In vitro-differentiering av Mouse embryonala stamceller (MES) celler med hängande släpp-metoden

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denna video visar hur du utföra in vitro-differentiering av mus-embryonala stamceller till embryoid organ med hängande släpp-metoden.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stamceller har den anmärkningsvärda potential att utvecklas till många olika celltyper. När en stamcell delar sig har varje ny cell potential att antingen förbli en stamcellstransplantation eller bli en annan typ av cell med en mer specialiserad funktion, är detta lovande vetenskapens ledande forskare att undersöka möjligheten av cellbaserade terapier för behandling av sjukdomen. När kultur i avstängning utan antidifferentiation faktorer, embryonala stamceller skiljer spontant och bildar tredimensionella flercelliga aggregat. Dessa cellaggregat kallas embryoid organ (EB). Droppe kultur är en allmänt använd EB bildandet induktion metod. Den rundade botten droppe tillåter aggregering av ES-celler som kan ge MES celler en god miljö för att bilda EBS. Antalet ES-celler aggregatied i en droppe kan kontrolleras genom att variera antalet celler i den inledande cellsuspension att hängas som en droppe från locket på en petriskål. Med denna metod kan vi reproducerbart bilda homogena EB från ett förutbestämt antal ES-celler.

Protocol

  1. Gelatinize T75 kolven med hjälp av en 0,1% gelatin-lösning och inkubera plattan i 37 ° C, 5% CO 2 vävnadsodling inkubator natten en dag innan.
  2. Ta ut MES celler från inkubera, aspirera mediet, skölj kultur ES-celler med PBS, lägg till 0,05% trypsin lösning att belägga botten av skålen (2 ml/100mm tallrik).
  3. Inkubera vid 37 ° C i ca 1 minut, tills cellerna avskedandet plattan.
  4. Försiktigt mal sönder (Pipettera upp och ner) den trypsinized celler fyra till sex gånger för att skingra ES-celler med en ansluten pasteurpipett,. Överför spridda ES-celler i ett 15-ml koniskt centrifugrör innehållande uppvärmd (37 ° C) MES medium.
  5. Samla cellerna genom centrifugering. Aspirera supernatanten, tillsätt 10 ml av MES medelstora och pipett upp och ner för att bilda en enda cell suspension.
  6. Överför cellsuspension i en T75 kolv redan belagda med 0,1% gelatin och inkubera vid 37 ° C med 5% CO 2 i en timme

    * Efter en timme har fibroblaster fäst vid plattan, men stamceller kvar i mediet. Pipettera upp mediet för att samla stamceller.

  7. Snurra cellerna vid 1000 rpm i 5 minuter och aspirera från MES medium. Tillsätt därefter ytterligare 10 ml MES differentiering medium och återsuspendera cellerna repetitiva pipettering tills det verkar vara en fin suspension av celler.
  8. Räkna celler med en hemocytometer använda differentiering medel för att späda ut suspensionen stamceller till en koncentration av 400 till 500 celler per 20ul (20ul/drop) i en steril bassäng.
  9. Lyft locket, försiktigt invertera den och placera den på toppen av skålen innehåller 10 ml PBS. Med hjälp av en flerkanalspipett, göra rader av 20ul droppar på upp-vände insidan av locket på vävnadsodling skålen.
  10. Placera försiktigt skålen i inkubatorn i 2 dagar. Efter två dagar, försiktigt vända plattan täcka, aspirera 180 ul färska differentiering medellång och satte flera droppar i brunnen av en 96-håls ultralåga fästplattan. Sedan pickup nedgången med pipetten och överföra droppar, en i taget, till den 96-brunnar. Placera plattorna i inkubatorn ostört i 3 dagar.
  11. Coat varje brunn i en 48-såväl vävnadsodling tallrik med 300ul på 0,1% gelatin. När du lagt till gelatin, Inkubera plattan över natten vid 37 ° C en dag kvar innan överföra EBS.
  12. Nästa dag aspireras gelatin från 48-brunnar. Tillsätt sedan 300 ul av differentiering medium till varje brunn. Överför EBS från 96 brunnar till 48 väl gelatin-plåt en efter en. Ändra mediet nästa dag och sedan ändra på medellång varannan dag för att upprätthålla cellernas.
  13. Spontan cardiaomyocyte sammandragningar bör vara tydlig inom 7 dagar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nackdelarna med hängande släpp-metoden är följande: den flytande volym av en droppe är begränsad till mindre än 50ul grund för att upprätthålla hänger droppar på locket genom ytspänning, och det är omöjligt att ändra medium för hängande droppar. Observation bilda strandsandaler droppar direkt med mikroskopi är också mycket svårt under odlingen. Vidare består droppe metoden i två steg, därför kan ett antal steg i droppe metoden vara besvärande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
  2. Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).

Comments

7 Comments

  1. Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 7:13 AM
  2. hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 12:09 PM
  3. Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2008 - 3:02 AM
  4. Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 8:00 AM
  5. Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2008 - 3:59 AM
  6. Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 12, 2009 - 10:42 AM
  7. Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 26, 2011 - 11:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics