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Articles by Andreas Gnirke in JoVE
JoVE General
Hi-C: un metodo per studiare l'architettura tridimensionale dei genomi.
1Program in Gene Function and Expression, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Broad Institute of Harvard and Massachusetts Institute of Technology, 3Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 4Program for Evolutionary Dynamics, Department of Organismic and Evolutionary Biology, Department of Mathematics, Harvard University, 5Department of Applied Mathematics, Harvard University, 6Department of Physics, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Systems Biology, Harvard Medical School, 8Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology
L'Hi-C metodo consente l'identificazione imparziali, genoma delle interazioni della cromatina (1). Hi-C coppie legatura di prossimità e di sequenziamento massicciamente parallelo. I dati ottenuti possono essere usati per studiare architettura genomica alle scale multiple: risultati iniziali identificate caratteristiche come territori cromosoma, la segregazione della cromatina aperti e chiusi, e la struttura della cromatina alla scala megabase.
Other articles by Andreas Gnirke on PubMed
Valutare L'impatto Dei Dati Di Sequenza Genomica Comparativa Sull'annotazione Funzionale Del Genoma Della Drosofila
È ampiamente accettato che dati di sequenza comparativa possono aiutare l'annotazione funzionale delle sequenze di genoma; Tuttavia, le specie e le caratteristiche dell'evoluzione del genoma per un confronto più informativo rimangono da determinare.
Sequenza Del DNA E L'analisi Del Cromosoma Umano 18
Cromosoma 18 sembra avere la densità genica più bassa di qualsiasi cromosoma umano ed è uno di soltanto tre cromosomi per i quali gli individui trisomiche sopravvivono al termine. Ci sono inoltre un certo numero di disordini genetici derivanti dal cromosoma 18 trisomia e aneuploidia. Qui riportiamo l'annotazione finito di gene e la sequenza del cromosoma umano 18, che consentirà una migliore comprensione della biologia normale e malattia di questo cromosoma. Nonostante la bassa densità di geni codificanti proteine sul cromosoma 18, troviamo che la proporzione di sequenze non codificanti la proteina evolutivamente conservato tra i mammiferi è vicino alla media di genome-wide. Estendendo questa analisi per l'intero genoma umano, troviamo che la densità di sequenze non codificanti la proteina conservate è in gran parte non correlativo con densità genica. Questo ha implicazioni importanti per la natura e i ruoli di non-proteina-codificazione degli elementi della sequenza.
Ridotto Sequenziamento Del Bisolfuro Rappresentazione Per Analisi Comparativa Della Metilazione Del DNA Ad Alta Risoluzione
Descriviamo un approccio su larga scala casuale definito sequenziamento del bisolfuro di rappresentazione ridotta (RRBS) per analizzare e confrontare i pattern di metilazione genomic. Frammenti di restrizione BglII erano dimensione selezionata a 500-600 bp, dotati di adattatori, trattati con bisolfito, PCR amplificato, clonato e sequenziato. Abbiamo costruito biblioteche RRBS da murino ES cells e da ES cells difettare methyltransferases del DNA Dnmt3a e 3b e abbattuto (kd) livelli di Dnmt1 (Dnmt[1(kd),3a-/-,3b-/-]). Sequenziamento di 960 RRBS cloni da Dnmt [1 (kd), 3a-/-, 3b-/-] cellule generate 343 kb della sequenza del bisolfuro non ridondante che copre 66212 cytosines nel genoma. Tutti, ma 38 cytosines era stati convertiti a uracile che indica un tasso di conversione di > 99.9%. Dei cytosines restanti 35 sono stati trovati in CpG e 3 in CpT dinucleotidi. Non-CpG metilazione era > 250-fold ridotto rispetto con selvaggio-tipo celle ES, coerente con un ruolo per Dnmt3a e/o Dnmt3b in CpA e metilazione di CpT. Un esame più attento ha rivelato una sequenza consenso intorno ai siti metilati né prove per il clustering del residua metilazione del genoma. I nostri risultati indicano perdita casuale anziché manutenzione specifica di metilazione in Dnmt [1 (kd), 3a-/-, 3b-/-] cellule. Conversione quasi completa del bisolfuro e in gran parte imparziale rappresentazione delle librerie RRBS suggeriscono che sequenziamento del bisolfuro fucile casuale può essere scalato a un approccio genome-wide.
Approfondimenti Dal Genoma Del Biotrophic Fungine Pianta Patogeno Ustilago Maydis
Ustilago maydis è un patogeno onnipresente di mais e un organismo modello consolidato per lo studio delle interazioni pianta-microbo. Questo fungo considerato non utilizzare strategie di virulenza aggressiva per uccidere il suo ospite. U. maydis appartiene al gruppo di biotrophic parassiti (gli smuts) che dipendono dal tessuto vivente per lo sviluppo e la proliferazione. Riportiamo la sequenza del genoma di un membro di questo gruppo di funghi biotrophic economicamente importante. Il 20,5 milioni-base U. maydis genoma assembly contiene 6.902 predetti geni codifica della proteina e manca di firme di patogenicità trovate nei genomi dei funghi patogeni aggressivi, ad esempio una batteria di enzimi degradanti cell-wall. Tuttavia, abbiamo rilevato inaspettate caratteristiche genomiche responsabili della patogenicità di questo organismo. In particolare, abbiamo trovato 12 cluster di geni che codificano per proteine secrete piccole con funzione sconosciuta. In famiglie piccole gene esiste una frazione significativa di questi geni. Analisi di espressione hanno mostrato che la maggior parte dei geni contenuti in questi ammassi sono regolamentata insieme e indotta nel tessuto infetto. Eliminazione dei singoli cluster alterato la virulenza di U. maydis in cinque casi, che vanno da una completa mancanza di sintomi di hypervirulence. Nonostante anni di ricerca nel meccanismo di patogenicità in U. maydis, fattori di virulenza 'vero' non erano stato precedentemente identificati. Così, la scoperta degli ammassi gene proteina secreta e la dimostrazione del loro ruolo decisivo nel processo di infezione funzionale illuminare precedentemente sconosciuti meccanismi di patogenicità operanti in biotrophic funghi. Analisi genomica sono, allo stesso modo, probabilmente aprire nuove vie per la scoperta dei determinanti di virulenza in altri agenti patogeni.
Scoperta Sistematica Di Motivi Normativi in Regioni Conservate Del Genoma Umano, Tra Cui Migliaia Di Siti Di CTCF Isolante
Conservato elementi non codificante (CNEs) costituiscono la maggior parte delle sequenze sotto purificante selezione nel genoma umano, ma la loro funzione rimane in gran parte sconosciuta. Prove sperimentali suggeriscono che molti di questi elementi svolgono un ruolo normativo, ma poco si sa circa la regolamentazione motivi in esse contenuti. Qui descriviamo un approccio sistematico per scoprire e caratterizzare motivi normativi all'interno dei mammiferi CNEs effettuando una ricerca per motivi lunghi (12-22 nt) con notevole arricchimento in CNEs e studiando le loro proprietà biochimiche e genomica. La nostra analisi identifica 233 motivi lunghi (LMs), corrispondenti a un totale di circa 60.000 istanze conservate in tutto il genoma umano. Questi motivi includono 16 elementi normativi precedentemente noti, quali l'istone 3'-UTR motif e l'elemento silenziatore neurone-restrittive, come bene come sorprendenti esempi di romanzo elementi funzionali. Il motivo più altamente arricchito (LM1) corrisponde al motivo X-box conosciuto da lievito e nematodi. Mostriamo che è vincolato dalla proteina RFX1 e identificare migliaia di istanze motivo conservate, suggerendo un ruolo ampio per la famiglia RFX nella regolazione genica. Un secondo gruppo di motivi (LM2 *) non corrisponde alcun motivo precedentemente noto. Dimostriamo di metodi computazionali e biochimici che definisce un sito di legame per la proteina CTCF, che è coinvolto nella funzione isolante per limitare la diffusione dell'attivazione del gene. Identifichiamo quasi 15.000 siti conservati che probabilmente servono come isolanti, e ci mostra che nelle vicinanze di geni separati dal predetto CTCF siti mostrano correlazione marcatamente ridotta nell'espressione genica. Questi siti possono così suddividere il genoma umano in domini di espressione.
Il Genoma Di Tribolium Castaneum Da Modello Beetle E Pest
Tribolium castaneum è un membro dell'ordine negli eucarioti più ricche di specie, un organismo potente modello per lo studio dello sviluppo dell'insetto generalizzato e un parassita importante dei prodotti agricoli immagazzinati. Descriviamo qui la sequenza del genoma. Questo coleottero onnivoro ha evoluto la capacità di interagire con un ambiente chimico vario, come dimostrato dalle grandi espansioni nel odorant e recettori gustativi, nonché P450 e altri enzimi di disintossicazione. Sviluppo in Tribolium è più rappresentativo di altri insetti che è Drosophila, un fatto riflette nel gene contenuto e funzione. Ad esempio, Tribolium ha mantenuto più ancestrali geni coinvolti nella comunicazione cellula-cellula di drosofila, alcuni espressi nella zona di crescita fondamentale per allungamento assiale in germe di breve sviluppo. Sistemica RNA interference in T. Tribolium funziona in modo diverso da quello in Caenorhabditis elegans, ma tuttavia offre potenza simile per la delucidazione di funzione del gene e l'identificazione di obiettivi di controllo selettivo degli insetti.
La Metilazione Del DNA Del Genoma-scala Mappe Di Pluripotenti E Cellule Differenziate
La metilazione del DNA è essenziale per il normale sviluppo ed è stata implicata in molte patologie, tra cui il cancro. La nostra conoscenza circa la distribuzione di genome-wide di metilazione del DNA, come cambia durante la differenziazione cellulare e come si riferisce alla metilazione dell'istone e altre modificazioni della cromatina nei mammiferi rimane limitata. Qui riportiamo la generazione e l'analisi dei profili di metilazione del DNA genoma-scala a risoluzione nucleotide in cellule di mammifero. Utilizzando high-throughput ridotta rappresentazione bisolfito sequenziamento e singola molecola-sequenziamento, abbiamo generato mappe di metilazione del DNA che coprono la maggior parte delle isole di CpG e un prelievo di campioni rappresentativo di elementi non codificanti conservati, trasposoni e altre caratteristiche genomiche, di cellule staminali embrionali di topo, cellule neurali embrionali staminali-cellula-derivato e primarie e otto altri tessuti primari. Diversi ritrovamenti chiave emergono dai dati. In primo luogo, schemi di metilazione del DNA sono meglio correlati con schemi di metilazione dell'istone rispetto al contesto di sequenza del genoma sottostante. In secondo luogo, metilazione di CpG sono dinamici marchi epigenetici che subiscono modifiche estese durante la differenziazione cellulare, soprattutto nelle regioni di regolamentare di fuori di promotori di nucleo. In terzo luogo, analisi di embrionali staminali-cellula-derivato e celle primarie rivela che 'debole' isole CpG associate a uno specifico set di geni inerente allo sviluppo subiscono ipermetilazione aberrante durante estesa proliferazione in vitro, in un modello che ricordano che ha segnalato in alcuni tumori primari. Più in generale, i risultati stabiliscono sequenziamento bisolfito rappresentazione ridotta come una potente tecnologia per il profiling epigenetico di popolazioni cellulari rilevanti per la biologia dello sviluppo, cancro e medicina rigenerativa.
L'effetto Materno, Egoista Elemento Genetico Medea è Associato Un Trasposone Composito Tc1
Fattori materno-effetto dominante arresto embrionale ("Medea") sono gli elementi nucleari egoisti che coniugano attività materna-letale e zygotic-salvataggio per guadagnare un vantaggio di sopravvivenza postzygotic. Mostriamo che attività Medea(1) in Tribolium castaneum è associato con un trasposone composito di Tc1 inserito appena a valle del neurotrasmettitore reuptake symporter mastodontiche tubuli (macchia), cui ortholog Drosophila ha funzioni materne e zygotic. L'inserimento di 21,5 kb contiene copie difettose di iniziazione fattore di allungamento-3, ATP synthase unità secondaria C e un gene RNaseD-correlati, nonché una copia di un gene procariotico DUF1703 potenzialmente intatta. Confronti di sequenza suggeriscono che l'attuale distribuzione delle Medea(1) riflette globale emanazione dopo un singolo evento ossono nel recente periodo evolutivo. Il sistema di Medea in Tribolium rappresenta un tipo insolito di conflitto intragenomic e potrebbe fornire un utile veicolo per la guida di auspicabile geni nelle popolazioni.
Selezione Di Soluzione Ibrida Con Oligonucleotidi Lunghissima Per Massively Parallel Sequenziazione Mirata
Targeting loci genomici sequenziamento parallelismo massivo richiede nuovi metodi per arricchire i modelli ad essere sequenziato. Abbiamo sviluppato un metodo di cattura che utilizza biotinilato RNA 'esche' per obiettivi di pesce fuori di un 'laghetto' di frammenti di DNA. il RNA è trascritto da oligodeoxynucleotides PCR amplificati originariamente sintetizzato su un microarray, generando esca sufficiente per catture multiple a concentrazioni abbastanza alte per guidare l'ibridazione. Abbiamo testato questo metodo con esche 170-mer che destinazione > 15.000 codifica esoni (2,5 Mb) e quattro regioni (1,7 Mb in totale) mediante sequenziamento Illumina come read-out. Circa il 90% di allineare in modo univoco basi cadde su o vicino a sequenza esca; fino al 50% laici su esoni corretto. L'uniformità fu tale che circa il 60% delle basi di destinazione nell'esonico 'catch' e circa l'80% in catture regionale, ha avuto almeno la metà la copertura Media. Una corsia della sequenza Illumina era sufficiente chiamare confidenza elevata genotipi per 89% dello spazio esone mirati.
Ab Initio Costruzione Di Un Transcriptome Eucariotica Di Massicciamente Parallelo Sequenziamento Di MRNA
Definizione del transcriptome, il repertorio delle regioni trascritti codificata nel genoma, è un compito impegnativo sperimentale. Attuali approcci, basandosi sul sequenziamento di ESTs o librerie di cDNA, sono costosi e impiego di manodopera. Qui, vi presentiamo un approccio generale per ab initio lievito scoperta del transcriptome completo di in erba, basato solo sulla sequenza del genoma non annotate ed eseguire milioni di brevi letture da un singolo sequenziamento massivamente parallelismo. Utilizzando algoritmi di romanzo, crea automaticamente un catalogo altamente accurata trascrizione. Il nostro approccio automaticamente e completamente definisce l'86% dei geni espressi sotto le condizioni date e scopre 160 precedentemente undescribed unità di trascrizione di 250 bp o più a lungo. Esso correttamente delimita il 5' e 3' UTR confini del 86 e 77% dei geni espressi, rispettivamente. Il metodo ulteriormente identifica l'83% delle giunzioni noto splice in geni espressi e scopre 25 introni precedentemente atipici, tra cui 2 casi di ritenzione dell'introne condizione-dipendente. La nostra struttura è applicabile ad organismi scarsamente comprensibili e può portare ad una maggiore comprensione degli elementi trascritti in un genoma esplorato.
Sequenziamento Del Bisolfuro Di Alto-rendimento Nei Genomi Dei Mammiferi
Metilazione del DNA è un critico mark epigenetici che è essenziale per lo sviluppo dei mammiferi e aberrante in molte malattie, tra cui il cancro. Nell'ultimo decennio diversi metodi sono stati sviluppati e applicati per caratterizzare la sua distribuzione genome-wide. Di questi, sequenziamento del bisolfuro di rappresentazione ridotta (RRBS) genera nucleotide risoluzione DNA metilazione del bisolfuro sequenziamento librerie che arricchiscono per regioni CpG-denso di digestione di limitazione metilazione-insensibile. Qui forniamo un ampio protocollo ottimizzato per la generazione di librerie RRBS e discutere la potenza di questa strategia per la profilatura a methylome. Includiamo informazioni su analisi di sequenza e la relativa copertura sulle regioni genomiche di interesse per un rappresentanza del mouse MspI generato Biblioteca RRBS. Sequenziamento contemporaneo e tecnologie basate su array sono confrontate con throughput di campione e la copertura, mettendo in evidenza la varietà di opzioni disponibili per indagare la metilazione del genoma-scala.
ALLPATHS 2: Piccoli Genomi Assemblati Con Precisione E Con Elevata Continuità Da Brevi Letture Accoppiate
Dimostriamo che genoma sequenze di qualità che si avvicinava finito può essere generato da brevi letture accoppiate. Usando 36 base (frammento) e 26 base (jumping) legge da cinque genomi microbici di varia composizione GC e dimensioni fino a 40 Mb, ALLPATHS2 generati assembly con contigs lungo, accurato e ponteggi. Velluto ed EULER-SR erano meno accurate. Ad esempio, per l'Escherichia coli, la frazione di 10 kb tratti che sono stati perfetti era 99,8% (ALLPATHS2), 68,7% (velluto) e 42,1% (EULERO-SR).
Mappatura Completa Delle Interazioni a Lungo Raggio Rivela Pieghevoli Principi Del Genoma Umano
Descriviamo Hi-C, un metodo che analizza l'architettura tridimensionale dell'intero genoma di accoppiamento basati sulla vicinanza legatura con sequenziamento massivamente parallelismo. Abbiamo costruito carte di prossimità spaziale del genoma umano con Hi-C con una risoluzione di 1 megabase. Queste mappe confermano la presenza di territori del cromosoma e la prossimità spaziale dei cromosomi piccoli, ricchi di gene. Abbiamo identificato un ulteriore livello di organizzazione del genoma che si caratterizza per la segregazione spaziale della cromatina aperta e chiusa a formare due compartimenti genome-wide. Alla scala megabase, la conformazione della cromatina è coerenza con un globulo frattale, un nodo-libero, conformazione del polimero che permette al massimo denso imballaggio pur conservando la capacità di piegare e spiegare qualsiasi locus genomico facilmente. Il globulo frattale è distinto dal modello di equilibrio globulare più comunemente utilizzati. I nostri risultati dimostrano la potenza di Hi-C per mappare le conformazioni dinamiche di interi genomi.
Mirati Sequenziamento Next-generation Del Transcriptome Cancro Migliora La Rilevazione Di Varianti Di Sequenza E Trascrizioni Di Fusione Romanzo
RNA-Seq mirati combina sequenziamento di prossima generazione con acquisizione di sequenze da un sottoinsieme di un transcriptome pertinente. Quando il test per l'acquisizione di sequenze da una libreria di cDNA del tumore tramite l'ibridazione di oligonucleotide sonde specifiche per 467 geni legati al cancro, questo metodo ha mostrato elevata selettività, migliorata la rilevazione di mutazione che permette la scoperta del romanzo trascritti chimerici e ha fornito dati di espressione di RNA. Così, mirati RNA-Seq produce una visualizzazione avanzata dello stato molecolare di un set di geni "grande interesse".
ZBED6, Un Fattore Di Trascrizione Romanzo Derivato Da Una Trasposizione Del DNA Addomesticati Regola IGF2 Espressione E Muscolo Crescita
Una singolo nucleotide la sostituzione nell'introne 3 di IGF2 nei suini abroga un sito di legame per un repressore e conduce a una triplice up-regolazione di IGF2 nel muscolo scheletrico. La mutazione ha importanti effetti sulla crescita muscolare, la dimensione del cuore e della deposizione di grasso. Qui, abbiamo identificato il repressore e trovare che la proteina, denominata ZBED6, è precedentemente sconosciuto, specifico per i mammiferi placentati e derivata da un Trasposone DNA dotata. Silenziamento del Zbed6 in mouse C2C12 myoblasts colpite Igf2 espressione, proliferazione cellulare, la guarigione della ferita e myotube formazione. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) sequenziamento utilizzando C2C12 cellule identificate circa 2.500 siti di legame di ZBED6 nel genoma, e il motivo del consenso dedotta ha dato una perfetta corrispondenza con il sito di legame stabilito in Igf2. Geni associati con siti di legame di ZBED6 ha mostrati un arricchimento altamente significativo per certe classificazioni Gene Ontology, compreso sviluppo e regolazione trascrizionale. Gli effetti fenotipici in maiali mutanti e ZBED6 a tacere C2C12 myoblasts, la conservazione di sequenza estrema, sua localizzazione nucleolare, la distribuzione tissutale ampia e molti geni bersaglio con funzioni biologiche essenziali suggeriscono che ZBED6 è un fattore di trascrizione importante nei mammiferi placentati, che influenzano lo sviluppo, crescita e proliferazione cellulare.
Mapping Di Metilazione DNA Genoma-scala Di Campioni Clinici a Singolo Nucleotide Risoluzione
Sequenziamento del bisolfuro misure livelli assoluti di metilazione del DNA a singolo nucleotide risoluzione, che fornisce una piattaforma robusta per la diagnostica molecolare. Abbiamo ottimizzato il sequenziamento del bisolfuro per l'analisi del genoma-scala di campioni clinici: qui si struttura come restrizione digestione obiettivi sequenziamento del bisolfuro di hotspot di regolazione epigenetica e descrivere un metodo statistico per valutare l'importanza dei pattern di metilazione del DNA alterato. Trenta nanogrammi di DNA è stato sufficiente per analisi genoma-scala e il nostro protocollo ha funzionato bene su campioni fissati in formalina, inclusi in paraffina.
Analisi Integrativa Del Transcriptome Melanoma
Studi globali della struttura di trascrizione e abbondanza nelle cellule tumorali consentono la scoperta sistematica delle aberrazioni che contribuiscono alla cancerogenesi, comprese fusioni del gene, isoforme di splicing alternativo e mutazioni somatiche. Abbiamo sviluppato un approccio sistematico per caratterizzare lo spettro delle alterazioni mRNA associato al cancro attraverso l'integrazione di trascrittomica e dati di genomici strutturali, e abbiamo applicato questo approccio per generare nuove conoscenze in biologia melanoma. Usando accoppiato-fine parallelismo massivo sequenziamento del cDNA (RNA-seq) insieme con le analisi dei dati del numero di copia cromosomica ad alta risoluzione, abbiamo individuato 11 fusioni del gene melanoma romanzo prodotti da riarrangiamenti genomici sottostante, come pure 12 trascrizioni readthrough romanzo. Abbiamo mappato queste trascrizioni chimerica a risoluzione base-coppia e li risalire alle loro origini genomici utilizzando le informazioni sul numero corrispondente copia cromosomica. Abbiamo anche utilizzato questi dati per scoprire e convalidare le mutazioni di base-coppia che accumulato in questi melanomi, rivelando un sorprendentemente alto tasso di mutazione somatica e sostenendone la nozione che le mutazioni puntiformi costituiscono il principale motore di progressione del melanoma. Presi insieme, questi risultati possono indicare nuove vie per la scoperta di destinazione nel melanoma, fornendo anche un modello per gli studi su larga scala transcriptome attraverso molti tipi di tumore.
Ab Initio Ricostruzione Di Cellule Specifiche Per Il Tipo Transcriptomes in Mouse Rivela La Struttura Multi-esonico Conservata Di LincRNAs
Sequenziamento del cDNA parallelismo massivo (RNA-Seq) fornisce un modo imparziale per studiare un transcriptome, inclusi geni codificanti e non codificante. Fino ad ora, la maggior parte dei studi di RNA-Seq hanno dipendeva fondamentalmente annotazioni esistenti e così focalizzato sui livelli di espressione e di variazione in trascrizioni conosciute. Presentiamo qui, la scrittura, un metodo per ricostruire il trascrittoma di una cellula di mammiferi utilizzando sola RNA-Seq letture e la sequenza del genoma. Abbiamo applicato e cellule staminali embrionali di topo, le cellule precursori neuronali e fibroblasti di polmone di ricostruire con precisione le strutture gene full-length per più noti geni espressi. Abbiamo individuato notevoli variazioni nei geni, tra cui migliaia di siti di inizio romanzo 5', 3' estremità ed esoni codifica interni di codificazione della proteina. Abbiamo quindi determinare le strutture di gene di oltre mille grande intergenic RNA non codificante (lincRNA) e loci antisenso. I nostri risultati aprire la strada alla diretta manipolazione sperimentale di migliaia di RNA non codificante e dimostrare il potere della ricostruzione di ab initio per eseguire il rendering di un'immagine completa del transcriptomes dei mammiferi.
Mirate Esone Sequenziamento Di Selezione in Soluzione Ibrida
Questa unità descrive un protocollo per l'arricchimento mirato degli esoni da librerie di DNA genomic casualmente tosate utilizzando un approccio di selezione in soluzione ibrida per il sequenziamento su un'Illumina Genome Analyzer II. I passaggi per la progettazione e ordinazione di un pool di oligo selezione ibrido sono rivisti, come sono le fasi critiche per eseguire la preparazione e la selezione di ibridi di una libreria di coppia-fine Illumina. I parametri critici, metriche di performance e workflow di analisi sono discussi.
Completa Analisi Comparativa Dei Metodi Di Sequenziamento Di RNA Strand-specifici
CDNA Strand-specifici, massively parallel sequenziamento (RNA-seq) è un potente strumento per la scoperta di trascrizione, annotazione del genoma e delineamento di espressione. Ci sono più metodi pubblicati per specifici strand RNA-seq, ma nessun consenso esiste sul modo di scegliere tra di loro. Qui abbiamo sviluppato una pipeline computazionale completa per confrontare la metrica di qualità biblioteca da qualsiasi metodo di RNA-seq. Utilizzando con Saccharomyces cerevisiae transcriptome come punto di riferimento, abbiamo confrontato sette protocolli libreria-costruzione, compreso sia pubblicato e nostri metodi. Abbiamo trovato marcate differenze in strand specificità, libreria complessità, regolarità e continuità di copertura, accordo con accuratezza e conosciute le annotazioni per il delineamento di espressione. Pesatura delle prestazioni e la facilità di ciascun metodo, abbiamo identificato la marcatura secondo-strand dUTP e i metodi di legatura Illumina RNA come i principali protocolli, con l'ex beneficiando della disponibilità attuale di sequenziamento accoppiato-fine. La nostra analisi fornisce un punto di riferimento globale, e la nostra pipeline di calcolo è applicabile per la valutazione dei protocolli futuri in altri organismi.
Sequenziamento Di RNA Specifico Strand Rivela Ampie Regolamentate Lunghe Trascrizioni Che Sono Conservate in Tutta La Specie Di Lievito
Recenti studi nel lievito gemmante hanno dimostrato che la trascrizione antisenso si verifica in molti loci. Tuttavia, il ruolo funzionale delle trascrizioni è stato dimostrato solo in pochi casi ed è stato suggerito che più trascrizioni possono derivare da promiscuo trascrizione bi-direzionale in un genoma denso.
Confronto Quantitativo Delle Tecnologie Di Mapping Metilazione Di DNA Del Genome-wide
La metilazione del DNA gioca un ruolo chiave nella regolazione della espressione genica negli eucarioti. Sebbene mitoticamente ereditarie e stabile nel tempo, pattern di metilazione del DNA cambia frequentemente in risposta alle influenze ambientali, la malattia e la differenziazione delle cellule. Parecchi metodi sono stati sviluppati per mappare la metilazione del DNA su scala genomica. Qui, noi quattro di questi approcci benchmark analizzando due linee di cellule embrionali staminali derivate da embrioni geneticamente indipendenti e una coppia di tumore del colon e del colon normale adiacente tessuto ottenuto dal donatore stesso. La nostra analisi rivela che metilato sequenziamento immunoprecipitazione del DNA (MeDIP-seq), acquisizione di DNA metilato di purificazione di affinità (MethylCap-seq), ridotto il sequenziamento di rappresentazione del bisolfuro (RRBS) e il dosaggio di Infinium HumanMethylation27 tutti produrre dati precisi di metilazione del DNA. Tuttavia, questi metodi differiscono nella loro capacità di individuare regioni differenzialmente metilati tra coppie di campioni. Noi di evidenziare punti di forza e di debolezza dei quattro metodi e dare consigli pratici per la progettazione di epigenomic studi caso-controllo.
Confronto Dei Metodi Basati Sulla Sequenza Di Metilazione Del DNA Di Profilo E L'identificazione Delle Modifiche Epigenetiche Monoallelic
Analisi dei pattern di metilazione del DNA si basa sempre più sui metodi di analisi basati sul sequenziamento. Il quattro tecnologie di sequenziamento utilizzate più frequentemente sono i metodi basati su bisolfito MethylC-seq e sequenziamento del bisolfuro di rappresentazione ridotta (RRBS) e le tecniche basate su arricchimento metilate DNA sequencing immunoprecipitazione (MeDIP-seq) e sequenziamento dominio di legame del DNA metilato (MBD-seq). Abbiamo applicato tutti e quattro i metodi biologici repliche di cellule staminali embrionali umane per valutare la loro copertura di CpG genome-wide, risoluzione, costo, concordanza e l'influenza della densità di CpG e contesto genomico. I livelli di metilazione valutati tramite i due metodi di bisolfito erano concordanti (loro differenza non superare una determinata soglia) per 82% per i produttori e il 99% dei cytosines non-CpG. Utilizzando chiamate binarie metilazione, i due metodi di arricchimento erano 99% concordanti e regioni valutate da tutti e quattro i metodi erano concordanti al 97%. Abbiamo combinato MeDIP-seq con enzima di restrizione di metilazione-sensibili (MRE-seq) sequenziamento per una copertura completa methylome a basso costo. Questo, insieme a RNA-seq e ChIP-seq delle cellule ES ci ha permesso di individuare regioni con stati epigenetici allele-specific, identificando la maggior parte delle regioni impresso noti e nuovi loci con epigenetico marchi monoallelic e monoallelic espressione.
Assemblee Di Alta Qualità Bozza Dei Genomi Dei Mammiferi Dai Dati Di Sequenza Massivamente Paralleli
Paralleli massivo tecnologie di sequenziamento del DNA stanno rivoluzionando genomica rendendo possibile generare miliardi di letture relativamente breve sequenza (~ 100-base) a costo molto basso. Considerando che tali dati possono essere facilmente utilizzati per una vasta gamma di applicazioni biomediche, ha dimostrato difficile usarli per generare assembly di alta qualità de novo genoma dei genomi di vertebrati grandi, ricchi di ripetizione. Ad oggi, le assemblee di genoma generate da tali dati sono caduti lontano a corto di quelli ottenuti con l'approccio di anziani (ma molto più costoso) capillare sequenziamento. Riportiamo qui, lo sviluppo di un algoritmo per l'assemblaggio del genoma, LG ALLPATHS e la sua applicazione a parallelismo massivo DNA sequence data dall'essere umano e del mouse genomi, generati sulla piattaforma Illumina. Le assemblee di genoma progetto risultante hanno buona precisione, contiguità a corto raggio, connettività a lungo raggio e la copertura del genoma. In particolare, la precisione di base è alto (≥99.95%) e le dimensioni del ponteggio (dimensione N50 = 11,5 per umani e 7,2 Mb per mouse) avvicinarsi a quelle ottenute con capillare di sequenziamento. La combinazione di tecnologia di sequenziamento migliorata e miglioramento dei metodi computazionali ora dovrebbe rendere possibile aumentare drammaticamente il de novo sequenziamento dei genomi di grandi dimensioni. Il programma ALLPATHS-LG è disponibile presso http://www.broadinstitute.org/science/programs/genome-biology/crd.
Riprogrammazione Espressione Del Fattore Avvia Il Rimodellamento Della Cromatina Mirata Diffusa
Nonostante i rapidi progressi nella caratterizzazione transcription factor-driven riprogrammazione di cellule somatiche di uno stato (iPSC) sulle cellule staminali pluripotenti indotte, rimangono ancora molte domande meccanicistiche. Per ottenere l'analisi approfondita degli eventi più presto nel processo di riprogrammazione, abbiamo analizzato sistematicamente i cambiamenti epigenetici e trascrizionali che si verificano durante l'induzione precoce del fattore dopo un discreto numero di divisioni. Abbiamo osservato cambiamenti rapidi, genome-wide nella modifica dell'istone, H3K4me2, a loci più di mille tra cui grandi sottoinsiemi di pluripotenza-correlati o inerente allo sviluppo regolamentato gene promotori e rinforzatori. Al contrario, modelli della modificazione H3K27me3 repressiva è rimasto in gran parte invariati salvo esaurimento mirato specificamente alle posizioni dove è maturata la metilazione H3K4. Questi eventi normativi della cromatina precedono transcriptional modifiche entro i loci corrispondenti. I nostri dati forniscono la prova per una risposta precoce, organizzata e popolazione a livello epigenetica a fattori di riprogrammazione ectopici che chiarire l'ordine temporale attraverso il quale identità somatica viene reimpostato durante la riprogrammazione.
Mappe Di Riferimento ES Umana E Variazione Delle Cellule IPS Abilitare La Caratterizzazione Di Alto-rendimento Delle Linee Di Cellule Pluripotenti
Il potenziale dello sviluppo di cellule staminali pluripotenti umane suggerisce che possono produrre tipi cellulari malattie rilevanti per la ricerca biomedica. Tuttavia, variazione sostanziale è stato segnalato tra le linee di cellule pluripotenti, che potrebbero influenzare la loro utilità e sicurezza clinica. Tali differenze specifiche della cella-linea devono essere meglio inteso prima che uno può tranquillamente utilizzare staminali embrionali (ES) o indotta da cellule pluripotenti staminali (iPS) nella ricerca traslazionale. Verso questo obiettivo abbiamo stabilito riferimento genome-wide mappe di metilazione del DNA ed espressione del gene per 20 precedentemente derivato umani ES linee e 12 linee di cellule umane iPS, e noi abbiamo misurato la propensione di differenziazione in vitro di queste linee cellulari. Questa risorsa ci ha permesso di valutare la somiglianza epigenetica e trascrizionale di cellule ES e iPS e di prevedere l'efficienza differenziazione di linee cellulari individuali. La combinazione di dosaggi produce una scorecard per la rapida e completa caratterizzazione di linee di cellule pluripotenti.
Analizzando E Riducendo Al Minimo La Distorsione Amplificazione PCR Nelle Librerie Di Sequenziamento Illumina
Nonostante l'output dei dati di sequenziamento Illumina sempre loci con estreme composizioni base sono spesso sotto-rappresentate o assente. Per valutare le fonti di bias di base-composizione, abbiamo rintracciato sequenze genomiche che vanno dal 6% al 90% GC attraverso il processo di PCR quantitativa. Abbiamo individuato in PCR durante la preparazione della biblioteca come principale fonte di pregiudizi e ottimizzato le condizioni. Nostro protocollo migliorato significativamente riduce il bias di amplificazione e minimizza i precedentemente gravi effetti della velocità di rampa di temperatura e strumento PCR.
Preparazione Di Librerie Di Sequenziamento Del Bisolfuro Rappresentazione Ridotta Per La Profilatura a Metilazione Del DNA Del Genoma-scala
Genome-wide mappatura della 5-metilcitosina è di vasto interesse in molti campi della biologia e della medicina. Una varietà di metodi sono stati sviluppati, e più recentemente sono state avanzate alla scala genome-wide utilizzando matrici e approcci di sequenziamento di nuova generazione. Abbiamo precedentemente segnalato rappresentazione ridotta del bisolfuro sequenziamento (RRBS), un protocollo basato su bisolfito che arricchisce parti CG-ricco del genoma, riducendo così la quantità di sequenziamento necessaria mentre cattura la maggior parte dei promotori e altre regioni genomiche pertinenti. L'approccio prevede la risoluzione del singolo-nucleotide, è altamente sensibile e fornisce le misure quantitative di metilazione del DNA. Questo protocollo dovrebbe consentire qualsiasi laboratorio di biologia molecolare standard generare le librerie RRBS di alta qualità. Brevemente, il DNA genomico purificato è digerito dall'enzima di restrizione metilazione-insensibile MspI per generare brevi frammenti che contengono dinucleotidi alle estremità. Dopo legatura a metilato Illumina gli adattatori, i frammenti del DNA CpG-ricco (40-220 bp), A-tailing ed estremità-riparazione sono dimensioni selezionati, sottoposti a conversione del bisolfuro, PCR amplificati e fine sequenziato su un'Illumina Genome Analyzer. Nota che allineamento e analisi di RRBS sequenziamento letture non sono contemplati nel presente protocollo. I requisiti di ingresso estremamente bassi (10-300 ng), l'applicabilità del protocollo campioni fissati in formalina ed inclusi in paraffina, e singolo-nucleotide risoluzione della tecnica si estende RRBS per una vasta gamma di applicazioni di ricerca e di campioni biologici e clinici. L'intero processo di costruzione della libreria RRBS prende ∼9 d.
Etichettatura Metabolica Di RNA Scopre I Principi Delle Dinamiche Di Produzione E Degradazione Di RNA Nelle Cellule Dei Mammiferi
Livelli di RNA cellulari sono determinati dall'interazione della RNA produzione, trasformazione e degradazione. Tuttavia, perché la maggior parte dei studi del regolamento RNA non distinguono i contributi separati di questi processi, poco è conosciuto circa come temporaneamente sono integrati. Qui ci combinare metabolica etichettatura di RNA ad alta risoluzione temporale con quantificazione di RNA avanzata e modellazione computazionale di stimare i tassi di trascrizione e di degradazione di RNA durante la risposta delle cellule dendritiche del mouse al lipopolisaccaride. Troviamo che i cambiamenti nei tassi di trascrizione determinano la maggior parte dei cambiamenti temporali nei livelli di RNA, ma che i cambiamenti nei tassi di degradazione sono importanti per modellare risposte taglienti 'picco'. Abbiamo usato il sequenziamento della popolazione appena trascritto RNA stimare temporaneamente costante RNA trasformazione e degradazione tariffe genome wide. Tassi di degradazione variano significativamente tra geni e contribuiscono alle differenze osservate nella risposta dinamica. Alcune trascrizioni, compresi quelli codifica citochine e fattori di trascrizione, maturano più velocemente. Il nostro studio fornisce un approccio quantitativo per studiare il processo integrativo del regolamento di RNA.
Full-length Transcriptome Assieme Da RNA-Seq Dati Senza Un Genoma Di Riferimento
Parallelismo massivo sequenziamento del cDNA ha permesso profonda ed efficace di sondaggio di transcriptomes. Attuali approcci per la ricostruzione di trascrizione da tali dati spesso si basano sull'allineamento letture di un genoma di riferimento e quindi non sono adatte per i campioni con un genoma di riferimento mancante o parziale. Qui vi presentiamo il metodo Trinità de novo Assemblea delle trascrizioni full-length e valutarla su campioni da lievito di fissione, mouse e aleurodidi, cui genoma di riferimento non è ancora disponibile. Efficiente costruzione ed analizzando i set di grafici de Bruijn, Trinity ricostruisce completamente una grande frazione delle trascrizioni, tra cui isoforme impiombato alternativamente e trascrizioni da geni recentemente duplicati. Confrontato con altri assemblatori di transcriptome de novo, Trinity recupera più full-length trascrizioni in una vasta gamma di livelli di espressione, con una sensibilità simile ai metodi che si basano su allineamenti del genoma. Il nostro approccio fornisce una soluzione unificata per la ricostruzione del transcriptome in ogni campione, soprattutto in assenza di un genoma di riferimento.
Selezione Di Ibridi Per Il Sequenziamento Dei Genomi Di Patogeni Da Campioni Clinici
Abbiamo adattato un protocollo di selezione soluzione ibrida per arricchire l'agente patogeno del DNA in campioni clinici dominato da materiale genetico umano. Utilizzando miscele finti di umani e parassita della malaria Plasmodium falciparum del DNA, nonché campioni clinici da pazienti infetti, dimostriamo una media di circa 40-fold arricchimento di DNA parassita dopo selezione ibrido. Questo approccio consentirà il sequenziamento del genoma efficiente di agenti patogeni da campioni clinici, così come il sequenziamento di endosymbiotic organismi come Wolbachia che vivono all'interno di diversi phyla di metazoi.
Distribuzione Genomiche E Inter-sample Variazione Di Metilazione CpG Non Tutti I Tipi Di Cellule Umane
La metilazione del DNA gioca un ruolo importante nello sviluppo e malattia. I siti primari di metilazione del DNA nei vertebrati sono cytosines nel contesto dinucleotide CpG, che rappresentano all'incirca tre quarti del contenuto totale di metilazione del DNA in umani e cellule di topo. Mentre la distribuzione genomica, stabilità interindividuale e ruolo funzionale di metilazione CpG sono ragionevolmente ben comprese, poco si sa circa la metilazione del DNA di targeting, CpA, CpT e CpC (non-CpG) dinucleotidi. Qui riportiamo un'analisi completa delle non-CpG metilazione in 76 scala genoma DNA metilazione mappe in pluripotenti e tipi di cellule differenziate. Confermiamo la metilazione CpG non per essere principalmente presenti nei tipi di cellule pluripotenti e osservare una diminuzione sulla differenziazione e vicino a completa assenza di vari tipi di cellule somatiche. Anche se nessuna funzione è stata assegnata ad esso in pluripotenza, nostri dati evidenziano che il pattern di metilazione CpG non riapparire alla riprogrammazione di cellule iPS. Curiosamente, i modelli sono altamente variabili e visualizza conservazione poco tra pluripotenti differenti linee cellulari. Troviamo una forte correlazione non-CpG metilazione e livelli di espressione DNMT3 mentre mostrando l'indipendenza statistica del non-CpG metilazione da pluripotenza associati espressione genica. In linea con questi risultati, mostriamo che atterramento di DNMTA e DNMT3B hESCs risulta in una riduzione globale della non-CpG metilazione. Infine, metilazione CpG non sembra essere correlata spazialmente con CpG metilazione. In sintesi che questi risultati contribuiscono ulteriormente la nostra comprensione di schemi di metilazione citosina in cellule umane utilizzando un campione rappresentativo di grande set.
