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Articles by Christopher Loewen in JoVE
JoVE General
Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae
Department of Cellular and Physiological Sciences, University of British Columbia - UBC
GFP-protéines de fusion sont largement utilisés pour visualiser les organites par microscopie confocale. Cependant, le dépistage de mutations qui affectent la morphologie des organites exige généralement mutagenèse individuelle et prend du temps. Ici, nous démontrons une méthode pour intégrer simultanément organite-GFP marqueurs dans près de 5000 gènes non essentiels dans la levure.
Other articles by Christopher Loewen on PubMed
L'homéostasie Du Cholestérol: Ce N'est Que Les INSIGs SCAP Lady
Trois nouvelles études ont de vastes implications pour l'homéostasie du cholestérol, l'identification d'un nouveau mécanisme par lequel un stérol-fonctions de détection de domaine dans l'activation des protéines réglementé stérols éléments réglementaires contraignantes.
Une ER Conservée Ciblage Motif En Trois Familles De Protéines De Liaison Et De Lipides Dans Opi1p Lié VAP
Le trafic intracellulaire des lipides est médiée à la fois par des vésicules membranaires et par un certain nombre de non-vésiculaires voies facilité par des protéines cytoplasmiques lipidiques contraignantes. Pour ces protéines pour agir efficacement, ils doivent être ciblés avec précision à des membranes spécifiques. Ici nous identifions un roman déterminant à court conservé appelé le motif FFAT qui est partagée par plusieurs protéines lipides apparemment sans rapport contraignants et se retrouve également dans Opi1p, un régulateur transcriptionnel de la synthèse des phospholipides dans la levure. Motifs FFAT agir en tant que membrane de ciblage des déterminants de leur interaction directe avec des homologues de VAMP-associated protein (VAP), une conservée réticulum endoplasmique (RE) des protéines. Dans la levure bourgeonnante, tous les quatre protéines avec des motifs FFAT interagir avec Scs2p, un homologue de VAP, de cibler l'ER dans une certaine mesure. La répartition précise intracellulaire de chacune de ces protéines dépend de l'intégration de l'interaction FFAT-Scs2p avec d'autres déterminants de ciblage, et de l'interaction est fonctionnellement importante. Nous concluons que la liaison à un homologue VAP est un mécanisme commun par lequel les protéines avec des motifs FFAT, dont la plupart sont impliqués dans le métabolisme des lipides, des membranes ER cibles.
Le Rôle De L'Assemblée Sous-unité Dans Périphérine-2 Ciblage Des Membranes Rod Disque Photorécepteur Et La Rétinite Pigmentaire
Périphérine-2 est un membre de la famille des tétraspanines des protéines membranaires qui joue un rôle essentiel dans la morphogenèse des photorécepteurs segment de disque externe. Des mutations dans périphérine-2 sont responsables de diverses maladies de dégénérescence rétinienne, y compris rétinite pigmentaire autosomique dominante (PDRA). Pour identifier les déterminants nécessaires à la périphérine-2 visant à membranes de disques et d'élucider les mécanismes sous-jacents ADRP, nous avons généré transgéniques exprimant des têtards de Xenopus de type sauvage et ADRP lié périphérine-2 mutants que des protéines de fusion fluorescentes vertes dans les photorécepteurs de tige. De type sauvage mutants périphérine-2 et P216L et C150S, qui s'assemblent comme des tétramères, ciblés sur des membranes de disque que visualisé par microscopie confocale et électronique. En revanche, les mutants et C214S L185P, qui forment des homodimères, mais pas tétramères, ont été retenus dans le segment de tige intérieure. Seule la maladie de la dégénérescence P216L mutant photorécepteur induite. Ces résultats indiquent que tétramérisation est nécessaire pour la périphérine-2 ciblage et l'incorporation dans les membranes de disque. Tétramérisation-mutants défectueux provoquer ADRP à une carence de type sauvage périphérine-2, tandis que tétramérisation-compétente P216L périphérine-2 ADRP causes par un effet dominant négatif, peut-être découlant de l'introduction d'une nouvelle chaîne oligosaccharide qui déstabilise les disques. Nos résultats indiquent en outre qu'un poste de contrôle entre les segments des photorécepteurs intérieure et extérieure ne permet correctement assemblés périphérine-2 tétramères être incorporés dans les membranes des disques naissantes.
Rôle De L'Assemblée Sous-unité Dans Rétinite Pigmentaire Autosomique Dominante Liée à Des Mutations Dans Peripherin 2
Périphérine 2 est une protéine membranaire spécifique photorécepteur impliqué dans la morphogenèse segment de disque externe et relié à des rétinopathies différents dont rétinite pigmentaire autosomique dominante (PDRA). Périphérine 2 et ROM1 assembler sous forme de mélange de base non covalentes tétramères homomères et qui pointent en outre hétéromère ensemble par des liaisons disulfure pour former des oligomères d'ordre supérieur. Ces complexes sont critique pour la formation et la structure de jante disque segment extérieur grâce à une interaction avec le canal de GMPc-dépendants et protéines photoréceptrices autres. Nous avons examiné le rôle de l'assemblage des sous-unités périphérine 2 ciblage sur les disques, la structure du segment externe, et la dégénérescence des photorécepteurs par l'étude des propriétés moléculaires et cellulaires de la périphérine 2 mutants dans des cellules COS-1 et transgéniques Xenopus laevis photorécepteurs tige. De type sauvage (WT) et le PDRA lié P216L mutant ont été transportés et incorporées dans les disques nouvellement formées segment externe de X. laevis transgénique. Le mutant P216L, cependant, l'instabilité induite progressive du segment externe et une dégénérescence des photorécepteurs éventuellement par le biais de l'introduction d'une nouvelle N-lié chaîne oligosaccharidique. En revanche, le C214S et L185P maladie liée, tétramérisation-mutants défectueux, ont été retenus dans le segment interne, mais n'a pas affecté la structure du segment externe ou d'induire une dégénérescence des photorécepteurs. Ensemble, ces résultats indiquent que la périphérine 2 mutations peuvent provoquer ADRP soit par une carence dans le document WT périphérine 2 (C214S, 1.185P) ou par un effet dominant négatif sur la stabilité du disque (P216L).
Un Site Très Conservé De Liaison Dans Des Vésicules Associée Protéines Membranaires-associated Protein (VAP) Pour Le Motif FFAT Des Lipides Des Protéines De Liaison
Une variété de lipides protéines de liaison contiennent un motif récemment décrit, désigné FFAT (deux phénylalanines dans un tube acide), qui se lie à des vésicules associé-protéine de membrane-associated protein (VAP). VAP est une protéine membranaire intégrale conservée du réticulum endoplasmique qui contient à son extrémité amino-terminale d'un domaine lié à la protéine majeure de spermatozoïdes nématodes. Ici, nous avons étudié l'interaction FFAT-VAP chez Saccharomyces cerevisiae, où la VAP homologue SCS2 régule le métabolisme des phospholipides par l'intermédiaire d'une interaction avec le motif de FFAT Opi1. En introduisant des mutations au hasard dans SCS2, nous avons constaté que les mutations qui abrogées liaison à FFAT ont été regroupés dans la région la plus hautement conservée. Utilisation de la mutagenèse dirigée, nous avons identifié plusieurs résidus critiques, y compris les deux lysines largement séparés dans la séquence primaire. En examinant tous les autres résidus basiques conservés, nous avons identifié un troisième résidu qui a été modérément important pour FFAT contraignant. VAP moulage sur la structure connue de protéine majeure de sperme a montré que les résidus critiques former une tache sur une face chargée positivement de la protéine. In vivo des études fonctionnelles de SCS22, une seconde SCS2-like gene chez S. cerevisiae, a montré que SCS2 était le gène dominant dans la régulation de Opi1, avec une contribution mineure de SCS22. Nous avons ensuite établi que la réduction de l'affinité de SCS2 mutants pour FFAT bien corrélée avec la perte de fonction, indiquant l'importance de ces résidus pour des motifs FFAT contraignantes. Enfin, nous avons constaté que VAP-A humaine pouvait se substituer à SCS2 mais qu'il fonctionnait mal, ce qui suggère que d'autres facteurs moduler la liaison de SCS2 aux protéines avec des motifs FFAT.
Héritage Des ER Corticale Dans La Levure Est Requis Pour L'Organisation Septines Normale
Comment les cellules de surveiller la distribution des organites est largement inconnue. Dans la levure bourgeonnante, le plus grand sous-domaine du réticulum endoplasmique (RE) est un réseau de corticale ER (CER) qui adhère à la membrane plasmique. La livraison des CER à partir de cellules mères pour les papilles, qui est appelé héritage CER, se produit comme un processus ordonné au début de bourgeonnement. Nous constatons que l'héritage CER est défectueux dans les cellules dépourvues SCS2, un homologue de levure de la VAP intégrante ER protéine de la membrane (vésicules associé de protéine de membrane-associated protein) conservées chez tous les eucaryotes. SCS2 et VAP humaine les deux pointes cibles de levure bourgeon, ce qui suggère une action conservée de VAP à attacher à des sites d'ER croissance polarisée. En outre, la perte de l'une des SCS2 ou ICE2 (une autre protéine impliquée dans l'héritage CER) perturbe ensemble septines au niveau du col des bourgeons. Cette perturbation entraîne un retard dans le passage à travers G2, activation de la kinase wee1 Saccharomyces (SWE1) et le point de contrôle morphogenèse. Ainsi, nous identifions un mécanisme impliqué dans la détection de la distribution des ER.
Critical Determinants De La Reliure Chromatine Par Saccharomyces Cerevisiae Yng1 Exister En Dehors De L'usine De Finger Homéodomaine
Le règlement temporelle et spatiale des histones modifications post-traductionnelles est essentielle pour structure de la chromatine et le bon fonctionnement. Le Saccharomyces cerevisiae NuA3 complexe histone acétyltransférase modifie la queue amino-terminale de l'histone H3, mais comment NuA3 est destiné à des régions spécifiques du génome n'est pas entièrement comprise. Yng1, une sous-unité de NuA3 et un membre de l'inhibiteur de la famille des protéines de croissance (ING), est nécessaire pour l'interaction de NuA3 avec la chromatine. Cette protéine contient un C-terminale des plantes homéodomaine (PHD) doigt qui interagit spécifiquement avec la lysine 4-triméthylé histone H3 (H3K4me3) in vitro. Cette initialement suggéré que NuA3 est destiné aux régions portant la marque H3K4me3; cependant, la suppression du doigt Yng1 PHD ne perturbe pas l'interaction avec la chromatine des NuA3 ou le résultat dans un phénotype compatible avec la perte de NuA3 fonction in vivo. Dans cette étude, nous avons découvert les bases moléculaires des anomalies dans ces données. Nous présentons à la fois des preuves génétiques et biochimiques qui sur toute la longueur Yng1 a deux indépendants histone motifs de liaison: un motif amino-terminal qui lie non modifié queues H3 et un doigt carboxyle-terminale PHD qui reconnaît spécifiquement H3K4me3. Bien que ces motifs peuvent se lier de façon indépendante les histones, ensemble, ils augmentent l'association apparente de Yng1 pour la queue H3.
Acide Phosphatidique Est Un Biocapteur PH Cette Biogenèse Des Membranes Liens à Métabolisme
Reconnaissance des lipides par des protéines est important pour leur ciblage et l'activation des voies de signalisation dans de nombreux, mais les mécanismes qui régulent ces interactions sont en grande partie inconnue. Ici, nous avons constaté que la liaison des protéines à l'acide des lipides de signalisation ubiquitaire phosphatidique (PA) dépendait du pH intracellulaire et de l'état de protonation de son groupe de tête de phosphate. Chez la levure, une diminution rapide du pH intracellulaire en réponse à la privation de glucose régulé de liaison de PA à un facteur de transcription, Opi1, que de manière coordonnée gènes réprimés métaboliques phospholipides. Ce couplage activé de la biogenèse des membranes de la disponibilité des éléments nutritifs.
Haute Densité Dépistage Tableau Pour Identifier Les Besoins Génétiques De La Tolérance Des Métaux De Transition Chez Saccharomyces Cerevisiae
Les systèmes biologiques sont développés avec une forte dépendance sur les métaux de transition pour accomplir un certain nombre de réactions biochimiques. Fer, le cuivre, le manganèse et le zinc sont essentiels pour pratiquement toutes les formes de la vie avec leurs chimies uniques qui contribuent à une variété de processus physiologiques, y compris le transport d'oxygène, production d'énergie cellulaire et la structure des protéines et la fonction. Les propriétés de ces métaux (et dans une moindre mesure, du nickel et du cobalt) qui les rendent si essentielle à la vie les rendent également très cytotoxique dans de nombreux cas à travers la formation de radicaux oxygène nocifs via la chimie de Fenton. Alors que la vie a évolué pour exploiter les chimies de métaux de transition à conduire des réactions physiologiques, les systèmes ont évolué de façon concomitante à la protéger contre les effets néfastes de ces mêmes métaux. Saccharomyces cerevisiae est un outil précieux pour l'étude de l'homéostasie des métaux avec la plupart des gènes identifiés à ce jour ayant homologues chez les eucaryotes supérieurs, y compris les humains. Utilisation de réseaux de haute densité, nous avons projeté un ensemble haploïde S. cerevisiae contenant suppression 4786 délétions de gènes non essentiels pour les souches sensibles à chacun des Fe, Cu, Mn, Ni, Zn et Co et a ensuite intégré les six écrans en utilisant l'analyse par grappes pour identifier voies qui sont uniques à différents métaux et d'autres ayant une fonction partagée entre les métaux. Les gènes avec aucune implication antérieure dans l'homéostasie des métaux ont été trouvés à contribuer à la sensibilité de chaque métal. D'importants recoupements a été observée entre les souches qui ont été sensibles au Mn, Ni, Zn et Co avec plusieurs de ces souches dépourvues de gènes de la voie haute affinité Fe de transport et les gènes impliqués dans le transport et l'acidification vacuolaire. Les résultats de l'ensemble du génome de six écrans de tolérance aux métaux montrent qu'il existe des points communs entre les défenses cellulaires contre la toxicité de Mn, Ni, Zn et Co avec Fe et Cu nécessitant des systèmes différents. En outre, le potentiel de nouveaux facteurs été identifié que la fonction de la tolérance à chacun des six métaux.
Mettre Le PH En Signalisation Acide Phosphatidique
L'acide lipidique phosphatidique (PA) a un rôle important dans la signalisation cellulaire et la régulation du métabolisme chez tous les organismes. De nouvelles preuves montrent que l'AP a également un rôle sans précédent d'un biocapteur pH, le couplage des changements de pH aux voies de signalisation intracellulaires. pH de détection est une propriété de la tête polaire phosphomonoester de PA. Un certain nombre d'autres lipides de signalisation puissants groupes de tête avec également contenir phosphomonoesters, ce qui implique que le pH de détection par les lipides peut être répandue en biologie.
Les Lipides Comme Conducteurs De L'Orchestre De La Vie
L'acide phosphatidique est un lipide métabolique intermédiaire important dans la biosynthèse des lipides dans toutes les cellules eucaryotes, mais il est encore plus que cela. L'acide phosphatidique est en train de devenir un lipide qui est à la fois compositeur et chef d'orchestre, où en plus de son rôle en tant que précurseur de biosynthèse (compositeur), il est également une molécule de signalisation puissant (conducteur), qui intègre la biogenèse membrane avec détection des éléments nutritifs et la croissance cellulaire. Cet article traite des progrès récents dans la levure qui chantent les louanges de l'acide phosphatidique comme l'un des conducteurs de la vie.
