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- Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza
- Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay
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Articles by Nathan A. Tanner in JoVE
JoVE General
Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza
Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School
Questo protocollo dimostra una semplice molecola singola tecnica di microscopia a fluorescenza per la visualizzazione di replicazione del DNA da replisomes singoli in tempo reale.
JoVE General
Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay
Descriviamo un metodo per osservare la replicazione in tempo reale di singole molecole di DNA mediate da proteine del sistema di replica batteriofago.
Other articles by Nathan A. Tanner on PubMed
Le Interazioni Della Polimerasi Di DNA Elicasi DNA Dinamiche Assicurano Movimento Forcella Replica Processive
Una singola copia del batteriofago T7 DNA polimerasi e DNA elicasi avanzare la forcella replica con un maggiore di 17.000 nucleotidi processivity. Ciononostante, la polimerasi transitoriamente si dissocia dal DNA senza lasciare il replisome. Ensemble e singola molecola tecniche dimostrano che questo processivity dinamico è reso possibile da due modalità di interazione della polimerasi del DNA-elicasi. Durante la sintesi del DNA polimerasi e l'elicasi interagire in un sito ad alta affinità. In questa modalità di polimerizzazione, la polimerasi si dissocia dal DNA circa ogni 5000 basi. La polimerasi, tuttavia, rimane legata per l'elicasi tramite una modalità di legame elettrostatico che coinvolge la coda C-terminale acida l'elicasi e una base nella regione della polimerasi che si lega anche il fattore di processivity. La polimerasi i trasferimenti tramite l'interazione elettrostatica intorno l'elicasi esamerica in cerca il modello di primer.
Studi Di Singola Molecola Della Dinamica Della Forcella Nella Replicazione Del DNA Di Escherichia Coli
Presentiamo gli studi di singola molecola della macchina replica Escherichia coli. Noi visualizzare holoenzymes di individuali e. coli DNA polimerasi III (Pol III) impegnati nella sintesi di estensione e leader-strand primer. Quando accoppiato per l'elicasi DnaB replicativa, Pol III media sintesi leader-filo con un processivity della 10,5 kilobasi (kb), otto superiore a quello di Pol III da solo. Aggiunta di primasi DnaG causa una riduzione triplice processivity della sintesi leader-filo, un effetto dipendente con l'interazione della proteina-proteina DnaB-DnaG anziché primasi attività. Un'analisi di singola molecola della cinetica replica con diverse concentrazioni DnaG indica che un'associazione cooperativa di due o tre monomeri DnaG di DnaB interrompe la sintesi. Modulazione dell'attività dell'elicasi DnaB attraverso l'interazione con DnaG suggerisce un meccanismo che impedisce la sintesi leader filo superando la sintesi del filamento lagging durante la sintesi primer lento sul filamento in ritardo.
Studi Di Singola Molecola Della Dinamica Della Forcella Nella Replicazione Del DNA Di Escherichia Coli
Osservazione in Tempo Reale Di Singola Molecola Della Replica Del DNA Rolling-circle
Vi presentiamo una tecnica semplice per la visualizzazione di replica di singole molecole di DNA in tempo reale. Allegando un substrato rolling-cerchio ad una camera di flusso microscopio montato TIRF, siamo in grado di monitorare la progressione degli eventi di sintesi del DNA singolo e misurare con precisione le tariffe e processivities del singolo T7 ed Escherichia coli replisomes come replicare il DNA. Questo metodo consente rapida e precisa caratterizzazione della cinetica della sintesi del DNA e gli effetti degli inibitori della replica.
Osservazione Di Singola Molecola Della Replica Del DNA Procariota
I recenti progressi nelle tecniche di manipolazione molecolare e di imaging ottico hanno permesso di osservare l'attività dei singoli enzimi e studiare le proprietà dinamiche dei processi che sono difficili a delucidare utilizzando tecniche ensemble-Media. L'uso di approcci di singola molecola ha dimostrato di essere particolarmente riuscita nello studio delle interazioni dinamiche tra i componenti presso la forcella di replicazione. In questa sezione descriviamo i metodi necessari per i sistemi di replica ofprokaryotic studi in vitro di singola molecola. Attraverso questi esperimenti, accurate informazioni sulle tariffe e processivities del DNA e la polimerizzazione. La capacità di monitorare in tempo reale lo stato di avanzamento di una forcella singola replica consente il rilevamento degli Stati intermedi, di breve durata che sarebbe difficile visualizzare in dosaggi di fase di massa.
Visualizzando La Replicazione Del DNA a Livello Di Singola Molecola
I recenti progressi nella molecola singola metodologia hanno permesso di studiare il comportamento dinamico dei singoli enzimi e loro interazioni con altre proteine in complessi multiproteici. Qui, descriviamo recentemente sviluppati metodi per studiare il coordinamento della DNA svolgitura, adescamento e sintesi presso la forcella di replicazione del DNA. La lunghezza delle singole molecole di DNA viene utilizzata per misurare l'attività del singolo replisomes impegnati in coordinato replicazione del DNA. In primo luogo, una tecnica di tethered-particella è usata per prevedere la formazione e il rilascio di cicli di replicazione. In secondo luogo, un metodo di formazione immagine di fluorescenza fornisce una lettura diretta delle tariffe di replica e processivities da replisomes individuali. La possibilità di direttamente osservare intermedi di reazione transitoria e caratterizzare il comportamento eterogeneo rende questi approcci di singola molecola importanti nuove aggiunte agli strumenti disponibili per studiare la replicazione del DNA.
Fascette Di E. Coli La Replicazione Del DNA in Assenza Di β Libero
Durante la replicazione del DNA, ripetitive sintesi dei frammenti di Okazaki discreti richiede meccanismi che garantiscono la DNA polimerasi, pinza e primasi proteine sono presenti per ogni ciclo. In Escherichia coli, questo processo procede attraverso il trasferimento della polimerasi in ritardo-filo da β scorrevole pinza sinistra a un frammento di Okazaki completato da una pinza montata su un nuovo primer di RNA. Queste pinze in ritardo-filo sono pensate per essere vincolato dal replisome dalla soluzione e caricata una nuova per ogni frammento. Qui, si discute di un meccanismo di sintesi del filamento lagging sorprendente, alternativa: replica efficiente in assenza di qualsiasi morsetti diversi da quelli assemblati con il replisome. Tramite esperimenti di singola molecola, mostriamo che complessi replica premontati sulla sintesi del DNA il supporto di più frammenti di Okazaki in assenza di morsetti β in eccesso. Il processivity di questi replisomes, ma non il numero di frammenti di Okazaki sintetizzati, dipende dalla frequenza di sintesi di RNA-primer. Questi risultati ampliano la nostra comprensione della sintesi del filamento in ritardo e sottolineano la stabilità del replisome continuare sintesi senza nuove fascette.
