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Articles by Arkadiusz W. Kulczyk in JoVE
JoVE General
Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay
Descriviamo un metodo per osservare la replicazione in tempo reale di singole molecole di DNA mediate da proteine del sistema di replica batteriofago.
Other articles by Arkadiusz W. Kulczyk on PubMed
Struttura Della Soluzione E Grippaggio Del DNA Del Dominio Zinc-finger Da Ligasi Del DNA IIIalpha
Ligasi del DNA IIIalpha effettua il passaggio di legatura finale nella base di escissione riparazione (BER) e single strand break repair (SSBR) meccanismi di riparazione del DNA. L'enzima riconosce single-strand nicks e altre caratteristiche di danni nel DNA double-stranded, sia attraverso il dominio catalitico e un dominio N-terminale contenente un singolo zinc finger. Quest'ultimo è omologato alle altre dita di zinco che riconoscono il DNA danneggiato, due in N terminale della poly(adenosine-ribose) della polimerasi e tre in N terminale di thaliana di Arabidopsis nick-rilevazione del DNA 3'-phosphoesterase. Qui, vi presentiamo la struttura della soluzione del dominio zinc-finger della ligasi del DNA umano IIIalpha, la prima struttura di un dito da questo gruppo. Esso è legato a quello del fattore di trascrizione eritroidi GATA-1, ma ha un'ulteriore N-terminale beta-strand e alfa-elica C-terminale. Mapping di spostamento chimico utilizzando un ligando di DNA contenente una rottura a singolo filamento ha dimostrato che la superficie della barretta dello zinco ligasi del DNA IIIalpha DNA-binding è sostanzialmente diversa da quello di GATA-1, coerente con il fatto che le due proteine riconoscono caratteristiche molto differenti nel DNA. Probabili implicazioni per il grippaggio del DNA sono discussi.
Inadeguata Inibizione Della RNA Polimerasi Host Limita La Crescita Del Batteriofago T7 Su Host Con Sovraesprimono Relativa Udk
Sovraespressione di udk, un gene che Escherichia coli codifica per una chinasi citidina/uridina, interferisce con la crescita del batteriofago T7. Mostriamo qui che l'inibizione della crescita fago T7 di udk sovraespressione può essere superata tramite inibizione di host RNA polimerasi. Iperespressione del gene 2, il cui prodotto inibisce la RNA polimerasi ospite, ripristina la crescita fago T7 su host con sovraesprimono relativa udk. Inoltre, la rifampicina, un inibitore della polimerasi del RNA host, ripristina la dimensione di burst del fago T7 su host con sovraesprimono udk relativa alla normalità. D'accordo con questi risultati, mutanti soppressore che superare l'inibizione derivante dalla sovraespressione di udk acquisire la capacità di crescere su host che sono resistenti alla inibizione della RNA polimerasi di gene 2 proteine e mutanti soppressore che superare una carenza di proteine gene 2 acquisire la capacità di crescere su host che udk overexpress. Le mutazioni che eliminano o indeboliscono forti promotori per host RNA polimerasi T7 del DNA e mutazioni nel gene T7 3.5 che influiscono sulla sua interazione con T7 RNA polimerasi, anche riducono l'interferenza con una crescita dall'host di RNA polimerasi T7. Vi proponiamo un modello generale per il requisito dell'host inibizione della RNA polimerasi.
Conformazionale Dinamica Del Batteriofago T7 DNA Polimerasi Ed Il Relativo Fattore Di Processivity, Escherichia Coli Tioredossina
5 Gene del batteriofago T7 codifica per una DNA polimerasi (gp5) responsabile per la replicazione del DNA del fago. Gp5 polimerizza nucleotidi con bassa processivity, dissociando dopo l'incorporazione di 1 a 50 nucleotidi. Tioredossina (trx) di Escherichia coli si lega saldamente (Kd = 5 nM) ad un unico segmento nel sottodominio pollice di processivity gp5 e aumenti. Noi abbiamo sondato le basi molecolari per l'aumento di processivity. Un esperimento di singola molecola rivela differenze nei tassi di attività enzimatica e processivity gp5 e gp5/trx. Piccolo angolo x-ray scattering studi combinati con dell'impronta della nucleasi rivelano due conformazioni gp5, uno allo stato libero e uno sull'associazione di trx. Analisi comparativa delle fessure DNA binding della polimerasi del DNA e proteine leganti il DNA mostrano che la superficie di associazione contiene più idrofobici residui di altre proteine leganti il DNA. La composizione equilibrata tra residui idrofobi e caricati del sito Associazione permette di scorrimento efficiente di gp5/trx sul DNA. Vi proponiamo un modello per i cambiamenti conformazionali trx-indotta in gp5 che migliorano il processivity aumentando l'interazione di gp5 con DNA.
Simultanee Misurazione Singola Molecola Del Fago T7 Replisome Composizione E Funzione Di Rivelare Il Meccanismo Di Scambio Della Polimerasi
Una completa comprensione dei meccanismi molecolari alla base del funzionamento di complessi multiproteici, grande richiede strumenti sperimentali in grado di visualizzare contemporaneamente architettura molecolare e attività enzimatica in tempo reale. Abbiamo sviluppato un romanzo saggio di singola molecola che combina il flusso-stretching di singole molecole di DNA per misurare l'attività del macchinario di replicazione del DNA con la visualizzazione della polimerasi del DNA fluorescente contrassegnate presso la forcella di replicazione. Correlando la stechiometria della polimerasi con la sintesi del DNA del replisomes del batteriofago T7, siamo in grado di descrivere quantitativamente il meccanismo di scambio della polimerasi. Troviamo che anche a concentrazione relativamente modesto della polimerasi (∼2 nM), solubile polimerasi sono reclutate per un replisome attivamente a sintetizzazione, aumentando drasticamente la concentrazione locale della polimerasi. Queste polimerasi in eccesso rimangono passivamente associate replisome tramite interazioni elettrostatiche con l'elicasi T7 per ∼50 s fino a una dissociazione stocastica e transitoria della polimerasi sintetizzazione dal primer-modello permette per un evento di scambio della polimerasi a verificarsi.
Pyrovanadolysis, Una Pyrophosphorolysis-come Reazione Mediata Da Pyrovanadate, Mn2 + E Polimerasi Del DNA Del Batteriofago T7
DNA polimerasi catalizzano il 3' -5 '-pyrophosphorolysis di un primer di DNA ricotto a un modello di DNA in presenza di pirofosfato (PP(i)). In questa inversione della reazione di polimerizzazione, deoxynucleotides nel DNA vengono convertiti in deossinucleoside 5'-trifosfati. Basato sulla carica, la dimensione e la geometria dell'ossigeno collegando i due atomi di fosforo, di PP(i), una varietà di composti è stata esaminata per la loro capacità di effettuare una reazione simile a pyrophosphorolysis. Descriviamo una manganese-mediata pyrophosphorolysis-come attività utilizzando pyrovanadate (VV), catalizzata dalla polimerasi del DNA del batteriofago T7. Indichiamo questa reazione pyrovanadolysis. Spettroscopia di assorbimento di raggi x rivela una distanza più corta di Mn-V del complesso della polimerasi-VV rispetto la distanza Mn-P la polymerase-PP(i) complesso. Questa disposizione strutturale presso il sito attivo i conti per l'attivazione enzimatica di Mn-VV. Proponiamo che il Mn(2+), più grande di Mg(2+), si inserisce il sito attivo della polimerasi di mediare associazione di VV nel sito attivo della polimerasi. I nostri risultati possono essere la prima documentazione che vanadio può sostituire per il fosforo nei processi biologici.
Accoppiamento Di DTTP Idrolisi Con DNA Svolgimento Dal Helicase Del DNA Del Batteriofago T7
La DNA elicasi codificata dal gene 4 del batteriofago T7 monta su single-stranded DNA come un hexamer di sei subunità identiche con il DNA passando attraverso il centro del toroide. L'elicasi coppie l'idrolisi di dTTP per traslocazione unidirezionale su single-stranded DNA e il ricalcolo del DNA duplex. PHE(523), posizionata in un ciclo di β-hairpin all'interfaccia subunità, gioca un ruolo chiave nell'accoppiamento l'idrolisi di dTTP ricalcolo del DNA. Sostituzione di Phe(523) con alanina o valina abolisce la capacità di helicase rilassarsi DNA o consentire la T7 polimerasi di mediare la sintesi del filamento-spostamento sul DNA duplex. Complementazione in vivo studi rivela un requisito per un residuo idrofobico con catene laterali lungo in questa posizione. In una struttura di cristallo del T7 elicasi, quando un nucleotide viene associato a un'interfaccia di subunità, Phe(523) è sepolto all'interno dell'interfaccia. Tuttavia, nello stato non associato, è più esposta sulla superficie esterna dell'elicasi. Questa differenza strutturale suggerisce che il β-hairpin recanti il Phe(523) può subire un cambiamento conformazionale durante l'idrolisi del nucleotide. Siamo postulare che dopo idrolisi di dTTP, Phe(523) sposta da all'interno dell'interfaccia di subunità a una posizione più esposta dove Contatta il filamento complementare sfollato e facilita la rimozione.
