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- Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert
- Machen Patch-Pipetten und Sharp Elektroden mit einem programmierbaren Puller
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Articles by Brandon E. Johnson in JoVE
JoVE General
Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University School of Medicine
Dies ist als eine Einführung in die Klemme Aufnahme von Xenopus laevis Oozyten Patch soll. Es deckt Dotterhaut Entfernung, Bildung einer Gigaohm Dichtung (Gigaseal) und die optionale Konvertierung der Patch auf die outside-out-Topologie.
JoVE General
Machen Patch-Pipetten und Sharp Elektroden mit einem programmierbaren Puller
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University School of Medicine
Dieses Video zeigt, wie eine programmierbare Abzieher verwenden, um Patch-Pipetten und scharfen Elektroden für die Elektrophysiologie zu machen. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Glas-Tools, einschließlich Injektionsnadeln zu machen.
Other articles by Brandon E. Johnson on PubMed
Alpha-Synuclein Knospen Hefe-Modell: Toxizität Durch Gestörte Proteasom Und Oxidativen Stress Verbessert
Morbus Parkinson (PD) ist eine häufige Neurodegenerative Erkrankung, die sich aus der selektiven Verlust von Mittelhirn dopaminergen Neuronen. Misfolding und Aggregation von dem Protein Alpha-Synuclein, oxidative Schäden und Proteasomal Wertminderung sind alle Hypothesen für die molekulare Ursache für diese selektive Neurotoxizität. Hier beschreiben wir eine Saccharomyces-Cerevisiae-Modell zur Bewertung der misfolding, Aggregation, und Toxizität-induzierende Fähigkeit von Wildtyp Alpha-Synuclein und drei Mutanten (A30P, A53T und A30P/A53T), und wir vergleichen Verordnung dieser Eigenschaften durch gestörte Proteasomes und durch oxidativen Stress. Wir fanden prominente Lokalisierung von Wildtyp und A53T Alpha-Synuclein in der Nähe von der Plasmamembran bekannte in-vitro-Lipid-Bindung Fähigkeit zu unterstützen. Im Gegensatz dazu war A30P meist zytoplasmatischen, während A30P/A53T beide Arten von Fluoreszenz angezeigt. Alpha-Synuclein war nicht giftig für verschiedene Hefestämme getestet. Als Hefe-Mutanten für den Proteasomal-Lauf (doa3-1) ausgewerteten, verspätete Alpha-Synuclein-Synthese und Membran-Verband waren wurden beobachtet; Hefe Mutant der Proteasomal GAP (sen3-1) stellte erhöhten Akkumulation und Aggregation von Alpha-Synuclein. Beide sen3-1und doa3-1 Mutanten ausgestellt synthetischen Letalität mit Alpha-Synuclein. Wenn Hefen mit einem Oxidationsmittel (Wasserstoffperoxid) in Frage gestellt wurden, Alpha-Synuclein war extrem tödlich auf Zellen, die Mangan-Superoxid-Dismutase Mn-SOD (sod2Delta) fehlten, aber nicht auf Zellen, die fehlte, Kupfer, Zink-Superoxid-Dismutase Cu, Zn-SOD (sod1Delta). Trotz der Toxizität angezeigt sod2Delta Zellen nie intrazelluläre Aggregate von Alpha-Synuclein. Wir schlagen vor, daß die toxische Alpha-Synuclein-Arten in der Hefe kleiner als die sichtbaren Aggregate sind und Toxizität z. Alpha-Synuclein-Membran-Verband b. wird. So entstanden die Hefen wirksame Organismen für die Charakterisierung von Faktoren und Mechanismen, die Alpha-Synuclein Toxizität zu regulieren.
Die Parallele Wurm-Tracker: Eine Plattform Zur Messung Der Durchschnittsgeschwindigkeit Und Arzneimittel-induzierter Lähmung Der Nematoden
Caenorhabditis Elegans Fortbewegung ist ein einfaches Verhalten, das verbreitet, genetische Komponenten Verhalten, synaptische Übertragung und Muskelfunktion zu zergliedern. Viele der Paradigmen, die geschaffen wurden, um die Studie von C. Elegans Fortbewegung basieren auf qualitative Experimentator Beobachtung. Hier berichten wir über die Umsetzung einer automatisierten Tracking-System entwickelt, um die Fortbewegung mehrere einzelne Würmer parallel zu quantifizieren.
Die Komplexe Dystrophin Steuert Bk Kanal Lokalisierung Und Muskel-Aktivität in Caenorhabditis Elegans
Genetische Defekte im Dystrophin-assoziierte Protein Komplex (DAPC) sind verantwortlich für eine Vielzahl von pathologischen Bedingungen einschließlich Muskeldystrophie, Kardiomyopathie und Vasospasmus. Konservierte DAPC Komponenten vom Menschen Caenorhabditis Elegans empfehlen eine ähnliche Molekulare Funktion. C. Elegans DAPC Mutanten weisen eine einzigartige lokomotorischen Defizit längerer Muskel Erregung und Kontraktion an. Hier zeigen wir, dass das C. Elegans DAPC ist wichtig für die korrekte Lokalisierung von SLO-1, der große Leitfähigkeit, Spannung- und Kalzium-abhängige (BK) Kaliumkanal, das einen großen nach außen Gleichrichterdiode Strom im Muskel unter den normalen physiologischen Zustand durchführt. Durch Analyse von Mutanten mit dem gleichen Phänotyp als DAPC Mutanten haben wir festgestellt, das neuartige Islo-1-Gen, das kodiert ein Protein mit zwei vorhergesagten Transmembran-Domänen. Wir demonstrieren ISLO-1 fungiert als ein neuartiges Adapter-Molekül, das die DAPC mit SLO-1 im Muskel verbindet. Wir zeigen, dass ein Defekt in der DAPC oder ISLO-1 unterbricht die normale SLO-1-Lokalisierung im Muskel. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen, dass SLO-1 eine hohe Calcium-Konzentration für die vollständige Aktivierung erfordert, finden wir, dass in der Nähe von L-Typ-Kalzium-Kanäle im Muskel, SLO-1 und bieten somit einen Mechanismus Kupplung Kalzium Zustrom lokalisiert ist mit der nach außen zur Berichtigung der aktuellen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die DAPC Muskel-Erregbarkeit moduliert durch Lokalisierung des SLO-1-Kanals, der Kalzium-reiche Regionen von C. Elegans Muskel.
Interagieren Alternativ Gespleißte Domänen, Um BK Kalium Kanal Anspritzung Regulieren
Die meisten menschlichen Gene enthalten mehrere alternative Splice-Sites, die geglaubt, um die Komplexität und Vielfalt des Proteome erweitern. Jedoch ist wenig bekannt über, wie die Interaktionen zwischen alternativer Exons Proteinfunktion regulieren. Wir nutzten Caenorhabditis Elegans Slo-1 große Leitwert Calcium und Spannung aktivierte Kalium (BK)-Kanal-gen, enthält drei Alternative Spleißen Websites (A, B und C) codiert und mindestens 12 Spleiß-Varianten, um die funktionellen Folgen von alternatives Spleißen zu untersuchen. Diese Arkane Websites aktivieren die Einfügung des Exons Codierung Teil des Reglers von K(+) Leitwert (RCK) 1 Ca(2+)-Koordination-Domäne (Exon A1 und A2) und Teile des RCK1-RCK2 Linker (Exon B0, B1, B2, C0 und C1). Exon-A1 und A2 sind in gewissem Sinne gegenseitig verwendet und sind 67 % identisch. Die anderen Exons können von bis zu 41 Rückstände den RCK1-RCK2-Linker erweitern. Alle Isoformen elektrophysiologische Aufnahmen zeigen, dass die A1 und A2 Exons zu, Aktivierung Kinetik und Ca(2+) Empfindlichkeit regulieren, aber nur, wenn alternative Exons sind am Standort B oder C eingefügt. So RCK1 interagiert mit dem RCK1-RCK2-Linker, und die Wirkung von Exon Variation Anspritzung hängt von der Kombination des alternativen Exons in jedes Isoform vorhanden.
Intragenic Alternative Spleißen Koordination Unbedingt Caenorhabditis Elegans Slo-1 Genfunktion
Alternatives Spleißen ist entscheidend für die Diversifizierung der eukaryotischen Proteome, aber die Regeln, die EZB und die Koordination der Spleißen Veranstaltungen unter mehreren Alternativen Spleiß-Standorten innerhalb einzelner Gene sind nicht gut verstanden. Wir entwickelt eine quantitative PCR-basierte Strategie zur Quantifizierung der Ausdruck der 12 Abschriften, die durch den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans Slo-1-Gen kodiert, enthält drei alternative Splice-Sites. Bedingte Wahrscheinlichkeit basierende Modelle verwenden, zeigen wir, dass Spleißen Veranstaltungen über diese Standorte hinweg koordiniert werden. Darüber hinaus identifizieren wir eine Punktmutation in einem Intron grenzte an einen alternativen Spleiß-Platz, das alternative Spleißen an allen drei Standorten stört. Diese Mutation führt zu abweichenden synaptischen Übertragung an der neuromuskulären Synapse. In einer genomischen Umfrage fanden wir, dass ein UAAAUC Element durch diese Mutation gestört in Introns flankierenden alternativer Exons in Genen mit mehreren Alternativen Splice Sites bereichert wird. Diese Ergebnisse belegen, dass die wirksame Koordinierung intragenic alternatives Spleißen ist essentiell für die normale Physiologie der Slo-1 in-vivo und vermeintliche spezialisierte Cis-regulatorische Elementen, die die Koordinierung der intragenic alternatives Spleißen Regeln zu identifizieren.
