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Profilatura di metiltransferasi e altri S-Adenosil- L-Omocisteina-binding proteine mediante spettrometria di massa Compound Capture (CCMS)
1Department of Biochemistry / Analytics, caprotec bioanalytics GmbH, 2Institute of Organic Chemistry, RWTH Aachen University
Composti cattura sono trifunzionale piccole molecole per ridurre la complessità del proteoma funzionale reversibile da piccola molecola-proteina seguiti da foto-reticolazione e purificazione. Qui si usa un composto di cattura con
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Sintesi Di S-adenosil-L-omocisteina Catturare Composti Per L'isolamento Selettivo Fotoindotti Di Methyltransferases
Comprendere l'interazione delle proteine cellulari diverse e i loro substrati è di maggiore interesse in epoca postgenomic. Per questo scopo, isolamento selettivo e l'identificazione di proteine da campioni biologici complessi è necessario e mirato l'isolamento delle famiglie di enzima è un compito impegnativo. Negli ultimi anni, metodi come proteina basata su attività di profilatura (ABPP) e spettrometria di massa composto cattura (CCMS) sono stati sviluppati per ridurre la complessità del proteoma mediante la funzione della proteina in contrasto con gli approcci standard, che utilizzano le differenze nelle proprietà fisiche per la separazione di proteine. Per isolare e identificare il subproteome consistente di S-adenosil-L-metionina (SAM o AdoMet)-dipendente methyltransferases (methylome), abbiamo sviluppato e sintetizzato trifunzionale cattura composti contenenti il prodotto chimicamente stabile cofattore S-adenosil-L-omocisteina (SAH o AdoHcy) come funzione di selettività. Analoghi SAH con amino linkers alle posizioni N6 o C8 sono stati sintetizzati e associate a ponteggi contenenti gruppi diversi photocrosslinking per modifica covalente proteine e biotina per isolamento di affinità. L'utilità di questi composti di cattura SAH per isolamento della proteina fotoindotti selettiva è dimostrata per i methyltransferases vari (MTases) che agiscono sul DNA, RNA e proteine, nonché con lysate delle Escherichia coli. Inoltre, può essere utilizzati per determinare le costanti di dissociazione per complessi MTase-cofattore.
Profilatura Di Methyltransferases E Altre Proteine S-adenosil-L-omocisteina-associazione Di Catturare Compound Spettrometria Di Massa
C'è una varietà di approcci per ridurre la complessità del proteoma in base alle interazioni della piccola molecola-proteina funzionale. Descriviamo un approccio generico basato su trifunzionale composti Capture, in cui l'interazione iniziale basata sull'equilibrio tra le proteine di sonda e bersaglio una piccola molecola è irreversibilmente fissato su foto-reticolazione tra una funzione indipendente foto-attivabile reattività di catturare Compound e la superficie delle proteine bersaglio. Successivamente, composto di cattura - proteine coniugate sono isolate dalle miscele biologiche complesse tramite la funzione di ordinamento di catturare Compound. Qui, descriviamo l'applicazione di un trifunzionale catturare composto che trasporta l'inibitore di prodotto metiltransferasi S-adenosil-L - omocisteina come la funzione di selettività per l'isolamento di methyltransferases da un complesso lysate di Escherichia coli cellule DH5α. Foto-attivata la reticolazione migliora il rendimento e la sensibilità dell'esperimento, e la specificità può essere facilmente testata per in esperimenti di concorrenza utilizzando un eccesso di S-adenosil-L - omocisteina libera.
