Entwicklung eines Larval Zebrafish Infection Model für Clostridioides difficile

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Präsentiert hier ist eine sichere und effektive Methode, um Zebrafischlarven mit fluoreszierend markierten anaeroben C. difficile durch Mikroinjektion und nichtinvasive Mikrogavage zu infizieren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, J., Ünal, C. M., Namikawa, K., Steinert, M., Köster, R. W. Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (156), e60793, doi:10.3791/60793 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Clostridioides difficile Infektion (CDI) gilt als eine der häufigsten Gesundheits-assoziierten Magen-Darm-Infektionen in den Vereinigten Staaten. Die angeborene Immunantwort gegen C. difficile wurde beschrieben, aber die genauen Rollen von Neutrophilen und Makrophagen in CDI sind weniger verstanden. In der aktuellen Studie werden Danio rerio (Zebrafisch) Larven verwendet, um ein C. difficile Infektionsmodell für die Abbildung des Verhaltens und der Zusammenarbeit dieser angeborenen Immunzellen in vivo zu etablieren. Zur Überwachung von C. difficilewurde ein Etikettierungsprotokoll mit einem Fluoreszenzfarbstoff eingerichtet. Eine lokalisierte Infektion wird durch Mikroinjektion mit der Bezeichnung C. difficile erreicht, die aktiv im Darmtrakt des Zebrafisches wächst und die Darmepithelschäden bei CDI imitiert. Dieses direkte Infektionsprotokoll ist jedoch invasiv und verursacht mikroskopische Wunden, die experimentelle Ergebnisse beeinflussen können. Daher wird hier ein nichtinvasiveres Mikrogavage-Protokoll beschrieben. Die Methode beinhaltet die Abgabe von C. difficile Zellen direkt in den Darm von Zebrafischlarven durch Intubation durch den offenen Mund. Diese Infektionsmethode imitiert eng den natürlichen Infektionsweg von C. difficile.

Introduction

C. difficile ist ein grampositiver, sporenbildender, anaerobeundischer und toxinproduzierender Bacillus, der die Hauptursache für schwere Infektionen im Magen-Darm-Traktist 1. Typische Symptome von CDI sind Durchfall, Bauchschmerzen und tödliche pseudomembranöse Kolitis, und es kann manchmal zum Tod führen1,2. Es gibt Beweise dafür, dass Immunantworten des Wirts eine entscheidende Rolle sowohl für das Fortschreiten als auch für das Ergebnis dieser Krankheit spielen3. Neben der Immunantwort ist die einheimische Darmmikrobiota entscheidend für den Beginn und die Pathogenese von CDI4. In den letzten zehn Jahren haben sowohl die Zahl der Fälle als auch die Sterblichkeitsrate von CDI aufgrund der Entstehung eines hypervirulenten Stammes von C. difficile (BI/NAP1/027)5,6signifikant zugenommen. Ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Immunmechanismen und der Rolle der Mikrobiota während der CDI wird zu neuen therapeutischen Entwicklungen und Fortschritten führen und eine bessere Bekämpfung dieser Epidemie ermöglichen.

Mehrere Tiermodelle, wie Hamster und Maus, wurden entwickelt, um Einblicke in die Immunabwehr gegen C. difficile7,8zu geben. Die Rolle angeborener Immunzellen ist jedoch noch immer wenig verstanden, zumal das angeborene Verhalten von Immunzellen hauptsächlich aus histologischer Analyse oder kultivierten Zellen in vitro abgeleitet wird. Daher wird die Einrichtung eines transparenten Zebrafischmodells, um die angeborene Immunantwort auf C. difficile innerhalb eines lebenden Wirbeltierorganismus zu enthüllen, solche Studien erleichtern. Zebrafischlarven haben ein funktionelles angeborenes Immunsystem, aber ihnen fehlt das adaptive Immunsystem bis 4-6 Wochen nach der Befruchtung9. Diese einzigartige Eigenschaft macht Zebrafischlarven zu einem ausgezeichneten Modell, um die isolierte Reaktion und Funktion angeborener Immunzellen in CDI zu untersuchen.

Dieser Bericht beschreibt neue Methoden mit Zebrafischlarven, um die Wechselwirkungen zwischen C. difficile und angeborenen Immunzellen, wie Makrophagen und Neutrophilen, zu untersuchen. Zunächst wird ein lokalisiertes Mikroinjektionsprotokoll vorgestellt, das C. difficile Inoculum und Färbung enthält. Mit in vivo konfokale Zeitraffer-Bildgebung wird die Reaktion von Neutrophilen und Makrophagen auf die Infektionsstelle aufgezeichnet, und die Phagozytose von Bakterien durch Neutrophile und Makrophagen wird beobachtet. Es wurde jedoch berichtet, dass die Injektion selbst Gewebeschäden verursacht und zur Rekrutierung von Leukozyten unabhängig von den Bakterienführt 10. Daher wird anschließend ein nichtinvasives Mikrogavage-Protokoll beschrieben, um C. difficile in den Darm von Zebrafischlarven zu liefern. Frühere Studien haben gezeigt, dass einheimische gastrointestinale Mikrobiota einen Wirt vor der Kolonisierung von C. difficile11schützen. Daher werden gnotobiotische Zebrafischlarven auch verwendet, um die Zebrafische, die infiziert sind, zu prädisponieren 12. Danach wird die Darmsektion durchgeführt, um lebensfähige C. difficile zu erholen und die Dauer ihrer Anwesenheit in Zebrafisch-Darmtrakten zu validieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle hier beschriebenen Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den gesetzlichen Bestimmungen durchgeführt (EU-Richtlinie 2010/63, Lizenz AZ 325.1.53/56.1-TUBS und Lizenz AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. Herstellung von niedrigschmelzenden Agarose-, Gelplatten- und Mikroinjektions-/Mikrogavagenadeln

  1. 0,08 g niedrigschmelzende Agarose (Materialtabelle, Agarose A2576) in 10 ml von 30% Danieau-Medium (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) und 17,4 mM NaCl, bei Raumtemperatur (RT) gelagert, um eine 0,8%-Lösung zu erhalten.
    HINWEIS: Es können höhere oder niedrigere Konzentrationen von Agarose verwendet werden. Allerdings variiert die erforderliche Zeit zur Erstarrung für verschiedene Marken von Agarose, auch bei der gleichen Konzentration.
  2. Vorbereiten von Mikroinjektions- und Mikrogavagenadeln aus Glaskapillaren (Materialtabelle).
    1. Verwenden Sie einen Micropipette-Puller mit den folgenden Einstellungen (beachten Sie, dass Einheiten spezifisch für den hier verwendeten Puller sind; siehe Tabelle der Materialien):Mikroinjektionsnadeln (Luftdruck = 500; Hitze = 400; Ziehen = 125; Geschwindigkeit = 75; Zeit = 150); und Mikrogavage Nadeln (Luftdruck = 500; Wärme = 400; Ziehen = 100; Geschwindigkeit = 75; Zeit = 150). Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um 3 l nukleasefreiH2O in die gezogene Nadel zu laden.
    2. Führen Sie die Nadel in den Injektor ein und befestigen Sie sie richtig. Stellen Sie die Nadel auf einen geeigneten Injektionswinkel ein. Stellen Sie den Einspritzdruck zwischen 600–900 hPa für Mikroinjektionsnadel und 200–300 hPa für Gavage-Nadel ein.
    3. Legen Sie einen Tropfen Mineralöl auf den schwarzen Kreis des Kalibrierschlittens. Verwenden Sie feine Zangen, um die Spitze der Nadel zu beschneiden. Injizieren Sie einen Tropfen in das Mineralöl, um die Größe des Tröpfchens zu messen.
    4. Passen Sie bei der Mikroinjektion die Injektionszeit an, um ein Tröpfchen mit einem Durchmesser von 0,10–0,12 mm zu erhalten, was einem Volumen von 0,5–1,0 nL entspricht. Für Mikrogavage erhalten Sie ein Tröpfchen mit einem Durchmesser von 0,18–0,20 mm, was einem Volumen von 3–5 nL entspricht.
  3. Bereiten Sie eine 1,5 % Agaroseplatte mit Agarose(Tisch der Materialien, 8050) in einer 10 cm Petrischale in 30% Danieaus Medium mit einer Kunststoffform als Mikrogavage-Form vor. Bei 4 °C lagern, um eine Austrocknung zu verhindern, bis sie benötigt wird. Vor dem Experiment auf RT oder 28 °C erwärmen.

2. Herstellung und Kennzeichnung von C. difficile und Sporen mit fluoreszierendem Farbstoff

  1. Bereiten Sie eine 1 mM Stammlösung eines Fluoreszenzfarbstoffs vor (Materialtabelle). Da der Farbstoff in 50 g Aliquots Pulver verkauft wird, fügen Sie der Durchstechflasche 69 l DMSO hinzu, um eine Lagerkonzentration von 1 mM zu erhalten.
  2. Bereiten Sie eine 100-M-Arbeitslösung des Fluoreszenzfarbstoffs vor, indem Sie in einem Zentrifugenrohr eine 18-L-L-Lösung von 1 m M zu 18 l DMSO hinzufügen und gut mischen.
  3. Culture C. difficile (R20291, ein Ribotyp 027 Stamm) durch Impfung von 10 ml BHIS flüssigem Medium mit zwei bis drei Kolonien von einem Teller in einer anaeroben Haube ohne über Nacht zu schütteln. BHIS wird BHI mit 0,5% (w/v) Hefeextrakt und 0,1% (w/v) L-Cystein ergänzt. 1 g L-Cystein in 10 ml ddH2O auflösen und durch Filtration sterilisieren, dann dem autoklavierten Medium hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1 g/L zu erhalten. Platten werden durch Zugabe von 15 g/L Agar-Agar vor dem Autoklavieren hergestellt. Die selektive Kultivierung von C. difficile erfolgt unter Verwendung von chromID C. difficile Platten (Tabelle der Materialien).
  4. Färbung C. difficile mit dem fluoreszierenden Farbstoff
    1. C. difficile bei einem OD600 von 1.0–1.2 und waschen 1x mit 1 ml 1x PBS (5.000 x g für 3 min bei RT). Resuspend in 1 ml von 1 x PBS.
    2. Fügen Sie 3 l Arbeitslösung des Fluoreszenzfarbstoffs in 1 ml Bakteriensuspension hinzu. Inkubieren Sie die Probe für 15 min bei RT im Dunkeln. Waschen Sie die gebeizte C. difficile einmal mit 1 ml PBS, um Restfarbstoff zu entfernen und in 1x PBS auf eine OD600 von 1,0 (1,0 OD600 entspricht etwa 108 cfu/ml).

3. Injektion von Stained C. difficile in Zebrafischlarven

  1. Anästhetisieren Sie 20–30 Zebrafischlarven an 5 Tagen nach der Befruchtung (hier als 5 dpf bezeichnet) mit 0,02%–0,04% Tricain (Tricainpulver wird in doppeldestilliertem Wasser gelöst und auf pH = 7 mit 1 M Tris-HCL-Lösung eingestellt) in 30% Danieaus Medium 10 min vor Injektion. Die anästhesierten Larven in eine frische 10 cm Petrischale geben und überschüssiges 30% Danieaus Medium entfernen.
  2. Legen Sie einen Tropfen von 0,8% niedrig schmelzende Agarose auf die Zebrafischlarven zu decken. Stellen Sie die Larven vorsichtig auf eine seitliche Position ein. Legen Sie die Petrischale für 30-60 s auf Eis, damit sich die niedrig schmelzende Agarose erstarren lässt. Fügen Sie 30% Danieaus Medium mit 0,02%–0,04% Tricain hinzu, um die Agarose abzudecken.
  3. Bereiten Sie die Injektionslösung vor. Fügen Sie 1 l 0,5% Phenolrot in PBS-Lösung in 9 l des farbstoffgefärbten C. difficile inoculum hinzu, um den Injektionsprozess zu visualisieren.
  4. Laden Sie eine kalibrierte Mikroinjektionsnadel mit der Injektionslösung mit einem Mikrolader. Montieren Sie die geladene Nadel auf einen Mikromanipulator und positionieren Sie sie unter einem Stereomikroskop.
  5. Stellen Sie den Einspritzdruck zwischen 600–900 hPa ein. Stellen Sie die Injektionszeit auf 0,1–0,3 s ein, um 0,5–1,0 nL zu erhalten. Stellen Sie die Nadel im Mikromanipulator in einem Winkel von 45° in Richtung der eingebetteten Larven ein.
  6. Legen Sie die Nadelspitze über den Magen-Darm-Trakt in der Nähe der Urogenitalpore. Durch Agarose dann den Muskel mit der Nadelspitze durchbohren, dann in das Darmlumen einsetzen und 0,5–1,0 nL C. difficileinjizieren. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die injizierten Larven zu überwachen und die richtig injizierten Larven für die konfokale Bildgebung aufzunehmen.

4. Erzeugung von gnotobiotischen Zebrafischlarven

  1. Verwenden Sie die etablierte natürliche Züchtungsmethode, um gnotobiotische Zebrafischembryonen zu erzeugen, einschließlich: In-vitro-Fertilisation, Waschen mit antibiotikahaltigem Medium (1 g/ml-Amphotericin B, 10 g/ml Kanamycin und 20 g/ml Ampicillin), Waschen mit 0,1% Gew/Vol-Polyvinylpyrrolidon-Jod (PVP-I) Und Inkubation der Embryonen in einer Zellkulturhaube12.
  2. Pflegen Sie alle gnotobiotischen Zebrafischlarven unter gnotobiotischen Bedingungen bis 5 dpf oder kurz vor der Gavage. Nach der Gavage werden Zebrafischlarven in einen Standard-Inkubator überführt, jedoch mit sterilem 30% Danieau-Medium.

5. Gavage von Zebrafisch Larven

  1. Kalibrieren Sie die Mikrogavage-Nadel wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  2. Messen Sie den Durchmesser der Nadelspitze, indem Sie die Nadel mit einem Tropfen Mineralöl auf einem Kalibrierschlitten platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Spitze einen Durchmesser von 30 bis 40 m, stumpf und glatt hat. Entsorgen Sie die scharfen oder rauen Nadeln.
    HINWEIS: Scharfe Kanten von Nadeln können durch schnelles Flammen abgestumpft werden.
  3. Bereiten Sie die gavage-Lösung wie in Schritt 3.3 beschrieben vor.
  4. Laden und montieren Sie die Nadel auf einen Mikromanipulator, wie in Schritt 3.4 beschrieben. Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass die Nadel in einem 45°-Winkel positioniert wird.
  5. Anästhesisieren Sie die Zebrafischlarven, auf die in Schritt 3.1 Bezug genommen wird. Wenn sich die Larven nicht mehr bewegen, übertragen Sie sie mit einer Pasteurpipette in die Nut einer Mikrogavage-Form.
  6. Legen Sie einen Tropfen von 0,8% niedrig schmelzende Agarose auf die Zebrafischlarven zu decken. Stellen Sie die Larven vorsichtig mit Köpfen an, die in 45°-Winkeln in der Nut aufrecht ausgerichtet sind, und Schwänzen an der Wand der Nut. Stellen Sie sicher, dass die Winkel der Köpfe ungefähr gleich sind, so dass sie mit dem Winkel der Gavage-Nadeln ausgerichtet sind. Legen Sie die Mikrogavage-Form für 30-60 s auf Eis, so dass die niedrig schmelzende Agarose erstarren kann, um die Positionen der Larven zu stabilisieren.
  7. Stellen Sie den Einspritzdruck zwischen 200–300 hPa ein. Stellen Sie die Injektionszeit auf 0,1–0,3 s ein, um ein Injektionsvolumen von 3–5 nL C. difficile zu erhalten.
  8. Betätigen Sie die Nadel vorsichtig durch die Agarose und dann in den Mund von Zebrafischlarven, durch die Speiseröhre. Sobald sich die Spitze der Nadel in der vorderen Darmlampe befindet, drücken Sie das Injektionspedal, um die Bakterien freizusetzen. Füllen Sie das Lumen des Darms mit dem gelieferten Volumen. Lassen Sie es nicht von der Speiseröhre oder Kloake überlaufen. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus dem Mund des Zebrafisches.
  9. Nach dem Gavage die infizierten Zebrafischlarven mit einer flexiblen Mikroladerspitze aus der Agarose retten, indem Sie die Agarose zunächst wegschneiden und dann die Larven anheben. Übertragen Sie diese Larven in sterile 30% Danieaus Medium. Spülen Sie die Larven zweimal in sterilem Medium. Die Larven in eine frische 10 cm Petrischale geben. Die Larven werden für bis zu 11 dpf gehalten.

6. Konfokale Mikroskopieanalyse von injizierten Zebrafischlarven

  1. Anästhesisieren Zebrafischlarven bezogen sich auf Schritt 3.1. Machen Sie ein Loch in den Boden einer 35 mm Petrischale mit einem Glasschlitten, der an der Bohrung befestigt ist, die als Bildkammer bezeichnet wird. Übertragen Sie Embryonen mit einer ausreichenden Menge von 30% Danieaus Medium auf den Boden der Bildkammer.
  2. Fügen Sie 200–300 l mit 1% niedrigschmelzender Agarose hinzu, um die anästhesierten Larven abzudecken. Da ein invertiertes konfokales Mikroskop verwendet wird, legen Sie den infizierten Bereich der Larven so nah wie möglich gegen die Glasrutsche.
  3. Lassen Sie die Agarose auf Eis für 30-60 s erstarren. Tauchen Sie die Agarose mit 30% Danieaus enthalten0%02%–0,04% Tricain.
  4. Stellen Sie die Larven mit einem konfokalen Laserscanmikroskop (Materialtabelle) auf.

7. Dissektion von Larval Zebrafisch Darm lebensfähig C. difficile

  1. Isolieren Sie Magen-Darm-Trakte von Larven, um die bakterielle Belastung zu analysieren. Beginnen Sie mit der Einschlässung von Zebrafischlarven mit 0,4 % Tricain.
  2. Den Zebrafisch kurz mit sterilem 1x PBS abspülen und auf eine frische Agaroseplatte geben.
  3. Zerlegung von Zebrafischen
    1. Legen Sie eine Nadel in den Rückenstamm von Zebrafischlarven in der Nähe des Kopfes, um den Zebrafisch zu immobilisieren. Entfernen Sie den Kopf hinter den Kiemen mit einer Lanze.
    2. Setzen Sie die zweite Nadel in die Mitte des Rückenstamms ein. Setzen Sie die dritte Nadel in den Bauch des Zebrafisches und ziehen Sie den Darm aus der Körperhöhle.
      HINWEIS: Es ist äußerste Sorgfalt erforderlich, um den intakten Darm zu isolieren. Wenn es schwierig ist, dies zu tun, führen Sie zusätzliche Züge durch, um den Rest des Darms von den verbleibenden inneren Organen zu trennen.
    3. Verwenden Sie eine Mikroinjektionsnadel, um 10–15 Darm in ein 1,5 ml-Rohr zu übertragen, das 200 l steril mit 1x PBS enthält.
    4. Homogenisieren Sie den Darm mit einem Stößel, um das Gewebe zu stören und Homogenate vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass der Stößel den Boden des Rohres erreicht, um alle Eingeweide vollständig zu stören.
  4. Inkubieren Sie die Homogenate in C. difficile Aufzuchtmedium, das D-Cycloserin und Cefoxitin enthält, mit oder ohne Taurocholat (TCA, ein Keimmittel von C. difficile sporen) in einer anaeroben Kammer.
  5. Inkubieren Sie die Platte anaerob für 48 h bei 37 °C.
  6. Verwenden Sie die Bakterienkultur für 16S rRNA-PCR.
    1. Setzen Sie eine Kolonie in 50 lh2O aus und kochen Sie sie bei 95 °C für 15 min. Pellet die lysierten Ablagerungen durch Zentrifugation (14.000 U/min für 2 min bei RT) und verwenden Sie 2 l des Überstandes als Vorlage in 25 l PCR-Reaktion mit C. difficile-spezifischenPrimern (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
    2. Wenn Bakterien aus flüssiger Kultur verwendet werden, 1 ml Kultur ernten und einmal mit 1 ml PBS (14.000 Rpm für 2 min bei RT) waschen. Das Pellet in 100 lh2Odd wieder aufhängen und wie oben durchgeführt behandeln. Um die Bakterienkolonien weiter zu charakterisieren, streifen Sie auf einer BHIS- oder ChromID-Platte (Materialtabelle).

   

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C. difficile ist streng anaerobe, aber das Chromophor von fluoreszierenden Proteinen erfordert in der Regel Sauerstoff zu reifen. Um dieses Problem zu überwinden, wurde ein fluoreszierender Farbstoff verwendet, um lebende C. difficile Zellen zu färben, die aktiv wuchsen (R20291, ein Ribotyp 027 Stamm; Abbildung 1A). Mit dem Gal4/UAS-System wurden stabile transgene Zebrafischlinien für die Live-Bildgebung erzeugt, bei denen die mpeg1.1- oder lyZ-Promotoren die Expression von EGFP-Fluoreszenzprotein in Makrophagen bzw. Neutrophilen (bzw.) auf Gal4-abhängige Weise trieben.

Das gefärbte C. difficile wurde in den Darmtrakt des Zebrafisches bei 5 dpf injiziert, und die infizierten Stellen wurden nach 1 h Inkubation abgebildet. Die Zeitraffer-Bildgebung zeigte, dass sowohl Neutrophile als auch Makrophagen die Infektionsstellen erreichten (Abbildung 1B), und die Anzahl dieser beiden angeborenen Immunzellen nahm zu, bis das C. difficile gelöscht wurde. Die Rodung erfolgte durch Phagozytose und Verdauung des markierten C. difficile. Abbildung 1C zeigt, dass ein aktiviertes Makrophagen zwei C. difficile Bakterien phagozytisiert (siehe Ergänzender Film 1).

Figure 1
Abbildung 1: Färbung und Infektion von C. difficile bei Zebrafischen. (A) Fluoreszierend als C. difficile Bakterien in infizierten Zebrafischen nach Mikroinjektion gekennzeichnet. Skala bar = 5 m . (B) Konfokale Z-Stack-Projektion mit grünen fluoreszierenden Neutrophilen in doppeltransgenen Zebrafischen Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 an der C. difficile Infektionsstelle bei 2 h Nachinfektion (hpi) angesammelt. Neutrophile werden in grün und C. difficile in rot dargestellt. Skala bar = 50 m. (C) Konfokale Zeitraffer-Bildgebung mit GFP-markierten Makrophagen phagozytosing rot fluoreszierend gefärbt C. difficile. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Obwohl Mikroinjektion die häufigste Methode ist, um Zebrafischlarven mit Krankheitserregern zu infizieren, verursacht diese Methode ausnahmslos Gewebeschäden, die experimentelle Ergebnisse beeinflussen können. Um dieses Problem zu vermeiden, wurde Mikrogavage verwendet, um fluoreszenzmarkierte C. difficile in das Darmlumen von Makrophagen und Neutrophilen-Reporterlinien bei 5 dpf zu liefern, die den natürlichen Weg von CDI imitiert (Abbildung 2A). Neutrophile und Makrophagen zeigten jedoch keine offensichtliche Migration in den Magen-Darm-Trakt für bis zu 12 h nach Mikrogavage (Abbildung 2B). In der Zwischenzeit verschwand die Fluoreszenz des markierten C. difficile nach ca. 5 h nach der Mikrogavage, wahrscheinlich aufgrund von 1) enzymatischer Zerstörung, 2) unangemessenen pH-Werten im Darm von Zebrafischen oder 3) Beginn der Sporenbildung und begleitender Membranveränderungen in den Bakterien (Abbildung 2B). Daher wurde eine Darmsesektionsmethode zum Nachweis von C. difficileeingeführt.

Figure 2
Abbildung 2: Mikrogavage von Zebrafischlarven mit C. difficile. (A) Repräsentatives Bild von Zebrafischlarven bei 5 dpf mit fluoreszenzbeflecktem C. difficilegekrümmt. Das Bild wurde um 3 h nach der Gavage aufgenommen, was zeigt, dass C. difficile im hinteren Darm von Zebrafischen vorhanden waren. Scale bar = 100 m . (B) Konfokale Zeitraffer-Bildgebung, die die Makrophagenmotilität demonstriert. Doppelte transgene Zebrafischlarven Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 bei 5 dpf wurden mit Fluoreszenz-labeliert C. difficilegegavaged. Die konfokale Zeitraffer-Bildgebung wurde für bis zu 12 h durchgeführt. Scale bar = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um zu bestätigen, ob C. difficile in der Lage war, Zebrafische zu bewohnen, wurden Zebrafisch-Darm zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Gavage getrennt. Dann wurden die isolierten Därme mit Plastikschädlingen homogenisiert und Homogenate in C. difficile Medium mit D-Cycloserin und Cefoxitin, mit oder ohne TCA inkubiert. Aktiv wachsende C. difficile Zellen wurden jedoch nur bis zu 24 h nach der Infektion sowohl mit als auch ohne TCA nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Es wird spekuliert, dass die indigenen mikrobiellen Gemeinschaften in konventionellen Larven C. difficile Invasion wegen ihrer KolonisationSresistenz verhindert.

Gnotobiotische Zebrafischlarven wurden auch verwendet. Darmproben 24 PSi wurden seziert und zeigten bakterielles Wachstum im Medium mit TCA oder ohne TCA, während keine Bakterien in der Kontrollgruppe wuchsen (Abbildung 3A). Zu späteren Zeitpunkten (d. h. 48 PSi, 72 PSi und 120 PSi) wuchsen die inkubierten Proben jedoch nur in dem Medium, das TCA enthielt, was darauf hindeutete, dass insgesamt C. difficile im Darm Sporen gebildet hatte (Abbildung 3B). Dies liefert eine mögliche Erklärung für den Verlust der Fluoreszenzkennzeichnung.

16S rDNA PCR wurde dann verwendet, um die gewachsenen Bakterien als C. difficilezu identifizieren, die spezifische PCR-Amplicons von vorhersehbarer Größe produzierten (ca. 800 bp; Abbildung 3C). Dieses Ergebnis wurde durch sequenziierende Sequenzierung dieser PCR-Produkte weiter überprüft. Anschließend wurden Bakterienkulturen auf einer BHIS-Platte verbreitet. Mehrere einzelne Kolonien wurden dann auf eine ChromID-Platte übertragen, die nur das C. difficile Wachstum unterstützte. Die Bakterien erschienen als typische schwarze Kolonien, was weiter darauf hindeutete, dass Bakterien aus dem Zebrafischdarm C. difficile waren (Abbildung 3D).

Figure 3
Abbildung 3: Nachweis von C. difficile im Zebrafischdarm nach einer Infektion. Für jedes der unabhängigen Experimente wurden 15–20 gnotobiotische Zebrafischlarven bei 5 dpf mit 3–5 nL von 108 KBE/ml C. difficile oder PBS als negative Kontrolle durch Mikrogavage infiziert. (A) Die Homogenate der sezierten Eingeweide wurden kultiviert. Bakterien wuchsen im Medium, das TCA 72 h enthält, nach einer Infektion mit gnotobiotischen Zebrafischlarven (1, nicht infizierte Kontrollgruppe; 2, R20291-infizierte Zebrafische; n = 3). (B) Schematische Darstellung der Gesamtversuchsergebnisse nach 24 h, 48 h, 72 h und 120 h nach der Infektion mit C. difficile (n = 3) (C) Bakterielle Proben wurden mit 16S rDNA PCR bei 72 h Postmikrogavage (1, nicht infizierte Kontrollgruppe; 2, R20291-infizierte Zebrafische; n = 3) getestet. (D) Das Wachstum von C. difficile auf ChromID-Platte; beachten Sie die schwarze Farbe von C. difficile, die ein Merkmal dieser Platten ist (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Movie 1
Ergänzender Film 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die vorgestellten Methoden modifizieren und erweitern einen bestehenden Ansatz zur Infektion von Zebrafischlarven durch Injektion und Mikrogavage10,14. Es zeigt auch einen Ansatz zur Untersuchung anaerobe Krankheitserreger mit Zebrafischlarven22. Darüber hinaus erleichtert das Protokoll die Analyse angeborener Immunzellreaktionen in vivo nach CDI und nach Deronisation von C. difficile bei Zebrafischen. Die Methode ist reproduzierbar und einfach in einem Routinelabor oder klinischen Umfeld durchzuführen.

Zur Überwachung der Phagozytose von C. Difficile von Leukozyten wurden zwei stabile transgene Zebrafischlinien verwendet (z.B. Tg[mpeg1.1: KalTA4]bz16), um Makrophagen (KalTA4: eine Zebrafisch-optimierte Gal4-Variante) und Tg(lyz: KalTA4)bz17 zu visualisieren und Neutrophile zu visualisieren, wenn sie mit dem transgenen Hintergrund von Tg(4xUAS: EG)hzm3-Trägern gekreuzt werden. Aufgrund der anaeroben Umgebung, die für das Wachstum von C. difficileerforderlich ist, sind genetische Werkzeuge zur Verfolgung von C. difficile begrenzt. Obwohl ein codonoptimierter mCherryOpt gemeldet wurde, um sie zu kennzeichnen, müssen C. difficile Bakterien fixiert werden, bevor sie Fluoreszenz aufweisen, bevor sie in Live-Bildgebungseinstellungen13verwendet werden. Daher wurde hier ein fluoreszierender Farbstoff verwendet, um lebende C. difficile mit roter Fluoreszenz zu färben, die mit den zahlreichen verfügbaren grünen fluoreszierenden transgenen Zebrafischstämmen kombiniert werden kann. Diese Methode kann leicht auf andere darmanaerobe Bakterien angewendet werden, wie Bacteroides fragilis und Helicobacter hepaticus. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass sowohl Neutrophile als auch Makrophagen bei infizierten Zebrafischen erkennen und Phagozytose C. difficile erkennen können.

Sowohl Immersion als auch Mikroinjektionsmethoden wurden regelmäßig verwendet, um Zebrafische20,21,22zu infizieren. Die Verwendung von Tauchmethoden ist einfach, aber dieser Ansatz macht es schwierig, die Invasionszeit von Bakterien in den Darm genau zu kontrollieren. Mikroinjektion ist die häufigste Methode, um Zebrafisch-Embryonen mit Krankheitserregern zu infizieren, verursacht aber ausnahmslos Gewebeschäden. Daher wurde Mikrogavage verwendet, um den natürlichen Infektionsweg nachzuahmen.

Es wurde jedoch festgestellt, dass gefärbte C. difficile um 5 h nach der Mikrogavage nicht nachweisbar wurde. Die Gründe dafür sind derzeit unklar, können aber entweder mit der 1) Intoleranz des Fluorophors unter Darmbedingungen oder 2) der Einleitung der Sporenbildung von C. difficile Zellen zusammenhängen. Es wurde ferner festgestellt, dass C. difficile in der Kultur der Volllarvenhomogenate nicht nachweisbar waren. Daher wurde der Darm jedes infizierten Zebrafisches seziert und dann kultiviert, um festzustellen, ob C. difficile noch das Darmgewebe von Zebrafischen bewohnte.

Aufgrund der einheimischen Mikrobiota konventioneller Mäuse sind nur Mäuse, die mit einem Antibiotikum-Cocktail oder gnotobiotischen Mäusen vorbehandelt werden, anfällig für C. difficile16. Ebenso wurde festgestellt, dass C. difficile nur im Darm von gnotobiotischen Zebrafischen nachgewiesen wurde, aber nicht bei konventionellen Wildzebrafischen 24 h nach der Infektion. Interessanterweise wuchsen Darmproben von 48 h, 72 h und 120 h Zebrafische nach der Infektion nur in Medien, die TCA enthielten. Wie oben beschrieben, stimuliert TCA die C. difficile Sporenkeimung in vitro. Dieses Ergebnis legt nahe, dass aktive C. difficile Zellen bereits vegetative Sporen im Zebrafischdarm bildeten und sporenabgeleitete Kolonien mit dem Mikrogavage-Ansatz nachgewiesen wurden.

Faszinierenderweise traten keimfreie Zebrafische immer noch nicht auf, wie z. B. der Darmneutrophilenzustrom oder sogar der Tod von Zebrafischen. Dies zeigt, dass eine Infektion durch Injektion angeborene Immunzellen durch Wundung aktivieren kann und dass nur aktivierte Makrophagen und Neutrophile in der Lage sind, C. difficileschnell zu erkennen. Darüber hinaus basiert eine wahrscheinliche Erklärung für den Mangel an prominenten CDI bei Zebrafischen auf den strukturellen Unterschieden zwischen Zebrafischen und Säugetierdärmen17. Dem Zebrafisch darm fehlen Darmkrypen, wo C. difficile häufig18. Zusammen mit der niedrigeren Erhaltungstemperatur von Zebrafischen im Vergleich zu der bei Säugetieren wurde daraus geschlossen, dass der Beginn von CDI bei Zebrafischen nicht so schnell auftritt wie bei Säugetiermodellen. Jedoch, zwei anaerobe Bakterien der menschlichen Mikrobiota, Lactobacillus paracasei und Eubacterium limosum, haben sich bewährt, innerhalb der Zebrafisch Darm19wachsen. Die hier vorgestellten technischen Fortschritte werden die Anwendung dieser Methode zur Untersuchung von C. difficile und anderen Bakterien oder Krankheitserregern aus dem Säugetierdarm in molekular beätzbaren Zebrafischlarven in vivo fördern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Timo Fritsch für die hervorragende Tierpflege. Wir danken den Mitgliedern der Labore Köster und Steinert für die Unterstützung und die hilfreichen Gespräche. Wir danken Dr. Dandan Han für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken der Finanzierung durch das Land Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A2576 Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM) Pronadisa 8050 It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial Stain Thermo Fisher Scientific B35001 Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion Broth Carl Roth GmbH X916.1
Brass (wild-type) deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2) Sigma-Aldrich C1396
Capillary Glass Harvard Apparatus 30-0019 Injection needles
Clostridioides difficile R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSO Carl Roth GmbH A994
FIJI open-source platform Image processing
HEPES Carl Roth GmbH 6763
Horizontal needle puller Sutter instrument Inc P-87
L-cysteine Sigma-Aldrich 168149
Leica Application Suite X (LAS X) Leica Image processing
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth GmbH P026
Micro injector eppendorf 5253000017
Microinjection molds Adaptive Science Tools TU1
Leica SP8 confocal microscope Leica
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH 5346
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth GmbH 9265
Taurocholate Carl Roth GmbH 8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
Yeast extract BD Bacto 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
  2. Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
  3. Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
  4. Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
  5. Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
  6. Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
  7. Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
  8. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  9. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
  10. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  11. Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
  12. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
  13. Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81, (5), 1652-1660 (2015).
  14. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
  15. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, (6), 1984-1992 (2008).
  16. Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
  17. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  18. Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
  19. Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
  20. Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
  21. Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
  22. Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics