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Articles by Andreea Trache in JoVE
JoVE General
Réponse Live Cell à la stimulation mécanique étudiée par microscopie à force atomique et optique intégré
1Department of Systems Biology and Translational Medicine, College of Medicine, Cardiovascular Research Institute, Texas A&M Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University
Ce document vise à instruire le lecteur dans le fonctionnement d'un système intégré à force atomique, microscope optique d'imagerie pour la stimulation mécanique des cellules vivantes en culture. Un protocole étape par étape est présentée. Un ensemble représentatif de données qui montre la réponse de cellules vivantes à la stimulation mécanique est présenté.
Other articles by Andreea Trache on PubMed
Les Intégrines Et La Réglementation De La Microcirculation : Des Artérioles à Des études Moléculaires à L'aide De La Microscopie à Force Atomique
Les intégrines sont une classe importante des récepteurs des protéines de la matrice extracellulaire qui peuvent médier les deux transmission de force, en raison de leurs liens avec la matrice cellulaire et le cytosquelette ; et transduction du signal, résultant de l'assemblages des protéines qui associent à focales contacts de signalisation. Par conséquent, les intégrines ont été proposés d'être le mechanosensor dans le muscle lisse vasculaire et les cellules endothéliales et de jouer un rôle central dans la mécanotransduction. À cet égard, force mécanique est un stimulant important pour nombreuses fonctions vasculaires, y compris contractile et processus de relaxation, prolifération, migration, attachement et détermination du phénotype cellulaire. Collectivement, ces fonctions définissent des propriétés physiologiques du système vasculaire comme le contrôle de la circulation sanguine, pression capillaire, la perméabilité et la résistance vasculaire périphérique et jouent un rôle dans les processus physiopathologiques comme l'hypertension, de diabète et d'artériosclérose. Nos connaissances concernant comment les intégrines détectent et transduce des forces physiques en signaux cellulaires et les intégrines jouent un rôle est incomplète. Par rapport aux autres récepteurs de surface cellulaire, intégrines ont une affinité assez faible pour leurs sites de liaison sur la matrice extracellulaire et leur affinité peut être réglée. Ces caractéristiques de l'interaction de l'intégrine-ligand peuvent faciliter les processus dynamiques comme la migration cellulaire, cellule remodelage et activation contractile en réponse à des forces extérieures. Des questions importantes demeurent en ce qui concerne la nature et l'origine de l'intégrine-mediated signaling in la paroi vasculaire.
Effets De L'histamine Sur L'interaction De La Fibronectine De Cellules Endothéliales étudié Par Microscopie à Force Atomique
Microscopie à force atomique a été utilisée pour étudier la réponse cellulaire à l'histamine, un des médiateurs inflammatoires majeurs qui causent l'hyperperméabilité endothéliale et une fuite vasculaire. Sondes AFM ont été marqués avec la fibronectine et utilisés pour mesurer la force de liaison entre l'intégrine alpha5beta1 et la fibronectine en quantifiant la force nécessaire pour briser les liaisons de l'intégrine fibronectine unique. Les changements cytosquelettiques, probabilité de liaison et adhérence vigueur avant et après traitement de l'histamine sur les cellules endothéliales ont été surveillés. Cellule topographie mesures indiquent que l'histamine induit de rétrécissement de la cellule. Probabilité de rigidité et de liaison cellulaire locale a augmenté de double après le traitement de l'histamine. La force nécessaire à liaison unique alpha5beta1-fibronectine rupture passée de 34,0 +/-0,5 pN dans les cellules témoins à 39 +/-1 pN après traitement de l'histamine. Expériences ont été également menées afin de confirmer la spécificité de l'interaction d'alpha5beta1-la fibronectine. En présence de GRGDdSP soluble diminue la probabilité d'événements adhésion > 50 % alors que la force d'adhérence entre l'alpha5beta1 et la fibronectine est demeurée inchangée. Ces données indiquent que des interactions intégrine-matrice extracellulaire jouent un rôle important dans la réponse des cellules endothéliales aux changements de médiateurs chimiques externes. Ces modifications peuvent être enregistrées comme des mesures directes sur direct cellules endothéliales en utilisant atomiques à force.
Les Propriétés Mécaniques De L'interaction Entre L'intégrine Alpha5beta1 Sur Les Cellules Musculaires Lisses Vasculaires Et De Fibronectine a étudié à L'aide De La Microscopie à Force Atomique
Les propriétés mécaniques des interactions intégrine-extracellulaire (ECM) sont importantes pour la mécanotransduction de cellules de muscle lisse vasculaire (CMLV), un processus qui est associée à des adhérences focales, et peuvent être d'une importance particulière dans les maladies cardiovasculaires. Dans cette étude, nous avons caractérisé l'activité sans engagement de force et de la liaison de la fibronectine initiale (FN)-interaction d'alpha5beta1 sur la surface des cellules à l'aide de la microscopie à force atomique (AFM). Il est postulé que ces événements de liaison initiale sont importantes pour l'Assemblée de l'adhérence focale ultérieures. Les adhérences FN-CMLV bloqua sélectivement par des anticorps contre alpha5 - et beta1-intégrines ainsi que des peptides RGD contenant mais pas par les anticorps contre alpha4-beta3-intégrines et, ce qui indique que les FN lié principalement à alpha5beta1. Une force sans engagement caractéristique de 39 +/-8 pN a été observée et interprétée pour représenter la force de liaison simple FN-alpha5beta1. La capacité du FN à adhérer à la CMLV (probabilité de liaison) est significativement réduite par les antagonistes de l'intégrine, sérum et facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF)-BB, tandis que l'acide lysophosphatidique (LPA) a augmenté de liaison des FN. Toutefois, aucun changement significatif dans la force sans engagement résolue a été observée. Après l'engagement, la force nécessaire pour déloger le talon FN-enduit de CMLV a augmenté avec l'augmentation du temps de contact, ce qui suggère une augmentation dépendant du temps nombre d'adhésions et/ou d'affinité de liaison modifiée. LPA amélioré ce processus, alors que le PDGF réduit, ce qui suggère que ces facteurs affectent également le processus multimoléculaire de regroupement de contact focal. AFM est donc un outil puissant pour la caractérisation des propriétés mécaniques des interactions intégrine-ECM et leur règlement. Nos résultats indiquent que l'activité fonctionnelle du alpha5beta1 et Assemblée contact focale peut être réglementée rapidement.
Atomic Force-multi-imagerie Intégrée Microscope Optique Pour La Surveillance De La Dynamique Moléculaire Dans Des Cellules Vivantes
Un hybride nouveau système d'imagerie est construit en intégrant la microscopie à force atomique (AFM) avec une combinaison de techniques d'imagerie optiques offrant une résolution spatiale élevée. Le principal de l'application de cet instrument (le microscope NanoFluor) est l'étude de la mécanotransduction avec une emphase sur les interactions cytosquelettiques-intégrine-matrice extracellulaires et leur rôle dans les réponses cellulaires aux changements dans les facteurs chimiques et mécaniques externes. L'AFM permet l'évaluation quantitative des changements cytosquelettiques, contraignant probabilité, forces d'adhérence et micromécaniques propriétés des cellules, tandis que les applications d'imagerie optiques permettent une coupe mince du corps cellulaire à l'interface de la lamelle couvre-objet-cellule, permettant l'étude des adhérences focales en microscopie de réflexion interne (IRM) et de la fluorescence de réflexion totale interne (FRBR). AFM-optique combinés des expériences d'imagerie montrent que la stimulation mécanique à la surface apicale des cellules provoque une réponse du cytosquelette génératrices de force, ce qui entraîne une réorganisation contact focale sur la surface terrière qui peut être surveillée en temps réel. Le NanoFluor système est également équipé d'un roman mécaniquement aligné système double caméra d'acquisition pour le transfert d'énergie par résonance synthétisée Forster (FRET). Le système intégré de microscope NanoFluor est décrite, y compris ses caractéristiques, applications et limites.
Utilisation De La Spectroscopie De Raman Exaltée De Surface Pour La Détection Des Intégrines Humaines
La recherche actuelle a révélé l'importance d'une classe de protéines de surface de cellules appelée intégrines dans différentes fonctions physiologiques vitales comme la coagulation sanguine, la régulation de la tension artérielle, le débit sanguin tissulaire et le remodelage vasculaire. La clé de l'intégrine fonctionnalité est sa capacité de provoquer la transmission de la force en interagissant avec la matrice extracellulaire et le cytosquelette. En outre, ils jouent un rôle dans la transduction du signal via leur connexion avec les protéines en points d'adhérence focale (FA). Pour comprendre le mécanisme complex de cellules et d'adhérence cellule-extracellulaire (ECM) qui est responsable de ces interactions biochimiques variées, il est nécessaire d'identifier les intégrines sur les cellules et de surveiller leur interaction avec les différents ligands. À cette fin, pour la première fois, nous utilisons la spectroscopie de Raman exaltée de surface (SERS) pour détecter les intégrines. Les résultats montrent la capacité à l'aide de SERS pour détecter les intégrines au régime de concentrations nanomolaires et faire la distinction entre deux types différents d'intégrines, alphaVbeta3 et alpha5beta1, qui sont présents dans les cellules de muscle lisse vasculaire (CMLV). Il est prévu que l'approche « sers » potentiellement aidera à élucider le mécanisme des interactions intégrine-ligand dans une variété de phénomènes d'importance physiologique.
Quantification Et Imagerie Confocale Des Protéines Spécifiques Moléculairement Imprimé Des Polymères
Nous avons utilisé la FITC--albumine comme la molécule de protéine modèle dans une stratégie de phase aqueuse molecular imprinted polymer (HydroMIP). Pour la première fois, l'utilisation d'un modèle de fluorescent étiqueté est signalée, avec caractérisation ultérieure du matériel intelligent pour montrer que l'HydroMIP possède une mémoire moléculaire significative par rapport à celle du polymère contrôle nonimprinted (HydroNIP). L'imagerie de la FITC--albumine HydroMIP imprimé à l'aide de la microscopie confocale est décrite, avec la suppression in situe de la protéine imprimée affichée en termes de changements observés dans la fluorescence du polymère imprimé, tant avant qu'après l'élution de gabarit (à l'aide d'une solution SDS/10% AcOH (p/v) de 10 %). Nous avons également rapport imprimé de l'imagerie d'une hémoglobine bovine (BHb) HydroMIP à l'aide de la microscopie confocale biphotonique et décrire les effets d'élution de modèle à la protéine autofluorescence. Les résultats contribuent à la compréhension des protocoles empreinte moléculaire phase aqueuse et de document, l'utilisation de la fluorescence est un outil utile dans le modèle d'étiquetage/détection et roman stratégies d'imagerie.
Microscopie à Fluorescence (FRBR) Réflexion Interne Totale
La microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion totale interne représente une méthode d'excitant et la visualisation des fluorophores présents dans la région près de la membrane des cellules vivantes ou fixes cultivées sur des lamelles couvre-objet. Microscope TIRF repose sur le phénomène de réflexion totale interne qui se produit lorsque la lumière passe d'un milieu de réfraction élevé (p. ex., verre) dans un milieu de réfraction faible (p. ex., cellule, eau). Le champ évanescent produit par total en interne reflète la lumière excite les molécules fluorescentes à l'interface de la cellule-substrat et est accompagnée d'une exposition minimale du volume cellulaire restants. Cette technique fournit des images de fluorescence contrasté, avec très faible bruit de fond et pratiquement aucun out-of-focus lumière, idéal pour la visualisation et la spectroscopie de fluorescence de la molécule unique près d'une surface. Cet appareil présente, de manière concise, le principe de fonctionnement, la diversité de l'instrument et les applications de microscopie FRBR pour l'étude d'échantillons biologiques.
Microscopie à Force Atomique (AFM)
Le microscope à force atomique (AFM) est un outil important pour l'étude des échantillons biologiques en raison de sa capacité à surfaces d'image sous liquides. L'AFM fonctionne en interaction physique d'une pointe en porte-à-faux avec les molécules sur la surface de la cellule. Forces d'adhérence entre les molécules de surfaces pointe et cellulaire sont détectés comme déviations en porte-à-faux. Ainsi, la pointe en porte-à-faux peut être utilisée pour l'image des cellules vivantes présentant la résolution atomique et sonder des événements moléculaires uniques dans les cellules vivantes dans des conditions physiologiques. Actuellement, c'est la seule technique disponible qui assure directement l'information structurale, mécanique et fonctionnelle à haute résolution. Cet appareil présente les composants de base AFM, les modes de fonctionnement, les conseils utiles pour la préparation de l'échantillon et un bref examen des demandes de l'AFM en microbiologie.
Microscopie Intégré Pour Imagerie En Temps Réel Des études Mécanotransduction Dans Les Cellules Vivantes
La force mécanique est un stimulant important et déterminant de nombreux lisses vasculaires fonctions des cellules musculaires dont la contraction, la prolifération, la migration et la fixation des cellules. Transmission de la force de l'extérieur de la cellule par des adhérences focales contrôle de la dynamique de ces sites d'adhésion et initie cascades de signalisation intracellulaire qui modifient le comportement cellulaire. Pour comprendre le mécanisme par lequel les cellules vivantes sens des forces mécaniques, et comment ils réagissent et s'adaptent à leur environnement, une première étape essentielle est de développer une nouvelle technologie pour étudier le comportement cellulaire au niveau subcellulaire, qui intègre un microscope à force atomique (AFM) avec un total fluorescence à réflexion interne (FRBR) et rotations rapides du disque (DSE) microscopie confocale, offrant une haute résolution spatiale et temporelle. AFM utilise une nanocapteur pour mesurer la topographie de la surface cellulaire et peuvent appliquer et de mesurer la force mécanique de haute précision. Microscopie TIRF est une technique d'imagerie optique qui fournit des images à contraste élevé à haute résolution du z molécules marquées par fluorescence dans le voisinage immédiat de l'interface cellulaire lamelle. DSE microscopie confocale permet rapide imagerie 3-D dans la cellule en temps réel. Le système intégré est largement applicable dans un large éventail de la biologie moléculaire des études dynamiques dans toutes les cellules vivantes adhérentes, ce qui permet l'imagerie optique directe de la réponse cellulaire à une stimulation mécanique en temps réel.
Mg2 + Module L'interaction De L'intégrine-extracellulaire Dans Les Cellules Musculaires Lisses Vasculaires étudié Par Microscopie à Force Atomique
Microscopie à force atomique (AFM) a été utilisée pour étudier l'interaction entre l'intégrine alpha5beta1 et la fibronectine (FN) en présence de cations divalents. Sondes AFM ont été marqués avec le FN et utilisés pour mesurer la force de la liaison entre l'intégrine alpha5beta1 et FN en quantifiant la force nécessaire pour briser les liaisons de FN-intégrine unique sur une plage physiologique du chargement de taux (100-10 000 AP/s). La force nécessaire à liaison unique alpha5beta1-FN rupture augmentée double sur le régime de chargement tarifs étudiés. Les variations de concentration de Mg(2+) et Ca(2+) affecté les paramètres thermodynamiques de l'interaction et modulation de l'énergie de liaison. Ces données indiquent que l'environnement ionique où résident les cellules musculaires lisses vasculaires, influence les paramètres mécaniques qui définissent l'interaction entre la matrice extracellulaire et les intégrines. Ainsi, dans un environnement dynamique mécanique tels que la paroi vasculaire, propriétés thermodynamiques liaison entre FN et alpha5beta1 intégrine varient en ce qui concerne les charges appliquées localement et des concentrations de cations divalents. Ces modifications peuvent être enregistrées sous des mesures directes sur les fibres musculaires lisses vivants à l'aide d'AFM.
Effet Matrice Extracellulaire Sur RhoA Signalisation De Modulation Dans Les Cellules Vasculaires Musculaires Lisses
Adaptations morphologiques des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) à l'environnement mécanique active dans laquelle ils résident, sont médiés par des interactions directes avec la matrice extracellulaire (MEC), qui entraîne des changements physiologiques au niveau intracellulaire. Cette étude visait à analyser les effets de l'ECM RhoA induite par la signalisation mécanique qui contrôle l'organisation d'actine et la formation d'adhésion focale. CMLV ont été transfectées avec des constructions de type sauvage (RhoA, dominant négatif ou constitutivement active) et plaqué sur les protéines ECM différents utilisés comme substrat (fibronectine, le collagène IV, collagène I, et de la laminine) ou poly-L-lysine comme témoin. Les modifications morphologiques de la CMLV ont été détectées par microscopie confocale de fluorescence et de fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie, et ont été vérifiées de façon indépendante en utilisant des tests d'adhérence et de l'analyse Western blot. Nos résultats ont montré que l'ECM a un rôle important dans la cellule d'étalement, d'adhérence et de la morphologie avec un effet direct sur RhoA signalisation modulant. L'activité de RhoA significativement affecté les fibres de stress et de convergence de réorganisation des adhérences, mais dans un contexte imposé par l'ECM. Ainsi, modulation de l'activité de RhoA dans les CMLV induit une activation accrue de fibres de stress et de la formation FA à 5h, tandis qu'une inhibition significative a été enregistrée à 24h après le placage sur l'ECM différente. Nos résultats fournissent la preuve biophysique qui module la réponse ECM CMLV aux stimuli mécaniques induisant intracellulaires de signalisation biochimiques impliqués dans l'adaptation cellulaire au micro-environnement local.
