Espressione rapida ed efficiente di più proteine negli embrioni aviari utilizzando l'elettroporazione dell'mRNA

Developmental Biology

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Summary

Riportiamo l'elettroporazione messaggera RNA (mRNA) come un metodo che permette l'espressione rapida ed efficiente di più proteine nel sistema del modello embrionale di quaglia. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare le cellule fluorescenti e registrare i loro movimenti in vivo mediante microscopia time-lapse poco dopo l'elettroporazione.

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Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

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Abstract

Riportiamo che l'elettroporazione dell'mRNA consente alle proteine fluorescenti di etichettare le cellule negli embrioni di quaglia viventi più rapidamente e in generale rispetto all'elettroporazione del DNA. L'elevata efficienza di trasfezione consente di co-trasfetare almeno 4 mRNA distinti con un'efficienza dell'87%. La maggior parte degli mRNA elettroporate sono degradati durante i primi 2 h dopo l'elettroporazione, permettendo di effettuare esperimenti sensibili al tempo nell'embrione in via di sviluppo. Infine, descriviamo come immaginire dinamicamente embrioni vivi elettroporate con mRNA che codificano varie proteine fluorescenti subcellulari mirate.

Introduction

L'elettroporazione è un metodo di trasfezione fisica che utilizza un impulso elettrico per creare pori transitori nella membrana plasmatica, permettendo a sostanze come gli acidi nucleici o le sostanze chimiche di passare nel citosol. L'elettroporazione è ampiamente utilizzata per fornire DNA in batteri, lieviti, piante e cellule di mammiferi1,2,3. Viene regolarmente utilizzato per introdurre carichi genetici nelle cellule bersaglio e nei tessuti all'interno dell'embrione aviario in via di sviluppo per studiare il controllo genetico dello sviluppo o etichettare le popolazioni migratorie di cellule4,5,6, 7. Tuttavia, esistono anche diverse limitazioni sperimentali con l'elettroporazione del DNA8. Per esempio, l'elettroporazione del DNA spesso introduce un numero altamente variabile di vettori di espressione per cellula e successivamente gli mRNA e le proteine che codificano. Questa variabilità può portare a una notevole eterogeneità cellulare-cellula che complica sia l'analisi dell'immagine che l'interpretazione dei dati9,10. Inoltre, le proteine dell'elettroporazione del DNA iniziano solo ad esprimere 3 h dopo l'elettroporazione e non raggiungono la massima efficienza nel numero di cellule e nell'intensità della fluorescenza fino a 12 h, probabilmente a causa del tempo necessario per il trasferimento nel nucleo e il completamento sia la trascrizione che la traduzione in vivo11.

Al contrario, la trafezione dell'mRNA è stata utilizzata efficacemente in una varietà di sistemi modello, tra cui Xenopus laevis oeciti per microiniezione12,13, riprogrammando le cellule staminali umane mediante trasfezione di lipofectamina di mRNA14 ed elettroporare le cellule staminali neurali nei topi adulti15. Abbiamo testato la capacità dell'elettroporazione dell'mRNA di etichettare in modo efficiente le cellule durante lo sviluppo embrionale aviaria precoce utilizzando mRNA sintetizzati in vitro che codificano proteine fluorescenti distinte (FP). Per i nostri studi, abbiamo utilizzato il vettore pCS2, un vettore di espressione multiuso che viene comunemente utilizzato per esprimere proteine negli embrioni di Xenopus e di pesce zebra. I promotori di polimerasi dell'RNA SP6 e T7 nel pCS2 consentono la sintesi di mRNA e proteine da qualsiasi gene clonato se usato in un sistema di trascrizione/traduzione in vitro.

Qui, dimostriamo che l'elettroporazione dell'mRNA consente un'espressione rapida ed efficiente delle proteine fluorescenti (FP) negli embrioni di quaglia gastrulanti. Abbiamo progettato e generato molti dei vettori di espressione utilizzati in questi studi. Ad esempio, abbiamo sottoclone del gene LifeAct-eGFP16 nel vettore pCS217 per esprimere dal promotore CMV e dal promotore SP6. Il gene inserito si trova a valle del promotore SP6 e a monte della coda18poli SV40. Negli embrioni co-elettropolizzati con mRNA e DNA, gli FP codificati da mRNA trascritti in vitro sono stati rilevati per la prima volta entro 20 min dall'elettroporazione, mentre le FP dei vettori di espressione del DNA sono state rilevate solo dopo 3 h. La codifica multipla degli mRNA per il nucleare, il Golgi e le proteine della membrana possono essere elettroporate in un embrione contemporaneamente, con conseguente espressione rapida ed efficiente di più proteine nelle singole cellule. Infine, utilizzando un recupero di fluorescenza in vivo dopo il fotobleaching (FRAP), mostriamo che la maggior parte dei mRNA elettroporate decade entro 2 h. Pertanto, una rapida produzione iniziale di proteine combinata con una nuova traduzione proteica limitata rende l'elettroporazione dell'mRNA una tecnica preziosa quando è necessario il controllo temporale dell'espressione.

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Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida approvate dal Children's Hospital di Los Angeles e dai comitati per la cura e l'uso degli animali della University of Southern California.

1. Vettori di espressione basati su pCS2 di generazione

  1. Per clonare pCS2.Lifeact-eGFP, preparare la spina dorsale vettoriale digerendo 2 g di pCS2.CycB1-GFP (un costrutto contenente un inserto diverso) con BamHI (10 U) e BsrGI (10 U) nel buffer di digestione appropriato (vedere Tabella dei materiali) diluito a 1x in una reazione totale volume di 50 l per 1 h a 37 gradi (vedere la figura 1 per lo schema della procedura di clonazione).
    1. Dephosphorylate le estremità libere 3'OH della spina dorsale vettoriale dalla reazione enzimatica di restrizione con l'aggiunta di gamberi alcalini fosfofore (1 U). Incubare per 30 min a 37 .
    2. Eseguire l'intera miscela in un buffer 1% di gel di agarose/1x Tris Acetate EDTA (TAE) a 90 V per 50 min e quindi macchiare il gel in una soluzione di 0,5 g/mL di bromuro di etidio in 1x tampone TAE per 15 min con dondolo delicato. Inoltre, assicurati di caricare i marcatori di peso molecolare in una corsia libera per aiutare a determinare le dimensioni del DNA.
    3. Utilizzando un Transilluminatore UV sicuro per il DNA per evitare di intasare i DNA, ritagliare rapidamente la spina dorsale vettoriale (dimensione prevista della banda di 4kb) dal gel di agarose e isolare il frammento di DNA dal pezzo di gel utilizzando un kit di purificazione del gel utilizzando le istruzioni del produttore.
  2. Contemporaneamente al passo 1.1, preparare l'inserto digerindo 2 g di pEGFP-N1-Lifeact con BglII (10 U) e BsrGI (10 U) in un buffer di digestione appropriato diluito a 1x in un volume di reazione totale di 50 - L per 1 h a 37 . Eseguire l'intera miscela in un gel di agarose dell'1% per isolare la banda di 800 bp come spiegato in precedenza nel passaggio 1.1.2-1.1.3.
  3. Dopo che sia il vettore che l'inserto sono purificati e quantificati sullo spettrofotometro, combinate 50 ng del vettore e 38 ng dell'inserto (1:3 molare rapporto di vettore per inserto) nel buffer di ligase del DNA T4 prima di aggiungere il DNA T4 ligase per catalizzare la reazione di legatura. Inoltre, impostare un controllo nessun DNA, un controllo solo vettoriale e un controllo solo inserimento. Incubare tutte le reazioni a temperatura ambiente per 30 min.
    1. Trasformare 1 ll della miscela(s) di ligazione in competente E. coli DH10. Inoltre, trasformare l'acqua solo controllo negativo e 20 pg di controllo pUC19 positivo. Stendere i batteri su piastre di agar Luria Broth (LB) contenenti 50 g/mL di ampicillina e incubare durante la notte a 37 .
    2. La mattina seguente, conta le colonie su ogni piatto.
      NOT: Idealmente, non ci dovrebbero essere colonie sulle piastre di controllo negativo, >100 colonie sul vettore: inserire le lastre di legatura e meno colonie sulla piastra solo vettoriale.
    3. Scegli almeno 8 colonie batteriche dalla piastra di agar trasformate con la miscela di ligazione vettoriale e inocularle usando stuzzicadenti sterili o punte di pipetta in 2 mL di brodo LB liquido contenente 50 Ampicillina.
    4. Estrarre il DNA da ciascuno dei cloni utilizzando kit di miniprep plasmide commerciali.
    5. Eseguire un digest di restrizione diagnostica utilizzando 500 ng di DNA da ogni clone utilizzando NotI (10 U) e BamHI (10 U) nel buffer di digestione appropriato diluito a 1x per 1 h a 37 gradi centigradi ed eseguire il DNA digerito su un 1% di gel di agarose nel buffer 1x TAE. Le dimensioni previste per i cloni positivi pCS2.Lifeact-eGFP sono di 3,9 kb e 978 bp.
    6. Trasformate 1 pg-100 ng di DNA dal clone positivo in competente E. coli DH10 e preparate 3-4 miniprep reazione, come descritto nei passaggi precedenti, per ottenere una quantità sufficiente di DNA per la reazione di trascrizione in vitro (minimo di 10 g).

2. Preparazione dell'mRNA da parte della trascrizione in vitro

  1. Linearizzare 10 g di pCS2.LifeAct-eGFP all'estremità 3' dell'inserto con NotI (10 U) in un buffer di digestione appropriato diluito a 1x in un volume di reazione totale di 50 .L a 37 s durante la notte.
    NOT: Per prevenire la contaminazione da RNase e ridurre la degradazione dell'mRNA, indossare i guanti durante la manipolazione dei campioni di mRNA.
  2. Purificare il DNA utilizzando una miscela di fenolo: cloroformio: alcol isoamyl (25:24:1, v/v).
    1. Aggiungere 150 l di acqua senza RNase per rendere il volume totale della reazione di digestione pari a 200 .L. Quindi, aggiungere 200 l di fenolo: cloroformio: l'isoamyl alcol e vortice la miscela per 20 s.
    2. Centrifuga in un microfugo alla velocità massima (18.400 x g) per 2 min. Rimuovere con attenzione la fase acquosa superiore che contiene il DNA linearizzato. Ripetere questo passaggio per rimuovere ulteriori impurità e fare attenzione a non interrompere il precipitato bianco che può formarsi tra le fasi liquide inferiore e superiore.
  3. Il DNA linearizzato precipitato aggiungendo 1/10 di acetato di sodio 3M volume (senza RNase) e 2,5 volumi di 100% di etanolo. Lasciare la miscela a -20 gradi centigradi per >30 min, quindi pellet il DNA centrifugando alla velocità massima (18.400 x g).
    1. Lavare il pellet di DNA con il 70% di etanolo, quindi asciugare ad aria il pellet per >5 min.
    2. Sciogliere il pellet di DNA in 5-L di acqua senza RNase. Quantificare il DNA mediante spettrofotometro.
      NOT: La concentrazione prevista del DNA è di 0,5-1 s/L con un rapporto A260/A280 compreso tra 1,7-2,0.
  4. Utilizzare 1 g di DNA linearizzato pCS2.LifeAct-eGFP per la trascrizione in vitro (IVT). Seguire le istruzioni del produttore nel kit commerciale (vedi Tabella dei materiali) per includere 10 l di tappo analogico (concentrazione finale 0,8 mM) e NTP (concentrazione finale 1 mM per ATP, CTP e TTP; 0,2 mM per GTP), 2 lun di buffer di reazione 10x (concentrazione finale 1x), 2 luna di polimerasi di RNA SP6 e acqua senza RNase fino a 20 -L.
    1. Incubare la miscela IVT per circa 2 h o più, a seconda delle dimensioni della trascrizione.
      NOTA: 2 h incubazione funziona bene per una trascrizione 3 kb, ma incubazione durante la notte funziona meglio per le trascrizioni che sono superiori a 5 kb.
    2. Per rimuovere i nucleotidi liberi dalla reazione di trascrizione, aggiungere 30 -L di soluzione di precipitazione dell'RNA LiCl (7,5 M di cloruro di litio, 50 mM EDTA) per far precipitare l'mRNA. Vorticare brevemente la miscela e conservare a -20 gradi centigradi per 30 min. Ruotare l'mRNA verso il basso per 15 min in un microfuge alla velocità massima (18.400 x g) e risciacquare con 70% di etanolo (senza RNase).
  5. Sciogliere l'mRNA sintetizzata in 15 -L di acqua senza RNase. Erogalare l'mRNA sintetizzato a 5 l/tubi (3 tubi in totale) e mettere a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine. Quantitate l'mRNA con uno spettrofotometro.
    NOT: La resa prevista è di 15-20 g di mRNA. Per un esperimento con 10 embrioni è sufficiente un lpossibile per un esperimento con 10 embrioni, supponendo che l'mRNA sia diluito da 1 g/l a 500 ng/L e che ogni embrione sia iniettato con 200 nL. Ogni tubo dovrebbe, pertanto, contenere un mRNA sufficiente per gli esperimenti da 5 dollari.
  6. Eseguire 300 ng di mRNA su un 1% di gel di garose in 1x tampone TAE dopo aver pulito tutte le apparecchiature di gel con la soluzione di decontaminazione RNase (ad esempio, RNase Away) e assicurarsi che l'mRNA appaia come una banda (più bande possono essere presenti se si formano strutture secondarie) e che non nella corsia di gel, che indica la degradazione dell'RNA.

3. Preparazione del mix di elettroporazione dell'mRNA

  1. Scongelare e diluire l'mRNA alla concentrazione desiderata (250-500 ng/L in acqua priva di RNase funziona bene per tutti gli mRNA testati in questo lavoro). Aggiungere un volume di colorante colorato (vedere Tabella dei materiali, senza RNA, 0,1% concentrazione finale) per aiutare a visualizzare il sito di iniezione di mRNA e posizionare correttamente gli elettrodi.
    NOTA:
    Se DNA e RNA sono combinati per eseguire una co-elettroporazione, assicurarsi che il DNA sia privo di RNacoli contaminati utilizzando l'estrazione del fenolo cloroformio e la precipitazione dell'etanolo prima della miscela di mRNA e DNA.
    1. Assicurarsi di preparare un controllo negativo utilizzando una soluzione di elettroporazione fittizia (senza RNA aggiunto). Se possibile, preparare un controllo positivo utilizzando mRNA pre-convalidato (mRNA che è stato dimostrato di produrre FP con successo negli esperimenti precedenti).
      NOT: Il controllo negativo è essenziale per tutti gli esperimenti di imaging per stabilire livelli di fluorescenza di fondo per la normalizzazione dei dati. Il controllo positivo è particolarmente importante quando si lavora con mRNA appena trascritto, aiutando a confermare che le impostazioni di elettroporazione hanno funzionato.
  2. Conservare la soluzione di elettroporazione dell'mRNA su un liquame di ghiaccio per prevenire la degradazione fino a quando non è pronto per procedere con l'elettroporazione.

4. Elettroporate mRNA in embrioni di quaglia vivente

  1. Raccogliere le uova di quaglia appena pelate ogni giorno e conservarle a 13 gradi centigradi in un frigorifero umido per non più di 1 settimana. Incubare le uova di quaglia a 38 gradi centigradi fino alle fasi di sviluppo embrionale desiderate19,20,21.
    NOT: Da HH3 a HH5 sono stati utilizzati in questo studio sia per l'imaging statico che per quello dinamico. Per gli embrioni HH3, lasciare gli ovuli a temperatura ambiente per 2 h prima della raccolta rende il processo di isolamento molto più facile in quanto gli embrioni sono generalmente più resistenti alle manipolazioni fisiche quando raffreddati.
  2. Isolare e preparare gli embrioni secondo il sistema di coltura CE22. Raccogliere almeno 5 embrioni per condizione, di cui almeno uno per fungere da controllo negativo (non elettroporate).
    1. Rompere delicatamente e versare l'uovo in un piatto Petri di 10 cm. Rimuovere la maggior parte della spessa albumina con una pipetta di trasferimento e rimuovere la restante albumina spessa intorno all'embrione asciugando delicatamente la superficie del tuorlo con una salvietta di tessuto per garantire che l'embrione si attacchi strettamente all'anello di carta.
    2. Posare la carta da filtro pretagliata (vedi Tabella deimateriali) sull'embrione e utilizzare le forbici per tagliare senza problemi intorno al perimetro dell'embrione.
    3. Utilizzare una pipetta Pasteur per essere alla base dell'embrione con PBS, utilizzando dolci flussi per liberare qualsiasi tuorlo attaccarsi all'embrione.
      NOT: Questo passaggio è fondamentale quando si lavora con embrioni più giovani (
    4. Tirare lentamente l'anello embrionale/carta con un angolo obliquo su e giù dal tuorlo in un piatto Petri pieno di PBS per un'ulteriore pulizia. Una volta rimossa la maggior parte del tuorlo, posizionare il lato ventrale dell'embrione su un piatto Petri da 35 mm coperto da una miscela semi-solida di agar/albumen.
  3. Preparare da sei a otto microcapillari di vetro lunghi 10 cm (O.D. - 1,2 mm) utilizzando uno strumento di espirazione a micropipetta in vetro.
  4. Collocare il lato ventrale dell'embrione nella camera di elettroporazione riempita con PBS. Utilizzando un microcapillare di vetro, iniettare un bolus di 200 nL del mix di elettroporazione mRNA o DNA/mRNA nella cavità tra l'epiblaste e la membrana vitelline che copre la regione desiderata.
    NOT: L'intera area anteriore per pellucida e qualche area per l'opaca è stata elettropolitanella nella maggior parte degli esperimenti mostrati in questo manoscritto.
  5. Posizionare gli elettrodi positivi e negativi (platino elettrodo quadrato piatto; lunghezza laterale di 5 mm) rispettivamente sulla parte superiore e inferiore dell'embrione e sull'elettroporate utilizzando la seguente sequenza di impulsi: cinque impulsi elettrici quadrati di 5 V, 50 ms di durata con intervalli di 100 ms utilizzando un elettroporatore in vivo. Assicurarsi che la distanza tra gli elettrodi sia di 5 mm.
    NOT: L'ottimizzazione dei parametri di elettroporazione è fondamentale per evitare condizioni che possano uccidere le fragili cellule embrionali. I parametri di tensione, lunghezza dell'impulso, intervalli di impulsi e il numero di impulsi per DNA e mRNA devono essere considerati per vari dispositivi di elettroporazione.
  6. Incubare gli embrioni elettropotati a 38 gradi centigradi nella fase di sviluppo desiderata.
    NOT: Uno stereoscopio di dissecing fluorescente (vedi Tabella deimateriali) aiuta a vagliare gli embrioni trasfettati rispetto a quello non trasvenuto.
  7. Se gli embrioni devono essere immagine staticamente, fissarli in 4% paraformaldeide in PBS per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi centigradi.
    1. Rimuovere gli embrioni dalla membrana vilia tagliando agevolmente il perimetro della carta filtrante con le forbici e staccando delicatamente la membrana lucida sulla superficie dorsale con pinze affilate.
    2. Lavare gli embrioni fissi in PBS/Triton (0,1%) 2x per 5 min e continuare con l'ibridazione in situ o immunostaining, se lo si desidera.
    3. Infine, macchiare l'embrione in 0,5 g/DAPI in PBS/Triton (0,1%) per almeno 30 min a temperatura ambiente. Lavare gli embrioni in PBS/Triton 2x per 5 min e ripulire l'embrione nella soluzione SCALE-U223 durante la notte.
  8. Per analizzare l'efficienza dell'elettroporazione (vedere la figura2), utilizzare lo strumento di analisi binaria e delle particelle e il canale DAPI su ImageJ per ottenere contorni nucleari da tutte le celle dell'immagine.
    1. Per utilizzare lo strumento binario su ImageJ, utilizzare una singola z-slice nel canale DAPI contenente la maggior parte delle celle e fare clic su Elabora > Binario > Rendi binario. Per separare le celle vicine, fare clic su Elabora > Binario > Bacino idrografico. Ottenere i contorni delle celle facendo clic su Analizza > Analizza particelle, dimensione impostata su 100-500 (m2).
    2. Assicurarsi che la maggior parte delle celle sia delineata nel canale DAPI e salvare i contorni delle celle facendo clic su Altro > Salva nella finestra popup di Gestione ROI.
    3. Usate questi contorni per ottenere i valori di intensità della fluorescenza per il canale mRNA e DNA aprendo il file precedentemente salvato su una singola z-slice nel canale mRNA o DNA, quindi fate clic su Misura sul gestore del ROI.
    4. Infine, filtrare questi valori di intensità, contando le celle con intensità di <6,000 fluorescenza come celle non transfette e le cellule con intensità di fluorescenza >6,000 come trasfetate.

5. Immagini FPs codificati da mRNA elettroporate

  1. Scegli l'embrione più sano e migliore elettropozzato per gli esperimenti di imaging dinamico dopo aver esaminato tutti gli embrioni elettropotati sotto lo stereoscopio di dissecing fluorescente.
    1. Continuare a incubare gli altri embrioni elettropotati e l'embrione non elettropoterato (il controllo negativo) in un'incubatrice separata durante l'imaging dell'embrione scelto nel caso in cui questo embrione muoia durante l'esperimento.
  2. Per l'imaging dinamico, utilizzare la coltura dell'embrione aviario ex ovo intero come descritto in precedenza24,25,26 con un microscopio confocale invertito.
    NOTA:
    Il microscopio è dotato di un'incubatrice sul palco (vedi Tabella deimateriali) che mantiene la temperatura a 36 gradi centigradi durante l'imaging. Durante l'allestimento del microscopio è stato osservato che gli embrioni incubati a 36 gradi centigradi sopravvivono più a lungo rispetto alle temperature più elevate, probabilmente perché il laser può causare il riscaldamento locale sull'embrione. I lettori devono determinare la temperatura di incubazione ottimale in fase per il proprio microscopio.
    1. Per creare dinamicamente un'immagine e visualizzare l'embriogenesi, pulire brevemente l'embrione elettropotizzati con PBS per rimuovere eventuali bolle che possono formarsi sul lato dorsale dell'embrione durante il processo di elettroporazione spostando l'embrione utilizzando le pinze in un PBS pulito soluzione.
    2. Posizionare l'embrione pulito direttamente su un piatto di imaging contenente un sottile strato di albumen-agar (150 dollari l, assicurandosi di non generare bolle sulla superficie dorsale dell'embrione22.
    3. Per garantire la sopravvivenza per l'imaging a lungo termine, aggiungere un piccolo pezzo di carta velina arrotolata ai bordi interni del piatto di imaging e sigillare il piatto utilizzando la pellicola di paraffina per ridurre al minimo l'evaporazione durante l'imaging e l'incubazione.
    4. Spostare rapidamente questo piatto allo stadio preriscaldato di un microscopio confocale e individuare il colorante colorato nell'embrione utilizzando il canale del campo luminoso (laser PMT 20%), che identifica la regione iniettata ed elettroporata.
  3. Impostare il software di imaging sull'obiettivo desiderato (10 o 20x), mirror dicroico (488 nm per GFP nm, 561 per RFP), spettri di emissione (499-562 nm per GFP, 570-695 nm per RFP) e attivare un laser appropriato (488 per GFP, 561 nm per RFP).
    NOTA:
    l'mRNA elettrofocato è stato tradotto in proteine che sono state osservate entro 20 min (vedi Figura 3). I metadati di imaging utilizzati per la maggior parte delle immagini in questo articolo erano: un microscopio confocale invertito con un obiettivo 20x (vedi Tabella deimateriali); pixel di persire il tempo, 1,5 dollari; di scansioni a 4 righe.
    1. Fare clic su Live sul software di imaging e regolare la potenza del laser su un'impostazione appropriata per l'intensità di fluorescenza a seconda di ogni potenza laser del microscopio. Inizia con l'imaging dell'embrione usando l'1% di potenza laser, 800 guadagni, e aumenta la potenza laser lentamente dell'1% di incrementi fino a quando non si vedono pixel saturi.
    2. Seguire questo diminuendo leggermente la potenza del laser fino a quando non si vedono più pixel saturi.
      NOT: La potenza laser scelta per l'inizio di una sessione di imaging di un embrione può essere buona per i punti temporali precedenti, ma non ideale in momenti successivi se la fluorescenza delle cellule diventa molto più luminosa o dimmer nel tempo. Per affrontare questo problema, immagini l'embrione a impostazioni di potenza leggermente inferiori inizialmente poiché le cellule elettroporate generalmente diventano più luminose nelle prime 6 ore dopo l'elettroporazione (vedere la figura 3A-E per la quantificazione dell'aumento del segnale). Se le immagini successive sono sature, continuare a visualizzare l'immagine con le impostazioni di imaging originali, ma scattare un'immagine aggiuntiva subito dopo con impostazioni di imaging più deboli (foro stenopeico più piccolo o potenza laser più debole).
    3. Immagina l'embrione ogni 3-5 min per tracciare la migrazione delle singole cellule attraverso diversi punti temporali. Per questo lavoro, le immagini erano z-stack (spesso 50 m) dell'intera area elettropostata, più un po 'di spazio in più verso il fondo della z-stack nel caso in cui l'embrione sprofondi nel letto agarose per tutta la sessione di imaging.
    4. Osservare la velocità di movimento delle celle controllando i primi punti temporali del primo filmato. Se le celle si muovono rapidamente (il che significa che usciranno dall'area dell'area dell'immagine entro un altro punto temporale), è consigliabile espandere lo zoom dell'area di immagine (1x à 0.8x) o l'imaging di un'area diversa.
      NOT: Le regioni embrionali dell'area pellucida si muovono molto più rapidamente di quelle dell'opaca. Inoltre, gli embrioni più giovani (HH3, HH5) spesso contengono cellule che stanno subendo un movimento più rapido rispetto agli embrioni più vecchi (>HH7).
    5. Dopo aver creato l'imaging della regione elettroponata dell'embrione, immaginare una regione non elettroponata dello stesso embrione per determinare i livelli di autofluorescenza (dovrebbe essere minimo se si usa l'embrione a bassa potenza laser).

6. Recupero di fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP) per testare l'integrità dell'mRNA

NOT: Un assaggio di fluorescenza in vivo dopo il fotobleaching (FRAP) può essere utilizzato per determinare per quanto tempo l'mRNA transinfezione potrebbe essere tradotto in FP. Il seguente protocollo descrive un esperimento FRAP per rilevare l'emivita di H2B. MRNA di citrino in un embrione elettropotato.

  1. Eseguire esperimenti FRAP sul microscopio confocale invertito utilizzando un obiettivo 20x 0.8 NA e un foro stenopeico completamente aperto.
    1. Dopo aver confermato l'elettroporazione di H2B-Citrine sullo stereomicroscopio e aver impostato l'embrione sullo stadio preriscaldato sul microscopio confocale invertito (vedi passo 5.2.4), fotobleach la maggior parte della fluorescenza cellulare da H2B-Citrine in una varietà di tempo punti (45 min, 2 h e 5 h dopo l'elettroporazione) utilizzando il laser da 405 nm con 70% di potenza laser, 100 iterazioni, velocità di scansione 4, che lascia solo il 5% della fluorescenza rimanente.
      NOT: Questo processo dovrebbe richiedere un paio di minuti.
    2. Continuare a incubare gli embrioni sullo stage a 36 gradi centigradi dopo la fotosbiancatura.
  2. Assicurati di prestare attenzione alla divisione attiva delle cellule all'interno della regione fotosbiancata, che indicano che le cellule fotosbiancate non sono completamente morte dopo il trattamento.
  3. Acquisire immagini post-candeggina (z-stack s della regione elettropoterata) per un massimo di 30 min a intervalli di tempo regolari (3 o 5 min) utilizzando il microscopio confocale.
    NOT: Se disponibile, utilizzare una linea Transgenica H2B-XFP come controllo positivo per garantire la sopravvivenza delle cellule nella regione fotosbiancata. Il tasso di recupero della fluorescenza per l'FP codificato dall'mRNA elettroporate dovrebbe diminuire, ma che per l'FP codificato tramite transgene dovrebbe rimanere costante per tutto il film.
  4. Per garantire che le condizioni di imaging non influenzino deleteriamente la sopravvivenza degli embrioni, incubare contemporaneamente embrioni elettroporate non fotofalati, che possono fungere da controllo per l'imaging.
  5. Per quantificare i risultati della fotobleachazione per il decadimento dell'mRNA dopo l'elettroporazione, tracciare la fluorescenza cellulare nel tempo (3 o 5 min) misurando l'intensità di fluorescenza del centro (un cerchio di 7,5 m) di ogni cellula utilizzando ImageJ. Misurare questo per tutte le cellule all'interno della regione fotosbiancata che non sono sottoposte a mitosi e sono stati completamente fotosbiancati.
    NOT: Considerare l'omissione delle cellule mitotiche dalla quantificazione poiché i nuclei mitotici hanno una fluorescenza più forte rispetto ai nuclei interfase a causa della condensa della cromatina.
  6. Tracciare l'intensità della fluorescenza nel tempo post-candeggina in una varietà di punti temporali (45 min, 2 h, e 5 h).

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Representative Results

L'elettroporazione dell'mRNA è più efficiente dell'elettroporazione del DNA

Abbiamo usato il pCS2. H2B-Citrine per preparare mRNA trascritto in vitro. Dal momento che l'elettroporazione del DNA viene di solito eseguita a 1-2 g/L, abbiamo usato una concentrazione equimolare di mRNA (calcolata intorno a 0,25-0,5 g/l per H2B-Citrine) per l'elettroporazione dell'mRNA. Per prima cosa abbiamo testato l'efficienza dell'elettroporazione del pCS2. DNA H2B-Citrine rispetto all'mRNA H2B-Citrine (in vitro trascritto dal promotore SP6 di pCS2. H2B-Citrine) elettroporrete DNA o mRNA separatamente in embrioni di quaglia HH5 e esaminando l'efficienza dell'elettroporazione a 12 ore dopo l'elettroporazione. Sebbene l'elettroporazione del DNA porti a una fluorescenza più luminosa in alcune cellule elettroporate, l'efficienza dell'elettroporazione del DNA è stata visibilmente inferiore rispetto agli FP codificati mRNA ampiamente espressi (Figura 2A e B).

Per tenere conto della variabilità intrinseca tra embrioni nel protocollo di elettroporazione, una combinazione equimolare della codifica mRNA H2B-Citrino e del DNA che esprime H2B-mKate2 è stata elettromorata nell'ectoderma degli embrioni HH5 e osservata in 12 h post-elettroporazione. Confrontando la co-elettroporazione del DNA e mRNA nello stesso embrione, il DNA che esprimeva FP era significativamente e costantemente meno efficiente di quello dell'mRNA (Figura 2C). Quantificando tutti gli embrioni elettropoturati solo con mRNA, DNA o una combinazione dei due, abbiamo scoperto che l'mRNA traffects -75% delle cellule in una determinata regione, mentre il DNA trasfeca solo il 25% delle cellule in una determinata regione (Figura 2D). La diffusione nell'espressione di proteine fluorescenti codificate da mRNA o DNA non era significativamente diversa in tutti gli embrioni coelettrodati (Figura 2E).

L'espressione proteica è più veloce nell'elettroporazione dell'mRNA rispetto all'elettroporazione del DNA

L'mRNA transinfetto dovrebbe portare a una produzione proteica più veloce in quanto può essere immediatamente riconosciuto dai macchinari di traduzione citosolica come si vede nella Figura 3. Il DNA deve essere traslocato nel nucleo, trascritto e l'mRNA trasportato al citosolo dove è riconosciuto dai macchinari di traduzione citosolica, che dovrebbero richiedere più tempo. Per confrontare direttamente l'mRNA e i tassi di espressione del DNA della produzione di proteine, abbiamo effettuato una serie di esperimenti di analisi temporale in cui abbiamo co-elettroporate una combinazione equimolare di DNA (pCMV.H2B-mKate2) e mRNA (H2B-Citrine) nell'ectoderm degli embrioni HH5. Abbiamo rilevato un'espressione FP codificata in mRNA circa 22 min dopo l'elettroporazione, che continua ad aumentare in intensità di fluorescenza relativa per 6 h (Figura3A-E, Supplemento. Filmato S1b). Al contrario, l'espressione FP con codifica del DNA è vista per la prima volta a 1,5 h dopo l'elettroporazione (Figura3A'-E', Supplemento. Filmato S1c) e continua ad aumentare di luminosità fino a 6 h quando il filmato è stato interrotto. Poiché le cellule elettroporate del DNA erano sature del marchio 6 h, abbiamo riimmaginato questa condizione con condizioni di imaging più deboli (Figura 3F-F''). In tutti i punti temporali di questo lasso di tempo (da 22 a 6 h), i transfetti di mRNA sono diverse volte più cellule del DNA (Supplemento. Film S1a, l'efficienza totale di elettroporazione attraverso brightfield e DAPI non sono mostrati perché queste immagini sono prese da un time-lapse di un embrione di quaglia di tipo selvatico). Sulla base di questo, concludiamo che l'elettroporazione dell'mRNA porta a proteine espresse in precedenza.

La co-elettroporazione di più mRNA è altamente efficiente

Successivamente, abbiamo cercato di testare ulteriormente l'efficienza dell'elettroporazione dell'mRNA elettroporando più mRNA in una regione di interesse. La coelettroporazione di DNA multipli aveva dimostrato in precedenza di essere relativamente inefficiente, mostrando che il numero di multi-etichettati era 25%, 14% e 10% per 2, 3 e 4 costrutti di DNA elettroporate, calcolato in proporzione al numero totale di cellule11 . Per prime abbiamo elettroporate due mRNA che codificano FP spettrali distinti (Turquoise2-Golgi/H2B-Citrine) in embrioni HH5 e ottenuto un'elevata efficienza trasfection in tutte le regioni elettroporate. Abbiamo usato questa doppia elettroporazione per catturare filmati di espansione radiale tra l'area pellucida e l'opaca in un embrione gastrulante HH4, immaginato 2 h post-elettroporazione (Supplemental Movie S2a, b, e c). L'H2B-Citrine è localizzato all'interno del nucleo cellulare e permette di tracciare la proliferazione cellulare27. Il Turquoise2-Golgi FP sembra mostrare la polarità subcellulare all'interno delle cellule embrionali, ma non sembra correlare con la velocità o la direzione delle cellule ectodermi in movimento in vivo28. Questo filmato (Supplemental Movie S2) mostra che le cellule elettroporate con più mRNA possono continuare la normale attività cellulare senza alcun difetti apparente.

Inoltre, la co-elettroporazione di 4 mRNA - Turquoise2-Golgi (per visualizzare l'apparato Golgi), LifeAct-eGFP (per visualizzare F-actin), H2B-Citrine (per visualizzare il nucleo), e membrana-Cherry FP (per visualizzare le membrane) - ha provocato 87% trasfection l'efficienza di tutti e 4 i mRNA in tutte le regioni elettroporate (Figura 4). LifeAct-EGFP e H2B-Citrine sono stati separati dallo strumento di elaborazione lineare di smiscelazione nel software commerciale.

L'analisi fRAP mostra la rapida degradazione dell'mRNA elettroporate durante le prime due ore dopo l'elettroporazione.

È risaputo che gli mRNA nudi sono rapidamente degradati dalle RNAases.l.m. Abbiamo postulato che l'elettroporazione dell'mRNA potrebbe essere utile per esperimenti di perdita o di guadagno di funzione, consentendo un'espressione rapida ed efficiente delle proteine in un embrione in via di sviluppo. Pertanto, sarebbe utile quantificare il tasso di decadimento dell'mRNA dopo l'elettroporazione dell'mRNA, poiché l'mRNA si degrada più velocemente del DNA nelle cellule. Nei precedenti rapporti sull'elettroporazione dell'mRNA nelle cellule staminali staminali neurali dei topi adulti, circa l'80% dell'mRNA è stato identificato 2 h dopo l'elettroporazione da qRT-PCR, ma poco o nessun mRNA è stato rilevato da 24 h dopo l'elettroporazione15. Abbiamo cercato di quantificare ulteriormente l'espressione dell'mRNA dopo l'elettroporazione progettando un saggio FRAP in vivo per rilevare i livelli di mRNA nelle cellule elettropose.

Il fotosbiancamento è la distruzione irreversibile del fluoroforo che può verificarsi quando il fluoroforo (proteine fluorescenti nel nostro caso) è in uno stato eccitato, che elimina la fluorescenza durante l'osservazione30,31. Qualsiasi luce emessa da proteine fluorescenti (FP) che può essere rilevata nelle cellule fotosbiancate al di sopra dei livelli di base dovrebbe, pertanto, rappresentare i nuovi FP codificati da maRNA intatti e trasfettati. Pertanto, abbiamo cercato di fotobleach le cellule elettroporate per eliminare tutta la fluorescenza derivata da FP esistente in una varietà di punti temporali e monitorare il successivo recupero di fluorescenza.

Utilizzando impostazioni di fotobleaching ottimizzate come descritto nella sezione del protocollo, abbiamo scoperto che il fotobleaching inizialmente riduce l'intensità della fluorescenza in tutte le celle fotosbiancate del 95% quando viene analizzato immediatamente dopo l'evento di fotosbiancatura. Questo è stato fatto a 45 min, 2 h, e 5 h post-elettroporazione (Figura 5A-C). Il recupero della fluorescenza in ogni cella all'interno della regione fotosbiancata è stato monitorato per un periodo di tempo di 30 min dopo la fotobleaching in ogni momento mediante l'imaging della stessa regione a intervalli di tempo regolari (3 o 5 min). I nostri dati suggeriscono che c'è una diminuzione significativa dei livelli di mRNA trasettati tra 45 min e 5 h dopo l'elettroporazione. Ciò è dimostrato dalla grande diminuzione dell'FRAP misurata a 5 h rispetto a45 min dopo l'elettroporazione. Per evidenziare il recupero della fluorescenza nelle celle sbiancate soprattutto nel punto di tempo 5 h, abbiamo migliorato la luminosità in Figura 5A-C utilizzando lo strumento luminosità / contrasto in ImageJ e mostrare queste immagini modificate in Figura 5D-F. È interessante notare che c'è una grande eterogeneità nel recupero della fluorescenza da cellula a cella all'interno dell'area fotosbiancata a 2 h perché alcune cellule recuperano la fluorescenza più velocemente di altre cellule (Figura5E', vedi puntedi freccia ). Tuttavia, tutte le cellule all'interno dell'area fotosbiancata 5 h recuperano la fluorescenza più lenta (Figura 5F'') rispetto alle cellule fotosbiancate a 2 h. Rileviamo anche attivamente le cellule che si dividono all'interno della nostra regione fotosbiancata, suggerendo che le cellule non sono morte a causa del processo di fotosbiancamento (Figura5E').

Quantifichiamo questi risultati nella Figura 6A mostrando l'intensità del segnale normalizzata di ogni cella all'interno delle aree fotosbiancate per un periodo di 30 minuti dopo l'evento di fotobleaching. Per ogni cellula, i valori di fluorescenza sono stati normalizzati rispetto all'intensità del segnale di quella cella immediatamente dopo il fotosbiancamento. Questa normalizzazione è stata fatta per tutte le celle in tutti i punti temporali immagine (45 min, 2 h, 5 h). I valori normalizzati di recupero della fluorescenza delle cellule all'interno della stessa regione foto sbiancata sono stati poi raggruppati e rappresentati nel tempo dopo l'evento di fotosbiancamento; pertanto, ogni punto del grafico rappresenta 35 celle. I dati non normalizzati sono mostrati anche nella figura 6B, in cui ogni linea rappresenta una cella con intensità del segnale di fluorescenza recuperante immediatamente dopo la fotobleaching. Questi dati nel complesso suggeriscono che per 5 h, tutte le cellule hanno esaurito la maggior parte del loro mRNA, con una grande porzione di questa goccia che si verifica tra 45 min e 2 h post-elettroporazione.

Figure 1
Figura 1: Schematico della procedura di clonazione per la creazione di costrutto pCS2-LifeAct-eGFP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: l'elettroporazione dell'mRNA è più efficiente dell'elettroporazione del DNA. (A-A'') Il DNA che esprime pCS2.H2B-Citrine è stato elettroporate nell'ectodermo degli embrioni HH5. La fluorescenza è stata osservata 12 h dopo l'elettroporazione. L'mRNA che esprimevaH2B-Citrine è stato elettropozzato nell'ectoderma degli embrioni HH5. La fluorescenza è stata osservata 12 ore dopo l'elettroporazione. La barra di scala : 50 m.(C-C'') Combinazione di equimolar di DNA (pCMV.H2B-mKate2) e mRNA (H2B-Citrine) è stata elettrostata in embrioni HH5 e osservata 12 h dopo l'elettroporazione. Sono stati testati tre embrioni per condizione (n - 2 esperimenti). La barra di scala (50 m. (D ) Sono stati quantificati tre embrioni di A, B e C (9 embrioni totali) per l'efficienza dell'elettroporazione utilizzando lo strumento di analisi delle particelle su ImageJ. È stata quantificata una regione di 200 m per ogni embrione (sono state contate almeno 150 cellule per regione). Il trattino medio rappresenta la media, mentre le barre superiore e inferiore rappresentano la deviazione standard dalla media. (E) Vengono analizzati tre embrioni coelettromratati (DNA e mRNA) per la diffusione del segnale in tutte le cellule elettroporate in una determinata regione di 200 m. Ogni embrione aveva circa 100 cellule positive per l'elettroporazione dell'mRNA e 30 cellule positive per l'elettroporazione del DNA. Il trattino medio rappresenta la media, mentre le barre superiore e inferiore rappresentano la deviazione standard dalla media. Non c'è differenza significativa tra la diffusione dell'mRNA e l'elettroporazione del DNA, ma l'elettroporazione dell'mRNA è molto più efficiente di quella del DNA. (A-C) Dimensioni : 425,10 x 425,10 x 55 m. Bit per pixel: 16. Metadati al microscopio: microscopio confocale invertito, obiettivo 20x (vedi Tabella deimateriali) (A) Es. 488 nm (0,05%), Emissione Traccia S1 - 508-579 nm; (B) Es. 488 nm (5,0%), Emissioni Traccia S1 - 508-579 nm; (C) Es. - 488 nm (5,0%), 561 nm (5,0%), Emission Track S1 - 508-579 nm; S2 - 606-695 nm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: elettroporazione dell'mRNA mostra l'espressione di 22 min dopo l'elettroporazione ed è molto più veloce dell'elettroporazione del DNA. Immagini rappresentative del corso temporale dopo l'elettroporazione di mRNA (H2B-Citrine) e DNA (pCMV.H2B-mKate2) con analisi del profilo di trama a 22 min (A-A''), 45 min (B-B''), 1,5 h (C-C''), 3 h (D-D')e 6 h (E-E')a l'inizio dell'imaging (n e 1). L'analisi del profilo di stampa viene fornita per ogni punto temporale visualizzato sulla freccia disegnata nell'immagine unita. Ogni picco nel profilo di trama rappresenta il nucleo di una cellula elettroporata. Le cellule generalmente diventano più luminose nell'intervallo di 6 h del film, indicando che l'mRNA è ancora tradotto in una nuova proteina fluorescente. Per il periodo di 6 ore, le immagini della stessa regione catturate utilizzando condizioni di imaging identiche (E-E'') e condizioni di imaging più deboli (F-F'') sono mostrate perché le immagini delle cellule elettroporate del DNA erano altamente sature utilizzando l'iniziale condizioni di imaging. Barra di scala: 20 m. Dimensioni: 425,10 x 425,10 x 55 m. Immagine viene visualizzata come proiezione di intensità massima in tutti i punti temporali immagine. Pixel abitano 2,55 s. Linea media 4. Bit per pixel: 16. Metadati al microscopio: microscopio confocale invertito, obiettivo 20x (vedi Tabella deimateriali) Ex - 488 nm (15%), 594 nm (5,0%) per l'iniziale; Ecc. 488 nm (7,5%), 594 nm (0,5%) per l'ultimo momento (Figura 2F), Emission Track S1 - 499-562 nm; S2 - 605-661 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: La coelettroporazione di quattro mRNA mirati a diverse strutture subcellulari è altamente efficiente. L'ectodermo di un embrione HH3 è stato elettroporate con mRNA che codificano mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine e membrana-Cherry. L'embrione è stato fissato e immagine a 4 ore dopo l'elettroporazione. La maggior parte delle cellule sono elettroporate all'interno della regione bersaglio dell'elettrodo con tutti e quattro i mRNA (87%). Sono stati mostrati dati rappresentativi (3 embrioni ciascuno, n e 2 esperimenti). Barra della scala ( 50 m. (A) Unire tutti e quattro i mRNA (mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine e membrana-Cherry). (B) Solo il canale H2B-Citrine (Es. 488 nm (0,7%), Em - 455-499 nm). (C) Solo canale mTurquoise2-Golgi (Es. 458 nm (22,0%), Em - 455-499 nm). (D) Unire H2B-Citrine e mTurquoise2-Golgi mostra che Golgi avvolge un lato del nucleo nella maggior parte delle cellule. (E) Solo canale LifeAct-eGFP (Es. 488 nm (0,7%), Em: 455-499 nm). (F) Solo canale membrana-ciliegia (Es. 594 nm (37,1%), Em : S2: 570-695 nm). (G) Unisci LifeAct-eGFP e membrana-Cherry mostra sovrapposizione nella maggior parte delle cellule. Dimensioni: 425,10 x 425,10. Pixel abitano 1,58 s. Linea media 4. Bit per pixel: 16. Metadati al microscopio: microscopio confocale invertito, obiettivo 20x (vedere Tabella dei materiali) Ex , 405 nm (2,4%), 458 nm (22,0%), 488 nm (0,7%), 594 nm (37,1%), Emissione Traccia S1 - 455-499; S2 - 570-695 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Il saggio di fotosbiancamento mostra una rapida degradazione dell'mRNA elettroporate durante le prime cinque ore successive all'elettroporazione. Il fotosbiancamento di una regione di 100 m2 contenente cellule elettroporate con mRNA che esprime H2B-Citrine viene eseguito a 45 min, 2 h e 5 h dopo l'elettroporazione. L'embrione è stato fotografato a intervalli di tempo regolari dopo il fotosbleaching (3 o 5 min). Le condizioni di fotosbiancatura sono le seguenti: 70% 405 nm laser, 100 iterazioni, circa 5 min durata per l'intera regione. Barra della scala 50 - M. (A-A'') 45 min pre e post-candeggina. B mostra l'embrione immediatamente dopo il fotosbleaching e C mostra l'embrione 30 min post candeggina. Barra della scala: 50 m. (B-B'') 2 h pre e post candeggina. Il perimetro del quadrato viene spostato perché le celle all'interno della regione fotosbiancata si sono spostate leggermente durante il periodo di candeggina. (C-C'') 5 h pre e post-candeggina. (D-D'' ) Stesse immagini di A-A'' con luminosità migliorata (valore massimo regolato a 11550 per migliorare la luminosità post-raccolta). (E-E'') Stesse immagini di B-B'' con luminosità migliorata (valore massimo regolato a 11550 per migliorare la luminosità post-raccolta). Le punte di freccia bianche indicano le celle con un recupero a fluorescenza più elevato rispetto alle celle circostanti. La punta della freccia ciano indica una cella fotosbiancata che ha recentemente subito la mitosi. (F-F'') Stesse immagini di C-C'' con maggiore luminosità (valore massimo regolato a 11550 per migliorare la luminosità post-raccolta). Dimensioni : 425,10 x 425,10 x 42 m. L'immagine viene visualizzata come proiezione di intensità massima in tutti i punti temporali immagine. Pixel abitano 1,58 s. Linea media 4. Bit per pixel: 16. Metadati al microscopio - microscopio confocale invertito, obiettivo 20x (vedere Tabella dei materiali) Ex - 488nm (1,5%), Emission Track S1 - 508-553 nm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Quantificazione del recupero della fluorescenza nelle cellule fotosbiancate. (A) L'intensità di fluorescenza di tutte le cellule all'interno delle regioni sbiancate (cellule sbiancate) è stata tracciata per ogni singola cellula durante ogni periodo di tempo post-candeggina. C'è un grande calo della velocità di intensità del segnale recuperato da 45 min a 2 h, seguito da una diminuzione minore da 2 h a 5 h. Viene visualizzata la barra di errore superiore per ogni punto, che rappresenta la deviazione standard dalla media. La linea mostrata è una retta di regressione lineare. R2 per 45 min, 2 h e 5 h è rispettivamente 0,83, 0,58 e 0,84. La metà superiore della barra di errore viene visualizzata per ogni punto. (B) L'intensità di fluorescenza di tutte le cellule all'interno delle regioni sbiancate (35 celle sbiancate) è stata tracciata per ogni singola cella durante ogni periodo di tempo post-candeggina e rappresentata graficamente senza normalizzazione. C'è un grande calo della velocità di intensità del segnale recuperato da 45 min a 2 h, seguito da un calo minore da 2 h a 5 h. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Film supplementare 1: elettroporazione mRNA porta ad un'espressione proteica precedente rispetto all'elettroporazione del DNA. MRNA H2B-Citrino e DNA H2B-mKate2 elettropostati nell'ectoderma dell'embrione HH5. La regione immagine è al confine del tessuto extraembrionale ed embrionale. Barra di scala : 50 m.(a) Sia il canale H2B-Citrine che il canale H2B-mKate2 mostrati (Es. 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), Em: 499-562 nm; S2: 605-661 nm). (b) Mostrata solo mRNA H2B-Citrine del canale (Es. 488 nm (15%), Em - 499-562 nm). (c) Viene visualizzato solo il canale DNA H2B-mKate2 (Es. 594 nm (5,0%), Em - 605-661 nm). Dimensioni : 850,19 x 850,19 x 110 m. L'immagine viene visualizzata come proiezione di intensità massima in tutti i punti temporali immagine. Pixel abitano 2,55 s. Linea media 4. Bit per pixel: 16. Metadati al microscopio: microscopio confocale invertito, obiettivo 20x (vedere Tabella deimateriali) Ex - 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), Emission Track S1 - 499-562 nm; S2 - 605-661 nm. Fare clic qui per scaricare questo file.

Film supplementare 2: La co-elettroporazione dei mRNA permette di studiare dinamicamente comportamenti cellulari distinti. L'espansione radiale delle cellule tra il confine embrionale ed extraembrionale è elettropolizzata con mRNA (H2B-Citrine e mTurquoise2-Golgi) e immagini durante la migrazione verso l'esterno. Questo filmato è stato immaginato da microscopia confocale da 2 a 5 h dopo l'elettroporazione mediante imaging ogni 6 min.  (a) Sia i canali H2B-Citrine che mTurquoise2-Golgi mostrati (Es. 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), Em - 446-526 nm; S2: 508-553 nm). (b) Solo il canale H2B-Citrine mostrato (Es. 488 nm (5,0%), Em - S2: 508-553 nm). (c) Solo il canale mTurquoise2-Golgi mostrato (Es. 458 nm (28%), Em - 446-526 nm). Dimensioni : 425,10 x 425,10 x 32,5 m. L'immagine viene visualizzata come proiezione di intensità massima in tutti i punti temporali immagine. Pixel abitano 0,79 s. Linea media 4. Bit per pixel: 16. Metadati al microscopio: microscopio confocale invertito, obiettivo 20x (vedere Tabella deimateriali) Ex - 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), Emission Track S1 - 446-526 nm; S2 - 508-553 nm. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

In questo protocollo, abbiamo fornito istruzioni passo dopo passo su come microiniettare ed elettroporate precisamente l'mRNA nelle cellule degli embrioni di quaglia gastrulanti. Abbiamo dimostrato che l'elettroporazione dell'mRNA in vitro sintetizzata consente un'espressione rapida ed efficiente delle proteine fluorescenti (FP) negli embrioni di quaglia gastrulanti (Figura 2 e 3). La fluorescenza dalla proteina H2B-citriga tradotta da mRNA elettroporati potrebbe essere rilevata mediante microscopia confocale entro 20 minuti e aumentata nella fluorescenza dell'FP per ore (Figura 3, Film supplementare1). Questo è sorprendentemente veloce e vicino al presunto tempo di maturazione per citrino32,33. Gli FP espressi dai vettori del DNA sono stati rilevati dopo 2-3 h (Figura 3, Supplemento. Filmato 1), che è simile ai rapporti precedenti8,34,35. Vari FP hanno tempi di maturazione unici, quindi una pianificazione avanzata assicurerà che l'FP ideale sia scelto in termini di distinzione spettrale e cinetica di maturazione desiderata per l'esperimento. Inoltre, i mRNA sintetizzati in modo più efficiente co-transfett cellule embrionali rispetto ai vettori di DNA11. La maggiore efficienza di trasfezione comporta la trasinfezione di più celle nella regione di interesse con singoli (Figura 2) o con più popolazioni di mRNA (Figura 4).

La stabilità dell'mRNA è altamente regolamentata e può essere influenzata dalla poliamdenazione, dalla splicing, dalla traduzione, dalla struttura secondaria e dalle regioni non tradotte per citarne alcuni36,37. Le emivite dell'mRNA sia endogeno che sintetizzatoall'interno delle cellule possono variare da minuti a 36giorni,38. Abbiamo usato il recupero della fluorescenza in vivo dopo il fotobleaching (FRAP) per sbiancare le proteine H2B-citrire con codifica mRNA esistenti e abbiamo osservato il recupero di fluorescenza H2B-citrino più apprezzabile durante le prime 2 ore dopo l'elettroporazione (Figura 5 e 6). Diversi mRNA avranno indubbiamente emivite diverse in base alla loro lunghezza, sequenze interne, 5' e 3 ' modifiche36,37, quindi ciascuno deve essere sfornato se lo si desidera.

L'imaging vitale richiede in genere un compromesso tra le condizioni ottimali per l'imaging di alta qualità e l'imaging veloce e meno tossico39,40. Quando si fa l'imaging, si consiglia di utilizzare la potenza laser a bassa potenza possibile per ridurre al minimo il fotosbiancamento e il fotodanno alle cellule embrionali (vedere le note per il passaggio 5.3 del protocollo)40. L'alterazione dell'impostazione del microscopio per le raccolte veloci (ad esempio, velocità di scansione più elevate, riduzione della media) spesso può aiutare senza perdere la risoluzione dell'immagine necessaria41. Infine, occorre prestare attenzione alla manipolazione e alla manipolazione degli embrioni durante la raccolta, l'elettroporazione e l'imaging (vedere il punto 4). Gli embrioni in fase iniziale sono delicati e possono essere facilmente danneggiati.

Nel complesso, la tempistica precisa e la localizzazione accurata dell'elettroporazione dell'mRNA consentono esperimenti di perturbazione che sfruttano l'espressione rapida, l'efficienza della co-trasfezione e il rapido decadimento delle trascrizioni di mRNA. La sovraespressione o la mancata espressione di un gene di interesse può essere realizzata attraverso l'elettroporazione di mRNA sintetizzati. Il tintinnio della concentrazione per ogni mRNA è fondamentale, poiché l'elettroporrarating troppo mRNA può causare tossicità cellulare non specifica, mentre un mRNA troppo piccolo potrebbe non etichettare le cellule desiderate o indurre cambiamenti fenotipici in modo adeguato. Esiste già una pletora di vettori generati per la sintesi in vitro di mRNA che codificano i marcatori di fusioni FP per la visualizzazione o prodotti genici alterati per le perturbazioni di diversi processi biologici da vari sistemi di modelli animali. Molti di questi costrutti progettati per la sintesi in vitro dell'mRNA possono essere ottenuti rapidamente ed economicamente da depositi plasmid senza scopo di lucro.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Ringraziamo David Huss per informazioni utili su questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) e dalla USC Provost's Undergrad Research Fellowship a M.T., dal Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award a M.D., e dall'Università di Premio Del Southern California Undergraduate Research Associates Program a R.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

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References

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