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Articles by Bryan J. Pfister in JoVE
JoVE Bioengineering
軸索のストレッチの成長：神経成長のメカノトランスダ
1Departments of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 2Graduate School of Biomedical Sciences, University of Medicine and Dentistry of New Jersey
ユニークな組織工学の手法は、軸索の伸長の成長をrecapitulatingで培養中の多数の神経線維を伸長するために開発された、神経は大きくするには身体の成長と一緒に細長いそれによって神経系の成長の形。
Other articles by Bryan J. Pfister on PubMed
軸索損傷のin Vitro一軸ストレッチモデルの
我々は軸索損傷、外傷性頭部外傷の一般的な脳組織の変形から生じる神経細胞死を研究するためのユニークな一軸延伸装置を開発しました。変位制御ではなく、力のコントロールを使用して、このデバイスは90秒（-1）、および現在軸索損傷を研究するために使用されている上記の> 70％株とひずみ速度を実現することができます。我々は、試料の変形、一軸均一で再現性の高いことを確認した。あらかじめ指定された変位のプロファイルはほぼ正確に実現することができる、および適切な細胞接着が容易に達成することができる。デバイス全体では、無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネットに収まることができ、標本は細胞培養のために便利です。このデバイスは、びまん性軸索損傷に関与する生体力学的問題の広い範囲を調査するために使用することができます。
統合された軸索の極端なストレッチの成長
大型動物は、神経や白質路の軸索は急速にも拡大することを示唆し、開発中に巨大な成長を受けることができます。統合された軸索から拡張する成長円錐がありませんので、機械的な力は、動物の成長と一致する軸索の伸長を刺激するかもしれないと仮定されている。しかし、統合された軸索の迅速かつ持続的な成長のこの独特なフォームが実証されていない。ここでは、文化の中で数日から数週間にわたって統合された軸索路のストレッチの高騰率の効果を評価するためにマイクロステッピングモータシステムを使用していました。我々は軸索路はストレッチが8ミリメートル/ dのレートで成長し、切断せずに10cmの長さに到達できることがわかった。細胞骨格の成分やオルガネラの形態と濃度が維持されながら、ダイナミックかつ長期的な伸びにもかかわらず、延伸軸索は、35％の口径に増加した。これらのデータは機械的な刺激がはるかに軸索成長のいずれかの以前に観察された制限を超え、統合された軸索路の極端な "ストレッチ成長"を誘発することができる最初の証拠を提供しています。
ストレッチに成長した軸索の構成移植性神経組織コンストラクトの開発
in vitroで成長した神経系の修復への新しいアプローチを追求し、fasciculated軸索路は、末梢神経や脊髄の病変にまたがるように設計された神経組織構築に開発されました。我々は、軸索路の数と長さを最大限に1cm/dayの前例のない軸索成長率に到達し、生活のコアコンポーネントとして機能するように8日に約5cm長い軸索路を作成するために極端な軸索伸長成長の新たプロセスを最適化神経組織は、構築します。免疫細胞化学的分析では、伸長線維が軸索であることを確認し、すべての主要な細胞骨格の成分は、ストレッチ成長地域にまたがって存在だった。我々は、80％のコラーゲンハイドロゲルの細長い細胞を包む文化からそれらを除去し、合成管にそれらを挿入することによって、移植可能な神経組織の構造を形成した。また、我々は直接伸長装置から除去することができた手術の膜上に軸索伸長の成長を誘導し、移植に適した円筒状の構造に形成された。能力は急速に元の神経の軸方向は、神経修復に未踏、潜在的に無料の方向を提供して反復することが生きている神経組織の構造を作成することができます。理想的には、生きている軸索路と神経損傷をブリッジすると、新しい機能の接続を確立または販売促進するのに役立つ可能性があります。
脊髄病変を注入機械的に設計さ神経組織コンストラクトの長期生存率と伸長
脊髄損傷（SCI）を修復するための最もアプローチは軸索伸長を促進するに頼る一方で、軸索はブリッジSCI病変に成長しなければならないことを広範な距離は、膨大な課題である。本研究では、長いSCI病変を修復するために、軸索路に住んで張られる長い神経組織構造を作成するための新しい組織工学的手法を使用していました。極端な軸索伸長成長の新たプロセスを悪用し、後根神経節（DRG）ニューロンから統合された軸索管は機械的に7日間で10 mmまでの試験管内伸長と神経組織の構築を形成するコラーゲンハイドロゲルに包まれた。さらに、ラットで変更された横方向の片側切断SCIモデルは、脊髄の長さ1 cmの空洞を作るために開発されました。 SCI次の10日は、コンストラクトは、病変に移植した動物を4週間後に移植組織学的分析のために安楽死させた。細胞の追跡方法と免疫組織化学により、移植細長い文化は一貫して脊髄損傷で4週間生き延びることが判明した。さらに、DRG軸索は、ホスト脊髄組織に移植された構造体の外に延長が認められた。これらの結果は、神経組織にも広範な脊髄病変を埋めるためにストレッチ成長軸索から成る構築の約束を示しています。
ストレッチ成長の軸索は、アクティブな電気信号を伝送する能力を保持する
軸索は、その目標を達成した後に少しは、広範な中枢神経系の成長について知られている。確かに、出生後の動物は、軸索が拡大体を収容するために引き伸ばされていることを示唆し、成長を続けています。我々は以前の軸索は、1センチメートル/日に達したストレッチの成長率を維持することができることが示されているが、それはアクティブな信号を送信する能力が維持されていたかどうかは不明であった。ここでは、ストレッチの成長は、ナトリウムチャネルの活性化、不活化し、リカバリまたはカリウムチャネルの活性を変化させなかった。さらに、ニューロンはストレッチ成長軸索に伝播する通常の活動電位を生成します。驚くべきことに、NaおよびKチャネル密度は神経伝達の忠実度を維持するために自然な応答を表すことができるストレッチ成長により増加した。
In Vitroでの神経構築およびNeurointerfaceで生産する神経エンジニアリング
最近、我々の研究室では、後期胚と成人期初期の間で発生する軸索の成長の自然なフォームをrecapitulated。本稿では、この小説の神経工学的なアプローチは、外部制御用に切断された運動感覚機能を統合する神経組織·インタフェースを生成するために使用することができる方法について説明します。
CNSの電気生理学の損傷によって誘発された改造
外傷性脳損傷（TBI）の中等度の例に軽度のは非常に一般的ですが、常に重篤な外傷後に見られるあからさまなpathophysiogical変更に関連付けられていません。神経細胞死が普及してメモリ、主な要因であると考えられているが、多くの軽度のTBI患者が苦しんで認知と運動機能の赤字は、常に細胞の損失と相関関係はありません。したがって、我々は機能障害を存続ニューロンの変化に起因するかもしれないと主張している。現在の研究では、外傷後の中枢神経系のシナプス回路を探求し始めました。ここでは、in vivoおよびinシナプスの電気生理学における傷害誘導性の変化に機械的な洞察を提供するTBIのin vitroモデルを使用して行われた重要な所見を確認してください。海馬では、研究は現在、TBIは、地域のシナプス回路の正常な機能を中断、生き残った神経細胞の興奮性および抑制性神経伝達の間に微妙なバランスを変化させることを示唆している。別のアプローチ、in vitroでの神経のストレッチ損傷の簡易モデルでは、直接損傷は血流、血液脳関門の完全性、またはin vivoで関連付けられている酸素の変化の非存在下でニューロンの生理学と細胞生物学にどのように影響するかを探求するために使用されている脳損傷のモデル。この章では、これら2つのモデルが受容体、細胞、回路レベルでの興奮性と抑制性シナプス伝達を変化させる方法と、これらの変化は認知障害と人間の震とう脳損傷に関連付けられている発作閾値の低減に貢献する方法について説明します。
移植のための含意：収穫人間のニューロンは、ライブ神経組織の構造として設計された。実験室調査
ニューロンの移植は、神経系は、動物モデルでの約束を示している修復することが、患者の大規模な神経損傷を埋めるため、臨床応用のための現実的なニューロンと不十分なアプローチのいくつかの実用的な情報源があります。そこで筆者らは、移植可能な神経組織構造に設計することができる神経細胞の臨床的に関連するソースを求めた。著者は文化の中で、その堅牢性に起因するヒトの後根神経節（DRG）ニューロンを評価することにしました。
ポリマー繊維を実施する上でカプセル化された神経構文を使用する組織工学神経電気リレーを開発
神経の電気的インターフェース·プラットフォームは、細胞外ニューロン集団の活動を監視するために開発されています。電気的にポリマー繊維は、その柔軟性、合わせた形状と制御された導電特性によるニューロンの持続的な機能的なインターフェースのための魅力的な基質である導電性ポリアニリンベース。本研究では、小径（<400マイクロモル）カプセル化された組織工学神経電気リレーのバックボーンとしての導電性ポリアニリンとポリプロピレン（PA-PP）のブレンドから成る繊維を利用しての神経生物学的考慮事項を取り上げた。我々は、PA-PP繊維のプライマリ後根神経節ニューロンの生存、接着や神経突起伸長を促進するための新しいアプローチを考案した。我々は、細胞接着性リガンドでコーティングされた繊維に向かって神経細胞の懸濁液を沈降にバイアスをかけるために周囲の表面電荷を操作することにより、約700のニューロンのmm（-2）に繊維表面上で実行可能な神経細胞の密度の10倍以上の増加を達成しました。神経細胞の密度で、この厳しい増加は、直接繊維に沿った強固な神経突起の拡張とネットワークの形成をもたらした。さらに、我々は潜在的にネットワークの安定性を促進しながら、保護バリアを形成するためにアガロースを使用してPA-PP繊維にこれらの神経ネットワークをカプセル化されます。カプセル化に続いて、神経回路網は、PA-PP繊維への整合性、高い生存率（> 85％）と親密な密着性を維持しています。これらの努力は、直接繊維表面上の小口径PA-PP繊維具体的には、改良されたneurocompatibility、高密度の神経細胞接着や神経突起ネットワークの開発を使用して、神経細胞集団と機能的電気インタフェースの確立のための重要な前提条件を達成しました。
人為的に設計さ軸索地帯を使用した末梢神経系を有する新規Neuroprostheticインタフェース
我々は以前の長さは数センチメートルの移植の生活軸索路を作成するために我々の研究室で開発された技術を説明してきました。本稿では、これらの人工神経組織の構成要素が潜在的に補装具の求心性と遠心性の通信を有効にするには、再生末梢神経系を有する新規neuroelectricalインタフェースを作成するために使用する方法について説明します。
移植エンジニア神経組織コンストラクトの長期生存との統合により、末梢神経の再生を促進する
末梢神経損傷は、外傷や手術の一般的な結果ですが、修理のための不十分な手段があります。特に、主要な神経病変を越えて軸索の再生を容易にするために改良された方法の重要な必要性がある。ここでは、ホスト軸索再生を導くために標識された経路を提供するために、移植可能な生きた神経組織構造を設計した。これらの構造は、長手方向に、ポリ（グリコール酸）チューブに挿入された軸索路の生活整列、ストレッチ成長から成っていた。構造体（同種）はラットで坐骨神経の切除部分を埋めるために移植され、組織学的分析は、移植片の生存、統合、およびホストの再生を決定するために6および16週の移植後で行った。両方の時点で、移植されたコンストラクトは、軸索の広大で張られる構造体の四肢で移植神経細胞体のクラスターを生き残ったと、彼らの移植前の形状を維持していることが判明した。移植された地域全体、ホスト、および移植片軸索の絡み合い叢は、移植された軸索が損傷を越えてホスト軸索再生を媒介していると示唆していました。 16週で軸索の移植後、大規模な髄鞘形成は、移植領域全体を観察した。さらに、移植神経細胞は宿主の神経に侵入、移植領域の余白を超えて軸索を伸ばしていました。特に、同種の構造のこの生存との統合は免疫抑制療法のない場合に発生しました。これらの知見は、主要な神経病変を埋めると軸索を介した軸索伸長やガイダンスを提供することにより、潜在的に、ホストの再生を促進するための組織工学軸索の構造を生活の約束を示しています。
頭部動作のローラーコースターに乗って：脳損傷のための含意
外傷性脳損傷の危険性（TBI）のジェットコースターに乗っている間は、実質的な注目を集めている。ジェットコースターに乗っている時の周りのTBIの症例報告では、ジェットコースターによる高重力（G-軍は）重要なTBIのリスクをもたらすと主張する多くの医療専門家をリードしてきました。頭部外傷の研究は、しかし、G-軍が単独でTBIを予測することはできませんことを示している。確立され頭部外傷の規準と手続きが日常的な活動とジェットコースターに乗っての間にTBIの可能性を比較するために用いた。三次元の頭部の動きは、3つの異なるジェットコースターに乗って、枕投げ、自動車の衝突シミュレーション時に測定した。データは、頭部の動きの同様の分析を使用して、パブリッシュされたデータで分析し、比較した。 8.05メートル/ sの車は4.1と0.36のジェットコースターの乗り物よりも大きいの6倍以上、3.41の28.1と頭部衝撃力の最大の頭部外傷の基準測定につながるクラッシュ。特に、ジェットコースターに乗る時の頭部加速度の線形および回転成分は、多くの一般的な活動によって誘発されるものよりも軽度であった。このように、ローラーコースター·ライドによって誘導される頭部の動きによるTBIの非常に低いリスクがあるように表示されます。
末梢神経の修復のための医工学の戦略：外科的用途、アートの状態、および今後の課題
末梢神経系へのダメージは驚くほど一般的であり、外傷や手術の合併症から主に発生します。神経機能の回復は、多くの軽度の損傷で発生しますが、結果は、重度の外傷後にしばしば不十分である。神経の修復と再生には、一意の臨床課題と機会を提示し、実質的な貢献は、医用生体工学戦略の情報に基づいたアプリケーションを介して行うことができます。この資料では、外科的意思決定や修復戦略のための芸術の状態に加えて、臨床症状と神経損傷の分類を見直します。この議論は現実的に神経損傷の治療を改善し、広範な回復を促進するために取り組まなければならない具体的な課題を提示します。特に、神経欠陥の長さで数センチは標準的な手法として、感覚神経移植を使用しますが、このアプローチは追加の手術に関連付けられたドナー神経および併存疾患の可用性によって制限されます。また、我々は現在、非侵襲的に神経損傷の程度を評価し、軸索再生を追跡するために不十分な能力を持っています。結果として、静観手術の決定は望ましくないとあまり成功し "遅延"修理手順につながる可能性があります。時間のために、この戦いでは、遠位の神経支持構造とターゲットの変性は、最終的に完全な機能回復を鈍化、進行する。したがって、末梢神経修復の最も差し迫った課題は、遠経路の有効性を維持するために、組織工学、神経自家移植の性能を一致させるか、または超えて移植、非侵襲的に神経損傷を評価し、軸索再生を追跡する能力、およびアプローチの開発が含まれてい再生過程中およびターゲット。医用生体工学の戦略は、重度の末梢神経損傷後の外科的管理と機能回復を改善し、実質的に基礎と応用の両方のレベルで貢献してこれらの問題に対処することができます。
胚性および成人ニューロンの軸索伸長成長のイメージングを生きる
神経系修復のための戦略は、成長円錐を介して成長メカニズムの知識から生じている。軸索伸長の成長の特徴的なプロセスは、神経の修復を加速する新たな経路を明らかにするかもしれない堅牢な、長期的な成長です。ここでは、ライブイメージングバイオリアクターは、密接にかかる張力によって開始された携帯電話のイベントを探索するように設計されました。成人および胚背根神経節（DRG）ニューロン間のストレッチ成長の可能性は、神経の修復に重要な差異を検討した。胚軸索は4？MM / dの単方向のストレッチの成長率が可能であったと確実に2週間以内の長さは4？センチに達した。大人の軸索は、わずか2？MM / Dに到達し、4？cmに達するために3週間を引き継いだ可能性があります。タイムラプスイメージングを利用して、我々は、ストレッチの成長と協調して成長円錐の運動性を観察した。ストレッチングの開始時には、成長円錐は、撤回した。しかし、10分以内？ストレッチ連続のH、成長円錐は、0.2の速度で延長？MM / dを張力の方向に向かい、全体的な軸索の伸長に貢献しています。我々は軸索輸送のストレッチの効果を決定するためにひずみの増加レベルで速いミトコンドリア輸送を分析した。輸送は24％のひずみで減少し始め、39％の歪みでほぼ完全に欠席した。驚くべきことに、軸索を回収し、その後のストレッチ成長することができました。静止張力が回復したようにテンションが完全に（？5％歪）がリリースされたときに、6.1の速度で後退し成長した軸索を伸ばす？m /秒と遅くなりました。リアルタイムで軸索伸長成長の過程を評価するこの能力は、張力軸索の成長と収縮を駆動するために使用する方法の詳細な研究が可能になります。
ハイスループット軸索傷害システムをエンジニアリング
軸索への外傷性損傷部位のいくつかの重要な生物学的メカニズムは、in vitroでのストレッチ傷害モデルで使用して明らかにされている。これらのモデルは、しかし、生産性が遅い保ち、単一文化の実験に基づいています。確かに、低収率は、プロテオミクス解析などの高スループット法を必要とする重要かつ十分な根拠の調査を妨げている。このニーズを満たすために、我々は外傷性脳損傷研究の次世代を加速し、対応するマルチウェルハイスループット傷害デバイスを設計した。このモジュラーシステムのストレッチは、24ウェル培養プレートフォーマットまたは同時に6個々のウェルのいずれかに神経培養を傷つける。カスタムソフトウェアのコントロールは、ユーザーが正確に所望の基板の変形と損傷パラメータを達成するために、圧力パルスのパラメータをプログラムすることができます。と非常に小さい標準偏差と立ち上がり時間、ピーク圧、および減衰を表示し、24ウェルモジュール - 圧力波形の解析では、ピーク圧力は直線的に入力圧力と弁開度に関連していたと6が示された。データはまた、圧力パルスは圧力室全体に均等に分散されたことを確認し、したがって、それぞれの損傷にも。重要なのは、基板の変形と加圧力との関係は、複数のウェル間で一貫していたと、各モジュールの予測可能なリニア動作が表示されます。これらのデータは、このマルチウェルシステムだけでなく、現在使用されているストレッチ傷害デバイスを実行し、神経外傷研究の分野にわたって必要とされるハイスループット研究に着手できることを確認してください。
神経再生およびin VivoでBiohybridizedインターフェイスMicrosystemsの神経組織工学（その2）
神経組織工学は驚異的な老化、病気の影響に対処するための約束、または神経系の損傷を提供しています。ここでは、直接損傷や病気の神経組織を置き換えるために生体組織の設計に関して、神経組織工学を確認したり、神経系の再生能力を増強すると失われた機能を復元する。この資料では、特に3次元（3-D）神経構造や神経biohybridized電気マイクロを設計し、組織の開発と実装に対応しています。生きている3-D神経の構造は、失われた神経解剖学を再現するために、神経再生のために制御された神経解剖学的、機能的特性を持つin vitroでの "プリエンジニアリング"であるかもしれない、またはデバイスへの神経組織のインターフェイスとして機能する。検討されて一つのアプリケーションは、移植時に、直接失われた接続を復元することによって、または軸索を介した軸索再生を悪用して、ホストの再生を促進することを目的足場として機能することで神経系の修復を容易にすることができる軸索路の構造を開発しています。別のアプリケーションでは、生きている神経組織工学構築物は、神経系との機能統合のための神経の電気的インタフェースMicrosystemsをbiohybridizeに検討されています。この設計では、in vivoで神経突起の内部成長とシナプス統合に潜在的に非器質性インタフェースを備えた、より自然な統合を活用し、生きているコンポーネントで発生する可能性があります。全体として、組織設計、3次元神経回路の構造の使用は著しく非組織工学的アプローチによって達成されていない神経系の再生またはデバイスベースの赤字の緩和を進めることができます。
