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Articles by Asa Hagner-McWhirter in JoVE
JoVE General
CyDye DIGEフルーア最小限の色素を用いた細胞表面タンパク質の選択的ラベリング
Research and Development, GE Healthcare Bio-Sciences AB
シンプルで具体的な方法は、分別工程なしで蛍光標識し、細胞表面タンパク質の拡張検出用に実証された。細胞表面タンパク質の差の存在量は、（2 - D）二次元電気泳動とEttan™DIGE技術を用いて解析した。
Other articles by Asa Hagner-McWhirter on PubMed
マウス グルクロニルヒドロラーゼ C5-エピメラーゼ遺伝子のターゲットを絞った中断 L イズロン酸欠けてヘパラン硫酸と新生児致死結果します。
グリコサミノグリカン ヘパラン硫酸 (HS) は胚発生におけるシグナル伝達事象を調節する蛋白質をバインドします。すべての識別された蛋白質の結合の HS のエピトープには l イズロン酸 (IdoA) が含まれています。マウス d グルクロニルヒドロラーゼ C5-エピメラーゼ遺伝子のターゲットを絞った中断 IdoA 欠けている構造的に変えられた HS で結果を報告します。対応する表現型は腎無形成、肺欠陥、骨格奇形に致命的であります。突然、脳、肝臓、消化管、皮膚や心臓を含む主要臓器システムは通常登場。IdoA ユニットは 2 O あたらしの異なる要件をいえに正常な腎臓、肺および骨格開発に不可欠であることを見つけます。対照的に、批判的にどうやらヘパラン硫酸を依存する知られている主要な初期発達するイベントは、通常 IdoA の不在でも進みます。
ヘパラン硫酸の生合成における不可逆グルクロニルヒドロラーゼ C5 エピマー化。
グルクロニルヒドロラーゼ C5-エピメラーゼ グルクロン酸の変換 l イズロン酸ユニットにおけるヘパラン硫酸の生合成を触媒します。基質認識ヘパラン硫酸塩前駆体多糖類の N 置換パターンによって異なります、N 硫酸化するには、非還元末端に向かって隣接するグルコサミン残渣が必要です。適切に N 硫酸化基板のエピマー化です d ブドウ糖構成の保持を優遇平衡と可溶性システムでは、自由に可逆 （・ ハグナー McWhirter A.、リンダール、米国、および Li、j. p.(2000) Biochem.J. 347, 69-75)。我々 セルラー システムでは、d-[5-(3) H] ガラクトースとヒト胚性腎臓 293 細胞をインキュベート エピメラーゼ反応の可逆性を検討しました。ラベルはグルクロン酸ユニットとヘパラン硫酸の前駆体多糖類に組み込まれた、後続の C5 エピマー化要イズロン酸に失われました。しかし、成熟したヘパラン硫酸鎖の deaminative 開裂によって得られたオリゴ糖の分析すべてグルクロン酸ユニット、C5 - 保持こと示される影響を受けやすいか、エピメラーゼに耐性のシーケンスが発生していたかに関係なく、(3) H ラベル。最終的な製品のすべての (3) H-ラベル エピメラーゼとの孵化はどうやら O 硫酸グループ ブロックによる可溶性システム、抵抗しました。グルクロン酸 C5 エピマー化効果的に生体内の可逆的であり、生合成の機械の厳しい組織に主張することが示唆されました。
高性能タンパク質解析のための近接結紮を介してウエスタンブロットが発生しました。
西部のしみが付くこと強力なであり広く使用されているメソッドが検出感度および特異性、およびターゲット蛋白質を検出するために高品質の抗体依存の制限ハードルを克服するために。デュアル抗体認識と強力なローカライズされた信号増幅に基づく、in situ 近接結紮アッセイでは、増加の検出感度と特異性リン酸化または相互作用するタンパク質などの複雑な目標を識別する能力と共にを提供しています。ここウェスタンブロッテイング in situ 近接結紮アッセイ メカニズムを適用しています。この組み合わせは、ローリング サークル増幅 DNA 分子ターゲット固有の ligation の反作用のため 16-fold 形成の等温の使用を許可または検出感度の大きい増加。デュアル抗体認識により高められた特定性高選択的試金、（伝統的なウェスタンブロッテイングすなわち両方生産異なる無指定バンド) 2 つの交差反応性 antitubulin 抗体の組み合わせが使用されたときに特定のバンドを検出することを確認しました。我々 もリン酸化血小板由来増殖因子受容体 β の検出近接結紮によって 1 つに対して受容体抗体を実証し、別のリン酸化チロシン残基に対する監督します。これは、ストリッピングし膜再徹底的なや 2 つの別々 の伝統的なしみを整列する必要が回避。我々 は、高パフォーマンス in situ 近接ここ説明結紮ベース ウエスタンブロット検出を介して化学発光や蛍光検出システムと互換性があるし、このように容易に任意の研究室で用いることができることを示しています。
