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Articles by Eliza Wiercinska in JoVE
JoVE Clinical and Translational Medicine
Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion
Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d'autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d'autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l'invasion.
Other articles by Eliza Wiercinska on PubMed
Smad7 Empêche L'activation De Cellules Stellaires Hépatiques Et De La Fibrose Hépatique Chez Les Rats
De nombreuses études mettent en cause les facteur de croissance transformant (TGF)-bêta signalisation dans FIBROGÉNÈSE hépatique. Pour perturber la voie TGF-bêta au cours de ce processus, nous avons surexprimé Smad7, un antagoniste intracellulaire de signalisation TGF-bêta, in vivo et en cellules stellaires hépatiques cultivées en primaire (CSH).
Expression Dépendant De Transdifférenciation Des Alpha-SMA Dans Les Cellules Hépatiques étoilées N'implique Pas De Voies De TGF-bêta Menant à Coinduction De Collagène De Type I Et Thrombospondine-2
Les cellules étoilées hépatiques (HSC) cultivés sur du plastique spontanément se transdifférencier en un type de cellule myofibroblastes (MFB). Ce système de modèle de FIBROGÉNÈSE hépatique se caractérise par des changements phénotypiques des cellules et la synthèse accrue de matrice. Ici, nous avons analysé si dépendante transdifférenciation induction de composantes d'ECM, par exemple, le collagène de type I et thrombospondine-2 (TSP-2), et les changements phénotypiques sont des événements coregulated et si les deux processus sont médiés par TGF-bêta ou les mécanismes. Bloquant le p38 dépendante de TGF-bêta voie MAPK dans HSC avec l'inhibiteur spécifique SB203580 fortement réduit collagène I et expression de l'ARNm de TSP-2 sans inhiber upregulation de MFB-marqueur typique, l'actine musculaire lisse-alpha (alpha-SMA). De même, interférence avec la voie de Smad2/3/4 à l'aide de dexaméthasone aussi fortement diminué expression du collagène de type I et TSP-2 tandis que transdifférenciation des HSC à la morphologie typique de MFB avec perte de gouttelettes graisseuses et alpha-SMA croissante n'a pas changée. En outre, p38 MAPK médiée par induction de collagène TSP-2 expression de TGF-beta1 et j'ai été encore atteint en présence de dexaméthasone, montrant que dexaméthasone ne bloque pas les p38 alors qu'il retarde la phosphorylation Smad2 et antagonise la stimulation d'une construction Smad3/Smad4 le journaliste dépendante des TGF-bêta. Fait intéressant, contrairement à SB203580 et de la dexaméthasone, la surexpression de l'antagoniste du TGF-bêta Smad7 réduit l'expression de l'ECM et simultanément inhibée morphologique transdifférenciation, indiquant que Smad7 s'acquitte de fonctions supplémentaires en HSC. En conclusion, nos résultats montrent que les changements phénotypiques des transdifferentiating HSC et induction de la synthèse de la matrice sont des processus indépendants, ce dernier étant stimulé par les deux, Smad dépendant et MAPK dépendant de TGF-bêta signalisation.
Stratégies Anti-TGF-bêta Pour Le Traitement De La Maladie Chronique Du Foie
L'abus d'alcool permanent peut entraîner des lésions hépatiques chroniques avec des séquelles délétères tels que foie cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Mécanismes de FIBROGÉNÈSE englobent le recrutement des cellules inflammatoires à l'endroit de la blessure et l'activation de cytokine médiée par des cellules étoilées hépatiques (HSC) avec accumulation de collagènes interstitielles. HSC transdifférenciation et accompagnant l'apoptose entraînent la destruction de l'architecture du foie et sont donc des étapes clés de la progression de la maladie. TGF-bêta représente la cytokine profibrogenic principale dans la fibrose du foie et d'autres troubles FIBROPROLIFÉRATIVES en induisant des dépôts de la matrice extracellulaire dans le cadre de la réponse de cicatrisation. En parallèle, TGF-bêta déclenche les hépatocytes qui réagissent fortement pour cette cytokine, d'apoptose, fournissant ainsi l'espace pour la génération d'une matrice de collagène et prolifération de HSC. Anti-TGF-bêta approches étaient établies et utilisées avec succès pour le traitement de la FIBROGÉNÈSE expérimentale. Dominantes récepteurs TGF-bêta négatifs (TbetaR), générées par la fusion du domaine Fc des IgG humaines et le fragment (extracellulaire) N-terminal de TbetaRII (Fc:TbetaRII) ont été utilisées pour réprimer la fibrose. De même, protéines de liaison de TGF-bêta comme décorine, cytokines antagonistes tels qu'OS protéine morphogénétique-7, facteur de croissance des hépatocytes, IL-10 ou IFN-gamma ont été aussi efficace que camostat mésilate, un inhibiteur de protéase qui éventuellement a abrogé l'activation protéolytique du TGF-beta. De plus, notre groupe récemment surexprimé Smad7 à une fibrose hépatique induite par la ligature du cholédoque et atteint une inhibition efficace de TGF-bêta intracellulaire de signalisation, et amortissent les effets profibrogenic en HSC cultivée et in vivo. Un lien direct entre l'effet de l'alcool et le TGF-bêta n'existe par les espèces réactives de l'oxygène qui sont générés dans les cellules hépatiques par le métabolisme de l'alcool et qui représentent des activateurs de signalisation TGF-bêta. Ainsi, soluble TbetaRII expression réduit partiellement FIBROGÉNÈSE expérimentales in vitro et in vivo en diminuant ROS intracellulaire et en inhibant la NADH oxydase. Les approches qui ciblent spécifiquement la signalisation profibrogenic TGF-bêta sont prometteurs pour traiter la maladie alcoolique du foie à l'avenir. Toutefois, afin d'assurer la sécurité pour les patients d'être traités, avec une forte spécificité des approches doivent être réalisés. Par conséquent, il est essentiel pour délimiter les actions profibrogenic du TGF-beta et l'influence de l'abus d'alcool au détail moléculaire.
ID1 Est Un Médiateur Critique Induite Par TGF-bêta Transdifférenciation Des Cellules étoilées Hépatique De Rat
Transforming growth factor (TGF)-bêta est gravement impliqué dans l'activation des cellules étoilées hépatiques (CSH) qui se produit pendant le processus d'atteinte hépatique, par exemple, en alcool, virus hépatotoxiques ou en aflatoxines. La surexpression de l'antagoniste du TGF-bêta Smad7 inhibe la transdifférenciation et arrestations des CSH dans un stade quiescent. En outre, la ligature du cholédoque (BDL)-fibrose induite est améliorée par l'introduction d'adénovirus exprimant Smad7 avec collagène diminuées et expression de muscle lisse alpha actine (alpha-SMA). Le but de cette étude était de caractériser davantage les détails moléculaires des voies de TGF-bêta qui contrôlent le processus de la transdifférenciation. Pour tenter d'élucider les gènes cibles de TGF-bêta responsables FIBROGÉNÈSE, a été réalisée une analyse des profils d'expression des ARNm Smad7 dépendant en CSH, ayant pour résultat l'identification de l'inhibiteur de la différenciation 1 gène (Id1). L'expression ectopique Smad7 en GPX a fortement réduit Id1 ARNm et protéines expression. À l'inverse, Id1 surexpression dans les CSH amélioré l'activation des cellules et contourné inhibition Smad7-dépendante de la transdifférenciation. En outre, précipitation ID1 dans autorenouveler trafiqué, formation alpha-SMA fibre, indiquant un rôle pivotal ID1 FIBROGÉNÈSE. Traitement des CSH avec TGF-beta1 a conduit à l'expression de protéine Id1 accrue, qui n'était pas directement induite par l'ALK5/Smad2/3, mais la voie de l'ALK1/Smad1. In vivo, expression Id1 et phosphorylation Smad1 étaient induites pendant la FIBROGÉNÈSE. En conclusion, Id1 est identifié comme le gène cible TGF-bêta/ALK1/Smad1 en GPX et représente un médiateur essentiel de transdifférenciation qui peut-être être impliqué dans la FIBROGÉNÈSE hépatique. On trouvera des documents supplémentaires pour cet article sur le site Web de l'HÉPATOLOGIE (http://interscience.wiley.com/jpages/0270-9139/suppmat/index.html).
FIBROGÉNÈSE Hépatique En Raison De La Cholestase Est Associée à Une Expression Accrue Smad7 Et Smad3 Signalisation
Profibrogenic TGF-bêta signalisation dans les cellules étoilées hépatiques est modulée au cours de la transdifférenciation. Stratégies visant à abroger les effets du TGF-bêta fournit des résultats prometteurs d'antifibrotiques, cependant, les données in vivo en ce qui concerne les Smad activation au cours de la FIBROGÉNÈSE sont rares.
Transforming Growth Factor Beta1 Haut-régule Facteur Régulateur Interféron 8 Durant Le Développement De Cellules Dendritiques
Les cellules de Langerhans (LC) représentent le contingent cutané des cellules dendritiques (DC). Leur développement dépend transformant beta1 de facteur de croissance (TGF-beta1) tel que démontré par l'analyse des TGF-beta1(-/-) souris, dépourvues de LC. Ici, nous avons utilisé un système de culture en deux étapes et profilage transcriptionnel de puces à ADN pour rechercher des gènes cibles de TGF-beta1 en DC. L'étude a identifié facteur régulateur interféron 8 (IRF-8) comme un gène de la nouvelle cible de TGF-beta1 signaling in DC. TGF-beta1 induit effectivement l'expression de la phosphorylation et de Fri-8 ARN et de protéine Smad2/3. Blocage de la voie TGF-beta1/Smad par l'expression ectopique de Smad7 inhibitrice et inhibiteur de la SB431542 aboli le TGF-beta1 induite par une régulation IRF-8. En outre, induction de TGF-beta1-dépendante de l'IRF-8 a eu lieu en l'absence de la biosynthèse des protéines, ce qui suggère une action directe de la signalisation TGF-beta1/Smad sur l'activité des gènes IRF-8. TGF-beta1 a également induit l'expression du récepteur de chimiokine CCR7 et amélioré la migration DC vers CCR7 ligand ELC. DC de IRF-8(-/-) souris montrent CCR7 réduction de l'expression et l'activité migratoire, impliquant ainsi la voie de signalisation TGF-beta1/Smad/IRF-8 dans le règlement CCR7. Ainsi, cette étude a identifié une nouvelle voie de signalisation TGF-beta1/Smad/IRF-8 ayant une incidence sur le phénotype de DC et de la fonction.
La Voie De La Protéine Morphogénétique Osseuse Est Inactivée Dans La Majorité Des Cancers Colorectaux Sporadiques
La découverte de mutations OS protéine morphogénétique (BMP) récepteur 1 a polypose juvénile suggère que les PGB est importants dans le cancer colorectal (CCR). Nous avons étudié la voie BMP dans le CCR sporadique.
Transforming Growth Factor-beta Induit L'expression De Facteur De Croissance Nerveuse Dans Les Cellules étoilées Du Pancréas Par Activation De La Voie De L'ALK-5
Facteur de croissance de nerf (NGF), un facteur de survie pour les neurones applique la douleur en sensibilisant les nocicepteurs. Également dans le pancréas, NGF a été associé à la douleur, et il peut stimuler la prolifération des cellules de cancer du pancréas. Les cellules étoilées hépatiques (HSC) répondent à NGF avec l'apoptose. Transforming growth factor (TGF)-bêta, un des plus fortes pro-fibrogène des activateurs de pancréatiques cellules étoilées (CFP) induit NGF et ses deux récepteurs dans une lignée humaine immortalisé (ihPSC) et primaires de rat CFP (prPSC) tel que déterminé par RT-PCR, western blot et immunofluorescence. Contrairement aux HSC, CFP a exprimé les deux récepteurs de NGF, bien que l'expression p75(NTR) était faible en prPSC. Contrairement aux ihPSC TGF-bêta activé les deux cascades de signalisation Smad en prPSC. La sécrétion de NGF a été diminuée par l'activine-like kinase (ALC) -5 inhibiteur SB431542, indiquant le rôle prédominant des ALK5 en activant le système de NGF dans CFP. Alors que le NGF n'affectait pas la prolifération ou la survie du PSC il induit l'expression de l'inhibiteur de différenciation-1. Nous concluons que dans des conditions de surexprimés TGF-bêta, comme la fibrose, niveaux NGF permettra également d'augmenter en CFP qui peut-être contribuer à des réponses de cicatrisation du pancréas.
TMEPAI, Une Protéine Transmembranaire De TGF-bêta-inductible, Séquestre Protéines Smad De Participation Active Dans La Signalisation TGF-bêta
Facteur de croissance transformant bêta (TGF-bêta) est une cytokine multifonctionnelle d'une importance capitale pour le contrôle de l'homéostasie de l'embryogenèse et de tissus. Comment les signaux de TGF-bêta sont atténués et résiliés ne sont pas bien comprises. Ici, nous montrons que TMEPAI, un gène cible directe de la signalisation TGF-bêta, s'oppose à la signalisation TGF-bêta en interférant avec type de TGF-bêta, j'ai du récepteur (TbetaRI)-induit la phosphorylation de R-Smad. TMEPAI peut interagir directement avec les R-SMAD via un motif d'interaction Smad. TMEPAI concurrence Smad ancre pour l'activation des récepteurs pour les R-Smad coincée, séquestrant ainsi les R-SMAD de TbetaRI activation de la kinase. Dans les cellules de mammifères, l'expression ectopique de TMEPAI inhibée règlement TGF-bêta-dependent de PAI-1, JunB, inhibiteurs de la kinase cycline-dépendante et expression de c-myc, tandis que la précipitation spécifique d'expression TMEPAI prolonge la durée de phosphorylation Smad2 et Smad3 induite par le TGF-bêta et la réactivité cellulaire potentialisée concomitamment à TGF-beta. Constamment, TMEPAI inhibe la formation de l'activine-mediated mésoderme chez les embryons de Xenopus. Par conséquent, TMEPAI participe à une boucle de rétroaction négative pour contrôler la durée et l'intensité de la signalisation TGF-bêta/Smad.
Acide 5-aminosalicylique Inhibe TGF-beta1 Signalisation Dans Les Cellules De Cancer Colorectal
La voie de transformation growth factor-beta (TGF-bêta) est une voie importante dans l'apparition et la progression du cancer colorectal. L'étude visait à déterminer les effets de l'acide 5-aminosalicylique (5-ASA) sur TGF-bêta signalisation dans les cellules de cancer colorectal in vitro. 5-ASA inhibée TGF-beta1 signalisation dans les cellules HCT116 et fibroblastes coliques, si l'on en juge par un essai de gène de journaliste spécifique du TGF-bêta, taux ARNm et de protéines 1-inhibiteur de l'activateur du plasminogène, trans-différenciation des fibroblastes, Smad3 phosphorylation et translocation nucléaire. Nous concluons que le 5-ASA inhibe TGF-beta1 signalisation dans les cellules du cancer colorectal et pourrait être un médicament thérapeutique puissant adjuvant, interférant avec la signalisation de TGF-bêta aberrant dans le cancer colorectal.
Matrix Metalloproteinase-14 (MT1-MMP)-médiation Endogline Effusion Inhibe L'angiogenèse Tumorale
Endogline est un corécepteur bêta-facteur de croissance transformant avec un rôle crucial dans l'angiogenèse. Une forme soluble de l'endogline est présente dans la circulation, mais le rôle de l'endogline soluble (sEndoglin) est mal compris. En outre, l'endogline effusion le mécanisme n'est pas connue. Par conséquent, nous avons examiné le rôle de sEndoglin dans l'angiogenèse tumorale et le mécanisme par lequel le domaine extracellulaire de l'endogline est libéré de la membrane.Dans des échantillons de cancer colorectal, nous avons observé l'endogline endothéliales haute expression de la protéine, accompagnée des niveaux légèrement inférieurs de sEndoglin dans la circulation, par rapport aux témoins sains. Analyse in vitro à l'aide des tests de germination endothéliales a révélé que sEndoglin réduit spontanée et vasculaire endothéliale induite par le facteur de croissance endothéliale germination. Les cellules endothéliales vasculaires ombilicales humaines ont été trouvés à sécréter des niveaux élevés de sEndoglin. Endogline effusion est inhibée par les inhibiteurs des métalloprotéinases (MMP) matrice et MMP-14 court hairpin RNA, indiquant les MMP-14 comme l'endogline importante excrétion protéase. Coexpression de l'endogline et membranaires MMP-14 a conduit à une forte augmentation des niveaux de sEndoglin. Excrétion endogline requis une interaction directe entre l'endogline et membrane localisée MMP-14. Utilisation de mutants de site de clivage, nous avons déterminé que les MMP-14 clivé endogline sur un site à proximité du domaine transmembranaire. Pris ensemble, cette étude montre que MMP-14 médie endogline effusion, qui peut réguler le potentiel angiogénique des cellules endothéliales dans le microenvironnement de la tumeur (cancer colorectal).
La Voie Du TGF-β/Smad Induit L'invasion Des Cellules Du Cancer Du Sein Par Le Biais De La Régulation De La Métalloprotéinase Matricielle 2 Et 9 Dans Un Système De Modèle D'invasion Sphéroïde
Facteur de croissance transformant β (TGF-β) a s'opposer à un rôle dans la progression du cancer du sein en agissant comme un suppresseur de tumeur dans la phase initiale, mais stimulant l'invasion et la métastase à un stade ultérieur. À la différence des mécanismes par lequel le TGF-β induit arrêt de croissance, les voies qui médient invasion tumorale ne sont pas bien comprises. Nous décrivons ici un système d'analyse d'invasion TGF-β-dependent consistant en sphéroïdes de MCF10A1 des cellules épithéliales mammaires normales (M1) et RAS-transformées (pré-) dérivés malignes (M2 et M4) incorporés dans des gels de collagène. Basale et induite par le TGF-β invasion de ces lignées cellulaires se trouvait être en corrélation avec leur potentiel tumorigène ; M4 montrant le comportement plus agressif et M1 montrant le moins. Invasion basale est fortement inhibée par l'inhibiteur de kinase du récepteur TGF-β SB-431542, indiquant l'implication d'autocrine activité TGF-β ou TGF-β-like. Invasion induite par le TGF-β dans M2 précancéreuses et cellules hautement malignes de M4 est aussi inhibée après précipitation spécifique de Smad3 ou Smad4. Fait intéressant, tant un large spectre matrix métalloprotéinases (MMP) inhibiteur et un inhibiteur sélectif de la MMP2 et MMP9 atténués induite par le TGF-β d'invasion des cellules M4, tout en laissant l'invasion basale intacte. Dans cette optique, TGF-β s'est avéré pour fortement inciter MMP2 et MMP9 l'expression d'une manière dépendante Smad3 et Smad4. Ce système de sphéroïde de collagène-encastré offre donc un modèle de dépistage utile pour le TGF-β/Smad- et fonction MMP2 et MMP9 invasion du cancer des seins.
Fonctions Oncogènes De HMDMX Dans La Transformation in Vitro De Fibroblastes Humains Primaires Et Retinoblasts Embryonnaire
Dans environ 50 % de tous les cancers humains, le suppresseur de tumeur p53 est muté. Il est généralement admis que, dans les tumeurs restantes, la protéine p53 sauvage est fonctionnellement altérée. Les deux principaux inhibiteurs de p53, hMDM2 (MDM2) et hMDMX (MDMX/MDM4) sont souvent surexprimés dans les tumeurs p53 sauvage. Considérant que l'activité principale de hMDM2 est de dégrader la protéine p53, son homologue étroite de hMDMX ne dégrade pas p53, mais il réprime son activité transcriptionnelle. Ici, nous étudions le rôle de hMDMX dans la transformation néoplasique des fibroblastes humains et retinoblasts embryonnaire, car un nombre élevé de rétinoblastomes contiennent des niveaux élevés de hMDMX.
BMP-7 TGF-β Inhibe Induite Par L'invasion Des Cellules Du Cancer Du Sein Par Inhibition De La β Intégrine (3) Expression
Le facteur de croissance transformant bêta (TGF)-β superfamille comprend cytokines telles que les protéines morphogénétiques de TGF-ß et Bone (PGB), qui jouent un rôle critique dans une multitude de processus biologiques. Dans le cancer du sein, des niveaux élevés de TGF-β sont associés à un mauvais pronostic, alors que l'inhibition de la β-TGF-signalisation réduit les métastases. En revanche, la BMP-7 inhibe la métastase osseuse des cellules de cancer du sein.
