Progettazione Di Un Nuovo Cofattore Fluorescente Per Methyltransferases Del DNA Ed Etichettatura Specifica Sequenza Di DNA

Journal of the American Chemical Society. Mar, 2003  |  Pubmed ID: 12643710

Etichettatura specifica sequenza di DNA è di immenso interesse per gli studi analitici e funzionali del DNA. Vi presentiamo un nuovo approccio per l'etichettatura di sequenza specifica di DNA usando un nuova concezione cofattore fluorescente per il methyltransferase del DNA da Thermus aquaticus (M.TaqI). Naturalmente, M.TaqI catalizza l'attacco nucleofilo del gruppo amminico exocyclic dell'adenina all'interno della doppia elica 5'--TCGA 3' del DNA sequenza sul gruppo metilico del cofattore S-adenosil-L-metionina (AdoMet) che conduce al trasferimento del gruppo metilico. La progettazione di un nuovo cofattore fluorescente per etichettatura covalente del DNA era basata su tre criteri: (1) sostituzione della catena laterale metionina del cofattore naturale AdoMet da un residuo di aziridinil conduce ad anello nucleofila catalizzata da M.TaqI apertura e accoppiamento del nucleoside tutta al DNA. (2) L'adenosil moiety è l'ancoraggio molecolare per l'associazione cofattore. (3) Collegamento di un fluoroforo tramite un linker flessibile alla posizione 8 dell'adenosil moiety non bloccare l'associazione cofattore. Secondo questi criteri è stato sintetizzato il nuovo cofattore fluorescente 8-amino[1''-(N''-dansyl)-4''-aminobutyl]-5'-(1-aziridinyl)-5'-deoxyadenosine (3). 3 associa circa 4 volte migliore rispetto al cofattore naturale AdoMet a M.TaqI ed è accoppiato con un breve oligodeoxynucleotide duplex da M.TaqI. L'identità dell'atteso nucleoside modificata è stata verificata da ionizzazione electrospray dopo frammentazione enzimatica del prodotto duplex. Inoltre, il cofattore nuovo 3 è stato utilizzato per l'etichetta in particolare sequenza del DNA del plasmide in una reazione catalizzata da M.TaqI.

Idrocarburi Policiclici Aromatici DNA-base Surrogates: Associazione Ad Alta Affinità Per Un Capovolgimento Di Base Adenina-specifico DNA Metiltransferasi

Angewandte Chemie (International Ed. in English). Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12949880

La Stabilità Del Pseudopeptides Cuscinetto Sulfoximines Chirale Come Spina Dorsale Modifica Elemento Verso La Proteinasi K

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. Oct, 2003  |  Pubmed ID: 12951094

Incorporazione di sulfoximines come spina dorsale Modifica elemento si traduce in due nuove obbligazioni pseudopeptide di visualizzazione avanzata (A bond) e fortemente ridotta reattività (legame B) verso idrolisi di proteinasi K.

Conveniente Sintesi Di Oligodeoxynucleotides Contenenti 2'-deossi - 6-thioinosine

Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. May-Aug, 2003  |  Pubmed ID: 14565242

Una sintesi facile di oligodeoxynucleotides (ODN) contenente 2'-deossi - 6-thioinosine (dI6S) basato sul nucleoside convertibili O6-fenil-2'-deoxyinosine è presentato. Dopo standard fase solida DNA sintesi e rimozione di cianoetil proteggere gruppi con trattamento DBU con sodio acquoso solfuro dell'idrogeno introduce la funzionalità di zolfo, deprotects le altre basi azotate e fende l'ODN dal supporto solido in una reazione di one-pot. In aggiunta, il coefficiente di estinzione di 2'-deossi - 6-thioinosine è determinato dalla frammentazione enzimatica dell'ODN risultante in presenza della deaminasi dell'adenosina.

Base Di Disadattamento Specifico DNA Lanciando Da Un Macrociclo Bisacridine

Chembiochem : a European Journal of Chemical Biology. Dec, 2003  |  Pubmed ID: 14661275

La maggior parte, se non tutti, gli enzimi che modificano chimicamente basi azotate nel DNA flip loro destinazione in base all'interno della doppia elica in una posizione extrahelical. Questa conformazione energeticamente sfavorevole è parzialmente stabilizzata dal legame specifico del sito abasic apparente in formazione. Così, enzimi DNA base-flipping, come methyltransferases del DNA e DNA glycosylases, generalmente legano fortemente a DNA contenente siti abasic o analoghi abasic-sito. Il bisacridine macrociclici BisA precedentemente ha dimostrato di legarsi abasic siti. Qui dimostriamo che è in grado di riconoscere specificamente DNA base mismatches e probabilmente induce capovolgimento di base. Legame specifico di BisA di DNA mismatch fu studiata da esperimenti di denaturazione termica mediante breve oligodeoxynucleotides duplex contenenti discordanze TT, TC o TG centrale o una partita di TA. In presenza del macrociclo un forte aumento della temperatura di fusione fino a 7,1 gradi c è stato osservato per il duplex mismatch-contenente, considerando che la temperatura di fusione del duplex completamente corrispondente è stata influenzata. Inoltre, BisA associazione indotta da una maggiore reattività del residuo mispaired timina nel DNA verso ossidazione di permanganato di potassio. Una reattività paragonabile è stata osservata in precedenza per una mancata corrispondenza base TT destinazione in presenza di methyltransferase del DNA M.TaqI. Questa somiglianza di un enzima noto capovolgimento di base suggerisce che inserimento di BisA nell'elica del DNA si sposta il residuo mispaired timina in posizione extrahelical, dove dovrebbe essere più incline a ossidazione chimica. Così, lanciando base del DNA non sembra essere limitata agli enzimi modificano il DNA, ma è probabile che anche essere indotta da un'associazione di piccole molecole sintetiche per un sito termodinamicamente indebolito nel DNA.

Sequenza-specifiche Metiltransferasi-indotta Di Etichettatura Del DNA (DNA Sorridente)

Chembiochem : a European Journal of Chemical Biology. Mar, 2004  |  Pubmed ID: 14997517

Viene presentato un nuovo concetto per l'etichettatura di sequenza specifica di DNA utilizzando cofattori chimicamente modificati per methyltransferases del DNA. Sostituzione della catena laterale dell'amminoacido della naturale cofattore S-adenosil-L-metionina con un gruppo di aziridina conduce ad un cofattore adatto per l'accoppiamento dei sequenza-specifiche metiltransferasi-catalizzata del DNA con il DNA. Sequenza-specifico con etichetta fluorescente DNA del plasmide è stato ottenuto utilizzando il methyltransferase del DNA da Thermus aquaticus (M.TaqI) come catalizzatore e associare un fluoroforo per il cofattore aziridina. Primi risultati suggeriscono che possono essere utilizzate tutte le classi di methyltransferases del DNA con le sequenze di riconoscimento diverso. Inoltre, questo nuovo metodo per contrassegno del DNA dovrebbe essere applicabile a una vasta gamma di gruppi reporter.

Sequenza-specifico Contrassegno Del DNA Methyltransferases Di Utilizzo

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2004  |  Pubmed ID: 15197308

Sequenza specifica etichettatura dei nativo dell'acido deossiribonucleico (DNA) rappresenta ancora un problema irrisolto più o meno. Difficoltà derivano principalmente dalla necessità di combinare due funzioni differenti: sequenza-specifico riconoscimento della formazione del DNA e legame covalente tra l'etichetta e il DNA. Methyltransferases del DNA (MTases) naturalmente in possesso di queste due funzioni e trasferire un gruppo metile da cofattore S-adenosil-L-metionina (AdoMet) ai residui di adenina o citosina all'interno di specifiche sequenze di DNA, che vanno in genere da due a otto paia di basi. Purtroppo, lo stesso gruppo metile è un gruppo di reporter molto limitato e sarebbe auspicabile per trasferire più grandi entità chimiche con DNA MTases. Sostituzione di una catena laterale metionina il cofattore naturale che adomet da un residuo di aziridinil conduce per il cofattore sintetico N-adenosylaziridine, che è quantitativamente, base e sequenza-specifico accoppiato con il DNA in una reazione catalizzata da DNA MTase. Allegando gruppi reporter interessanti ad un idoneo la posizione di N-adenosylaziridine una grande varietà di nuovi cofattori sintetici sono ottenuti per l'etichettatura specifica sequenza di DNA. Questo metodo è illustrato da accoppiamento gruppi amminici primari e biotina per breve oligodeoxynucleotides duplex o DNA del plasmide usando il DNA MTase M.TaqI.

Trasferimento Diretto Di Gruppi Estesi Da Cofattori Sintetici Dai Methyltransferases Del DNA

Nature Chemical Biology. Jan, 2006  |  Pubmed ID: 16408089

S-adenosil-L-metionina (AdoMet) è il donatore di metile importanti per le reazioni di metilazione biologica catalizzata dai methyltransferases. Riportiamo la prima sintesi chimica di AdoMet analoghi con catene di carbonio esteso sostituendo il gruppo metile e la loro valutazione come cofattori per tutte le tre classi di methyltransferases del DNA. Estesi gruppi contenenti un doppio o triplo legame in posizione beta al centro di solfonio sono stati trasferiti sul DNA in modo catalitico e sequenza-specifico, dimostrando un'alta utilità di tali cofattori sintetici per mirati funzionalizzazione dei biopolimeri.

Sintesi Di Analoghi Di S-adenosil-L-metionina E Il Loro Uso Per Transalchilazione Sequenza Specifica Di DNA Dai Methyltransferases

Nature Protocols. 2006  |  Pubmed ID: 17487172

Qui descriviamo un procedimento sintetico One-Step per la preparazione di analoghi di S-adenosil-L-metionina (AdoMet) con catene di carbonio esteso sostituendo il gruppo metile. Questi analoghi AdoMet funzionano come cofattori efficiente per methyltransferases del DNA (MTases), e forniamo un protocollo per il trasferimento di sequenza-specifiche delle catene laterali estesi da questi analoghi AdoMet al DNA da DNA MTases. Diretta chemoselective allylation o propargylation di S-adenosil-L-omocisteina (AdoHcy) a zolfo è raggiunto nelle condizioni acide necessarie per proteggere altre posizioni nucleofila in AdoHcy. I legami insaturi in posizione beta al centro di solfonio del risultante AdoMet analoghi sono progettati per stabilizzare lo stato di transizione formato su DNA MTase-catalizzata attacchi nucleofili al carbonio accanto al centro di solfonio e piombo per trasferimento efficiente delle catene laterali estesi al DNA. Utilizzando questi protocolli, funzionalizzata DNA sequenza-specifico può essere ottenuto entro una o due settimane.

Etichettatura Quantitativa Del DNA Del Plasmide Lungo Con Precisione Nanometrica

Chembiochem : a European Journal of Chemical Biology. Sep, 2007  |  Pubmed ID: 17654629

Consegna Di Siero Proteine Insensibile, Intranucleari Dai Lipidi Cationici Multiuso SAINT-2

Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. Nov, 2007  |  Pubmed ID: 17884225

Composti cationici liposomiale sono ampiamente utilizzati per introdurre siRNA e DNA in cellule vitali, ma nessuno di questi composti sono anche in grado di introdurre le proteine. Qui descriviamo l'uso di un lipido cationico anfifilico SAINT-2:DOPE per la fornitura efficiente di proteine in cellule (Profezione). Etichettatura gli studi hanno dimostrato l'efficienza di consegna uguale per proteina per quanto riguarda il DNA e siRNA. Inoltre, le proteine complessate con Saint-2:DOPE sono stati consegnati con successo, a prescindere dalla presenza di siero, e l'efficienza di Profezione non fu influenzato dalle dimensioni o la carica della proteina: complesso liposomiale cationico. Utilizzo di beta-galattosidasi come una proteina reporter, attività enzimatica è stato rilevato fino al 98% delle cellule aderenti, fino a 83% delle cellule sospensione fino al 70% delle cellule primarie dopo Profezione. Un anticorpo consegnato è stato rilevato nel citoplasma fino a 7 giorni dopo la Profezione. Consegna di methyltransferase M.SssI portato nella metilazione del DNA, che porta ad una diminuzione nell'espressione di E-caderina. Il sistema di trasporto multiuso lipido-mediata qui riportato può introdurre proteine nella cellula con un'efficienza di consegna uguale per quanto riguarda i nucleotidi. La consegna è a prescindere dalla presenza di siero, e la proteina può esercitare la sua funzione nel citoplasma e nel nucleo. Inoltre, la metilazione del DNA di consegna M.SssI come strumento di romanzo per silenziamento genico ha potenziali applicazioni nella ricerca di base e terapia.

Un Nuovo Strumento Per La Biotecnologia: I Methyltransferases AdoMet-dipendente

Trends in Biotechnology. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17254657

AdoMet-dipendente methyltransferases catalizzare metile altamente specifico gruppo trasferimenti dall'onnipresente cofattore S-adenosil-L-metionina ad una moltitudine di bersagli biologici nella cella. Recentemente, i methyltransferases del DNA sono stati utilizzati per il fissaggio di sequenza-specifico, covalente dei più grandi gruppi chimici di plasmidi e batteriofagi DNA utilizzando due classi di analoghi sintetici di AdoMet. Questi cofattori sintetiche, in combinazione con il miriade methyltransferases AdoMet-dipendente disponibile in natura, forniscono nuovi strumenti molecolari per la funzionalizzazione di precisi, mirati e l'etichettatura di grandi DNAs naturale e, in tutte le probabilità, RNA e proteine. Questo spiana la strada per numerose applicazioni romanzo nell'analisi funzionale di metilazione biologica, biotecnologie e diagnostica medica.

Mirate Il Contrassegno Del DNA Metiltransferasi-diretto Trasferimento Dei Gruppi Attivati (mTAG)

Journal of the American Chemical Society. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17309265

2-Aminopurine Capovolto Nel Sito Attivo Di Adenina-specifico DNA Metiltransferasi M.TaqI: Strutture Cristalline E Time-resolved Di Fluorescenza

Journal of the American Chemical Society. May, 2007  |  Pubmed ID: 17455934

Riportiamo la struttura di cristallo del methyltransferase del DNA dell'adenina-N6, M.TaqI, complessato con DNA, mostrando l'adenina fluorescente analogici, 2-aminopurine, capovolto fuori l'elica di DNA e che occupa praticamente la stessa posizione nel sito attivo, come l'adenina destinazione naturale. Spettroscopia di fluorescenza del complesso cristallino riporta fedelmente questo stato risolto da tempo: capovolgimento di base è accompagnata dalla perdita della componente molto breve (circa 50 ps) durata associata completamente base-stacked 2-aminopurine nel DNA, e 2-aminopurine è soggetta a notevole tempra di pi stacking interazioni con Tyr108 il motivo catalitico IV (NPPY). Questo dimostra 2-aminopurine ad essere un'eccellente sonda per lo studio di base lanciando da M.TaqI e suggerisce tempra simili nei siti attivi del DNA e RNA adenina-N6 così come DNA methyltransferases di citosina-N4 condivisione del IV motivo conservate. In soluzione, la stessa risposta di fluorescenza caratteristica conferma destacking completo da DNA e inoltre è osservata quando il residuo chiave proposto per flipping base da M.TaqI, la timina base partner di destinazione, viene sostituito da un analogo sito abasic. La corrispondente struttura cocrystal Mostra 2-aminopurine nel sito attivo di M.TaqI, dimostrando che la timina partner non è essenziale per capovolgimento di base. Tuttavia, in questa struttura, uno spostamento del prossimo 3' del target base nel posto vacante lasciato dopo il capovolgimento di base è osservato, a quanto pare replicando un ruolo stabilizzante della timina partner mancante. Time-resolved di fluorescenza e acrilamide tempra misurazioni dei complessi M.TaqI in soluzione forniscono la prova per un sito di legame alternativo per la destinazione extra-helical base all'interno di M.TaqI e suggeriscono che la timina partner assiste nel fornire la base di destinazione nel sito attivo.

DNA Etichettatura Topologie Per Monitoraggio Formazione Dei Complessi DNA-proteina Di Anisotropia Di Fluorescenza

Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2007  |  Pubmed ID: 18066831

In questo lavoro, anisotropia di fluorescenza è stato utilizzato per studiare il legame del DNA del DNA metiltransferasi M.TaqI. Per questo scopo breve DNA molecole etichettati con tre differenti fluorofori (bromuro di etidio Cy3 e arancio di tiazolo) sono state preparate in varie topologie e la loro idoneità per il rilevamento della formazione dei complessi DNA-proteina è stato studiato.

Architettura Di Scala Molecolare: Engineered Giunzioni Di Tre E Quattro Vie

Bioconjugate Chemistry. Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18069780

Biomolecolare autoassemblaggio fornisce una base per la costruzione di bottom-up di nanoscala utili e diverse architetture. DNA è comunemente utilizzato per creare questi assembly ed è spesso sfruttato come un reticolo o una matrice. Sebbene geometricamente rigida e altamente prevedibile, questi fogli di costrutti ripetitivi spesso mancano la possibilità di essere enzimaticamente manipolato o allungata da tecniche biochimiche standard. Qui, descriviamo due approcci per la realizzazione di giunzioni di DNA posizione controllata, su scala molecolare, discrete, tre e quattro vie. Il primo approccio per la costruzione di queste giunzioni si basa sull'uso di nonmigrating cruciforms generati dai oligonucleotides sintetici che grandi, segmenti di DNA double-stranded, biologicamente generati enzimaticamente sono legati. Il secondo approccio utilizza il DNA metiltransferasi-based sorridente (di DNA metiltransferasi-indotta contrassegno sequenza-specifico) metodo per site-specifically incorporano una biotina all'interno del DNA biologicamente derivato. Streptavidina viene quindi utilizzato per giunzioni di forma tra filamenti di DNA unici. L'assembly risultante hanno collegamenti precisi e predeterminati con lunghezze che possono essere variati da enzimatica o tecniche di ibridazione, o geometricamente controllati con metodi standard di funzionalizzazione del DNA. Queste giunzioni sono posizionate con risoluzione di singolo nucleotide su modelli di grandi dimensioni, micrometro-lunghezza. Entrambi gli approcci generano assembly di DNA che sono pienamente compatibili con i metodi standard ricombinanti e quindi fornire una base di romanzo per applicazioni nanoengineering.

Enzima-regia Di Posizionamento Di Nanoparticelle Su Grandi Modelli Del DNA

Bioconjugate Chemistry. Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18088085

Viene descritto un metodo per posizionare le nanoparticelle sul DNA con alta risoluzione utilizzando un approccio basato su enzima. Questo fornisce un comodo itinerario per assemblare le nanoparticelle multipli (per esempio, Au e CdSe) a posizioni specifiche con un alto livello di controllo e di espandibilità per assiemi più complessi. Microscopia a forza atomica è usata per analizzare le nanostrutture, che hanno interesse potenziale per biosensori, guida d'onda ottica, elettronica molecolare e gli studi di trasferimento di energia.

Riassemblaggio Funzionale Degli Enzimi Di Spalato in Loco: Un Nuovo Approccio Per La Metilazione Del DNA Bersaglio Altamente Sequenza-specifici

Chembiochem : a European Journal of Chemical Biology. Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18189249

6-Tioguanina Nel DNA Come CD-spettroscopiche Sonda Per Studiare I Cambiamenti Strutturali Locali Al Legame Con Le Proteine

Chirality. Sep, 2008  |  Pubmed ID: 18293364

Una combinazione della spettroscopia teorica e sperimentale di Dicroismo circolare (CD) è stata usata per studiare le deformazioni locali del DNA causati dal legame della base lanciando methyltransferase del DNA M.TaqI. Per studiare in modo selettivo i cambiamenti strutturali all'interno del DNA, abbiamo sostituito i residui di guanina singolo in sei posizioni diverse nel DNA duplex con 6-tioguanina (s(6)G), che assorbe a 342 nm dove non modificato DNA e l'enzima sono trasparenti. La forma e la lunghezza d'onda di transizione di un CD del segnale circa 340 nm negli spettri di DNA libero ed il DNA è associato a M.TaqI sono stati trovati a dipendere dalla posizione della sonda s (6) G. Forza rotazionale teorico sono stati calcolati utilizzando il metodo della matrice che viene spesso utilizzato per modellare il CD di biomolecole grandi. I cromofori soli in questi calcoli sono stati le basi dell'acido nucleico. Confronto tra il misurato e gli spettri calcolati CD ha dimostrato che il metodo di calcolo applicato riproduce qualitativamente il gruppo dominante osservato circa 340 nm in tutti i casi. Dai nostri risultati si conclude che i cambiamenti spettrali osservati sul legame dell'enzima al DNA sono infatti principalmente a causa di cambiamenti strutturali all'interno del DNA e non agli altri effetti causati dalla presenza dell'enzima.

Persistente Downregulation Della Molecola Di Adesione Pancarcinoma-associati Delle Cellule Epiteliali Tramite Metilazione Intranucleari Attiva

International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. Jul, 2008  |  Pubmed ID: 18398839

La molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM) è espressa ad alti livelli sulla superficie della maggior parte delle cellule di carcinoma. SiRNA silenziamento dell'espressione EpCAM conduce al ridotto potenziale metastatico delle cellule tumorali, dimostrando la sua importanza nella progressione del tumore e oncogenesi. Tuttavia, siRNA terapia richiede consegna sequenza o integrazione nel genoma della cellula ospite. Quindi abbiamo deciso di esplorare una forma più definita per influenzare l'espressione genica EpCAM. I meccanismi sottostanti l'attivazione trascrizionale del gene EpCAM, entrambi in tessuto epiteliale normale così come nella cancerogenesi, sono capiti male. Mostriamo che la metilazione del DNA gioca un ruolo cruciale nell'espressione di EpCAM, e inoltre, silenziamento attiva di EpCAM endogeno attraverso la metilazione del promotore EpCAM risultati in una persistente downregulation di EpCAM espressione. In un pannello di carcinoma derivato linee cellulari, analisi di bisolfito ha mostrato una correlazione tra lo stato di metilazione del promotore EpCAM ed EpCAM espressione. Trattamento delle linee cellulari EpCAM-negativi con un agente demethylating indotta EpCAM espressione, sia a livello di mRNA e proteine e causato sovraregolazione di EpCAM espressione in una linea cellulare EpCAM-positivo. Dopo la consegna delle DNA metiltransferasi M.SssI in cellule di carcinoma ovarico EpCAM-positive, la metilazione del promotore EpCAM portato nel silenziamento dell'espressione EpCAM. SiRNA-mediated silencing è rimasto per 4 giorni, dopo di che EpCAM riespressione aumentato nel tempo, mentre M.SssI-mediata downregulation di EpCAM mantenuto attraverso successive divisioni cellulari, come la repressione ha persisto per almeno 17 giorni. Questo è il primo studio che mostrano che la metilazione del DNA attiva porta a sostenuta silenziamento dell'espressione EpCAM endogena.

Riconoscimento Selettivo Del DNA Pirimidina-pirimidina Disadattamento Da Bis-intercalators Macrociclico Con Limitazioni Di Distanza

Nucleic Acids Research. Sep, 2008  |  Pubmed ID: 18658249

Associazione di tre macrociclici bis-intercalators, derivati di acridina e naftalene e due composti aciclici modello oligodeoxynucleotides duplex mismatch contenenti ed abbinati è stato analizzato da esperimenti di denaturazione termica, studi di spettrometria di massa ionizzazione elettrospray (ESI-MS) e titolazioni cilindrata (FID) fluorescenti intercalator. Il bis-intercalators macrociclici legano a doppiette contenenti timina non corrispondenti basi con alta selettività sopra quelle pienamente corrispondenti, considerando che i composti aciclici modello sono molto meno selettivi e fortemente legano al DNA corrispondente. Inoltre, i risultati di esperimenti di denaturazione termica sono in ottimo accordo con le affinità di binding ottenute mediante ESI-MS e misurazioni FID. I FID risultati dimostrano anche che il naftalene macrociclici derivati BisNP preferenzialmente associa al mismatch pirimidina-pirimidina rispetto a tutti gli altri possibili incongruenze di base. Questo ligando compete anche in modo efficiente con un enzima DNA (M.TaqI) per l'associazione di un duplex con un TT-mismatch, come dimostrato dalle titolazioni fluorescenza competitiva. Complessivamente, i nostri risultati dimostrano che macrociclico con limitazioni di distanza bis-intercalators sono efficiente e selettive ligandi mismatch-associazione che possono interferire con l'associazione disadattamento enzimi.

Riconoscimento Di Mancate Corrispondenze Homopyrimidine Da Bisintercalators Macrociclico Con Limitazioni Di Distanza

Nucleic Acids Symposium Series (2004). 2008  |  Pubmed ID: 18776277

Associazione di tre bisintercalators macrociclici per mancata corrispondenza contenente duplex è stata analizzata da esperimenti di denaturazione termica, studi di spettrometria di massa elettrospray (ESI-MS) e titolazioni cilindrata (FID) fluorescenti intercalator. Il bisintercalators macrociclici legano ai duplex contenente timina non corrispondenti basi con alta selettività sopra quello completamente adattato e affinità nella gamma submicromolar (Kd). I FID risultati dimostrano anche che il naftalene macrociclici derivati BisNP preferenzialmente associa al mismatch pirimidina-pirimidina rispetto a tutti gli altri possibili incongruenze di base. Questo ligando compete anche in modo efficiente con un enzima DNA (M.TaqI) per l'associazione di un duplex con una mancata corrispondenza di TT.

Sequenza-specifiche Methyltransferase-Induced Etichettatura (sorridere) Del DNA Del Plasmide Per Lo Studio Delle Cellule Di Transfezione

Bioorganic & Medicinal Chemistry. Jan, 2008  |  Pubmed ID: 17977734

Plasmide DNA (pUC19 e pBR322) era sequenza-specifico, legame covalente etichettato con Cy3 fluorofori utilizzando un cofattore di N-adenosylaziridine appena sintetizzato e il methyltransferase del DNA M.TaqI. I plasmidi fluorescente coniugati sono stati utilizzati per la transfezione delle cellule di mammiferi e loro distribuzione intracellulare è stato visualizzato da epifluorescenza e microscopia di fluorescenza confocale. Sebbene questi plasmidi eucarioti non contengono sequenze di importazione nucleare, è stata osservata una traslocazione in nuclei.

Sintesi Di S-adenosil-L-omocisteina Catturare Composti Per L'isolamento Selettivo Fotoindotti Di Methyltransferases

Chembiochem : a European Journal of Chemical Biology. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 20049756

Comprendere l'interazione delle proteine cellulari diverse e i loro substrati è di maggiore interesse in epoca postgenomic. Per questo scopo, isolamento selettivo e l'identificazione di proteine da campioni biologici complessi è necessario e mirato l'isolamento delle famiglie di enzima è un compito impegnativo. Negli ultimi anni, metodi come proteina basata su attività di profilatura (ABPP) e spettrometria di massa composto cattura (CCMS) sono stati sviluppati per ridurre la complessità del proteoma mediante la funzione della proteina in contrasto con gli approcci standard, che utilizzano le differenze nelle proprietà fisiche per la separazione di proteine. Per isolare e identificare il subproteome consistente di S-adenosil-L-metionina (SAM o AdoMet)-dipendente methyltransferases (methylome), abbiamo sviluppato e sintetizzato trifunzionale cattura composti contenenti il prodotto chimicamente stabile cofattore S-adenosil-L-omocisteina (SAH o AdoHcy) come funzione di selettività. Analoghi SAH con amino linkers alle posizioni N6 o C8 sono stati sintetizzati e associate a ponteggi contenenti gruppi diversi photocrosslinking per modifica covalente proteine e biotina per isolamento di affinità. L'utilità di questi composti di cattura SAH per isolamento della proteina fotoindotti selettiva è dimostrata per i methyltransferases vari (MTases) che agiscono sul DNA, RNA e proteine, nonché con lysate delle Escherichia coli. Inoltre, può essere utilizzati per determinare le costanti di dissociazione per complessi MTase-cofattore.

Enzimatica Funzionalizzazione Site-specific Di Substrati Methyltransferase Proteina Con Alchini Per Fare Clic Su Etichette

Angewandte Chemie (International Ed. in English). Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20572224

Metilazione Del DNA Bersaglio Da Una DNA Metiltransferasi Accoppiata Ad Una Tripla Elica Formando Del Oligonucleotide Per Down-regolare La Molecola Di Adesione Delle Cellule Epiteliali

Bioconjugate Chemistry. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20593890

La molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM) è una glicoproteina di membrana che è stata identificata come un marcatore di avvio di cancro cellule. EpCAM è altamente espresso sulla maggior parte dei carcinomi e transitori silenziamento dell'espressione EpCAM conduce al ridotto potenziale oncogenico. Per silenziare il gene EpCAM in maniera persistente tramite mirata metilazione del DNA, un mutante di bassa attività (C141S) della specifici CpG DNA metiltransferasi che m.SSSI è stato accoppiato ad un oligonucleotide triple-elica-formante (TFO-C141S) appositamente per il gene EpCAM. Plasmidi reporter che codifica la proteina fluorescente sotto il controllo di diversi frammenti di promotore EpCAM sono stati trattati con il TFO-C141S verde coniugano per determinare la specificità di metilazione del DNA mirata nel contesto di un promotore EpCAM funzionale. Trattamento dei plasmidi con TFO-C141S portato efficiente e metilazione specifica di CpG mirati si trova direttamente a valle della tripla elica formando sito (TFS). La metilazione del DNA senza sfondo è stata osservata in una regione di bp 700 del promotore EpCAM né in una regione di 400 bp del gene reporter a valle di TFS. La metilazione della destinazione CpG non ha avuto un effetto rilevabile sull'attività del promotore. Questo studio mostra che la combinazione di un TFO specifico e una variante di metiltransferasi ridotta attività può essere utilizzata per indirizzare la metilazione del DNA in siti predeterminati con alta specificità, permettendo la determinazione di CpG cruciale per l'attività di promotore.

Espandendo L'ambito Chimico Di RNA:methyltransferases a Alkynylation Site-specific Di RNA Per L'etichettatura Di Clic

Nucleic Acids Research. Mar, 2011  |  Pubmed ID: 21037259

Questo lavoro identifica la combinazione di trasferimento enzimatico e fare clic su etichette come un metodo efficiente per il tagging site-specific di molecole di RNA per studi biofisici. Un doppio-attivato analogico dell'onnipresente co-substrate S-adenosil-l-metionina fu impiegato per una catena di cinque carbonio contenente un gruppo terminale alkynyl su RNA di trasferimento enzimaticamente. Il tRNA: methyltransferase Trm1 trasferito il moiety alkynyl esteso alla sua destinazione naturale, la N2 di guanosina 26 in tRNA(Phe). LC/MS e LC/MS/MS tecniche sono stati utilizzati per individuare e caratterizzare i nucleosidi modificati così come il suo prodotto di cicloaddizione con una fluorescente azide. Quest'ultimo ha provocato da una reazione d'etichettatura via Cu (I)-catalizzata azoturo-alchini 1,3-cicloaddizione Clicca chimica, produzione di RNA site-specifically con etichetta cui idoneità per singoli esperimenti fluorescenza molecola è stata verificata in esperimenti di spettroscopia di fluorescenza correlazione.

Sequenza Specifica Etichettatura Covalente Del DNA

Biochemical Society Transactions. Apr, 2011  |  Pubmed ID: 21428951

Modificazione del DNA sequenza-specifico è di importanza per le applicazioni nel bio - e nano-tecnologia, diagnostica medica e ricerca fondamentale delle scienze della vita. Preferenzialmente, etichettatura deve essere eseguita in modo covalente, che evita dubbi sulla dissociazione etichetta dal DNA in varie condizioni. Negli ultimi due decenni sono stati sviluppati metodi diversi per l'etichetta DNA nativo. Triple-elica-formante oligodeoxynucleotides e tornanti poliammidi che legano sequenze di DNA in particolare nella maggiore e minore rispettivamente groove sono state utilizzate come dispositivi per l'etichettatura di covalente successive di targeting. Inoltre, enzima-regia di etichettatura si avvicina utilizzando nicking endonucleases in combinazione con le polimerasi del DNA o methyltransferases del DNA sono state impiegate. Questa recensione riassume varie tecniche utili per la funzionalizzazione di DNA lungo nativo.

Profilatura Di Methyltransferases E Altre Proteine S-adenosil-L-omocisteina-associazione Di Catturare Compound Spettrometria Di Massa

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2012  |  Pubmed ID: 22065221

C'è una varietà di approcci per ridurre la complessità del proteoma in base alle interazioni della piccola molecola-proteina funzionale. Descriviamo un approccio generico basato su trifunzionale composti Capture, in cui l'interazione iniziale basata sull'equilibrio tra le proteine di sonda e bersaglio una piccola molecola è irreversibilmente fissato su foto-reticolazione tra una funzione indipendente foto-attivabile reattività di catturare Compound e la superficie delle proteine bersaglio. Successivamente, composto di cattura - proteine coniugate sono isolate dalle miscele biologiche complesse tramite la funzione di ordinamento di catturare Compound. Qui, descriviamo l'applicazione di un trifunzionale catturare composto che trasporta l'inibitore di prodotto metiltransferasi S-adenosil-L - omocisteina come la funzione di selettività per l'isolamento di methyltransferases da un complesso lysate di Escherichia coli cellule DH5α. Foto-attivata la reticolazione migliora il rendimento e la sensibilità dell'esperimento, e la specificità può essere facilmente testata per in esperimenti di concorrenza utilizzando un eccesso di S-adenosil-L - omocisteina libera.

Incorporato Enzimaticamente Tag Genomic Per Ottica Mappatura Del DNA-Binding Proteins

Angewandte Chemie (International Ed. in English). Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22331600

Il genoma del batteriofago T7 può essere mappato tramite di DNA metiltransferasi-indotta contrassegno sequenza-specifico. Nella loro comunicazione (DOI: 10.1002/anie.201107714), E. Weinhold, S. Weiss, Y. Ebenstein e colleghi mostrano che la posizione della polimerasi del RNA che sono associati al DNA può essere visualizzata come un barcode lineare ottico, che permette variazioni strutturali nel DNA genomico per essere analizzati e fornisce un ulteriore livello di informazioni contestuali sul genoma a livello di singola molecola.