Detectar el establecimiento de suministro de sangre compartido en ratones parabióticos mediante inyección de glucosa en vena caudal

Biology

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Summary

Aquí describimos un nuevo método para detectar el establecimiento exitoso de circulación sanguínea compartida de dos parabiontes a través de una inyección de glucosa en venas caudales, que causa un daño mínimo y no es mortal para los parabionts.

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Liu, X., Bai, X., Li, M., Li, H., Zhang, Y., Yang, B. Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection. J. Vis. Exp. (156), e60411, doi:10.3791/60411 (2020).

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Abstract

La parabiosis es un método experimental para combinar quirúrgicamente dos animales paralelos a lo largo del eje longitudinal del cuerpo. Presentamos un protocolo para detectar el establecimiento exitoso de chimerismo sanguíneo en parabionts mediante una inyección de glucosa en vena caudal. Se construyeron ratones parabióticos. La glucosa se inyectó en el ratón del donante a través de la vena de la cola, y la fluctuación del nivel de glucosa en sangre se midió en ambos ratones utilizando un glucómetro de la sangre en diferentes momentos. Nuestros resultados mostraron que después de la inyección de glucosa, el nivel de glucosa en sangre en ratones donantes aumentó bruscamente después de 1 min y disminuyó lentamente a partir de entonces. Mientras tanto, el nivel de glucosa en sangre de los ratones receptores alcanzó un pico de 15 minutos después de la inyección. Se obtuvieron resultados similares con Evans azul, utilizado como un control positivo para la glucosa. La fluctuación sincrónica de los niveles de glucosa en sangre indica que el flujo sanguíneo entre los dos ratones se estableció con éxito.

Introduction

La parabiosis es un método de modelado en el que dos organismos vivos se unen quirúrgicamente y se desarrollan como un único sistema fisiológico con un sistema circulatorio compartido1. Estos modelos se han utilizado ampliamente para estudiar la fisiología debido a la ventaja de que las sustancias producidas por un solo individuo pueden actuar sobre ambos animales al mismo tiempo a través del sistema circulatorio compartido. Desde mediados de la década de 1800, cuando los experimentos parabóticos fueron pioneros por Paul Bert2,los métodos para construir modelos parabióticos se han estandarizado. Sin embargo, ha faltado un método sencillo y conveniente para verificar el establecimiento exitoso del chimerismo sanguíneo. Se ha informado de que la circulación cruzada puede evaluarse con éxito inyectando por vía intraperitoneal un 0,5% de tinte azul Evans en uno de los parabiontes seguido de la medición de la absorbancia del azul evans en la sangre de ambos parabionts con un lector de microplacas3. Otro método requiere una raza de ratón específica que contenga CD45.1+- y CD45.2+ -etiquetadamonsen cada parabiont. La citometría celular se utiliza para determinar el cinismo sanguíneo midiendo la frecuencia de los dos marcadores en monocitos del bazo o la sangre4. Sin embargo, estos métodos son a menudo letales o engorrosos para los animales, y un método seguro y simple para la verificación rápida y confiable de los modelos parabióticos es altamente deseable. En este estudio, establecimos un nuevo método para este propósito, que fue validado en un modelo de ratón de parabiosis. La concentración de glucosa en muestras de sangre extraídas de una vena de cola se mide utilizando un glucómetro, y el patrón de cambios en el nivel de glucosa en ratones donantes y receptores se considera una indicación del chimerismo de circulación. Nombramos a este método el "método de fluctuación de glucosa". La aplicación de este método de validación no se limita a los ratones, sino que podría extenderse a diversos modelos patológicos, excepto aquellos con desregulación grave del metabolismo de la glucosa. El procedimiento es simple, ahorra tiempo y es seguro.

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Protocol

Todos los procedimientos relacionados con los animales y su cuidado fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Harbin.

NOTA: Las herramientas y equipos necesarios para el método se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparación de materiales y animales

  1. Pedir ratones macho C57BL/6 con peso entre 20 g-25 g de un proveedor de animales de laboratorio estándar.
  2. Casar a los ratones en un ciclo de 12 h de luz: 12 h de oscuridad a 24 o 26 oC con acceso ad libitum al agua y a los alimentos.

2. Parabiosis

  1. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol a una concentración de 0,1 mL/10 g. Confirmar la anestesia adecuada según lo indicado por la relajación muscular, la respiración lenta y constante, la pérdida del reflejo de estimulación cutánea y la desaparición del reflejo corneal.
  2. Aplique pomada oftálmica con una punta Q para prevenir los ojos secos.
  3. Realice el procedimiento de parabiosis como se describió anteriormente5.
    1. Coloque los ratones en posición supina. Afeitar a fondo el lado izquierdo de un ratón y el lado derecho del otro ratón comenzando aproximadamente 1 cm por encima del codo a 1 cm por debajo de la rodilla con una afeitadora eléctrica. Usa crema depilatoria para limpiar totalmente el pelaje de la piel asecada.
    2. Limpie las áreas afeitadas con yodoforo. Coloque los ratones en una almohadilla calentada cubierta por una almohadilla estéril.
    3. Crea incisiones longitudinales de la piel a partir de 0,5 cm por encima del codo hasta 0,5 cm por debajo de la articulación de la rodilla usando un par de tijeras afiladas en el lado afeitado de cada animal.
    4. Separe suavemente la piel de la fascia subcutánea después de la incisión.
    5. Conecta el olecranon y la rodilla del parabiont con una sutura 3-0.
    6. Sutura la piel arasada con una sutura continua de 5-0.
  4. Inyectar 0,5 ml de 0,9% de NaCl por vía subcutánea a cada ratón para evitar la deshidratación.
  5. Inyectar tramadol (10 mg/25 g/día) por vía intramuscular a cada ratón para aliviar el dolor.

3. Validación del chimerismo circulante

  1. Método de fluctuación de glucosa
    NOTA: Verifique la construcción exitosa del chimerismo de circulación entre parabiontes utilizando el método de fluctuación de glucosa (sin ayuno) el día 10 después de la cirugía de parabiosis.
    1. Anestetizar los parabiontes mediante inyección intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol a cada ratón a una concentración de 0,1 ml/10 g.
    2. Fije los ratones donantes en un fijador de cola de ratón visual Veous.
    3. Frota las venas caudales en el flanco de una de las colas del parabiont con una bola de algodón empapada en 70-75% de alcohol para limpiar la cola y dilatar los vasos sanguíneos.
    4. Sostenga una jeringa de 1,0 ml que contenga glucosa en la mano derecha y mantenga la aguja paralela a la vena (menos de 15o).
    5. Inserte la aguja en una posición de aproximadamente 2 x 4 cm de la punta de la cola.
    6. Inyectar 100 ml de glucosa (1,2 g/kg) en el donante en un plazo de 10 s.
      NOTA: El término donante se refiere al parabionte que recibe la inyección de glucosa a través de la vena de la cola. El receptor es el otro parabionte, que no recibe glucosa directamente.
    7. Limpie los dedos de los dedos de los dedos de los dedos con iodophor. Cortar los dedos de los dos del dono y los ratones receptores con una tijera y recoger una gota de sangre en diferentes puntos de tiempo después de la inyección de glucosa (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, y 60 min). Retire el coágulo de sangre en cada punto de tiempo de recolección para evitar más daños.
      NOTA: El volumen de sangre recolectada fue de 10-25 ul para una prueba, y 90-225 ul en total.
    8. Incoar la sangre en el centro de las tiras reactivas del glucómetro para la detección del nivel de glucosa.
  2. Usa la contramancha azul de Evan como control positivo3.
    1. Inyectar 200 ml de contramancha azul de Evan al 0,5% de la contramancha azul de Evan por vía intraperitoneal en el ratón del donante.
    2. 2 h más tarde, eutanasia los parabiontes mediante inyección intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol a cada ratón a una concentración de 0,2 ml/10 g, y recoger sangre de ambos parabiontes por punción cardíaca.
    3. Centrifugar las muestras de sangre a 916 x g durante 15 min.
    4. Recoge el suero del sobrenadante.
    5. Diluir el suero con 0,9% de NaCl a la 1:50.
    6. Mida la absorbancia de las muestras de suero diluidas a 620 nm con un espectrofotómetro.

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Representative Results

En seis ratones donantes, los niveles de glucosa en sangre aumentaron bruscamente a 26,5 émol/L (aumento del 173%) a un promedio de 1 min después de la inyección de 100 ml de glucosa (1,2 g/kg) a través de la vena de la cola y luego disminuyeron gradualmente a 13,3 mol/L a los 60 min. En ratones receptores, la glucosa en sangre aumentó lentamente después de la inyección y alcanzó el primer nivel máximo a 15 min (47% de aumento, 12,2 mol/L). Sobre la base de los resultados anteriores, el estándar para el chimerismo de circulación se estableció de la siguiente manera: 1) un fuerte aumento en el nivel de glucosa en sangre (un aumento mínimo del 100% o >20 émol/L) en ratones donantes dentro de 1 min después de la inyección de glucosa, y 2) un aumento significativo en el nivel de glucosa en sangre en ratones receptores 15 min después de la inyección (un aumento mínimo del 37%)(Figura 1).

La concentración de evans tinte azul en el suero de parabionts también indicó la construcción exitosa del chimerismo de circulación (Figura 2). Eutanasiamos los parabiontes después de la medición de glucosa en sangre usando 5,2,2-tribromoetanol (20 g/L). Se observaron claramente las uniones vasculares subcutáneas entre los parabiontes(Figura 3).

La Figura Suplementaria 1 muestra que los ratones donantes tuvieron un aumento significativo del nivel de glucosa en sangre 1 min después de la inyección de glucosa, mientras que el nivel de glucosa en sangre de los ratones receptores no fue elevado, lo que demostró que el chimerismo de circulación en parabionts no se estableció con éxito 1 día después de la cirugía de parabiosis. Del mismo modo, el nivel de OD en sangre en ratones receptores no fue tan elevado como el de los ratonesdonantes (Figura Suplementaria 2).

Basándonos en los resultados del método de fluctuación de glucosa, encontramos que dos pares de parabiontes no establecieron el chimerismo sanguíneo 15 días después de la cirugía de parabiosis. Como se muestra en la Tabla Suplementaria 1, los dos ratones receptores no tuvieron un aumento del nivel de glucosa en sangre dentro de los 60 minutos después de la inyección de glucosa en los ratones donantes. La concentración sanguínea de Evans azul en los dos receptores tampoco fue elevada(Tabla Suplementaria 2), lo que demostró que el método de fluctuación de glucosa era tan sensible como el método azul de Evans.

Por otra parte, para evaluar la influencia de la glucosa inyectada en el metabolismo de la insulina, detectamos el nivel de insulina en sangre 1 h y 3 h después de la inyección de 100 l de glucosa (1,2 g/kg) en ratones(Figura suplementaria 3). El nivel de insulina en sangre se redujo notablemente 1 h después de la inyección de glucosa debido al aumento rápido de la glucosa y se recuperó a niveles normales a 3 h. Estos resultados demostraron que los efectos de la glucosa que inyectamos en el metabolismo de la insulina eran restaurables.

Figure 1
Figura 1: Cambios del nivel de glucosa en sangre en parabionts después de la inyección de glucosa a través de la vena caudal. (A) Nivel de glucosa en sangre de ratones donantes. (B) Nivel de glucosa en sangre de ratones receptores (n.o 6). Los datos se presentan como la media de SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. 0 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La concentración de Evans azul en muestras séricas de parabionts medida por un lector de microplacas. Los datos se presentan como la media de SEM. ***p < 0,001 (n x 6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Generación de vasogangiones subcutáneos en la piel conectada entre los parabiontes. Izquierda: Imagen representativa de los ratones parabiosis. Derecha: Una imagen representativa del vasoganglion subcutáneo entre los parabiontes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 1
Figura suplementaria 1: El nivel de glucosa en sangre de parabionts se analizó 1 día después de la cirugía de parabiosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 2
Figura suplementaria 2: La concentración de Evans azul medida por lector de microplacas en el suero de los parabiontes 1 día después de la cirugía de parabiosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 3
Figura complementaria 3: La concentración de insulina en el suero de los ratones después de la inyección de glucosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

0 min 5 min 15 min 20 min 40 min 60 min
Donante-1 5.7 26.2 21.2 17.6 16.9 15.4
Destinatario-1 6.7 5.8 5.9 6.2 5.2 5.4
Donante-2 8.4 25.5 21.1 20.5 17.4 13.8
Destinatario-2 6.7 5.8 5.9 6.2 5.2 5.4

Cuadro Suplementario 1: Nivel de glucosa en sangre (mómol/L) en parabiontes 15 días después de la cirugía de parabiosis.

Control-1 Donante-1 Destinatario-1 Control-2 Donante-2 Destinatario-2
Valor OD 0.059 0.935 0.062 0.068 0.862 0.073

Cuadro Suplementario 2: Concentración sanguínea de Evans azul (valor OD) en parabiontes 15 días después de la cirugía de parabiosis.

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Discussion

La parabiosis se refiere a la técnica quirúrgica de conectar dos animales vivos para establecer un sistema vascular común por medios experimentales6,7,8. La ventaja de este modelo es que las sustancias producidas por un solo individuo pueden actuar sobre ambos animales al mismo tiempo. Por lo tanto, el modelo de parabiosis se puede utilizar para explorar el papel de una sustancia o factor en una enfermedad relacionada, produciendo muchas conclusiones significativas e innovadoras. En vista de su gran valor de aplicación, el modelo ha aportado una mejor comprensión de las enfermedades del sistema cardiovascular8,9,10,11,12,13, trastornos del sistema nervioso14,15, trasplante de órganos16, y diabetes17,18.

Sin embargo, la verificación del establecimiento exitoso del chimerismo de circulación es el primer paso determinante para los estudios con parabiosis. Estudios actuales han reportado algunos métodos para detectar el chimerismo circulante. 4informaron que el cinismo sanguíneo se confirmó en pares parabióticos midiendo la frecuencia mixta de monocitos en el bazo con diferentes marcadores etiquetados en los ratones donante (CD45.1+) y receptor (CD45.2+). En este método, se utilizaron ratones específicos con CD45.1+- o CD45.2+ monocitosetiquetados para cada parabiont para la parabiosis. Se necesitaba citometría celular para determinar el cinismo sanguíneo midiendo la integración de las células sanguíneas marcadas. Además, Marta yotros 3 evaluaron la circulación cruzada inyectando por vía intraperitoneal 200 l de tinte azul Evans al 0,5% en uno de los parabiontes. La sangre de ambos parabiontes se recogió 2 h más tarde por punción cardíaca. El chimerismo sanguíneo se determinó por un aumento de la concentración azul de Evans en los ratones receptores, que fue probado por un lector de microplacas. Aunque estas estrategias nos permiten determinar el cinismo sanguíneo, todavía hay muchas limitaciones que no se pueden ignorar. En primer lugar, para los métodos letales, el chimerismo de sangre sólo puede ser confirmado en la ejecución. Sin embargo, en nuestro método, el establecimiento de cinismo en la sangre se puede probar en cualquier momento después de la cirugía de parabiosis. Los parabiontes con chimerismo circulante establecido sin éxito pueden ser excluidos para un estudio adicional con antelación para reducir la carga de trabajo innecesaria. De hecho, utilizando nuestro método de fluctuación de glucosa pudimos elegir a los ratones con la construcción infructuosa de cinismo en sangre en ciertos parabiontes, que podría ser debido a un tiempo insuficiente de parabiosis, manipulación de cirugía inestable, cicatrización de heridas retrasada o tejido corporal desconectado causado por la lucha animal. En tales circunstancias, el fracaso del chimerismo de sangre también se confirmó mediante el uso del método azul Evans. Estos resultados indican que el método de fluctuación de glucosa fue tan eficaz como el método Azul Evans(Figura Suplementaria 1 y Figura Suplementaria 2, Tabla Suplementaria 1 y Tabla Suplementaria 2). En segundo lugar, los métodos de validación utilizados actualmente son excesivamente lentos y difíciles, a diferencia de este nuevo método, que es simple y eficaz.

En el presente estudio, probamos con éxito el chimerismo de circulación en ratones parabióticos por el método de fluctuación de glucosa. Los ratones fueron anestesiados para la inyección de glucosa y las mediciones del nivel de glucosa en sangre, lo que facilitó su manipulación. Inyectamos 100 s de glucosa (1,2 g/kg) a través de la vena de la cola de los ratones dentro de 10 s. En estas condiciones, se observó una fluctuación regular de los niveles de glucosa en sangre en ratones donantes y receptores. Es importante destacar que la cantidad de glucosa que usamos tendía a elevar establemente el nivel de glucosa en sangre dentro de un cierto rango. Además, los resultados mostraron que el nivel de insulina en sangre se recuperó al rango normal 3 h después de la inyección de glucosa(Figura suplementaria 3),lo que sugiere que la cantidad de glucosa inyectada en los ratones tuvo efectos mínimos sobre el metabolismo de la insulina. Además, la dosis de glucosa que le dimos al donante fue inferior a la utilizada para la prueba de tolerancia a la glucosa de ratones (para la GTT, 2 g/kg de glucosa se inyecta por vía intraperitoneal a los ratones, igualando aproximadamente 1,6 g/kg a través de la inyección de vena caudal19,20,21), lo que significa que la dosis de glucosa para el método de fluctuación de glucosa no causaría hiperglucemia y otras alteraciones perjudiciales. En conclusión, el método que utilizamos es eficaz, inofensivo y ahorra tiempo. Sin embargo, podría limitarse a ratones diabéticos en parabiosis, que todavía necesitan más experimentos para la confirmación.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la National Nature Science Foundation of China (81570399 y 81773735), el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China - Proyecto de Investigación de Modernización de la Medicina Tradicional China (2017YFC1702003), y Hei Long Jiang Fondo de Ciencia Juvenil Sobresaliente (JC2017020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
curved forceps JZ surgical Instruments, China J31340
fine scissors JZ surgical Instruments, China WA1030
needle forcep JZ surgical Instruments, China 60017961
2.5 mL syringes Agilent, USA 5182-9642
Tribromoethano Sigma-Aldrich, USA T48402-5G
penicillin Solarbio, China IP0150
tramadol Yijishiye, China YJT712520
glucometer Roche Diabetes Care, Indiana Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain Solarbio, China G1810
depilatory cream Nair, USA LL9161
Warming Blanket (Heating pad) Kent Scientific Corp, USA TP-22G
Electrical shaver Codos, China CP-5000
3-0,5-0
surgical suture
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China SYZ 3-0#, SYZ 5-0#

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References

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