Vivre Marqueur Des Vésicules Synaptiques: Synaptotagmine-GFP

Genesis (New York, N.Y. : 2000). Sep-Oct, 2002  |  Pubmed ID: 12324970

Pêche Pour Les Gènes Chick: Triple-label Entier Montage Hybridation in Situ Fluorescente Détecte Expression Génique Simultanéité Et Le Chevauchement Dans Les Embryons D'oiseaux

Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. Mar, 2004  |  Pubmed ID: 14991720

Multi-couleur d'ensemble de montage hybridation in situ est une technique puissante pour comparer les profils d'expression spatiale de deux ou plusieurs gènes dans les embryons en développement. Nous avons développé un triple label amplifié toute monture hybridation fluorescente in situ (FISH) qui permet la détection de trois ARNm différents dans un seul embryon. Le protocole utilise simultanément l'hybridation in situ à ribosondes haptenylated, suivie par la détection d'anticorps séquentielle en utilisant des anticorps anti-haptène conjugué à la peroxydase de raifort, et l'amplification du signal tyramide (CST) du système de détection de fluorescence. Microscopie à fluorescence conventionnelle identifie les domaines de l'expression des gènes qui se chevauchent au niveau des tissus, tandis que la microscopie confocale de fluorescence permet une seule cellule de résolution et différencie les types de cellules spécialisées au sein d'un tissu donné. Ce protocole permettra aux chercheurs engagés dans l'utilisation de la FISH avec un solide point de départ pour adapter leur propre dans les protocoles d'hybridation in situ, que ce soit seuls ou en combinaison avec l'immunohistochimie ou vert colocalisation protéine de fluorescence.

Une Sous-unité Du Récepteur Du Glutamate Chez La Drosophile Essential Qui Fonctionne Dans Les Deux Neuropile Centrale Et La Jonction Neuromusculaire

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. Mar, 2005  |  Pubmed ID: 15788777

Un écran en avant chez la drosophile génétique des mutants avec un défaut de développement synaptique identifiée mauvaise réception (BREC). Homozygotes mutants Brec sont embryonnaires létales, paralysé, et ne montrent aucune transmission détectable synaptique à la jonction glutamatergique neuromusculaire (JNM). La cartographie génétique, des tests de complémentation, et de la génomique spectacle séquençage que les mutations Brec de perturber une sous-unité ionotropiques non caractérisée récepteur de glutamate, nommée ici "GluRIID." GluRIID est exprimé dans le domaine post-synaptique de la jonction neuromusculaire, ainsi que largement dans le neuropile synaptique du système nerveux central. Dans le NMJ de mutants nuls Brec, tous les sous-unités connues des récepteurs de glutamate sont indétectables par immunocytochimie, et tous les récepteurs du glutamate fonctionnels sont éliminés. Ainsi, nous concluons que GluRIID est essentielle pour l'assemblage et / ou la stabilisation des récepteurs du glutamate dans la jonction neuromusculaire. Dans les embryons Brec mutant nul, la fréquence des périodiques courants excitateurs dans les neurones du moteur est considérablement réduite, ce qui démontre que l'activité du SNC schéma moteur est régulée par GluRIID. Bien que le développement synaptique et la différenciation moléculaire apparaissent autrement perturbé dans les mutants nuls, viables hypomorphic mutants Brec afficher NMJs considérablement sous-bois de la fin du développement larvaire, ce qui suggère que l'activité-dépendante GluRIID motif central réglemente périphérique croissance synaptique. Ces études révèlent que GluRIID une sous-unité du récepteur du glutamate nouvellement identifié qui est essentielle pour l'assemblage des récepteurs du glutamate / stabilisation de la JNM périphérique et nécessaire pour la sortie du moteur correctement configurée dans le SNC.

Human ESCRT Et Protéines ALIX Interagir Avec Des Protéines De La Coque Centrale Et De La Fonction Dans La Cytocinèse

The EMBO Journal. Oct, 2007  |  Pubmed ID: 17853893

TSG101 et ALIX à la fois la fonction en matière de VIH en herbe et dans la formation de vésicules au niveau du corps multivésiculaires (MVB), où ils interagissent avec d'autres complexes de tri endosomal requis pour les facteurs de transport de la voie (ESCRT) nécessaires pour la libération des virus et des vésicules. Analyses protéomiques ont révélé que ALIX et TSG101/ESCRT-I également lier une série de protéines impliquées dans la cytocinèse, y compris CEP55, CD2AP, ROCK1, et IQGAP1. ALIX et TSG101 concentrer à centrosomes et sont ensuite recrutés pour les midbodies de la division des cellules par des interactions directes entre la région «charnière» de la centrale CEP55 et GPP basées sur des motifs au sein de TSG101 et ALIX. ESCRT-III et VPS4 protéines sont également recrutés, ce qui indique qu'une grande partie de la voie ESCRT se localise dans le milieu du corps. L'appauvrissement de ALIX et TSG101/ESCRT-I inhibe l'étape d'abscission de la cytokinèse des cellules HeLa, comme le fait la surexpression VPS4, confirmant une exigence pour ces protéines dans la division cellulaire. En outre, mutants ponctuels ALIX ce bloc CEP55 et CHMP4/ESCRT-III contraignant aussi inhiber l'abscission, indiquant que les deux interactions sont indispensables. Ces expériences suggèrent que la voie ESCRT peuvent être recrutés pour faciliter analogues des événements de fission membranaires au cours du VIH en herbe, la formation des vésicules MVB, et le stade d'abscission de la cytokinèse.

Avec Facultés Affaiblies Piège Neutrophiles Extracellulaire (NET) Formation: Un Roman Déficit Immunitaire Inné Des Nouveau-nés De L'homme

Blood. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19221037

Les neutrophiles sont hautement spécialisées innées cellules effectrices qui ont évolué pour tuer des agents pathogènes. Nouveau-nés humains ont un syndrome multifactoriel commune de la dysfonction des neutrophiles qui est incomplètement caractérisée et contribue à une septicémie et d'autres complications infectieuses graves. Nous avons identifié un défaut roman dans les défenses antibactériennes de nouveau-nés: l'incapacité à former des neutrophiles pièges extracellulaires (filets). NET sont des réseaux de l'ADN extracellulaire, la chromatine, et des protéines antibactériennes qui interviennent meurtre extracellulaire de micro-organismes et sont pensées pour former par l'intermédiaire d'une voie de mort unique, signalée par la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase générés par les espèces réactives de l'oxygène (ROS). Nous avons constaté que les neutrophiles des enfants nés à terme et les prématurés ne parviennent pas à former NET lorsqu'il est activé par les agonistes-in inflammatoires contrairement à leucocytes et des adultes en bonne santé. Le déficit dans la formation NET va de pair avec un déficit non comptabilisé antérieurement dans le meurtre bactérienne extracellulaire. Génération de Ross ne se complètent pas le défaut dans la formation de NET par les neutrophiles néonatales, comme il l'a fait dans les cellules adultes avec la NADPH oxydase inactivé, ce qui démontre que Ross sont nécessaires mais pas suffisantes intermédiaires de signalisation et l'identification d'un déficit dans les voies liées ou en aval dans les leucocytes néonatales. Avec facultés affaiblies formation NET peut être un aspect essentiel d'une immunodéficience commune de développement qui prédispose les nouveau-nés à l'infection.

Les Effets Toxiques Directs De L'extrait Aqueux De Fumée De Cigarette Sur Les Myocytes Cardiaques à Des Concentrations Cliniquement Pertinentes

Toxicology and Applied Pharmacology. Apr, 2009  |  Pubmed ID: 19371621

Notre objectif était de déterminer si les concentrations cliniquement pertinentes de l'extrait aqueux de fumée de cigarette (CST) ont des effets directs délétères sur les myocytes ventriculaires pendant l'ischémie simulée, et d'étudier les mécanismes impliqués.

Human ESCRT-III Et VPS4 Protéines Sont Nécessaires Pour Centrosome Et D'entretien De La Broche

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20616062

La voie ESCRT aide à la transmission de l'étape finale d'abscission de la cytokinèse chez les mammifères et les archées. Chez les mammifères, deux protéines très précoces agissant de la voie ESCRT, Alix et TSG101, sont recrutés à la coque centrale par le biais d'interactions directes avec la phosphoprotéine CEP55. CEP55 réside au centrosome pendant la majeure partie du cycle cellulaire, mais migre ensuite vers la coque centrale au début de la cytokinèse, suggérant que la voie ESCRT peut également avoir des liens centrosomales. Ici, nous avons systématiquement analysé les exigences en matière de fin d'action des mammifères ESCRT-III et VPS4 protéines à différentes étapes de la mitose et la division cellulaire. Nous avons trouvé que l'appauvrissement de VPS4A, VPS4B, ou l'un des 11 différents de l'homme ESCRT-III (CHMP) a inhibé protéines abscission. Remarquablement, l'épuisement de la personne ESCRT-III et VPS4 protéines a également modifié le centrosome et nombre de pôles du fuseau, la production multipolaire broches (la plupart des ESCRT-III/VPS4 protéines) ou des fuseaux monopolaires (CHMP2A ou CHMP5) et provoquer des défauts dans la ségrégation des chromosomes et de la morphologie nucléaire. VPS4 protéines concentrées à pôles du fuseau durant la mitose et puis à midbodies pendant la cytocinèse, ce qui implique que ces protéines fonctionnent directement sur les deux sites. Nous concluons que ESCRT-III/VPS4 protéines de fonction à centrosomes pour aider à réguler leur entretien ou la prolifération et puis à midbodies cours abscission, contribuant ainsi à assurer la progression ordonnée travers les différentes étapes de la division cellulaire.

Exploiter L'immunité Antitumorale Du Refus De La Rechute Et à Améliorer La Durée De Rémission

Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22198309

Les survivants du cancer font souvent des rechutes dues à l'évolution des médicaments clones résistants et de repeupler les cellules souches tumorales. Notre étude préclinique a démontré que les lymphocytes de patients cancéreux en phase terminale peut être converti à partir spectateurs tolérantes in vivo dans efficaces les lymphocytes T cytotoxiques in vitro tuant propres du patient les cellules tumorales contenant la drogue clones résistants et les cellules souches tumorales. Nous avons conçu un essai clinique combinant le peginterféron α-2b avec l'imatinib pour le traitement de stade III / IV tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) avec le rationnel qui peginterféron α-2b sert en tant que signaux de danger à promouvoir l'immunité antitumorale tout en tuant l'imatinib de la tumeur efficace sape induite par des tumeurs tolérance et d'approvisionnement antigènes spécifiques de tumeurs in vivo, sans leucopénie, permettant ainsi des cellules dendritiques et bonne lymphocytes T cytotoxiques différenciation vers la réponse Th1. L'analyse intermédiaire de huit patients ont montré une induction significative de l'IFN-γ-producteur-CD8 (+),-CD4 (+),-des cellules NK, et l'IFN-γ-producteur-infiltrant les tumeurs des lymphocytes, ce qui signifie réponse Th1 importante et NK l'activation. Après un suivi médian de 3,6 ans, de réponse complète (CR) + réponse partielle (RP) = 100%, la survie globale = 100%, un patient est décédé de la maladie sans rapport avec tout en rémission, six des sept patients évaluables sont soit dans la poursuite de PR / CR (5 patients) ou qui ont une survie sans progression (PFS, 1 patient) dépassant la limite supérieure du niveau de confiance de 95% du génotype spécifique-PFS de la phase III à l'imatinib en monothérapie (CALGB150105/SWOGS0033), ce qui démontre très prometteurs les résultats cliniques. Le procès en cours est fermée à la préparation d'un procès plus l'avenir. Nous concluons que la combinaison de la thérapie ciblée et de l'immunothérapie est sûr et induit la réponse Th1 importante et l'activation des cellules NK et a démontré une efficacité clinique très prometteur dans les GIST, ce qui justifie le développement dans d'autres types de tumeurs.

Glutathion-dépendant Stress Réductrice Déclencheurs Oxydation Mitochondriale Et Cytotoxicité

The FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22202674

Pour étudier les effets de la prédominance thiol non protéique, le glutathion (GSH), sur l'homéostasie redox, nous avons utilisé des stratégies complémentaires pharmacologiques et génétiques afin de déterminer les conséquences à la fois de contenu en GSH perte et le gain de fonction in vitro. Nous avons suivi les événements d'oxydo-réduction dans le cytosol et les mitochondries en utilisant la réduction-oxydation sensibles protéine fluorescente verte (roGFP) sondes et le niveau de réduction des thiorédoxines / oxydé (TRXs). Soit H (2) O (2) ou l'inhibiteur de réductase Trx 1-chloro-2 ,4-dinitrobenzène (DNCB), dans le cœur de rat embryonnaire (H9c2) des cellules, a évoqué 8 ou 50 mV plus oxydant glutathion potentiel redox, E (hc ) (GSSG/2GSH), respectivement. En revanche, la N-acétyl-L-cystéine (NAC) de traitement dans H9c2 cellules, ou la surexpression de la ligase soit cystéine glutamate (GCL) sous-unité catalytique (GCLC) ou sous-unité modificateur de GCL (GCLM) dans embryonnaires humaines de rein 293 T (HEK293T) cellules, a conduit à 3 - à 4 fois plus de GSH et causé 7 ou 12 mV plus la réduction de E (hc), respectivement. Cette condition, paradoxalement, a augmenté le niveau de l'oxydation mitochondriale, comme l'a démontré par des changements d'oxydo-réduction dans mitochondriale roGFP et TRX2. Enfin, soit de la NAC traitement (CE (50) 4 mM) ou soit une surexpression de GCLC ou GCLM exposé cytotoxicité accrue et la susceptibilité au milieu plus réducteur a été atteint à une baisse des niveaux de ROS. Pris dans leur ensemble, nos résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel la GSH-dépendante du stress réductrice déclenche l'oxydation mitochondriale et cytotoxicity.-Zhang, H., Limphong, P., Pieper, J., Liu, Q., Rodesch, CK, chrétiens, E ., Benjamin, IJ glutathion-dépendante du stress réductrice déclenche l'oxydation mitochondriale et la cytotoxicité.

Quantification De La Dystrophine Immunofluorescence Dans Des échantillons De Muscle Dystrophinopathie

Neuropathology and Applied Neurobiology. Jan, 2012  |  Pubmed ID: 22243335

Buts: dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est généralement associée à l'expression de dystrophine absente ou presque absente au sarcolemme. Quantification des niveaux très faibles de signal de la dystrophine dans les études par immunofluorescence de biopsies musculaires sections présente un défi technique. Cela est particulièrement vrai dans le cadre d'essais de médicaments la preuve de principe, dans lequel la détection et la quantification de ce qui peut avoir des changements importants dans les niveaux d'expression est importante, même si les niveaux absolus de dystrophine reste faible. Méthodes: Nous avons développé une méthode d'analyse d'image qui permet fiable et semi-automatisée de quantification par immunofluorescence de l'expression de dystrophine de bas niveau dans les sections co-marquées pour la spectrine. L'utilisation d'un script personnalisé Metamorph pour créer un masque région contiguë de la spectrine, nous quantifions l'intensité du signal dystrophine seulement au niveau des pixels dans le masque de la spectrine qui, vraisemblablement, représentent le sarcolemme. En utilisant cette méthode, nous avons analysé la biopsie musculaire tissus d'une série de patients atteints de DMD, dystrophie musculaire de Becker (BMD), intermédiaire dystrophie musculaire (IMD), et le tissu de contrôle normal. Résultats: L'analyse de coupes sériées sur plusieurs jours confirme la reproductibilité, et de la dystrophine normalisée: rapports d'intensité de la spectrine (exprimée en pourcentage de tissu de contrôle normale) sont bien corrélés avec les niveaux d'expression de dystrophine tel que déterminé par analyse par Western blot. Conclusions: Cette méthode offre une méthode robuste et fiable de détection de biomarqueurs pour les essais de thérapies DMD. © 2012 Les Auteurs. Neuropathologie et appliquée Neurobiologie © 2012 Société britannique neuropathologique.