Des Cellules Humaines Primaires Diffèrent Dans Leur Sensibilité Au Transfert De Gènes RAAV-2-médiation Et La Durée Des Expression Du Gène Rapporteur

Journal of Virological Methods. Sep, 2002  |  Pubmed ID: 12270659

La sensibilité d'une variété de différents tissus primaires a été examiné à long terme avec la protéine recombinante de type transduction virus adéno-associé 2 (rAAV-2) et les facteurs influençant l'efficacité de la transduction. Contrairement à d'autres utilisant des lignées cellulaires et des modèles animaux, l'accent a été mis sur l'utilisation de cellules humaines primaires. Renforcée protéine fluorescente verte (EGFP) l'expression du gène marqueur est examinée à l'aide de cellules activé par fluorescence de tri analyse. Les cellules cibles les plus efficaces pour le transfert de gènes rAAV-2-médiation étaient épithéliales bronchiques, l'artère endothéliale ainsi que des cellules musculaires lisses et squelettiques avec des taux moyens allant de transduction de 34,3 à 81,6%. Taux de transduction baisse entre 4,3 et 19,5% ont été trouvés dans les chondrocytes, les cellules dermiques folliculaires papilles épithéliales et les fibroblastes. Pas de transduction a été observée dans les mélanocytes, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)-CD34 mobilisés (+) ou les cellules malignes des cellules CD19 (+) provenant de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique. Une proportion de EGFP-exprimant le muscle squelettique et les cellules musculaires lisses a été maintenue sur une période de 6 semaines après transduction (42,7 + / -5,4 et 67,1 + / -0,9%, respectivement). Fait intéressant, parmi follicule pileux cellules épithéliales de la proportion de cellules transduites est passée de 8 + / -0,5 à 36 + / -7,7% au cours de 6 semaines. En revanche, pour les cellules endothéliales, les cellules épithéliales bronchiques et les fibroblastes, un déclin rapide du nombre de cellules exprimant EGFP ont été notés. Une relation inverse entre la proportion de cellules en phase G2 / M du cycle cellulaire et l'expression des gènes à long terme a été observée. Tous les rAAV-2 des cellules sensibles primaires exprimé FGFR-1 et l'intégrine alphaV compatible avec leur rôle de co-récepteurs pour les AAV-2. En conclusion, l'AAV-2 est un système de vecteur approprié pour la transduction et l'évaluation des effets fonctionnels de l'expression des gènes à long terme dans le muscle humain primaire et cellules du follicule pileux.

Les Méthodes De Production Pour Des Vecteurs De Transfert Génique Basée Sur Sérotypes De Virus Adéno-associés

Methods (San Diego, Calif.). Oct, 2002  |  Pubmed ID: 12413413

Des vecteurs dérivés de virus adéno-associé de sérotype 2 (AAV-2) représentent un outil le plus prometteur pour le transfert de gène humain, parce que ces vecteurs ne sont ni pathogènes, ni toxique pour la cellule cible, et de permettre l'expression des gènes à long terme dans une grande variété de tissus. Cependant, ils sont plutôt inefficace à infecter un certain nombre de types cellulaires cliniquement pertinentes, et de la transduction par ces vecteurs est probablement entravée par des anticorps neutralisants qui sont très répandues dans la population humaine. Par conséquent, un nombre croissant de chercheurs sont actuellement tournent leur attention vers les cinq autres sérotypes d'AAV, pour essayer de développer ces vecteurs en tant que nouveaux pour le transfert de gène humain, l'espoir de surmonter les problèmes liés à l'AAV-2 vecteurs. Je décris ici et de discuter de la méthodologie pour produire ces vecteurs AAV alternatives en culture de tissus. Dans le détail, deux stratégies sont comparées qui reposent sur la transfection de cellules en culture avec deux ou trois plasmides, contenant le vecteur AAV génome et l'encodage AAV et les fonctions auxiliaires adénoviraux. Chacune de ces protocoles peut être utilisé pour emballer un génome d'AAV recombinant dans des capsides de son propre sérotype (génération de «vrais» sérotypes) ou de «contre-paquet" cet ADN vecteur dans des capsides dérivées d'une autre sérotype AAV ("pseudotypage"). Comme ces approches sont encore à leurs premiers stades, les limites actuelles de la technologie actuelle sont discutés, et les éventuelles améliorations possibles proposées.

Helper Virus-free, De La Production Optiquement Contrôlable, Et Deux à Base De Plasmides De Vecteurs Viraux Adéno-associés Des Sérotypes 1 à 6

Molecular Therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. Jun, 2003  |  Pubmed ID: 12788658

Nous présentons une stratégie simple et sûre pour la production de haute-titrage de virus adéno-associés (AAV) de vecteurs dérivés des six sérotypes d'AAV différents (AAV-1 à AAV-6). La méthode, appelée «HOT», est exempt de virus helper, optiquement contrôlables, et basée sur la transfection de seulement deux plasmides, c'est-à-un vecteur AAV construction et l'un des six nouveaux plasmides auxiliaires AAV. Celui-ci ont été conçus pour effectuer l'AAV sérotype gènes rep et cap ainsi que des fonctions auxiliaires adénovirales, ainsi que uniques fluorescentes cassettes d'expression de protéines, permettant la confirmation de la transfection avec succès et d'identification du plasmide transfectée. Croix-encapsidation de l'ADN vecteur dérivé de AAV-2, -3 ou -6 était jusqu'à 10 fois plus efficace en utilisant nos nouveaux plasmides, par rapport à un conservateur adénovirus dépendant de la méthode. Nous avons également identifié une variété d'anticorps utiles, permettant la détection des protéines Rep ou VP, ou capsides assemblées, de tous les sérotypes d'AAV six. Enfin, nous décrivons tropismes cellulaires uniques et de la cinétique de l'expression du transgène pour les vecteurs AAV de sérotype dans les cellules primaires ou transformés à partir de quatre espèces différentes. En somme, la stratégie de HOT et les anticorps présentés ici, avec les résultats rapportés, devrait faciliter et soutenir le développement de vecteurs AAV de sérotype que de nouveaux outils puissants pour la thérapie génique humaine.

Préclinique in Vivo D'évaluation Des Pseudotypés Vecteurs Viraux Adéno-associés Pour La Thérapie Génique Du Foie

Blood. Oct, 2003  |  Pubmed ID: 12791653

Nous rapportons la génération et l'utilisation de pseudotypés viral adéno-associé (AAV) pour l'expression spécifique du foie de sang humain facteur IX de coagulation (hFIX). Par conséquent, un génome de l'AAV-2 codant pour le gène hfIX a été contre-emballés dans des capsides AAV de type 1 à 6 en utilisant efficace, à grande échelle la technologie pour la production de particules et de purification. Chez les souris immunocompétentes, les particules de vecteur qui en résultent ont exprimé des niveaux élevés hFIX allant de 36% (AAV-4) à plus de 2000% de la normale (AAV-1, -2 et -6), qui devrait dépasser les niveaux curatifs chez les patients atteints d'hémophilie . Expression de la dose-et temps-dépendante, avec AAV-6 diriger l'apparition plus rapide plus fort et d'expression hFIX à toutes les doses. Fait intéressant, l'administration systémique de particules x 2 vecteur AAV de 1012-1, -4 ou -6 abouti à des niveaux hFIX similaires à ceux obtenus par la livraison veine porte. Pour tous les autres sérotypes et les doses de particules, l'administration du vecteur hépatique a donné jusqu'à 84 fois plus de protéines hFIX livraison veine de la queue, corroborée par le nombre de vecteurs de même augmenté de copies d'ADN dans le foie, et a suscité une réponse immunitaire réduite contre les capsides virales. Enfin, des tests de neutralisation ont montré immunologique variable de réactions croisées entre la plupart des sérotypes d'AAV. Notre technologie et les résultats devraient faciliter le développement de thérapies géniques AAV pseudotype base pour l'hémophilie B et d'autres maladies liées au foie.

Vecteurs Viraux Adéno-associés Pour En épingle à Cheveux Courte Expression D'ARN

Methods in Enzymology. 2005  |  Pubmed ID: 15644194

Cinq publications récentes ont documenté la réussite du développement et de l'utilisation de vecteurs de transfert de gènes sur la base de virus adéno-associé (AAV) pour exprimer en épingle à cheveux courts ARN (shRNA). Dans des cultures de cellules de mammifères et chez les animaux entiers, l'infection par ces vecteurs a été démontré que conduire à effet de choc spécifique, efficace et stable de divers gènes endo-ou exogène ciblées. Ici nous passons en revue cette approche passionnante, pour déclencher l'interférence ARN in vitro et in vivo par shRNA exprimée à partir de vecteurs AAV, et décrire la technologie state-of-the-art pour la génération de particule de vecteur. En particulier, nous présentons un ensemble de plasmides de nouveaux vecteurs AAV qui ont été spécifiquement conçus pour le clonage facile et rapide de cassettes d'expression shRNA dans AAV. Les plasmides contiennent d'autres ARN polymérase III promoteurs (U6, H1, ou 7SK) ensemble avec une séquence respective de terminaison, ainsi que d'ADN de bourrage pour garantir une taille de vecteur optimal pour conditionnement efficace dans des capsides d'AAV. Pour fournir un maximum de polyvalence et de la convivialité, les constructions ont également été conçue pour contenir un ensemble de sites de restriction uniques de reconnaissance d'enzymes, ce qui permet le remplacement simple et directe de la cassette shRNA ou autres composantes du vecteur avec des séquences personnalisées. Nos nouveaux plasmides vecteurs de compléter la technologie existante vecteur AAV et devrait aider à établir davantage AAV comme une alternative plus prometteuse à l'utilisation de virus adéno-ou rétro-? Vecteurs lentiviraux comme vecteurs shRNA.

Entretien Accrue Et Persistance Des Transgènes Par Excision De Cassettes D'expression De Séquences Plasmidiques Dans Vivo

Human Gene Therapy. May, 2005  |  Pubmed ID: 15916481

Persistance de l'expression du transgène est un obstacle majeur à nonvirus médiation approches de thérapie génique. Nous avons suggéré que la liaison covalente de l'ADN bactérien de la cassette d'expression joue un rôle crucial dans la répression transcriptionnelle des transgènes in vivo. Pour mieux comprendre le rôle de la liaison covalente de l'ADN plasmidique à la cassette d'expression et de répression de la transcription, et si cet effet pourrait être atténué silence en modifiant la structure moléculaire d'ADN vecteur in vivo, nous avons généré un système pour convertir les plasmides de routine dans un purifié cassette d'expression, libre de l'ADN bactérien après transfert de gène in vivo. Pour ce faire, l'alpha-1-antitrypsine humaine (HASM) et de l'homme de facteur de coagulation IX gènes rapporteurs (hfIX) ont été flanqué par des sites de reconnaissance d'endonucléases ISceI deux, et coinjected avec un plasmide codant pour l'ADNc I-Scel ou un plasmide contrôle en foie de souris. Deux semaines après l'administration d'ADN, les souris injectées avec le gène rapporteur seul ou avec le contrôle pertinent plasmide a montré de faibles taux sériques de HASM ou hFIX, qui est resté faible sur toute la longueur de l'expérience. Toutefois, les animaux qui ont exprimé I-Scel eu un 5 - à 10 fois plus élevée dans le sérum ou HASM hFIX qui a persisté pendant au moins 8 mois (la durée des études). Expression de l'I-Scel entraîné dans le clivage et l'excision des cassettes d'expression de la colonne vertébrale plasmide, formant principalement des cercles dépourvus de séquences d'ADN bactériens, tels qu'établis par une batterie de transfert de Southern et les analyses différentes en chaîne par polymérase en tant C57BL / 6 et SCID traitée souris. En revanche, seule l'entrée des parents bande circulaire d'ADN plasmidique a été détecté chez les souris injectées avec le gène rapporteur seul, ou un plasmide I-Scel avec le journaliste HASM plasmide manque des sites I-SceI. Des résultats similaires ont été obtenus lorsque le système FLP recombinase a été utilisé pour faire des mini-plasmides dans le foie de souris in vivo. Cette étude présente en outre une preuve indépendante que la suppression de la liaison covalente entre les séquences plasmidiques et transgène conduit à une augmentation marquée et la persistance de l'expression du transgène. Démêler les mécanismes par lesquels la liaison covalente de l'ADN bactérien de la cassette d'expression est connecté à gene silencing est fondamental pour établir le mécanisme de la régulation transcriptionnelle dans les systèmes mammaliens et sera important pour le développement de vecteurs non viraux polyvalents qui peuvent être utilisés pour atteindre persistante l'expression des gènes dans différents types cellulaires.

Transduction Du Foie Avec Un Virus Recombinant Adéno-associé Est Principalement Limitée Par Le Sérotype Capside Génotype Vecteur Non

Journal of Virology. Jan, 2006  |  Pubmed ID: 16352567

Nous et d'autres ont récemment rapporté très efficace de transfert de gènes du foie avec virus adéno-associé 8 (AAV-8) pseudotypes, c.-à-AAV-2 génomes emballés dans AAV-8 capsides. Ici, nous avons étudié si la transduction du foie pourrait être encore amélioré en utilisant des séquences virales empaquetage de l'ADN (répétitions terminales inversées [RTI]) provenant de génotypes autres que AAV 2. À cette fin, nous avons effectué deux séries de constructions de vecteurs de transport des cassettes d'expression intégrant un gène de la GFP ou le facteur IX humain (hfIX) gène flanqué de RTI de génotypes AAV 1 à 6. Initiale dans les analyses in vitro de la réplication d'ADN vecteur GFP, l'encapsidation et la transduction des cellules a révélé un degré étonnamment élevé d'interchangeabilité entre les six génotypes. Pour la suite des études in vivo, nous traversons-emballé les six variantes hfIX en AAV-8 et infusé souris via la veine porte avec des doses de 5 x 10 (10) à 1,8 x 10 (12) particules. Notamment, tous les vecteurs exprimé relativement élevés niveaux plasmatiques hFIX sein d'une cohorte dose au cours des 6 mois suivants, en même temps que la conclusion d'un nombre équivalent de copies d'ADN vecteur par cellule. Hépatectomies partielles abouti à environ 80% des gouttes niveaux hFIX et les numéros de vecteur de copies d'ADN de tous les groupes, indiquant le génotype-indépendante persistance de l'ADN vecteur principalement épisomale. Analyses par Southern blot de l'ADN du foie total en fait confirmé la présence de la plupart identiques et non intégrées formes vectorielles moléculaires pour tous les génotypes. Nous concluons que, contrairement sérotypes, génotypes AAV ne sont pas critiques pour la transduction des hépatocytes efficace et peut être librement substitué. Ceci corrobore notre modèle actuel de vecteur AAV la persistance dans le foie et fournit des informations utiles pour la conception et l'application futures de l'AAV recombinant.

Amélioration De Transfert De Gène Cardiaque Par Transcriptionnelle Et Transductional Ciblage Des Vecteurs Adéno-associés Virales

Cardiovascular Research. Apr, 2006  |  Pubmed ID: 16448634

Des vecteurs basés sur le virus recombinant adéno-associé 2 (AAV-2) sont un outil prometteur pour le transfert de gènes cardiaques. Cependant, des applications thérapeutiques potentielles doivent tenir compte de la transduction prédominante du foie une fois AAV-2 vecteurs entrent dans la circulation systémique. Nous avons donc pour but d'accroître l'efficacité et la spécificité de la livraison vecteur cardiaque en combinant la surface de la transcription et le ciblage cellulaire.

Fatality Chez La Souris En Raison De La Sursaturation Des MicroARN Cellulaires / Court En épingle à Cheveux D'ARN Pathways

Nature. May, 2006  |  Pubmed ID: 16724069

L'interférence ARN (ARNi) est un phénomène universel et de l'évolution conservée de silençage génique post-transcriptionnelle par le biais de la séquence-spécifique la dégradation de l'ARNm, déclenchées par de petits ARN double brin. Parce que ce mécanisme peut être efficacement induite in vivo par l'expression complémentaire cible en épingle à cheveux courts ARN (shRNA) à partir de vecteurs non viraux et virales, l'ARNi est attrayant pour la génomique fonctionnelle et la thérapeutique de l'homme. Ici nous avons systématiquement enquêter sur les effets à long terme de l'expression shRNA soutenue de haut niveau dans le foie des souris adultes. Robuste expression shRNA dans tous les hépatocytes après perfusion intraveineuse a été réalisé avec un vecteur d'shRNA livraison optimisée sur la base de duplex-ADN contenant de type virus adéno-associé 8 (AAV8). Une évaluation de 49 distinctes AAV / shRNA vecteurs, unique en longueur et la séquence et dirigés contre six cibles, a montré que 36 ont causé des blessures du foie dose-dépendante, avec 23 en fin de compte causer la mort. La morbidité a été associée à la régulation négative de foie dérivés microARN (miARN), indiquant une éventuelle concurrence de ce dernier avec shRNA pour limiter les facteurs cellulaires nécessaires pour le traitement de divers petits ARN. In vitro et in vivo transfection shRNA impliquait que l'un des facteurs tels, partagée par les voies shRNA / miARN et facilement saturé, est le karyophérine nucléaire exportin-5. Nos résultats ont des conséquences fondamentales pour l'avenir des stratégies basées sur l'ARNi chez les animaux et les humains, car le contrôle intracellulaires niveaux d'expression shRNA sera impératif. Cependant, le risque de sursaturer endogènes des voies d'ARN petits peuvent être minimisés par l'optimisation de la dose et la séquence shRNA, comme en témoigne ici par notre rapport de la persistance et thérapeutiques ARNi contre l'hépatite B humaine du virus in vivo.

Le Récepteur Laminine 37/67-kilodalton Est Un Récepteur Pour Les Sérotypes De Virus Adéno-associés 8, 2, 3, Et 9

Journal of Virology. Oct, 2006  |  Pubmed ID: 16973587

Virus adéno-associé sérotype 8 (AAV8) est actuellement en train de devenir un vecteur de transfert de gène puissant, en raison de sa capacité à transduire efficacement différents tissus in vivo. Bien que ce l'on croit être en partie due à sa capacité à uncoat plus facilement que les sérotypes d'AAV autres comme AAV2, comprendre tous les processus sous-jacents AAV8 transduction est important pour son application et l'utilisation optimale de la thérapie génique humaine. Ici, nous fournissons le premier rapport d'un récepteur cellulaire pour AAV8, la laminine 37/67-kDa récepteur (LAMR). Nous document contraignant de LAMR à AAV8 protéines de capside et des virions intacts in vitro et de démontrer sa contribution à AAV8 transduction des cellules en culture et le foie de souris in vivo. Nous montrons aussi que LAMR joue un rôle dans la transduction par trois autres sérotypes étroitement liées (AAV2, -3 et -9). L'analyse des séquences et de suppression nous a permis de cartographier LAMR liaison à deux sous-domaines protéiques prédites d'être exposés à l'extérieur AAV capside. Utilisation de LAMR, qui est exprimée de façon constitutive dans de nombreux tissus cliniquement pertinents et est surexprimé dans de nombreux cancers, fournit une explication moléculaire à tropisme tissulaire AAV8 de large. En plus de son efficacité de la transduction robuste, nos résultats confirment la poursuite du développement de AAV8 vecteurs basés sur des applications cliniques chez l'homme, en particulier pour la thérapie génique des tumeurs.

Un écran Double-hybride Identifie Cathepsines B Et L Comme Facteurs De Déshabillage Pour Virus Adéno-associé 2 Et 8

Molecular Therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. Feb, 2007  |  Pubmed ID: 17235311

Des vecteurs basés sur différents sérotypes de virus adéno-associé sont très prometteurs pour la thérapie génique humaine, fondée sur leurs tropismes tissulaires uniques et distincts des profils immunologiques. Un candidat particulièrement intéressant, c'est AAV8, ce qui peut rapidement et efficacement transduire une large gamme de tissus in vivo. Afin de mieux comprendre les mécanismes derrière AAV8 transduction, nous avons utilisé deux hybrides de levure analyses pour cribler une banque d'ADN de foie de souris complémentaires pour des protéines cellulaires capables d'interagir avec les protéines de la capside virale. Au total, nous avons récupéré environ 700 clones, comprenant plus de 300 gènes indépendants. Analyses des séquences montré occurrences multiples pour plus de 100 gènes, codant pour l'dont deux endosomique cystéine protéases cathepsines B et L. particulier, ces deux protéases aussi physiquement interagi avec la partie correspondante de la capside AAV2 dans la levure, mais pas avec AAV5. Nous démontrons que les cathepsines B et L sont essentiels pour la transduction AAV2 et AAV8 médiation efficace de cellules de mammifères, et de documenter la capacité de la cathepsine B purifiée et des protéines L de lier et de cliver intactes AAV2 et AAV8 particules in vitro. Ces données suggèrent que la cathepsine clivage médié pourrait premiers capsides AAV pour décapsidation nucléaire subséquente, et indiquent que l'analyse de gènes supplémentaires récupérées dans notre écran peut aider à élucider les mécanismes sous-jacents transduction par AAV8 et sérotypes.

Combinatoire ARNi: Une Stratégie Gagnante Pour La Course Contre Des Cibles En évolution?

Molecular Therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. May, 2007  |  Pubmed ID: 17311009

La possibilité d'utiliser l'ARN double brin pour inhiber l'expression génique séquence-spécifique (ARN interférence, ou ARNi) est en train de révolutionner la science et la médecine aussi bien. De nombreuses études pré-cliniques sont l'évaluation de l'ARNi en tant que modalité thérapeutique nouvelle dans la lutte contre le gain de fonction maladies autosomiques dominantes, le cancer, et les infections virales. Une préoccupation émergente est que les mono-thérapies ARNi pourrait finalement ne parviennent pas à contrôler les virus qui peuvent échapper à réduire au silence par mutation et / ou la suppression ARNi. Ainsi, des stratégies sophistiquées sont en cours d'élaboration qui visent à éviter la résistance virale en combinant effecteurs ARNi uns avec les autres ou avec d'autres inhibiteurs de l'expression des gènes. Plusieurs rapports déjà de valider ce nouveau concept de «combinatoire ARNi" (Kornai) et d'illustrer sa polyvalence en décrivant la co-expression de l'ARNi déclencheurs dirigée contre uniques ou multiples, virales ou cellulaires, des cibles. D'autres études documenter la prestation réussie de ces déclencheurs avec d'autres silencieux ARN ou de protéines à base de. En outre, les vecteurs ont été conçus pour se fondre l'inhibition du gène de RNAi-médiation avec les stratégies conventionnelles de remplacement de gènes. Collectivement, ces mesures ouvrent de nouvelles avenues thérapeutiques intéressantes, mais pourrait également augmenter les risques inhérents à l'ARNi la technologie, y compris les réponses immunitaires, hors de ciblage, et de sursaturation des voies endogènes. Ici, nous avons un examen critique de toutes les stratégies de Kornai et de discuter les conditions requises pour leur transition vers l'application clinique.

Knockdown Rapide Et Stable D'un Gène Endogène Dans L'épithélium Pigmentaire Rétinien

Human Gene Therapy. Oct, 2007  |  Pubmed ID: 17892416

La loi du silence sélectif de gènes cibles dans des types cellulaires spécifiques par interférence ARN (ARNi) représente une approche puissante à la fois à la thérapie génique de la dominante actifs allèles mutants, et à l'enquête de la fonction normale des gènes dans des modèles animaux in vivo. Nous avons établi une méthode simple et polyvalent in vitro pour le criblage de l'efficacité de l'ADN-ARN en épingle à cheveux à base de courts (shRNA), et a identifié un shRNA très efficace ciblant le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF), un gène pensé à jouer des rôles importants dans endogènes réponses neuroprotecteurs dans la rétine de rat. Nous avons utilisé deux vecteurs viraux, sur la base de lentivirus et virus adéno-associé (AAV), pour fournir des shRNA et bFGF silence dans les cellules de l'épithélium pigmentaire in vivo. Les expériences d'AAV fait usage d'un «double brin stabilisé" version de ces vecteurs d'apparition rapide de l'expression génique. Dans l'épithélium pigmentaire rétinien chez le rat, shRNA remis, soit par vecteur réduit immunoréactivité bFGF à des niveaux indétectables dans les cellules transduites, alors qu'un témoin non fonctionnel intégrant la construction d'une mutation deux paires de base-n'a eu aucun effet mesurable sur l'expression du bFGF. Silencing débuté dans les quelques jours après l'injection du virus et est resté stable tout au long de la période d'observation, aussi longtemps que 60 jours. La livraison des constructions virales RNAi offre une approche puissante et polyvalente pour la thérapie génique et l'analyse des questions fondamentales en biologie de la rétine.

ARNi Et La Thérapie Génique: Une Attraction Mutuelle

Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2007  |  Pubmed ID: 18024667

Le phénomène phylogénétiquement conservés cellulaire de l'interférence ARN (ARNi)-la séquence-spécifique de post-transcriptionnelle de l'expression génique médiée par petits ARN double brin-détient la promesse importante pour la recherche fondamentale et pour le développement de médicaments. Particulièrement attrayant d'un point de vue médical, c'est la juxtaposition de la nouvelle méthodologie de l'ARNi avec des stratégies de transfert de gènes établies, en particulier des vecteurs viraux pour la livraison ARNi efficace et tissu-spécifique pour les patients. Ici, nous résumons les dernières avancées cliniques et expérimentales dans l'ARNi approches fondées sur la thérapie génique. Nous avons brièvement présenter les nouvelles stratégies non-viraux pour le transfert de siRNA, avant de comparer les trois vecteurs viraux actuellement principalement développés en tant que véhicules de livraison shRNA, l'adénovirus, lentivirus, et de virus adéno-associé (AAV). En outre, nous décrivons les plus cliniquement pertinentes génétiques, les cibles acquises ou infectieuse poursuivis à des fins thérapeutiques. Plus précisément, nous évaluons l'utilisation d'un vecteur à médiation ARNi pour le traitement de processus viraux, les cancers solides, troubles lymphoprolifératifs et les maladies neurodégénératives et oculaires. En outre, nous mettons en évidence de nouvelles applications émergentes, y compris les thérapies par cellules souches et de la transgenèse animale, ainsi que discuter de quelques-uns des écueils potentiels et les limites inhérentes aux approches individuelles. Alors que nous prévoyons que les régimes éventuels sera façonné par notre compréhension croissante de la complexité de la biologie humaine ARNi, ainsi que par des améliorations progressives de dessins navette virales, les avantages potentiels scientifiques et médicales à partir d'un mariage réussi de l'ARNi et la thérapie génique semble énorme.

Application Thérapeutique De L'ARNi: Est L'ARNm De Ciblage Enfin Prêt Pour Prime Time?

The Journal of Clinical Investigation. Dec, 2007  |  Pubmed ID: 18060021

Avec une vitesse sans précédent, l'interférence ARN (ARNi) a progressé depuis sa découverte fondamentale dans les organismes inférieurs pour devenir un outil puissant génétique et peut-être notre seule biothérapeutique la plus prometteuse pour un large éventail de maladies. De nombreuses études ARNi efficacité chez l'animal de laboratoire, et les premiers essais cliniques sont en cours et à ce jour suggèrent que l'ARNi est sûr à utiliser chez les humains. Pourtant, des obstacles importants ont également fait surface et doivent être surmontés avant thérapeutiques ARNi applications peut devenir un traitement standard. Ici nous passons en revue les obstacles les plus critiques et les préoccupations pour l'ARNi de transition clinique, l'accouchement, et la sécurité. Nous mettons en évidence les solutions émergentes et en même temps de discuter de nouvelles thérapeutiques ARNi basés sur des concepts. Les progrès rapides actuels créer optimisme réaliste que la mise en place de l'ARNi en tant que modalité nouvelle et puissante clinique chez l'homme est proche.

Remplacement Du Parenchyme Hépatique Chez Les Souris Transplantées Par Hépatocytes Allogéniques Est Facilitée Par La Transplantation De Moelle Osseuse Et Médiée Par Les Cellules CD4

Hepatology (Baltimore, Md.). Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18220289

Le manque de donneurs d'organes adéquats constitue une limitation majeure à l'utilisation généralisée de succès de la transplantation hépatique pour de nombreuses maladies hépatiques humaines. Une option alternative souhaitable thérapeutique est la transplantation d'hépatocytes (HT), mais cette approche est également limité par une pénurie de cellules du donneur et par des barrières immunologiques. Par conséquent, l'expansion in vivo de cellules transplantées tolérantes apparaît comme un roman et cliniquement pertinente potentiel thérapie alternative cellulaire. Vers ce but, dans la présente étude nous avons établi un nouveau modèle de souris qui combine HT avec avant transplantation de moelle osseuse (BMT). Hépatocytes des bailleurs de fonds ont été calculées à partir d'alpha humain (1)-antitrypsine (HASM) des souris transgéniques de la souche FVB. Serial sériques enzyme-linked immunosorbent assays pour les protéines HASM ont été utilisés pour surveiller la prise de greffe des hépatocytes et de l'expansion. Chez les souris dépourvues de contrôle bénéficiaires BMT, nous avons observé à long terme encore modeste greffe des hépatocytes. En revanche, les animaux subissent plus BMT syngénique avant HT a montré une 3 - à 5 fois augmentation des niveaux sériques HAAT après 24 semaines. En outre, le repeuplement du foie complète a été observée dans les hépatocytes transplantés souris Balb / C qui avaient été transplantés de la moelle osseuse allogénique FVB-dérivée. Ces résultats ont été validés par une comparaison des niveaux HAAT entre le donneur et les souris receveuses et par HASM spécifique immunomarquage. Pris ensemble, ces résultats suggèrent un effet synergique de BMT sur des hépatocytes transplantés pour l'expansion et l'induction de tolérance. Foies d'animaux repeuplés affiché d'importantes infiltrations mononucléaires, constitué principalement de CD4 (+) des cellules. Blocage de la dernière avant la prolifération HT abrogé des hépatocytes transplantés, ce qui impliquait un rôle essentiel joué par les CD4 (+) des cellules dans la sélection des hépatocytes in vivo à la suite BMT allogénique. CONCLUSION: Le modèle de souris présente fournit une plate-forme polyvalente pour l'étude des mécanismes régissant HT en rapport direct avec le développement des stratégies cliniques pour le traitement de l'insuffisance hépatique humaine.

In Vitro Et in Vivo Gene Therapy Evolution Vecteur Via Métissage Multispécifique Et Reciblage De Virus Adéno-associés

Journal of Virology. Jun, 2008  |  Pubmed ID: 18400866

Virus adéno-associé (AAV) sérotypes différents globalement efficacités de transduction et tropismes tissulaires et donc un potentiel énorme en tant que vecteurs pour la thérapie génique humaine. En réalité, cependant, leur utilisation chez les patients est limitée par répandus anti-AAV immunité ou par leur performance inadéquate dans les objectifs spécifiques, illustré par l'AAV de type 2 (AAV-2) prototype dans le foie. Ici, nous avons tenté de fusionner des qualités souhaitables de plusieurs isolats AAV naturelles par une technologie d'ADN de la famille adaptée aléatoire pour créer une bibliothèque complexe de capsides hybrides à partir de huit différents virus de type sauvage. Sélection sur primaire ou transformé hépatocytes humains a abouti à des piscines d'hybrides à partir de cinq des sérotypes de départ: 2, 4, 5, 8 et 9. Sélection plus rigoureuse avec antisérums humains mis en commun (immunoglobuline intraveineuse [IgIV]), puis conduit à la sélection d'un seul type 2/type 8/type 9 chimère, AAV-DJ, qui se distingue de son parent le plus proche naturel (AAV-2) de 60 capside acides aminés. Vecteurs recombinants AAV-DJ surclassé huit sérotypes d'AAV standard dans la culture et ont largement dépassé les AAV-2 dans le foie des souris naïves et l'administration d'IgIV vaccinés. Un domaine liaison à l'héparine dans l'AAV-DJ a été trouvé pour limiter la biodistribution dans le foie (et quelques tissus d'autres) et d'affecter dose-réponse des vecteurs et la neutralisation des anticorps. Par ailleurs, nous rapportons le premier succès in vivo des capsides AAV biopanning en utilisant une nouvelle AAV-DJ-dérivée bibliothèque virale affichage peptide. Deux peptides enrichi après repiquage série dans les poumons de souris médiateur dans le reciblage de l'AAV-DJ vecteurs distincts des cellules alvéolaires. Notre étude valide la famille réarrangement d'ADN et d'affichage peptide viral que deux approches puissantes et compatibles à l'évolution moléculaire de nouveaux vecteurs AAV pour l'homme applications de thérapie génique.

Taire De L'acide Hépatique Transporter Protein Gras 5 in Vivo Inverse Induite Par Le Régime Non-stéatose Hépatique Et Améliore L'hyperglycémie

The Journal of Biological Chemistry. Aug, 2008  |  Pubmed ID: 18524776

Non-alcoolisées maladie du foie gras est un grave problème de santé lié à l'obésité et diabète de type 2. Pour étudier l'effet biologique et le potentiel thérapeutique de l'acide hépatique absorption inhibition de gras, nous avons utilisé une technique virus adéno-associé à médiation interférence ARN pour abattre l'expression de l'acide hépatique transport des protéines in vivo gras 5 avant ou après l'établissement de non-alcoolisées gras une maladie du foie chez la souris. En utilisant cette approche, nous démontrons ici la capacité d'atteindre spécifique, knockdown non-toxique, persistante et de la protéine transport des acides gras dans le foie de souris 5 d'une injection de virus adéno-associé unique, résultant en une réduction marquée de l'acide hépatique absorption alimentaire gras, réduit l'absorption calorique, et la protection concomitante de l'alimentation induite par la non-stéatose hépatique. Il est important, effet de choc de la protéine transport des acides gras 5 a également été en mesure d'inverser déjà établi non la stéatose hépatique, ce qui entraîne l'homéostasie du glucose significativement amélioré l'ensemble du corps. Ainsi, l'activité continue de l'acide hépatique transport des protéines gras 5 est nécessaire pour maintenir l'absorption calorique et flux d'acides gras dans le foie lors de l'alimentation riche en gras et peut présenter un roman avenue pour le traitement des non-stéatose hépatique.

Expression De ShRNA à Partir D'un Promoteur Tissu-spécifique Pol II Est Un Efficace Et Sûr ARNi Thérapeutiques

Molecular Therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. Sep, 2008  |  Pubmed ID: 18665161

Il a été observé que la surexpression de certains ARN en épingle à cheveux court (shRNA) peut induire une cytotoxicité aiguë. Cela a soulevé des préoccupations concernant la sécurité de l'utilisation de l'interférence ARN (ARNi) la technologie comme un outil thérapeutique potentiel. Nous avons cherché à relever ce défi de la régulation de l'expression en développant un vecteur mono-cistronique pour l'expression tissu-spécifique d'un shRNA d'une polymérase du foie dérivée (pol) promoteur II. Ce nouveau concept induit efficacement silence cible dans des cellules d'hépatome in vitro et dans le foie de souris in vivo. Afin de démontrer l'innocuité et l'amélioration thérapeutique potentielle de cette approche, nous avons sélectionné un shRNA ciblant l'antigène de surface d'enveloppe (GSC) de l'hépatite B (VHB), qui est parmi les plus toxiques lorsqu'ils sont exprimés à partir du promoteur U6 couramment utilisé. L'emballer comme un ADN double brin dans un virus adéno-associé (AAV) pseudotype 8 et le délivrant une dose de particules secondaires (1 x 10 (12)) à HBV souris transgéniques entraîné dans la réduction stable de sAg sérum à 85% de commencer les niveaux, sans aucun signe de dommages au foie concomitante. Avec cette amélioration de la tolérance, le foie-spécifique pol II shRNA expression a persisté pendant plus d'un an après l'injection. Nous en concluons que ce système pol II expression shRNA associé à un vecteur puissant de livraison représente une alternative efficace à U6, soit basés sur des stratégies ou des systèmes qui permettent d'atteindre une spécificité tissulaire grâce à l'utilisation d'éléments supplémentaires.

ARN Muselage Petit: State-of-the-art

Advanced Drug Delivery Reviews. Jul, 2009  |  Pubmed ID: 19427885

Plus simplement une seule décennie, nous avons assisté à la maturation rapide du champ de l'interférence ARN - l'inactivation de gène spécifique de la séquence médiée par petits ARN double brin - directement à partir de ses débuts à l'âge adulte. Avec des données intéressantes en train d'émerger à partir des premiers essais cliniques, il est désormais plus probable que jamais que les médicaments ARNi offrira bientôt une autre classe d'agents puissants dans notre lutte contre les maladies infectieuses et génétiques. Accélérer ce processus et en ajoutant à la promesse de l'ARNi est notre arsenal en expansion constante de l'ARNi innovantes basées sur des outils expérimentaux et les technologies cliniquement applicables. Cet article à un examen critique d'une sélection de pertinentes avancées récentes dans des thérapies ARNi, à partir de nouveaux modèles de siRNA asymétriques ou bi-fonctionnelle, l'utilisation délibérée de petits ARN pour réguler la transcription nucléaire, l'exploitation technique des puissants vecteurs adéno-associés virales pour l'expression shRNA, d'un développement endogène miARN pour contrôler l'expression du transgène ou le tropisme vectoriel, à des tentatives élégantes pour inhiber miARN cellulaires impliqués dans la maladie humaine. Cet examen portera également présenter des mises en garde sur les risques potentiels inhérents à l'ARNi in vivo dans les applications, avant de discuter des dernières découvertes surprenantes sur la circulation des miRNAs dans les fluides du corps humain, et en concluant avec une perspective sur l'avenir possible de l'ARNi en tant qu'outil de plus en plus puissante biomédicale.

Faible Niveau De Cytotoxicité ShRNA Peut Contribuer à La Carcinome Hépatocellulaire MYC-induite Chez La Souris Adulte

Molecular Therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 19844192

ARN en épingle à cheveux courts (shRNA) ont émergé comme une nouvelle modalité thérapeutique, mais il ya une inquiétude croissante sur les effets non spécifiques in vivo. Ici, nous avons utilisé des vecteurs viraux pour exprimer shRNA contre p53 endogène dans le foie de sursis MYC-souris transgéniques. Comme prévu, les shRNA silence p53 hépatique et de la tumorigenèse hépatique accélérée lorsque MYC a été exprimés en même temps. Étonnamment, les différents de contrôle pertinent shRNA même induit une apparition rapide de la tumorigenèse, comparable à du tétrachlorure de carbone (CCl4), un puissant cancérigène. Nous avons constaté que des doses shRNA même marginaux peut déjà déclencher hépatotoxicité histologiquement détectable et augmenté l'apoptose des hépatocytes. En outre, nous avons constaté que l'expression shRNA hépatique microARN au niveau mondial dérégulée (miRNA) l'expression, et que les niveaux d'activité et shARN encore augmenté en présence de MYC. En MYC-souris transgéniques exprimant, la lésion hépatique induite par marginale shRNA suffi à stimuler davantage la division hépatocellulaire qui était à son tour associée à l'expression nettement accrue de l'cycline B1 mitotique. Par conséquent, même à faibles doses, peut provoquer des shRNA de bas niveau hépatotoxicité qui peut faciliter la capacité de l'oncogène MYC pour induire la tumorigenèse hépatique. Notre prudence mandat de données concernant le potentiel cancérogène possible des shRNA lorsqu'il est utilisé comme agent de clinique, en particulier dans les cas où les tissus sont génétiquement prédisposés à la transformation cellulaire et la prolifération.

Six Virus à ARN Et Quarante Et Un Hôtes: Virales Petits ARN Et De Modulation Des Répertoires Petits ARN Dans Les Systèmes De Vertébrés Et Invertébrés

PLoS Pathogens. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 20169186

Nous avons utilisé multiplexé séquençage à haut débit pour caractériser les changements dans les populations d'ARN petits qui se produisent pendant l'infection virale dans les cellules animales. Les petits ARN à base de mécanismes tels que l'interférence ARN (ARNi) a été démontré dans les usines et les systèmes d'invertébrés à jouer un rôle clé dans les réponses d'accueil à l'infection virale. Bien homologues des voies effectrices ARNi clés sont présents dans les cellules de mammifères, et peut lancer une dégradation médiée par ARNi des ARNm ciblés expérimentalement, un rôle pour ces réponses en mammifères interactions hôte-virus reste à être caractérisé. Six différents virus ont été examinés dans 41 systèmes hôtes expérimentalement sensibles et résistantes. Nous avons identifié le virus dérivés de petits ARN (vsRNAs) de tous les six virus, avec l'abondance totale variant de «extrêmement rare» (moins de 0,1% des petits ARN cellulaire) à très abondante (comparable à l'abondance des micro-ARN "miARN"). En plus de l'apparition de vsRNAs cours de l'infection, nous avons vu un certain nombre de changements spécifiques dans les profils miRNA d'accueil. Pour les modèles d'infection de plusieurs enquêtes de façon plus détaillée, l'ARNi et l'interféron voies modulé l'abondance de vsRNAs. Nous avons également trouvé des preuves pour les populations de vsRNAs qui existent siRNA recto verso avec zéro à trois nucléotides 3 'surplombe. En utilisant des populations de cellules portant un réplicon de l'hépatite C, nous avons observé volet sélectif de chargement de siRNA sur des complexes Argonaute. Ces expériences définissent vsRNAs comme un élément possible de l'interaction entre les virus animaux et de leurs hôtes.

Protéines Argonaute Sont Des Facteurs Déterminants De L'efficacité Des ARNi, La Toxicité, La Persistance Et à Le Foie Des Souris Adultes

The Journal of Clinical Investigation. Sep, 2010  |  Pubmed ID: 20697157

surexpression de shRNA vecteurs viraux de thérapie génique peut déclencher une cytotoxicité conduisant à une insuffisance d'organes et de létalité chez les souris et les rats. Ce processus implique probablement une saturation des facteurs endogènes ARNi cellulaires, y compris exportin-5 (Xpo-5). Ici, nous avons montré que la surexpression Xpo-5 une efficacité accrue shRNA dans le foie des souris adultes, mais a augmenté d'hépatotoxicité. Nous avons identifié les 4 membres de la famille de protéines Argonaute humaine (Ago) en tant que facteurs en aval impliqués dans la saturation de l'ARNi cellulaire endogène, qui ont tous été en mesure d'interagir avec shRNA dans les cellules et des souris. Dans des études de co-expression Ago / shRNA, il ya-2 (Slicer) était le principal facteur limitant déterminant de la fois in vitro et in vivo ARNi efficacité, la toxicité et la persistance. Chez les souris adultes, basée sur un vecteur Ago-2/Xpo-5 coexpression accrue U6 axée silence shRNA des cibles hépatiques exogènes et endogènes, de l'hépatotoxicité réduite, et prolongée par la stabilité ARNi plus de 3 mois. L'utilisation de plus faibles promoteurs d'ARN polymérase III pour réduire au minimum l'expression shRNA également atténué la toxicité in vivo et a permis knockdown supérieure à 95% persistante de l'hépatite B et d'autres transgènes dans le foie de souris pour plus de 1 an. Nos études prouvant que l'abondance de petits ARN peuvent surcharger la voie endogène ARNi et de révéler les stratégies possibles pour réduire l'hépatotoxicité du court et à long terme gene silencing clinique chez l'homme.

Stabilité Thermodynamique Des ARN En épingle à Cheveux Petites Influence Très Fortement Les Processus De Chargement Des Différents Mammifères Argonautes

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. May, 2011  |  Pubmed ID: 21576459

MicroARNs et ARNsi interagir avec des séquences cibles dans ARNm, induire le clivage et la répression des gènes non clivé à base par l'intermédiaire du complexe ARN-induite silencieux (RISC) qui se compose d'un des quatre protéines Argonaute mammifères, Ago1-Ago4. Le processus de la façon dont Dicer ARN en épingle à cheveux substrat petits shRNA) sont chargés dans différents Agos mammifères in vivo n'est pas bien établie. Nous rapportons ici que shRNA sont chargés dans Agos mammifères dans deux processus par étapes, d'association physique et d'activation, ce dernier étant l'étape limitante avec noncleaving RISC. On établit que, bien que des duplex ARN transformés à base de se lier à shRNAs Agos dans des cellules avec une affinité similaire, le degré par lequel les complexes sont activé (couplée à la suppression du brin passager) en corrélation avec l'instabilité thermodynamique de duplex ARN en cours de chargement, plutôt que l' structure de l'ARN, comme cela a été précédemment démontré chez la drosophile. Fait intéressant, il ya le chargement de siRNA est moins sensible aux thermostabilité que celle de leurs équivalents shRNA. Ces résultats peuvent avoir des implications importantes pour la conception future de l'ARNi basée sur la thérapeutique.

Mécanismes Cellulaires Interférence ARN. Préface

Progress in Molecular Biology and Translational Science. 2011  |  Pubmed ID: 21846566

Lorsque Les Réseaux Cellulaires Hors De Contrôle: Dérégulation Mondiale De La Machinerie ARNi En Pathologie Humaine Et De La Thérapie

Progress in Molecular Biology and Translational Science. 2011  |  Pubmed ID: 21846572

L'interférence ARN (ARNi) est un plan évolutif conservé mécanisme cellulaire fondamental du gène puissante et la réglementation du génome dont les disfonctionnement est associée à de nombreuses pathologies humaines majeures, de troubles métaboliques et les infections virales aux cancers. Au cours des 5 dernières années, des preuves irréfutables ont été accumulées que cette association est assurée par les dérégulations de certains mi (CRO) et l'expression des ARN qui a suivi aberrante de leurs gènes cibles. En outre, une série de rapports intéressants est maintenant une preuve supplémentaire que les troubles de l'homme sont aussi fréquemment caractérisées par des altérations mondiaux dans le mécanisme de l'ARNi, comprenant l'expression irrégulière et en fonction de la protéine clé joueurs Drosha, DGCR8, les Exportin-5, Dicer, TRBP, et Argonaute . Ici, nous avons un examen approfondi de ces résultats qui apparaissent dans les contextes spécifiques de cancers et d'infections par des agents pathogènes viraux et, en outre, de décrire les observations connexes dans précliniques des études de thérapie génique / ARNi. Enfin, nous avons aussi bien discuter de la pertinence de ces résultats pour l'avenir de base RNAi de recherche ainsi que pour la traduction imminente clinique de l'ARNi des technologies et des concepts thérapeutiques.

To Go, Ou Ne Pas Aller, Telle Est La Question - Six Réflexions Personnelles Sur La Mobilité Géographique Comment Peut Affecter Votre Carrière Et De Vie

BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. Oct, 2011  |  Pubmed ID: 21858845

La Dose Peut Faire Le Poison: Leçons Tirées De Défavorable Dans Toxicités Causées Par Surexpression in Vivo ARNi

Silence. 2011  |  Pubmed ID: 22029761

RÉSUMÉ: Au cours des cinq dernières années, a accumulé des preuves que le vecteur-médiation robuste interférence ARN (ARNi) l'expression peut déclencher des effets secondaires graves chez les animaux petits et grands, à partir de la tumorigenèse cytotoxicité et accélérée à l'échec d'organes et la mort. Les notions récurrentes dans ces études que d'un paramètre critique est la force d'expression et que l'ARNi Exportin-5 et les protéines Argonaute sont de limitation de vitesse des mammifères ARNi, impliquent fortement dépendante de la dose de saturation de la voie endogène miRNA comme l'un des mécanismes sous-jacents. Cette mini-revue résume les travaux et les données pertinentes menant à ce modèle intriguant et met en évidence les voies potentielles permettant de soulager l'ARNi induits par la toxicité dans les futures applications cliniques.

Le Destin De Traçage Des Hépatocytes Matures Dans L'homéostasie Du Foie De Souris Et De La Régénération

The Journal of Clinical Investigation. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22105172

Des données récentes ont contredit l'opinion dominante selon laquelle l'homéostasie et la régénération du foie adulte sont médiés par la duplication de soi de la lignée restreints hépatocytes et les cellules épithéliales biliaires. Ces nouvelles données suggèrent que les cellules progénitrices du foie ne fonctionne pas uniquement comme un système de sauvegarde des blessures chroniques du foie, mais plutôt, ils produisent également des hépatocytes après une blessure aiguë et sont en fait la principale source de nouveaux hépatocytes au cours le chiffre d'affaires des hépatocytes normaux. En outre, d'autres faits suggèrent que les hépatocytes sont capables de conversion lignée, agissant en tant que précurseurs de cellules épithéliales biliaires au cours des blessures biliaire. Pour tester ces concepts, nous avons généré un hépatocyte sort de traçage modèle basé sur chronométré et spécifique de la recombinase Cre expression et l'activation du gène marqueur dans tous les hépatocytes de souris adultes Rosa26 journaliste avec un vecteur adéno-associé virale. Nous avons trouvé que les hépatocytes dérivés nouvellement formées à partir des hépatocytes préexistantes dans le foie normal et que les cellules progénitrices du foie contribué de façon minime à la régénération hépatocytaire aiguë. En outre, nous n'avons trouvé aucune preuve que le dommage biliaire induite de conversion des hépatocytes en cellules épithéliales biliaires. Ces résultats sont donc restaurer les paradigmes dominants de l'homéostasie précédemment foie et la régénération. En outre, notre système nouveau vecteur sera un outil précieux pour chronométré, efficace, et la boucle spécifique de séquences floxés dans les hépatocytes.

Déterminants Expression De Protéines Argonaute Mammifères Dans La Médiation De Gene Silencing

Nucleic Acids Research. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22210886

ARN interférence se produit par deux procédés principaux: l'ARNm spécifique au site de clivage et la dégradation de l'ARNm non-clivage ou basé sur la répression traductionnelle. Site-spécifique de clivage est effectué par Argonaute-2 (Ago2), tandis que tous les quatre protéines mammaliennes Argonaute (Ago1-Ago4) peut effectuer un clivage non-inhibition, indiquant que Ago1, Ago3 et Ago4 peuvent avoir des fonctions similaires, mais potentiellement redondante . Il a été observé que dans les tissus des mammifères, l'expression de Ago3 et Ago4 est considérablement plus faible par rapport à Ago1; cependant, une optimisation des Ago3 et Ago4 séquences codantes pour inclure uniquement le codon le plus commun à chaque position d'acide aminé a été en mesure d'augmenter l'expression de Ago3 et Ago4 à des niveaux comparables à celle de Ago1 et Ago2. Ainsi, nous avons examiné si les caractéristiques des séquences particulières existent dans la région codante de la Ago3 et Ago4 qui peut empêcher un haut niveau d'expression. Permutation des sous-régions de la séquence il ya de type sauvage et optimisé identifié la partie de la région codante (nucléotides 1-1163 pour Ago-3 et 1-1494 pour Ago-4) qui est le plus influent de l'expression. Cette constatation a des implications pour la conservation de l'évolution des protéines Ago dans la lignée des mammifères et le rôle biologique des protéines potentiellement redondants Ago peut avoir.