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Articles by Alberto Bartesaghi in JoVE
JoVE Immunology and Infection
低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定
1Laboratory of Cell Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, 3National Library of Medicine, National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia, 7Duke University, 8Yale University, 9University of Notre Dame, 10Washington University in St. Louis, 11Bioinformatics and Computational Biosciences Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
プロトコルは、低温電子トモグラフィーと三次元画像処理を用いた膜タンパク質の構造を決定するためにハイスループットなアプローチを説明します。それは、試料の準備の詳細、データ収集、データ処理や解釈をカバーし、アプローチの代表的なターゲット、HIV - 1エンベロープ糖タンパク質の生産で締めくくります。これらの計算手順は、リモートで作業し、データ処理および構造解析に貢献する研究者や学生を可能にする方法で設計されています。
Other articles by Alberto Bartesaghi on PubMed
電子断層の定量的解釈のためのエネルギーベースの3次元セグメンテーションアプローチ
電子線トモグラフィーでは、光学顕微鏡では不可能であることよりも有意に高い解像度で細胞や組織の三次元構造の決定が可能になります。電子断層は、原則として、細胞内のアセンブリとオルガネラの多数の場所とのアーキテクチャ上で大量の情報が含まれています。断層の機能解析のための信頼できる定量的なアプローチの開発が重要な問題、および生物学電子顕微鏡画像に固有の低信号対ノイズ比に起因する困難な見通しです。これは、一部には、生物試料の途方もない複雑さの結果である。我々はHIV粒子とHIV感染ヒトマクロファージから派生した固定、プラスチック包埋切片から記録された電子断層で選択された細胞区画の自動セグメンテーションのための新しい方法について報告する。断層内の個々の機能は、画像の特徴によって定義された距離空間のグローバル極小曲面とその境界を検出するロバストアルゴリズムを使用してセグメント化されています。最適化は、セグメンテーションエネルギーの迅速かつ正確な最小化のために適切な設定を提供し、都心の粒子の内部点を持つ変換球状ドメインで行われる。このメソッドは、HIV感染症の生化学的マーカーとの相関のための細胞やプレゼントの機会のアセンブリのさまざまな段階での半自動検出し、HIV粒子の統計的評価のためのツールを提供しています。ここで開発したセグメンテーションアルゴリズムは、電子断層の自動分析の基礎を形成し、データ収集率の急激な増加与えられた特に有用であろう。また、このような大規模な集団の研究から、HIV感染細胞の断層解析から得られたかもしれないものとして非常に大規模なデータセット、の研究を可能性があります。
T細胞とSIV/HIV-1間の接触の電子線トモグラフィー：ウイルスの侵入のための含意
ヒトとサル免疫不全ウイルス（HIVとSIV）を含む霊長類レンチウイルスのエンベロープ糖タンパク質は、膜貫通糖タンパク質（通常はgp41の）と、ウイルスの侵入を開始するために、標的細胞上のCD4を結合する表面糖タンパク質（gp120の）のヘテロダイマーである。我々は分離やCD4 +標的細胞と接触してSIVウイルス粒子の精製三次元のアーキテクチャを決定するために電子線トモグラフィーを使用しています。三量体ウイルスのエンベロープ糖タンパク質表面のスパイクは、外観で異質であり、典型的に約120遠位端の長さ約120幅。 T細胞表面上にSIVまたはHIV-1のドッキングすることで首状のコンタクト領域を介して発生した約400幅と一貫して五から七棒状の機能の密なクラスタは、それぞれ約100から構成されて長いと約幅100。ウイルスは、抗CD4抗体、CCR5拮抗薬TAK779、またはペプチドエントリ阻害剤SIVmac251 C34の存在下でTリンパ球とインキュベートされたときは、この独特の構造が観察されていません。細胞に結合したウイルス粒子については、いくつかの三量体であってもウイルス粒子当たり、多くの70のエンベロープ糖タンパク質三量体を示すウイルス製剤が使用された場合には、ビリオンセル·インタフェースでは、このクラスタから離れて観察した。 "エントリの爪"という言葉は、この接触領域は、ウイルスの侵入の分子機構を理解するための空間的なコンテキストを提供します。エントリの爪の分子組成と構造の決定は、HIV-1のエントリの抑制のための改良された薬物の同定を容易にすることができる。
ウイルスの電子線トモグラフィー
包まれ、複雑なウイルスの分子構造を理解することは構造生物学に挑戦的なフロンティアです。これらのウイルスでは、あるウイルス粒子から別の構造と組成変化は、一般的に成功した対称性の高いウイルスが過去に実装されている手順を平均結晶またはイメージのいずれかの使用を排除します。染色標本のクライオ電子線トモグラフィーの進歩は、染色されたとプランジ凍結細胞の電子線トモグラフィーは、ウイルスの侵入の細胞のコンテキストを可視化するために使用され、識別、およびそのような精製されたウイルスの表面糖タンパク質スパイクなどの個々のサブコンポーネントの分子の平均のための新しい機会を提供しながら、とレプリケーション。彼らは異種とpleiomorphicウイルスの生物学の我々の理解に関連するここでは、両方の分野における最近の進展を確認してください。
ネイティブのHIV-1のgp120三量体の分子構造
ヒトとサル免疫不全ウイルス（HIVとSIV、それぞれ）のエンベロープ糖蛋白質（ENV）は、感染を開始するために、標的細胞上の細胞表面受容体CD4への結合を媒介するウイルス。 envは膜貫通糖タンパク質（gp41）を、表面の糖タンパク質（gp120の）のヘテロダイマーであり、ウイルス膜の表面に三量体を形成している。三次元画像の分類とアベレージングを組み合わせた低温電子断層撮影法を用いて、三量体envのリガンド非結合状態では、広く中和抗体B12との複合体との三元複合体でネイティブHIV-1で表示された三次元構造を報告するCD4および17b抗体。電子線トモグラフィーによって得密度マップにで単量体のgp120コアB12-とCD4/17b-boundコンフォメーションの既知の結晶構造をフィッティングすることにより、我々はリガンド非結合やCD4に結合した状態で、ネイティブのHIV-1のgp120三量体の分子モデルを導出する。我々は、各gp120の単量体の外側に回転と変位を引き起こし、そのCD4のEnvの三量体の主な再編の結合結果を示しています。これは、ウイルスと標的細胞膜との間の緊密な接触につながる、三量体の中心軸に沿ってgp41の領域の再配置と結合されるように表示されます。我々の調査結果は、構造体と三量体HIV-1抗体の中和と標的細胞への付着に関連したgp120の立体構造変化を解明する。
クライオ電子線トモグラフィーと三次元画像アベレージングを使用した膜タンパク質の構造決定
生物学的興味の膜タンパク質複合体の大半は均一に精製し、または機能の損失なしに生理学的に関連するコンテキストから削除することはできません。これは、簡単にX線結晶構造解析や従来の低温電子顕微鏡を使用して、これらのタンパク質複合体の立体構造を決定することが可能ではありません。 3D画像の分類とアベレージングを使用して低温電子断層撮影法を組み合わせた新興のメソッドは、無傷の細胞と非対称ウイルスの膜タンパク質アセンブリの構造のin situ測定のためのユニークな機会を提供し始めて、しかし、である。ここでは、この分野における最近の進展を確認し、それらのネイティブ環境での膜タンパク質の立体構造を記述するために、これらの方法の可能性を評価します。
四次構造のひずみ依存性の変化：無傷のウイルスで三量体SIVとHIV-1エンベロープ糖タンパク質の分子構造
人間による標的細胞の感染の最初のステップと、密接に関連したサル免疫不全ウイルス（HIVとSIV、それぞれ）は、ウイルスの膜貫通糖タンパク質（gp41）を、表面の糖タンパク質のヘテロダイマーで構成され、（ENV）三量体のエンベロープ糖タンパク質の結合で発生します。 （gp120の）T-細胞を標的とします。無傷のウイルスでenv三量体の分子構造の知識は、ウイルス細胞間相互作用の分子機構を理解するために、HIV /エイズと闘うための効果的な免疫ベースのワクチンの設計の両方が重要である。無傷のHIV-1ビリオンのBALの以前の分析では、既に〜20Åの分解能でリガンド非結合やCD4-リガンド状態でenvの三量体の構造をもたらしました。ここでは、V1とV2の変数が近く、スパイクの頂点に位置するループでSIVmneE11S、SIVmac239とHIV-1 R3A株からenvの三量体の分子アーキテクチャは、以前にBAL HIV-1のために決定それに密接に同等であることを示しているウイルスと細胞の間の接触ゾーンへ。三量体EnvのでV1/V2ループの位置が決定的にこれらのループの削除にenvを発現するように設計HIV-1 R3Aビリオンの構造解析により確認された。驚くべきことに、SIV CP-MAC、CD4非依存性株では、三量体Envのは、それがsCD4と複合されたときにHIV-1 EnvのBALに見られるそれと同様のコンフォメーション中でスプレーのgp120三量体で構成的に "開かれた"コンフォメーションであるCD4i抗体17B。我々の調査結果は、CD4非依存性のウイルスの侵入の分子機構の構造的な説明を提案し、さらに低温電子断層撮影法はそのままウイルスに表示されたEnvの異なる、機能的に関連する四次構造を発見するために使用することができることを規定しています。
三量体HIV-1糖Gp140免疫原およびネイティブHIV-1エンベロープ糖タンパク質は同じ閉じた状態と開いた第四紀の分子構造を表示します。
HIV-1感染の最初のステップは、三量体HIV-1エンベロープ糖蛋白質（ENV）、膜貫通型糖タンパク質（gp41の）のヘテロダイマーと表面糖タンパク質（gp120の）への細胞表面のCD4の結合で発生します。無傷のウイルスで観察されたものと同様の構造と機能のプロパティを表示している三量体Envの可溶性バージョンのデザインは、HIV /エイズに対するワクチンとして有効であると考えられる免疫原を設計の観点から非常に望ましい。サブボリュームの平均化と組み合わせて低温電子断層撮影法を使用して、我々は三量体HIV-1 Envの細胞外ドメインの切断され、可溶化されたバージョンですSOSIP gp140三量体の構造を分析した。我々はリガンド非結合gp140三量体はそのままHIV-1ビリオンの表面上のリガンド非ネイティブトリマーで表示されることに似て四配置を採用することを示している。可溶性CD4、そのケモカインレセプター結合部位でのgp120に結合したFab 17B、あるいはその両方可溶性CD4および17bのFabとの複合する場合は、gp140三量体は、それぞれのgp120のプロトマーの外側に回転とずれがあるとしたオープン構造を表示します。我々は、可溶性三量体の閉じた状態と開いたコンフォメーションにおけるgp120の三量体の分子配列は、可溶性gp140三量体を確立し、無傷のHIV-1ビリオンのBALで三量体gp120の、それぞれ、閉じた状態と開いた状態を観察したものと同じであることを示しているネイティブ三量体Envので表示される第四級アンモニウム構造転移を模倣するように設計することができます。
クライオ電子線トモグラフィーを用いて決定三量体サル免疫不全ウイルスエンベロープ糖タンパク質の可溶性CD4に結合した米国の三次元構造
サル免疫不全ウイルスの表面に表示された三量体のエンベロープ糖タンパク質（Env）のスパイク（SIV）とヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）ビリオン、ウイルス糖タンパク質gp120およびgp41の3ヘテロで構成されています。 gp120の細胞表面のCD4とケモカイン受容体への結合がgp120およびgp41の立体構造変化を誘発することが知られているが、三量体の四次構造の変化はごく最近明らかにされている。 HIV-1 BALの場合は、 "開いた"コンフォメーションに "閉"から三量体の顕著な転位でCD4添付ファイルの結果を分離します。 SIVトリマーでCD4の効果は、しかし、記載されていない。低温電子断層撮影法を使用して、我々は今、可溶性CD4（sCD4）バウンドつの異なる株（SIVmneE11S、SIVmac239、及びSIV CP-MAC）のSIVのEnv三量体の状態の分子構造を決定した。 HIV-1 BAL、SIVmneE11SとSIVmac239 envにマークされた対照的にsCD4結合後のわずかなコンフォメーション変化を示した。三量体envがsCD4-複合状態のenv HIV-1 BALで見られ、我々はどちらsCD4の結合時にコンフォメーションに有意さらなる変化がないことを示すことに似て恒常的に "オープン"コンフォメーションが表示されます。SIV CP-MACでは、または抗体7D3。密度マップは、レセプター結合部位の反対側にあるgp120の上でその7D3および17b抗体標的エピトープを示しています。これらの結果は、SIV Envの構造の多様性に新たな洞察を提供し、三量体SIV EnvのにバインドされているsCD4の向きの歪み依存性のバリエーションがあることを示している。
クライオ電子線トモグラフィーと三次元サブボリューム·アベレージングを使用したコンフォメーション不均一性の計算の分離
我々は以前、単一の優占種が存在していた場合には、高分子集合体の立体構造を得るためにサブボリュームの平均化と分類を組み合わせた低温電子断層撮影法を使用し、三量体HIV-1とSIVの様々な解析にこれらのメソッドを適用しているエンベロープ糖蛋白質（ENV）。ここでは、同時に存在する複数の立体配座を区別するためにくさび補正3D画像の配置と分類方法が見つからない、反復、自動化された示すことによって、これらの研究を拡張します。我々は、Envの異なるコンフォメーションの状態を表すベクトルの要素の空間分布を測定するための手法を提案する。我々は、彼らが混合物中に存在する場合、以前に特徴付け閉じた状態と開いたコンフォメーションと同様に、Envのリガンド非結合および抗体 - リガンドの状態の明確な分離を可能にする戦略を処理するデータを識別します。我々は、最も低い信号対雑音比のスパイクを識別し、削除すると、個々のEnvのサブボリュームと、そのアライメント精度の間のアライメントの全体の精度を向上させ、順番に、異種の混合物中での立体構造の不均一性を評価する際に画像分類の成功を決定することを示している。我々は正常Envのリガンド非結合および抗体 - リガンドと同様にオープンとクローズのコンフォメーションのために異なる立体構造を分離し、再構築することによって計算の分離のためにこれらの手順を検証する混合物を同時に提示します。
