisse zeigten wir OCT um die gesamte 3D Struktur von der Tumor-Sphäroid entwickeln im Laufe der Zeit zu visualisieren. 3D-Bildgebung OCT könnten den Blick auf das Sphäroid in beliebiger Orientierung und jeder Querschnitt mit hoch-Abwicklungsfähigkeit, die gab es nicht in herkömmlichen bildgebender Verfahren, die die Auflösung auf die Tiefe fehlt. Voxel-basierte Volumen Quantifizierung basierend auf 3D-Daten OCT ergab darüber hinaus eine genaue Quantifizierung der Sphäroid Volumes ohne ihre ursprüngliche Form anzunehmen. Daher, wir haben gezeigt, dass OCT eine robuste bildgebende Modalität für 3D Morphologie Charakterisierung des Tumors Sphäroide die sorgt für genaue Messungen der charakteristische Wachstumsmuster für verschiedene Zelllinien und potenziell kann als eine Alternative für Droge-Antwort-Bewertung.

Lebensfähigkeit Tests mit fluoreszierenden Färbung bleibt ein beliebter Ansatz für Funktionsanalysen des Tumors Sphäroide, vor allem für Drogen-screening-18. Die störende Natur von Fluoreszenzfarbstoffen zeigt jedoch, dass diese Tests nur für Endpunkt Studien geeignet sind. In unseren repräsentativen Ergebnissen (Abbildung 4) haben wir eine alternative Methode, die Zellviabilität innerhalb der gesamten Sphäroid charakterisieren kann. Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass OCT die Toten-Zelle-Region aus der lebensfähigen Region in den Sphäroid basierend auf intrinsische optische Dämpfung Kontrast unterscheiden könnte. Darüber hinaus mit bildgebenden 3D-Fähigkeit und nicht-destruktive Natur des OCT-Systems, quantitative Auswertung der Toten-Zelle-Distributionen und in Situ Kontrolle des Fortschreitens der Toten Zelle Regionen innerhalb der Sphäroid sind möglich, die potenziell wertvoller informieren der Sphäroid Wachstumsmuster. Wir sollten jedoch beachten, dass in unseren repräsentativen Ergebnissen wir nicht in der Lage sind, verschiedene Arten von Zelle Tod Modi, wie Apoptose und Nekrose in der binären OCT Dämpfung Karte zu unterscheiden.

Da ein Medikament zusammengesetzte Bibliothek kann umfangreich sein (> 10.000), ein Hochdurchsatz- und robustes System Tumor Sphäroide im Multi-well-Platten bei Drogentest zu charakterisieren ist zwingend erforderlich. Die aktuellen Hochdurchsatz-imaging-System erreichen eine Vorführung von insgesamt 96-Well-Platte in < 5 min in 2D scan Modus22. OCT kann zwecks Hochdurchsatz-Screening mit Hilfe einer motorisierten Stufe angepasst werden. Man kann auch erhalten ein handelsüblicher OCT-System (siehe Tabelle der Materialien für eine Liste der kommerziellen OCT-Systeme) mit einer ähnlichen Leistung zu unserem benutzerdefinierten OCT-System und einem motorisierten Stadium in das System integrieren. Allerdings müssen Anstrengungen unternommen werden, das kommerzielle OCT-System um die motorisierten Bühne integrieren verändern. Kundenspezifische Software-Implementierung, die Synchronisation zwischen OCT Erwerb Trigger und Bühne Bewegung Trigger zu realisieren ist zudem erforderlich. Für unser Prototyp HT-OCT-System dauerte es 2-18 Sekunden ein 3D OCT-Daten aus einem einzelnen Tumor Sphäroid, abhängig von der Wahl der Kamerageschwindigkeit zu erwerben. So kann die gesamte Erfassungszeit ~3.2 min für eine 96-Well-Platte mit HT-OCT-System möglichst kurz sein. Die Zwischenschritte für das aktuelle HT-OCT-System, einschließlich Datenverarbeitung, lesen und Schreiben von Daten auf Festplatten und Bühne Bewegungen blieben jedoch zeitaufwendig. Zusätzliche ~ 18 min wäre am Anfang der ~3.2 min Mindestangaben Erfassungszeit erforderlich. Die gesamte imaging-Zeit kann in mehrfacher Hinsicht weiter reduziert werden: State-of-the-Art OCT Landnutzungssystemen ausgestattet mit einem High-Speed-durchstimmbare Laser Quelle50,51; optimiert den Workflow durch die Anordnung der kritischen Schritte (Datenerfassung, Datenverarbeitung, schreiben, Tischbewegung) arbeiten parallel; beschäftigen Sie eine parallele OCT-Bildgebung mit einer Raum-Division multiplexing Setup52. Mit System-Optimierung, das Hochdurchsatz-OCT-System in Krebs Arzneimittelforschung sowie Charakterisierung von anderen 3D Bio-fabrizierten Proben genutzt werden (zB., 3D Gewebe Organellen) für verschiedene biomedizinische Anwendungen.

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Disclosures

Die Autoren geben keine konkurrierenden Interesse.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NSF gewährt IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH Zuschüsse, R21EY026380, R15EB019704 und R01EB025209 und Lehigh University Gründerfonds.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

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References

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