Quantitative Messung von intrathecally Synthetisierten Proteinen bei Mäusen

Neuroscience

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Summary

Erhöhte Spinalflüssigkeitsproteinspiegel können entweder das Ergebnis der Diffusion von Plasmaprotein über eine veränderte Blut-Hirn-Schranke oder intrathekale Synthese sein. In diesem Artikel wird ein optimiertes Testprotokoll vorgestellt, das hilft, beide Fälle zu unterscheiden und quantitative Messungen von intrathekalen synthetisierten Proteinen liefert.

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Gilli, F., Welsh, N. C., Linzey, M. R., Royce, D. B., DiSano, K. D., Pachner, A. R. Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice. J. Vis. Exp. (153), e60495, doi:10.3791/60495 (2019).

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Abstract

Cerebrospinalfluid (CSF), eine Flüssigkeit im Gehirn und im Rückenmark gefunden, ist von großer Bedeutung für die grundlegende und klinische Wissenschaft. Die Analyse der CSF-Proteinzusammensetzung liefert wichtige Informationen in der grundlagenspezifischen neurowissenschaftlichen Forschung sowie neurologischen Erkrankungen. Eine Einschränkung besteht darin, dass Proteine, die in CSF gemessen werden, sowohl aus der intrathekalen Synthese als auch aus der Transudation aus Serum stammen können, und die Proteinanalyse von CSF kann nur die Summe dieser beiden Komponenten bestimmen. Um zwischen Proteintransudation aus dem Blut und intrathekal produzierten Proteinen in Tiermodellen sowie beim Menschen zu unterscheiden, müssen CSF-Proteinprofilierungsmessungen mit herkömmlichen Proteinanalysewerkzeugen die Berechnung des Albumin-CSF/Serumquotienten(Q-Albumin), eines Markers für die Integrität der Blut-Hirn-Schnittstelle (BBI) und des Proteinindex (Q-Protein/Q-Albumin ), eine Schätzung der intrathekalen Proteinsynthese umfassen. Dieses Protokoll veranschaulicht das gesamte Verfahren, von der CSF- und Blutentnahme bis hin zu Quotienten und Indexberechnungen, zur quantitativen Messung der intrathekalen Proteinsynthese und BBI-Beeinträchtigung in Mausmodellen neurologischer Störungen.

Introduction

Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), eine klare und farblose Flüssigkeit, die das Gehirn und das Rückenmark umgibt, hat eine große klinische und grundlegende wissenschaftliche Bedeutung. Das CSF bewahrt die elektrolytische Umgebung des Zentralnervensystems (ZNS), gleicht den systemischen Säure-Basenstatus aus, versorgt neuronale und gliale Zellen mit Nährstoffen, fungiert als Lymphsystem für das ZNS und transportiert Hormone, Neurotransmitter, Zytokine und andere Neuropeptide durch das ZNS1. Da die CSF-Zusammensetzung die Aktivität des ZNS widerspiegelt, bietet diese Flüssigkeit einen wertvollen, wenn auch indirekten Zugang, um den physiologischen und pathologischen Zustand des ZNS zu charakterisieren.

CSF wurde verwendet, um Bedingungen zu diagnostizieren, die das ZNS seit über hundert Jahren beeinflussen, und für die meiste Zeit wurde es in erster Linie von Ärzten als diagnostisches Werkzeug untersucht. In den letzten Jahren haben Neurobiologen jedoch das Potenzial von CSF für die Untersuchung der Pathophysiologie des ZNS erkannt. Insbesondere wurden im bereich der Neurowissenschaften mehrere Werkzeuge zur Proteinanalyse mit hohem Durchsatz eingeführt, die eine detaillierte Untersuchung der Proteinzusammensetzung des GFK ermöglichen, mit der Erwartung, dass diese Analyse dazu beitragen kann, Einblicke in die dynamischen Veränderungen zu geben. innerhalb des CNS auftreten.

Technologische Entwicklungen in Multiplex-Immunoassay-Techniken wie Luminex und Simoa-Technologien2,3, bieten Forschern heute die Möglichkeit, Hunderte von Proteinen in sehr niedrigen Konzentrationen zu erkennen. Darüber hinaus ermöglichen dieselben Technologien die Verwendung kleiner Probenvolumina und fördern damit Studien an Kleintieren, einschließlich Mäusen, bei denen begrenzte Probenmengen von GFK bis vor kurzem detaillierte Charakterisierungen der Flüssigkeit verhindert haben.

Eine Einschränkung ist jedoch, dass Proteine, die in CSF gemessen werden, aufgrund einer beschädigten Blut-Hirn-Schnittstelle (BBI) aus der intrathekalen Synthese und/oder Transudation aus Serum stammen können. Leider kann die Proteinanalyse von CSF allein nur die Summe dieser beiden Komponenten bestimmen. Um zwischen transudate und intrathecally produzierten Proteinen zu unterscheiden, müssen CSF-Proteinmessungen mit einem verfügbaren Proteinanalyse-Tool an die individuelle Variabilität der Serumkonzentrationen sowie die Barriereintegrität angepasst werden. Obwohl diese Anpassung häufig in der klinischen Praxis verwendet wird, z. B. der CSF-IgG-Index, der eine hohe Empfindlichkeit für den Nachweis der intrathekalen IgG-Synthese4,5,6hat bisher nur sehr wenige Studien die CSF-Proteinkonzentrationen für die Serumkonzentration und Barriereintegrität korrigiert7,8.

Derzeit ist der Reibergram-Ansatz der beste Weg, um die Barrierefunktion und intrathekale Synthese von Proteinen zu bestimmen. Es handelt sich um eine grafische Auswertung in CSF/Serumquotientendiagrammen, die auf integrierte Weise sowohl die Barrierefunktion (Dys)-Funktion als auch die intrathekale Proteinsynthese analysiert und sich auf ein ausschließlich blutabgeleitetes Protein9,10bezieht. Das reichlich reichlich eiternreiche Proteinalbumin wird in der Regel als Referenzprotein ausgewählt, da es nur in der Leber produziert wird und weil seine Größe, ca. 70 kDa, zwischen kleinen und großen Proteinen11liegt. Das Analysediagramm wurde erstmals 1987 von Reiber und Felgenhauer für die wichtigsten Klassen von Immunglobulinen (Igs)11definiert, wobei empirisch auf den Ergebnissen aus der Analyse tausender menschlicher Proben9. Der Ansatz wurde später durch die Anwendung der beiden Fick-Gesetze der Diffusion in der Theorie der molekularen Diffusion/Durchflussrate12bestätigt. Eine solche Theorie zeigt die Diffusion eines Proteins durch die Barriere hat eine hyperbolische Verteilung und kann quantitativ die Dynamik von Proteinen in der ZNS9,13erklären. Insgesamt besteht der Vorteil der Verwendung des Reibergram zum Nachweis der intrathekalen Proteinsynthese darin, dass es gleichzeitig die Proteinfraktion identifiziert, die aus dem Serum in das CSF gelangt, sowie die Menge an Protein, die im CSF aufgrund der lokalen Produktion gefunden wird.

Der vorliegende Artikel und das zugehörige Protokoll beschreiben das gesamte Verfahren, von der CSF- und Blutentnahme bis zu den endgültigen Berechnungen zur Korrektur des CSF-Proteinspiegels, für die quantitative Messung der intrathekalen Proteinsynthese in Mausmodellen neurologischer Störungen. Dieses Verfahren bietet eine Ausgangsbasis, anhand derer (1) der pathophysiologische Ursprung eines CSF-Proteins und (2) die Stabilität und funktionelle Bedeutung der Barriereintegrität beurteilt werden können. Dieses Verfahren und Protokoll sind nicht nur nützlich für die Beurteilung von Maus-CSF-Proben, sondern auch nützlich bei der Analyse von CSF in einer Vielzahl von Tiermodellen von neurologischen Erkrankungen und menschlichen Patienten.

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Protocol

Alle Tierarbeiten verwenden Protokolle, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Geisel School of Medicine in Dartmouth überprüft und genehmigt wurden.

1. Sammlung von Flüssigkeiten

HINWEIS: Sowohl Serum als auch CSF sind erforderlich. Für das Überleben und die Nekropsie werden zwei Protokolle für jede Flüssigkeitssammlung benötigt.

  1. Serum- und CSF-Sammlung unter Verwendung von Überlebensverfahren
    HINWEIS: Für die Survival-Flüssigkeitssammlung sollte die Serumsammlung der CSF-Sammlung vorausgehen, da es sich um ein weniger invasives Verfahren handelt. CSF muss innerhalb einer Woche nach der Ziehung des Serums erhalten werden.
    1. Retro-orbitale Blutungsverfahren für die Serumsammlung.
      HINWEIS: Dieses Verfahren ist für ÜberlebenBlutungen von Mäusen14. Das beschriebene Verfahren gilt für jedes Alter, Geschlecht und Geschlecht von Mäusen. Da die IACUC-Regeln vorschreiben, dass ein maximales Blutvolumen von 1 % des Körpergewichts als einzelne Blutentnahme entfernt werden kann, wird empfohlen, dass das Verfahren nur an Mäusen mit einem Gewicht von mehr als 15 g durchgeführt wird.
      1. Bewegen Sie die Käfige mit Mäusen aus dem Rack in einen geeigneten Arbeitsbereich. Bereiten Sie die Anästhesie-Gasmaschine vor, indem Sie den Sauerstoffdurchflussmesser auf 1 l/min einschalten.
      2. Legen Sie das Tier in die Induktionskammer und schließen Sie den Deckel fest. Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer auf 3,5% ein und überwachen Sie das Tier bis zum Liegerad.
      3. Entfernen Sie das Tier aus der Kammer und bewerten Sie den Grad der Anästhesie durch Pedalreflex, d.h. feste Fußpolster-Pinch. Sicherstellen einer angemessenen Tiefe der Anästhesie vor der Durchführung des Verfahrens: Mangel an Reaktion auf eine feste Prise deutet auf eine ausreichende Anästhesie.
      4. Halten Sie die anästhesierte Maus zurück, indem Sie die lockere Haut hinter den Ohren mit dem Daumen und Zeigefinger der nicht-dominanten Hand greifen. Wölben Sie die Augen, indem Sie den Zeigefinger verwenden, um die Haut über dem Auge und den Daumen zurückzuziehen, um die Haut unter den Augen zurückzuzeichnen.
      5. Legen Sie die Spitze einer Pasteur-Pipette in die Augenhöhle unter dem Augapfel(Abbildung 1, linkes Panel), und lenken Sie die Spitze bei ca. 45° in Richtung der Mitte der Augenhöhle(Abbildung 1, rechte sam), die Spitze beträgt ca. 45°. Drehen Sie die Pipette zwischen den Fingern während des Vorwärtsgangs. Tragen Sie sanften Druck auf und geben Sie dann frei, bis Blut in die Pipette gelangt.
        HINWEIS: Die maximale Blutmenge, die gleichzeitig von diesem Ort entnommen werden kann, beträgt etwa 1% des Körpergewichts, z. B. 0,2 ml von einer 20 g Maus.
      6. Entfernen Sie die Kapillare vorsichtig, um Verletzungen des Auges zu verhindern, und legen Sie das gesammelte Blut in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr. Schließen Sie das Augenlid und wenden Sie leichten Druck mit Gaze an, um weitere Blutungen zu verhindern. Sobald vollständig wachsam und mobil (in der Regel 3-5 min), kehren Sie die Maus zu seinem Haltekäfig zurück.
      7. Lassen Sie das Blut für 30 bis 60 min bei Raumtemperatur (RT) gerinnen, dann Zentrifugieren sie Blut für 10 min bei 2.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge von 4 °C. Mit einer sauberen Pipettentechnik sammpere Serum in eine neue, beschriftete 0,5 ml Durchstechflasche. Durchserlegen Sie die Durchserbflasche Serum bei -80 °C sofort einfrieren.
    2. CSF-Sammlung mit Überlebensverfahren
      HINWEIS: Dieses Verfahren ist für Überlebensoperationen und basiert auf dem Protokoll, das von Liu und Duff im Jahr 2008 veröffentlicht wurde.15. Die Mäuse werden durch einen Ketamin (20 mg/ml), Xylazin (0,5 mg/ml) und Acepromazin (0,5 mg/ml) Cocktail intraperitoneal verabreicht anbeet.
      1. Bewegen Sie die Käfige mit Mäusen aus dem Rack in einen ausgewiesenen Operationsarbeitsbereich. Bereiten Sie den Operationsraum in einer sterilen Umgebung vor. Stellen Sie sicher, dass alle verwendeten Instrumente und Materialien vor der Operation sterilisiert werden.
      2. Wiegen Sie die Maus und berechnen Sie das benötigte Anästhesievolumen (0,1 ml Anästhesiecocktail für eine 20 g Maus). Injizieren Anästhesie intraperitoneal16. Testen Sie nach einigen Minuten die Maus, indem Sie das Fußpolster kneifen, um eine ausreichende Anästhesie zu gewährleisten. Wenn mehr Anästhetikum erforderlich ist, spritzen Sie den Anästhetikum-Cocktail weiter 0,01 bis 0,03 ml.
      3. Verwenden Sie entweder eine Schere oder einen Rasierer, um einen kleinen Bereich des Kopfes zu rasieren, am kaudalen Ende, medial auf dem Schädel, um groß genug Arbeitsbereich für DIE CSF-Sammlung zu belichten. Positionieren Sie die Maus in der anfälligen Position auf dem stereotaxic Instrument, und stabilisieren Sie den Kopf mit Ohrleisten(Abbildung 2A).
        HINWEIS: Die Maus ist so ausgelegt, dass der Kopf mit dem Körper einen Winkel von fast 135° bildet (Abbildung 2A). Sobald das Tier positioniert ist, wird ein chirurgischer Vorhang verwendet, um ein steriles Feld an der chirurgischen Stelle zu erhalten. Klare Klebevorhänge werden für die CSF-Sammlung bei Mäusen bevorzugt, da sie eine direkte und gezieltere Visualisierung des Tieres ermöglichen.
      4. Die chirurgische Stelle mit 30% Chlorhexidin-Diacetat abwischen. Mit einem sterilen Skalpell, machen Sie einen sagittalen Schnitt der Haut schlechter als der Okziput, um Muskeln über der Zisterne magna auszusetzen.
      5. Durch stumpfe Zerlegung mit Zangen, trennen Sie das unterkutane Gewebe und Muskeln, um die Zisternen magna zu belichten (Abbildung 2B). Verwenden Sie Mikroretraktoren, um die Muskeln auseinander zu halten (Abbildung 2B) und setzen Sie die Dura mater Meningealschicht über der Zisternen magna aus.
      6. Waschen Sie vorsichtig mit steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS), um eine mögliche Blutkontamination zu entfernen. Trocknen Sie die Dura mater mit einem sterilen Wattestäbchen und punktieren Sie die Membran, die die Zisterne magna bedeckt, sanft mit einer 30 G Nadel. Fügen Sie schnell und vorsichtig ein kleines Glaskapillarrohr ein, um CSF zu sammeln (Abbildung 2C).
        HINWEIS: Der intrakranielle Druck ermöglicht es CSF, spontan in die Kapillare zu fließen (Abbildung 2C). Je nach Alter und Größe der Maus werden von jeder Maus ca. 5 x 12 l CSF erhalten.
      7. Entfernen Sie vorsichtig das Kapillarrohr aus der Membran. Schließen Sie das Rohr durch einen Polyethylenschlauch(Materialtabelle) an eine 3 ml Spritze an und injizieren Sie das gesammelte CSF in ein markiertes 0,5 ml-Rohr (Abbildung 2D). Fläschchen im Eis aufbewahren.
      8. Schließen Sie den Schnitt durch Verwendung von Polydioxanon-Nähte (PDS) mit Einwegnadel und mit vergrabenen Nähten17. Reinigen Sie den Bereich von getrocknetem Blut oder Gewebe.
      9. Injizieren Sie Mäuse subkutan oder intraperitoneal16, mit 0,05,0,1 mg/kg Buprenorphinhydrochlorid als analgetische Behandlung. Auch subkutan 1 ml sterile Saline injizieren, um Austrocknung zu verhindern.
      10. Legen Sie die Maus wieder in einen sauberen und warmen Käfig für die Erholung. Sobald die Maus mobil ist und in der Lage ist, Nahrung und Wasser zu erreichen, legen Sie den Käfig wieder auf das Rack.
      11. Zentrifuge CSF für 10 min bei 1.000 x g in einer 4 °C gekühlten Zentrifuge. Überprüfen Sie den Grad der Blutkontamination durch visuelle Inspektion zur Identifizierung von Xanthochromie und Vorhandensein eines roten Pellets im Boden des Rohres. Entsorgen Sie blutverunreinigte Proben.
        HINWEIS: Die Formel für die Korrektur von CSF-Proteinmengen in blutverunreinigten Proben basiert auf Gleichungsparametern, die den Proteingehalt in CSF und Serum, Hämatokrit (HCT) und rote Blutkörperchen (RBC) in CSF und Blut18umfassen. Eine solche Korrekturstrategie kann jedoch aufgrund des geringen Volumens nicht ohne weiteres auf Maus-CSF-Proben angewendet werden, wodurch die Korrekturstrategie auf eine Sichtprüfung beschränkt wird.
      12. Mit einer sauberen Pipettentechnik, sammeln CSF in einem neuen 0,2 ml Rohr, hinter dem Pellet mit Zellen. Verdünnen Sie CSF 1:3 mit PBS, um den Volumenverlust durch Aerosol zu reduzieren. Die Durchstechflasche mit CSF sofort bei -80 °C einfrieren.
  2. Serum- und CSF-Sammlung unter Verwendung von Nicht-Überlebensverfahren
    HINWEIS: Für die Nicht-Überlebensflüssigkeitssammlung geht die CSF-Sammlung der Serumsammlung voraus, da die Maus einen Puls haben muss.
    1. CSF-Sammlung bei Necropsy
      HINWEIS: Dieses Verfahren ist für nicht-Überlebens-Chirurgie, und etwa 10-20 L CSF wird von jeder Maus erhalten. Ein steriles Operationsfeld wird empfohlen, ist aber für eine Nicht-Überlebensoperation nicht erforderlich.
      1. Bewegen Sie die Käfige mit Mäusen aus dem Rack in einen komfortablen Arbeitsbereich. Befolgen Sie die Schritte 1.1.2.2-1.1.2.7 und 1.1.2.11-1.1.2.12 für die CSF-Sammlung. Fahren Sie mit Abschnitt 1.2.2 für die Serumsammlung fort.
    2. Blutentnahme durch intrakardiale Punktion (offener Ansatz)
      HINWEIS: Das erwartete Blutvolumen beträgt ca. 3% des Körpergewichts, z. B. 0,6 ml von einer 20 g Maus.
      1. Nach der CSF-Sammlung stellen Sie sicher, dass die Maus durch Kneifen des Fußpolsters noch ausreichend beäscht ist. Wenn eine Reaktion beobachtet wird, eine zweite Dosis Anästhetikum verabreichen. Wenn keine Reaktion beobachtet wird, fahren Sie fort.
      2. Legen Sie das Tier auf den Rücken und tupfer Haut auf den Bauch mit 70% Alkohol. Mit einer chirurgischen Schere die Brusthöhle öffnen und das Herz freilegen. Legen Sie eine 25 G Nadel (an einer 3 ml Spritze befestigt) in den linken Ventrikel ein und setzen Sie den Spritzenkolben vorsichtig unter Druck. Nadel zurückziehen, nachdem Blut entnommen wurde.
      3. Führen Sie eine sekundäre Methode der Euthanasie wie Enthauptung oder zervikale Dislokation durch, um sicherzustellen, dass das Tier verstorben ist.
      4. Drücken Sie den Kolben der Spritze nach unten und injizieren Sie das gesammelte Blut in eine 1,5 ml Durchstechflasche. Lassen Sie das Blut 30-60 min bei RT gerinnen und zentrieren Sie es dann 10 min bei 2.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge von 4 °C.
      5. Mit sauberer Pipettentechnik sammpere Serum in eine neue, beschriftete 0,5 ml-Durchstechflasche. Durchserlegen Sie die Durchserbflasche Serum sofort in einem Gefrierschrank von -80 °C einfrieren.

2. Proteinanalyse

  1. Verwenden Sie eine bevorzugte Methode, z. B. Luminex-Technologie, um Zielproteine und Albumin in übereinstimmenden Serum- und CSF-Proben zu quantifizieren.
    HINWEIS: Hier wird ein Beispiel mit der Luminex-Magnettechnologie gegeben, aber praktisch jede Technik, die Proteinmengen misst, einschließlich enzymgebundener Immunsorbent-Assays (ELISAs), kann auf das aktuelle Protokoll angewendet werden. Idealerweise werden CSF- und Serumproben sowohl für Albumin- als auch für Zielproteine auf derselben Plattform ausgeführt. Die Assay-Bedingungen müssen für entscheidende Schritte im Protokoll optimiert werden, wie z. B. Antigen-Perlen-Kopplungskonzentration, Serum- und CSF-Probenverdünnungen, am besten passgenaue Standardkurven für jeden Analyten und Pufferzusammensetzung, um die unspezifische Reaktivität zu reduzieren. Wird ein kommerzielles Kit für die Protein-Messung verwendet, z. B. das Immunglobulin-Isotypisierungs-Kit (Materialtabelle) zur Erfassung von Daten, die inAbbildung 3müssen die Anweisungen der Hersteller befolgt werden.
    1. Beim Auftauen und vor der Analyse Zentrifugen-CSF- und Serumproben (2.000 x g für 10 min) und verwenden sie den Überstand, um eine Verstopfung der Filterplatten und/oder Sonde zu verhindern. Befolgen Sie das mit dem Kit gelieferte Assay-Verfahren für geeignete Probenverdünnungen. Andernfalls bestimmen Sie die geeignete Verdünnung für jeden Analyten und Flüssigkeit. Proben in PBS entsprechend verdünnen.
      ANMERKUNG: Wenn es keine spezifischen Leitlinien oder Anweisungen gibt, müssen vor der Studie Verdünnungen für jeden Analyt und jede Flüssigkeit festgestellt werden, indem die geeigneten Verdünnungsbereiche bestimmt werden, die erforderlich sind, um Konzentrationsschätzungen zu erhalten, die zuverlässigen Bereich einer Standardkurve. Die Kenntnis der Eigenschaften der zu analysierenden biologischen Probe, z. B. physiologische und pathologische Konzentrationen in der Flüssigkeit, ermöglicht es, verschiedene Verdünnungen mit Proben mit niedrigem, mittlerem und hohem Analytgehalt auszuprobieren. Wenn der erwartete Konzentrationsbereich in den Proben von vornherein bekannt ist, können die Verdünnungen nach der Berechnung ausgewählt werden, wie oft die Probe verdünnt werden muss, um innerhalb des gewählten Standardkurvenbereichs zu liegen.
      VORSICHT: Denken Sie bei der Berechnung der Verdünnungsfaktoren daran, dass CSF bereits 1:3 verwässert wurde.
    2. Bereiten Sie eine Standardkurve für jedes Protein von Interesse vor, z. B. Albumin und IgG, wie sie zur Generierung von Daten in Abbildung 3verwendet werden, durch serielle Verdünnung von Referenzstandardproteinen. Mischen Sie bei der Vorbereitung von Standardkurven jede höhere Konzentration gründlich, bevor Sie die nächste Verdünnung machen.
      HINWEIS: Unabhängig von der gewählten Methode der Quantifizierung ist es wichtig, bei jeder Testierung eine Standardkurve einzuschließen, um die Proteinkonzentration in Proben zu schätzen. Die beste Wahl für einen Referenzstandard ist eine gereinigte, bekannte Konzentration des Proteins von Interesse. Die Entscheidung über die spezifischen Verdünnungen sowie die Anzahl der Datenpunkte und Replikationen, die zur Definition der Standardkurve verwendet werden, hängt vom Grad der Nichtlinearität in der Standardkurve ab.
    3. Wählen Sie die entsprechenden Antikörper-gekoppelten magnetischen Perlensätze (Tabelle der Materialien). Für einzelne Perlenfläschchen jede Durchstechflasche für 30 s und Wirbel für 1 min. Bereiten Sie eine "Arbeitsperlenmischung" vor, indem Sie die Perlenbestände auf eine Endkonzentration von 50 Perlen jedes Sets/L im Assay/Waschpuffer verdünnen (PBS, 1% Rinderserumalbumin [BSA]). Fügen Sie 50 l der gemischten Perlen zu jedem Brunnen in einer flachen 96-Well-Platte(Materialtabelle).
      VORSICHT: Die leuchtstofffreien Perlen sind lichtempfindlich. Daher sollten sie während des gesamten Verfahrens vor längerer Lichteinwirkung geschützt werden.
    4. Diagramm emittieren Sie die Platzierung von Hintergründen, Standards und Beispielen in einem gut zugeordneten Arbeitsblatt.
    5. Fügen Sie jedem Hintergrundbrunnen 50 l Assay/Waschpuffer und für die Standardkurve 50 l von jedem Standard hinzu. Laden Sie 50 ml jeder verdünnten Probe in die entsprechenden Bohrungen zuletzt. Die Platte mit Folie umwickeln und mit Rührung (ca. 800 Rpm) auf einem Plattenschüttler für 30 min bei RT inkubieren.
    6. Legen Sie die Platte auf einen Handmagneten(Materialtabelle) und legen Sie die Platte auf den Magneten für 60 s, um eine vollständige Einstellung der magnetischen Perlen zu ermöglichen. Entfernen Sie den Brunneninhalt, indem Sie die Platte sanft dekantieren und auf saugfähige Pads tippen, um Restflüssigkeit zu entfernen.
    7. Waschen Sie die Platte, indem Sie sie vom Magneten entfernen, indem Sie 200 L Assay/Waschpuffer hinzufügen, 30 s schütteln und schließlich wieder am Magneten anbringen. Waschen 3x wiederholen.
    8. Verdünnen Sie den biotinylierten Detektionsantikörper, d.h. biotinmarkierten Antikörper, der gegen die Proteinwirtsart aufgezogen wird, auf 4 g/ml im Test-/Waschpuffer. Fügen Sie jedem Bohrkörper 50 l des verdünnten Detektionsantikörpers hinzu. Bedecken Sie die Platte und brüten Sie 30 min bei RT auf dem Plattenschüttler bei 800 Umdrehungen von 15.00 00.00 00.00 00.000 Min.. Legen Sie die Platte auf den Magneten und wiederholen Sie die Schritte 2.1.6 und 2.1.7.
    9. Phycoerythrin (PE)-konjugiertes Streptavidin (SAPE) im Assay/Waschpuffer auf 4 g/ml verdünnen. Fügen Sie jedem Brunnen 50 L verdünnten SAPE hinzu. Bedecken Sie die Platte und brüten Sie 30 min bei RT auf dem Plattenschüttler bei 800 Umdrehungen von 15.00 00.00 00.00 00.000 Min.. Legen Sie die Platte auf den Magneten und wiederholen Sie die Schritte 2.1.6 und 2.1.7.
    10. Entfernen Sie die Platte vom Magneten und setzen Sie die Perlen in 100 l Assay/Waschpuffer wieder auf. Lesen Sie Brunnen mit einem Dual-Laser-Flow-basierten Detektionsgerät, das die Erkennung der Größe der PE-Fluoreszenzintensität (FI) ermöglicht.
      HINWEIS: Das erzeugte Signal, z. B. FI, ist proportional zur Menge des Zielantigens, das an der Oberfläche der Perlen befestigt ist.
    11. Exportieren Sie Rohdaten und erstellen Sie Standardkurven durch Graphikerkennungssignal FI im Vergleich zu Standardproteinkonzentrationen. Verwenden Sie die Standardkurve(en), um die Konzentration der Analyten in den Stichproben zu berechnen.
      HINWEIS: Albumin wird bevorzugt in g/dL ausgedrückt, während Proteine von Interesse bevorzugt in mg/dL ausgedrückt werden.

3. Intrathekale Indexberechnungen

  1. Organisieren Sie Proteinkonzentrationswerte in einer Kalkulationstabelle, und analysieren Sie die Ergebnisse, indem Sie die folgenden Formeln anwenden.
  2. Qalbuminberechnen :
    Equation 1
    wobeiCSF-Albumin und Serum-Albumin Konzentrationen von Albumin in übereinstimmenden Serum- bzw. CSF-Proben sind.
  3. Berechnen SieQ-Protein:
    Equation 2
    wobeiCSF-Protein und Serumprotein Konzentrationen von Zielproteinen in aufeinander abgestimmten Serum- bzw. CSF-Proben sind.
  4. Berechnen Sie den Proteinindex:
    Equation 3

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Representative Results

Dieses repräsentative Experiment zielte darauf ab, die intrathekale Synthese von IgG in zwei klinisch relevanten Nagetiermodellen der Multiplen Sklerose (MS) zu vergleichen: die PLP139-151-induzierte schubförmige experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis (R-EAE) und die chronisch progressive, Theiler-Murinen-Enzephalomyelitis-Virus-induzierte Demyelinating-Krankheit (TMEV-IDD). R-EAE ist ein nützliches Modell zum Verständnis schubförmiger MS, während das TMEV-IDD-Modell chronisch progressive MS19enthält.

Für die vorliegende Studie wurde eine quantitative Analyse der intrathekalen IgG-Synthese in R-EAE (n = 12) und TMEV-IDD (n = 28) durchgeführt. Beide Gruppen wurden auf dem Höhepunkt ihrer Krankheit analysiert. Eine weitere Gruppe von 10 Mäusen wurde scheinbehandelt und diente als altersgerechte Kontrollgruppen (cR-EAE n = 4, cTMEV-IDD sham n = 6).

Zur Messung des gesamten IgG in übereinstimmenden Serum- und CSF-Proben wurde ein magnetischer Perlenansatz mit dem handelsüblichen Bausatz (Materialtabelle) verwendet. Der Gesamte-IgG-Wert wurde von der Summe der Werte der Unterklasse IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 abgeleitet. Albumin wurde mit einem kommerziellen Mausalbumin ELISA Kit (Table of Materials) gemessen, da ein Luminex-Assay für Albumin zu dieser Zeit nicht verfügbar war. Alle Messungen wurden sorgfältig nach den Anweisungen der Hersteller durchgeführt. Albuminquotient (Qalbumin) und IgG Index (QIgG/Qalbumin) wurden dann verwendet, um blut- und cNS-abgeleitetes IgG im CSF zu unterscheiden.

Wie in Abbildung 3Adargestellt, sind die tatsächlichen Konzentrationen des gesamten IgG im CSF beider Nagetiermodelle von MS im Vergleich zu den entsprechenden altersgerechten Scheinkontrollen signifikant erhöht(p - 0,026). Allerdings zeigen R-EAE-Mäuse signifikant verbesserteQ-Albumin-Werte (p -0,019), was auf eine erhöhte Durchlässigkeit der Barriere bei diesen Mäusen hindeutet (Abbildung 3B). Umgekehrt gibt es keine Unterschiede inQ-Albumin zwischen TMEV-IDD und Scheinmäusen(p = 0,49), was unseren bisherigen Befund einer intakten Barriere bei TMEV-IDD-Mäusen7,8bestätigt. Um die transudate und intrathecally produzierte IgG in R-EAE und TMEV-IDD weiter zu unterscheiden, wurde der IgG-Index gemessen, der deutlich höhere Werte bei TMEV-IDD-Mäusen(p -0,0006) und damit der intrathekalen IgG-Produktion in diesem Modell(Abbildung 3C) zeigte.

Eine intakte Barriere bei TMEV-IDD-Mäusen zusammen mit einem hohen IgG-Index legt nahe, dass in diesem Modell Antikörper innerhalb des CNS produziert werden. Umgekehrt liefern in R-EAE ein signifikanter Barriereabbau und ein niedriger IgG-Index Hinweise darauf, dass das CSF IgG hauptsächlich von peripheren und nicht von intrathekalen B-Zellen produziert wird, was auch darauf hindeutet, dass in diesem akuten MS-Modell CSF IgG hauptsächlich aus Serum abgeleitet ist.

Figure 1
Abbildung 1: Retro-orbitale Blutung von Mäusen. Links: Korrekte Platzierung der Nadel relativ zur retro-orbitalen Sinus, dem Augapfel und der Rückseite der Umlaufbahn. Rechts: Die Pipettenposition beginnt im medialen Canthus des Auges und gleitet zum dorsalen Aspekt des Orbits. Die Kapillare wird in einem Winkel von 45° eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: CSF-Sammlung bei Mäusen. (A) Die Ohrstangen stützen den Kopf der Maus, und die Maus ist so angelegt, dass der Kopf einen 135°-Winkel mit dem Körper bildet. Der Pfeil zeigt auf die exponierte Zisterne magna. (B) Durch stumpfe Sezierung mit Zangen werden die Muskeln getrennt, um die Zisterne magna (durch den Pfeil gezeigt) freizulegen. Mikroretraktoren werden verwendet, um die Muskeln auseinander zu halten. (C) Ein kleines Glaskapillarrohr wird verwendet, um CSF aus der Zisterne magna zu sammeln. CSF fließt aufgrund des intrakraniellen Drucks spontan in die Kapillare. Der Pfeil zeigt auf das gesammelte CSF in der Kapillare. (D) Das CSF wird über eine modifizierte 3 ml Spritze in ein 0,5 ml-Rohr übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Blut-Hirn-Barrierefunktion und intrathekale Synthese von IgG in R-EAE und TMEV-IDD. Dot Blot, der (A) die CSF-Werte von IgG -Gesamt-IgG-Werten (mg/dL) darstellt, gemessen durch Luminex-Technologie, (B) Albumin CSF/Serumquotienten (Qalbumin) und (C) IgG-Indizes (QIg/Qalbumin) in R-EAE- und TMEV-IDD-Mäusen sowie altersgerechte Kontrollmäuse (cR-EAE und cTMEV-IDD). Horizontale Linien stellen den Medianwert für diese Gruppe dar. p < 0,0001; p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Quantitative Methoden zur Bewertung erhöhter CSF-Proteinkonzentrationen sind nützliche Werkzeuge zur Charakterisierung des physiologischen und pathologischen Zustands des ZNS. Über die zuverlässige Quantifizierung des CSF-Proteinspiegels hinaus erfordert der Nachweis von CSF-Proteinen jedoch eine Expression von Ergebnissen, die zwischen blut- und zNS-abgeleiteten Fraktionen im CSF unterscheiden. Bislang erlauben die häufig verwendeten Proteinquantifizierungstests jedoch keine Diskriminierung zwischen den beiden Proteinkomponenten, selbst mit Hilfe von Werkzeugen mit hohem Durchsatz. Daher wurden spezifische Korrekturen an Proteinmessungen vorgeschlagen, um zwischen Proteinen, die im ZNS-Fach synthetisiert werden, und Aus dem Blut gewonnenen Proteinen zu unterscheiden. Solche Korrekturen kompensieren die individuelle Variabilität sowohl der Serumkonzentrationen als auch der Barriereintegrität. Insgesamt basieren diese Korrekturen auf Berechnungen eines CSF/Serumquotienten(Q-Protein), der die Variabilität aufgrund von Unterschieden in der individuellen Konzentration des Serumproteins reduziert. Die Variation desQ-Proteins im Zusammenhang mit individuellen Unterschieden in der Barrierefunktion kann weiter verringert werden, indem dasQ-Protein mit einem CSF/Serumalbuminquotienten (Qalbumin) in Beziehung gebracht wird. Die Kombination beider Korrekturen wird allgemein als Proteinindex bezeichnet undwird als Q-Protein/Q-Albumin-Verhältnis 4,6berechnet.

Albumin, synthetisiert und von der Leber abgesondert, ist das wichtigste Plasmaprotein, das im Blut zirkuliert. Da Albumin ausschließlich außerhalb des CNS produziert wird und seine CSF-Werte niedrig sind (0,15 g/dl), weisen erhöhte CSF-Albumin-Spiegel entweder auf eine Schädigung des BBI oder eine Blutkontamination aufgrund intrathekaler Blutungen oder traumatischer CSF-Sammlung hin. In jeder dieser Bedingungen transudiert Albumin im Verhältnis zu seiner Serumkonzentration das Serum in das CSF. Daher kann dasQ-Albumin ohne Blutkontamination als Indikator für die Barrierefunktion20verwendet werden. Umgekehrt bleibt dasQ-Albumin bei Menschen und Tieren mit einem intakten BBI21konstant. Eine grundlegende Annahme für die Verwendung dieses Quotienten4,6 bei der berechnung der intrathekalen Proteinsynthese ist, dass die erhöhte Menge an CSF-Protein in Gegenwart einer undichten Barriere proportional zur Erhöhung der CSF-Albuminkonzentration ist. Diese Annahme wurde experimentell in einer Studie aus dem Jahr 19774bestätigt, in der Autoren bei MS-Patienten die Blut-CSF-Passage von radioaktiv markiertem IgG und Albumin aus gesunden menschlichen Seren überwachten.

Ähnlich wie bei Albumin kann jedes Protein im Blut das BBI überqueren. Wenn die Barriere intakt ist, ist dasQ-Protein relativ konstant. Im Gegensatz zu Albumin können jedoch auch viele Proteine innerhalb des ZNS synthetisiert werden. Infolgedessen kann ein verändertesQ-Protein durch eine beschädigte Barriere und/oder eine erhöhte intrathekale Proteinproduktion entstehen. Wenn jedoch eine erhöhte CSF-Proteinkonzentration nur auf ein kompromittiertes BBI zurückzuführen ist, werden die Werte fürQ-Protein undQ-Albumin erhöht, verglichen mit Werten für dieselben Quotienten bei Tieren mit einer intakten Barriere. Im Gegensatz dazu sind erhöhte CSF-Proteinkonzentrationen höchstwahrscheinlich auf eine erhöhte intrathekale Synthese zurückzuführen, und nur dasQ-Protein wird letztlich erhöht.

Die Verwendung des Proteinindexes kann teilweise durch fünf Faktoren begrenzt werden: 1) die große Variabilität der CSF-Albuminkonzentration bei gesunden Tieren, 2) den unterschiedlichen hydrodynamischen Radius von Proteinen, 3) die endogene ZNS-Expression von Proteinen, 4) verschiedene Probenahmeverfahren und 5) die morphologischen Unterschiede des BBI. Die große Variabilität der CSF-Albuminkonzentration bei gesunden Tieren führt zu einer erheblichen Variabilität der Werte für den endgültigen Proteinindex. Beim Menschen zum Beispiel ist dasQ-Albumin altersabhängig, da es mit22Jahren zunimmt. Ein früherer Bericht erwähnte auch einen geschlechtsbasierten Unterschied in Qalbumin bei einer gesunden Bevölkerung23. Ebenso hängen bei Mäusen Albumin-Konzentrationen vom Alter und dem Mausstamm24ab, z.B. kann sich dasQ-Albumin für junge, männliche, C57Bl/6-Mäuse vomQ-Albumin für alte, weibliche, DBA/1J-Mäuse unterscheiden. Daher können standardisierte Referenzintervalle für die Barriereintegrität nicht über und innerhalb der Spezies festgelegt werden, und es müssen geeignete Schwellenwerte auf der Grundlage der spezifischen Versuchsbedingungen berechnet werden.

Ein weiterer Faktor, der die Variabilität in normalen Indizes zwischen Proteinen verursacht, ist ihre molekulare Größe. Der Durchgang von Serumproteinen durch das BBI hängt von ihrer molekularen Größe ab, und die Korrelation zwischen Clearance-Rate und Molekulargewicht (MW) wird häufig verwendet, um die Durchlässigkeit des BBI zu bewerten. Allgemeine Proteinstrukturen reichen von zehn bis mehrere tausend Aminosäuren. Einige Proteine sind von relativ kleiner molekularer Größe, wie Chemokine, mit einem Molekulargewicht zwischen 8 und 20 kDa. Ein derart niedriger MW begünstigt die Überquerung des BBI, was letztlich zu höheren normalen Proteinindizes führt. Anders sind andere Proteine, wie IgM, sehr groß (900-950 kDa), daher zeigen sie sehr niedrige Indizes unter normalen Bedingungen6. Dies ist jedoch nicht immer der Fall, da trotz einer ähnlichen MW einige Proteine die Barriere viel besser durchdringen als andere Proteine, möglicherweise aufgrund einer anderen Form. Somit hängt der Diffusionskoeffizient eines Proteins und damit die daraus berechneten hydrodynamischen Radien sowohl von der Größe als auch von der Form der Moleküleab 25. Der grundlegende Unterschied zwischen dem geometrischen und dem hydrodynamischen Volumen eines Proteins wird am deutlichsten bei großen Proteinen über 150 kDa. Die abnehmenden Clearance-Raten z.B. von Ceruloplasmin (132 kDa), IgG (150 kDa) und IgA (150 kDa) spiegeln die hydrodynamische Heterogenität dieser drei Proteine wider, die eine ähnliche MW25aufweisen. Es ist auch möglich, dass unter normalen Umständen eine intrathekale Produktion von Proteinen erfolgt. Einige Chemokine, z. B. CXCL10, werden in der Regel intrathecally produziert, während andere, z. B. CXCL13, nicht26,27sind. Dies bedeutet, dass die Interpretation von Proteinindizes unter den meisten experimentellen Bedingungen im Allgemeinen eine Analyse alters-, geschlechts- und stammangepasster unbehandelter Kontrollen erfordert.

Der Proteingehalt in Flüssigkeiten kann auch durch verschiedene Probenahmeverfahren beeinflusst werden. Auch wenn dies kein Problem für die CSF-Sammlung ist, wie hier beschrieben - es gibt keine Unterschiede bei der CSF-Probenahme zwischen den beschriebenen Überlebens- und Nicht-Überlebensverfahren -, können verschiedene Blutentnahmemethoden einen Einfluss auf die Gesamtserumproteinmenge haben. Einige Methoden der Blutentnahme ergeben arterielles Blut, andere liefern venöses Blut, während andere eine Mischung aus beiden14ergeben. Die Probe, die aus der überlebenden retroorbitalen Blutung gewonnen wird, ist eine Mischung aus venösem Blut und Gewebeflüssigkeit, während die terminale Blutentnahme aus der Herzpunktion venöses oder arterielles Blut oder eine Mischung aus beiden14ergeben kann. Bei gesunden Tieren kann der Gesamtprotein- und Albumingehalt des arteriellen Blutserums etwas höher sein als die gleichen Fraktionen des venösen Blutserums28. Dies sollte bei der Vergleich von Überlebens- und Nicht-Überlebensproben berücksichtigt werden.

Ein wichtiges Merkmal schließlich ist die heterogene morphologische Struktur des BBI, die mindestens zwei unterschiedliche Barrieren umfasst, die Blut-Hirn-Schranke (BBB) am Endothel der Hirnmikrogefäße und die Blut-CSF-Barriere (BCSF) am Epithel der Aderhautplexus2 . Beide Barrieren schränken und regulieren den Durchgang von Molekülen und Zellen zwischen den peripheren und zerebrospinalen Kompartimenten, obwohl sie dies durch verschiedene Mechanismen tun. Während die BBB eine echte physikalische Barriere ist, die sich durch ein komplexes Zusammenspiel zwischen Denzellen auszeichnet, ist die BCSF eher eine physiologische Barriere, die hauptsächlich vom CSF-Fluss abhängt. Reduzierung der CSF-Produktion, -Freisetzung und -Durchflussmenge aufgrund neurologischer Erkrankungen und/oder Traumata beeinträchtigen die BCSF-Funktion, wodurch dasQ-Album in9,30,31,32erhöht wird. Daher dient Qalbumin als besserer Marker für die BCSF-Permeabilität als die BBB oder allgemein BBI-Permeabilität.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Berechnung eines Proteinindex eine relativ einfache und gut charakterisierte Methode zur Diskriminierung zwischen transudate und intrathekal produzierten Proteinen ist. Der Vorteil dieser Formel, um die allgemeine Messung von Proteinen in CSF-Proben zu korrigieren, besteht darin, dass sie eine objektive Variable erzeugt, um die intrathekale Synthese von Proteinen zu quantifizieren und die BBI-Funktion, insbesondere BCSF,(Dys)-Funktion, zu messen. Angesichts der Robustheit dieses Ansatzes bietet die Korrektur der CSF-Proteinmengen durch denQ-Albumin- und Proteinindex eine Grundlage, anhand derer (1) der pathophysiologische Ursprung eines CSF-Proteins und (2) die Stabilität und funktionelle Bedeutung der Barriereintegrität beurteilt werden können. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, von der CSF- und Blutentnahme bis hin zu den endgültigen Berechnungen zur Korrektur der gesamten CSF-Proteinmenge, die für Mausmodelle bei neurologischen Erkrankungen gilt. Das gleiche Protokoll kann jedoch leicht an die Untersuchung von CSF und der intrathekalen Synthese von Proteinen bei jedem Tier, einschließlich des Menschen, angepasst werden. Q-Albumin und IgG-Index werden bereits häufig in der klinischen Praxis zur Diagnose entzündlicher neurologischerErkrankungen6 verwendet. Dieselben Parameter wurden auch erfolgreich verwendet, um eine breite Palette von Zytokinen und Chemokinen bei Patienten mit entzündlichen demyelinierenden Erkrankungen26,33,34zu bewerten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken den Mitarbeitern des Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) in Dartmouth für ihre fachkundige Betreuung der Mäuse, die für diese Studien verwendet werden. Der Bornsteiner Forschungsfonds finanzierte diese Forschung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL insulin syringe BD 329650
1 mL syringe BD 329622
25 gauge needle BD 305122
3 mL syringe BD 309582
30 gauge insulin needle BD 305106
Absorbent pads Any suitable brand
Acepromazine Patterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic Washer BioRad 171020100 Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader BioRad 171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates BioRad 171025001
Biotinilated detection antibody Any suitable source The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503
Buprenorphine hydrochloride PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Capillary Tubes Sutter Instrument B100-75-10 OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.
Centrifuge tube, 0.2 mL VWR 20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mL VWR 87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mL VWR 87003-294
Chlorhexidine diacetate Nolvasan E004272
Disposable pipettes tips Any suitable brand
Ear bars KOPF Instruments 1921 or 1922
Ethanol Kopter V1001
Freezer VWR VWR32086A
Gauze Medline NON25212
Heating pad Sunbeam XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction Chamber VETEQUIP
Isoflurane Patterson Vet Supply Inc NDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed) Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) BioRad Antibody-coupled magnetic bead
Microplate Shaker Southwest Scientific SBT1500
Microretractors Carfill Quality ACD-010 Blunt - 1 mm
Microsoft Office (Excel) Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel EMD Millipore MGAMMAG-300K Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.
Mouse Albumin capture ELISA kit Novus Biological NBP2-60484 Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.
Multichannel pipette Eppendorf 3125000060
Non-Sterile swabs MediChoice WOD1002 Need to be autoclaved for sterility
Oxygen AIRGAS OX USPEA
Pasteur Pippettes Fisher 13-678-20A 5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen Patterson Vet 8695G P-3 Reverse Cutting, 18"
PE-Streptavidin BD Biosciences 554061
Pipetters Eppendorf Research seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated Centrifuge Beckman Coulter ALLEGRA X-12R
Scale Uline H2716
Scalpel Feather EF7281
Shaver Harvard Apparatus 52-5204
Standard proteins Any suitable source The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.
Stereotaxic instrument KOPF Instruments Model 900LS Standard Accessories
Sterile 1 x PBS Corning Cellgro 21-040-CV
Sterile saline Baxter 0338-0048-02 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2) Fine Science Tools 11271-30 Dumont
Surgical Scissors Fine Science Tools 14094-11 Stainless 25x
Vaporizer + Flow meter Moduflex Anhestesia Instruments
Vortex Fisher 02-215-414
Warming pad Kent Scientific Corporation RT-JR-20
Water Sonicator Cole Parmer EW-08895-01
Xylazine Patterson Vet Supply Inc

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References

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