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Articles by Gil Levkowitz in JoVE
JoVE General
Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres
Molecular Cell Biology, Weizmann Institute of Science
Microscopie multiphotonique permet de contrôler les photons de basse énergie avec une pénétration profonde et optiques phototoxicité réduite. Nous décrivons l'utilisation de cette technologie pour l'étiquetage de cellules vivantes dans des embryons de poissons zèbres. Ce protocole peut être facilement adapté à la photo-induction de diverses molécules lumière réactive.
Other articles by Gil Levkowitz on PubMed
Zinc Finger Protein Trop Peu De Contrôles Pour Le Développement Des Neurones Monoaminergiques
Le mécanisme de contrôle du développement des dopaminergiques (DA) et sérotoninergiques (5HT) neurones chez les vertébrés n'est pas bien comprise. Ici nous avons caractérisé un mutant poisson-zèbre - trop peu (tof) - qui se développe 5HT rhombencéphale et les neurones noradrénergiques, mais ne développe pas l'hypothalamus et les neurones DA 5HT. tof code pour un répresseur du cerveau antérieur-doigt de zinc de transcription spécifique qui est homologue à l'Fezl mammifère (prosencéphale de zinc en forme de doigt embryonnaire protéine). Analyses Mosaic et co-marquage a montré que fezl n'a pas été exprimé dans les neurones DA ou 5HT et au lieu contrôlé le développement de ces neurones non-cellule-autonome. La fois le motif eh1 liée répresseur et le domaine de zinc second doigt étaient nécessaires pour la fonction de tof. Nos résultats indiquent que tof / fezl est un élément clé dans la régulation du développement des neurones monoaminergiques dans le cerveau des vertébrés.
L'immunothérapie Passive Amyloïde Efface Amyloïde Et Active Transitoirement Microglies Dans Un Modèle De Souris Transgénique Des Dépôts Amyloïdes
Le rôle de la microglie dans l'élimination des dépôts amyloïdes après administrés par voie systémique anticorps anti-Abêta reste incertaine. Dans l'étude actuelle, nous avons injecté des souris transgéniques APP Tg2576 hebdomadaires avec un anticorps anti-Abêta pour 1, 2 ou 3 mois de telle sorte que toutes les souris étaient de 22 mois à la fin de l'étude. Chez les souris immunisées pendant 3 mois, nous avons trouvé une amélioration des performances alternance dans le labyrinthe en Y. Histologiquement, nous étions en mesure de détecter la souris IgG liée aux dépôts amyloïdes congophile dans ces souris traitées avec l'anticorps anti-Abêta, mais pas chez ceux traités avec un anticorps de contrôle. Nous avons constaté que l'expression du récepteur Fcgamma sur la microglie a été augmenté après 1 mois de traitement, alors que CD45 a été augmenté après 2 mois de traitement. Associé à ces changements microgliales a été une réduction des dépôts amyloïdes à la fois diffus et compact après 2 mois de traitement. Fait intéressant, les marqueurs microglies ont été réduits pour contrôler les niveaux après 3 mois de traitement, alors que les niveaux d'amyloïdes est restée réduite. Les taux sériques de Abeta et les niveaux d'anticorps anti-Abêta ont été élevés à des niveaux similaires à tous les trois temps de survie chez les souris traitées anti-Abêta injections plutôt que des injections d'anticorps de contrôle. Ces données montrent que l'anticorps est capable de pénétrer dans le cerveau et se lient à des dépôts amyloïdes, susceptibles opsonisation l'Abeta et résultant en Fcgamma médiée par le récepteur phagocytose. En collaboration avec nos travaux antérieurs, nos données font valoir que tous les mécanismes proposés de anti-Abêta amyloïde élimination médiée par les anticorps peuvent être actifs simultanément.
Spécification Des Neurones Hypothalamiques Par Le Règlement De La Double Orthopédie Protéine à Homéodomaine
Dans l'élaboration de l'hypothalamus, une variété de neurones sont générés de façon mutuellement adjacente dans un procédé hautement coordonnée, mais mal connu. Une question cruciale qui reste sans réponse est de savoir comment le développement coordonné de plusieurs types de neurones est atteint dans cette région relativement étroite anatomique. Nous nous concentrons sur dopaminergique (DA) et oxytocinergic (OT) des neurones comme un paradigme pour le développement de deux types de cellules hypothalamiques éminents. Nous avons constaté que le développement de la DA et OT-comme les neurones dans le poisson-zèbre est orchestrée par deux nouvelles voies qui régulent l'expression de la protéine homéodomaine contenant orthopédie (OTP), un facteur clé de différenciation neurale hypothalamique. L'analyse génétique a montré que le récepteur PAC1 G-couplé à la protéine et le doigt de zinc contenant du facteur de transcription Fezl acte amont à ANP. In vivo et des expériences in vitro ont démontré que Fezl et PAC1 réguler Otp à la transcription et les niveaux post-transcriptionnels, respectivement. Nos données révèlent un nouveau réseau génétique qui contrôle la spécification des neurones hypothalamiques chez les vertébrés, et Otp endroits comme un facteur déterminant qui sous-tend la différenciation Fezl et PAC1-médiation.
Dopaminergique Taille De Cluster Neuronale Est Déterminé Au Cours De Modélisation Du Cerveau Antérieur Précoce
Nous avons exploré les effets de robustes neuronaux signaux de structuration des plaques, comme voie de signalisation Wnt canonique, sur la différenciation et la configuration des sous-types de neurones dans le diencéphale poisson-zèbre à une seule cellule de résolution. Étonnamment, la perturbation de la signalisation Wnt n'a pas eu d'effet global sur la spécification des destins diencéphaliques, mais de manière sélective le nombre de touchés dopaminergiques (DA) des neurones. Nous avons identifié la zone ancêtre de DA dans l'ébauche diencéphalique de la plaque neurale en utilisant une méthode uncaging à deux photons à base et a montré que le nombre de non-DA neurones dérivés de cette zone géniteur n'est pas altérée par l'atténuation Wnt. En utilisant l'analyse birthdating, nous avons déterminé le calendrier de la division cellulaire des progéniteurs dernière DA et a révélé que le changement du nombre de cellules DA suite à l'inhibition Wnt n'est pas due à des changements dans la cinétique du cycle cellulaire de sortie. L'inhibition conditionnelle de Wnt et de la prolifération cellulaire a démontré que Wnt limite le nombre de progéniteurs DA pendant une fenêtre de la plasticité, qui se produit à la neurogenèse primaire. Enfin, nous avons démontré que Wnt8b est un modulateur du nombre de cellules DA qui agit par l'intermédiaire du Fz8a (Fzd8a) récepteur et son aval LEF1 effecteur, et qui nécessite l'activité du facteur de transcription Fezl (Fezf2) pour ce processus. Nos données montrent que la réponse différentielle des différentes populations neuronales au signal Wnt n'est pas une simple interprétation de leur position antéro-postérieure relative. Cette étude montre également, pour la première fois, que la taille de la population diencéphalique DA est modulé à l'intérieur de la plaque neurale beaucoup plus tôt que prévu, concomitante avec Wnt-médiées par les événements de structuration régionales.
Nasale Embryonnaire LHRH Facteur Joue Un Rôle Dans La Migration Du Développement Et De Projection De La Gonadolibérine 3 Neurones Chez Le Poisson Zèbre
L'initiation de la puberté et le fonctionnement du système reproducteur dépendent le bon développement du hypophysiotropic hormone libérant la gonadotropine (GnRH) du système. Une étape cruciale dans ce processus est la migration embryonnaire des neurones à GnRH de la zone olfactive à l'hypothalamus. L'utilisation d'un modèle de poisson zèbre transgénique, Tg (gnrh3: EGFP), dans lequel GnRH3 neurones et les axones sont marqués par fluorescence, nous avons examiné si le poisson-zèbre NELF est essentiel pour le développement de GnRH3 neurones. Le poisson-zèbre NELF ADNc a été cloné et caractérisé. Pendant le développement embryonnaire, NELF est exprimée en GnRH3 neurones et dans les sites cibles de GnRH3 projections et péricaryon, avant le début de leur migration. Knockdown NELF a entraîné une perturbation du système GnRH3 qui comprenait absence ou trompeur de la croissance axonale et GnRH3 la migration incorrecte ou arrêtés de GnRH3 péricaryon. Ces résultats suggèrent que NELF est un facteur important dans la migration de développement et de la projection de GnRH3 neurones chez le poisson zèbre.
Protéines Neural Olig2 Agit En Amont De L'Sim1 Régulateur Transcriptionnel Pour Spécifier Diencéphaliques Neurones Dopaminergiques
Facteurs neuronaux sont exprimés dans les progéniteurs neuronaux et de réglementer la neurogenèse et la gliogénèse. Des études récentes ont suggéré que ces facteurs sont également impliqués dans la détermination spécifiques destins neuronales en régulant l'expression de leurs gènes cibles, créant ainsi les codes de transcription pour la spécification de sous-type neuronal. Dans la présente étude, nous montrons que dans le poisson-zèbre le gène Olig2 de neurones et les Sim1 régulateur transcriptionnel sont co-exprimés dans un sous-ensemble des progéniteurs diencéphaliques destinés vers la dopaminergique (DA) sort neuronale. Alors que SIM1 ARNm est également détectée dans les neurones dopaminergiques matures, l'expression de Olig2 est éteint avant à la borne DA différenciation. La perte de fonction soit de Olig2 ou Sim1 conduit à DA de développement avec facultés affaiblies. Enfin, Olig2 régule l'expression de Sim1 et le gain de la fonction de Sim1 sauve les déficits dans la différenciation DA causés par effet de choc ciblée de Olig2. Nos résultats démontrent pour la première fois que l'engagement des neurones dopaminergiques diencéphaliques basales est réglementée par l'action combinée de la protéine neuronale Olig2 et son aval neuronale Sim1 effectrice spécifique.
Haute Résolution Plan Destin Du Diencéphale Poisson Zèbre
Le diencéphale agit comme un site interactif entre les systèmes sensoriels, centrale, et le système endocrinien et est l'une des structures les plus élaborées dans le cerveau des vertébrés. Pour mieux comprendre le développement embryonnaire et la morphogenèse du diencéphale, nous avons développé une photoactivation améliorée (uncaging)-basée lignée traçage stratégie. Pour déterminer la position exacte d'un domaine progéniteur diencéphalique donné, nous avons utilisé une lignée transgénique de conduire la protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules exprimant la protéine proneural, Neurogenin1 (Neurog1), qui a été utilisé comme un point de repère visible de la plaque neurale. Cette méthode facilitée étiquetage précise de groupes définis de cellules dans le diencéphale potentiel de la plaque de poisson-zèbre neuronal. De cette manière, nous avons appelé plusieurs zones de chevauchement de la diencéphale, assurant ainsi l'exactitude et la reproductibilité de notre lignée de traçage quelles que soient les changements dynamiques de la plaque neurale en développement. Nous présentons une carte sort du diencéphale le poisson-zèbre à une résolution spatiale plus élevée que précédemment décrit.
Cxcl12a-Cxcr4b Signalisation Est Importante Pour Le Bon Développement Du Système GnRH Du Cerveau Antérieur Chez Le Poisson Zèbre
Hypothalamo hormone libérant la gonadotropine (GnRH) neurones contrôler la sécrétion de gonadotrophine pituitaire et de la gamétogenèse. Au cours du développement, ces neurones migrent de la placode olfactive à l'hypothalamus. Le mécanisme moléculaire précis de cette migration neuronale n'est pas claire. Ici, nous avons examiné si le récepteur de chimiokine, Cxcr4b, et son ligand analogue, Cxcl12a, sont nécessaires pour la migration correcte des neurones chez le poisson zèbre GnRH3. Déviés GnRH3 projections axonales et de la migration neuronale ont été détectés chez des larves qui portent une mutation homozygote cxcr4b. De même, knockdown de Cxcr4b ou Cxcl12a conduit à l'apparition d'anomalies GnRH3 projections axonales et la migration cellulaire, y compris l'absence de la traversée caractéristique latérale de GnRH3 axones à la commissure antérieure et chiasma optique. Double-étiquetage analyse a montré que cxcr4b et cxcl12a sont exprimés le long de la voie de migration GnRH3 (c.-à-placode olfactive, le nerf terminal et le chiasma optique). Les résultats de cette étude suggèrent que le Cxcl12a-Cxcr4b ligand-récepteur paire sont impliqués dans la migration des neurones chez le poisson zèbre GnRH3, et sont donc essentiels pour le développement de ce système.
Développement De L'hypothalamus Poisson Zèbre
Neurones hypothalamiques réguler les fonctions corporelles fondamentales, y compris le sommeil, la pression artérielle, la température, la faim et le métabolisme, la soif et la satiété, le stress et le comportement social. Ceci est réalisé au moyen de la sécrétion de différents neuropeptides hypothalamiques et les neurotransmetteurs qui affectent endocrinien, métabolique, et les activités de comportement. Troubles développementaux de l'hypothalamus circuits neuronaux sont associés à des troubles neurologiques qui perturbent à la fois l'homéostasie physiologique et psychologique. La spécification des cellules de l'hypothalamus et morphogenèse peut être étudiée uniquement chez le poisson zèbre, un organisme vertébré prête facilement à des manipulations génétiques. Comme les embryons sont optiquement transparent et de développer à l'extérieur, ils fournissent un outil puissant pour les analyses in vivo de neurones et de leurs circuits. Ici, nous discutons les connaissances actuelles sur la neuroanatomie de l'hypothalamus du poisson zèbre et des études récentes l'identification des déterminants essentiels de différenciation hypothalamique. Pris ensemble, ces rapports démontrent que les voies moléculaires qui sous-tendent le développement de l'hypothalamus sont en grande partie conservée entre le poisson-zèbre et les mammifères. Nous concluons que le poisson-zèbre s'est révélée un modèle vertébré utile pour comprendre la structuration, la spécification, la morphogenèse, et la fonction ultérieure de l'hypothalamus.
Visualisation De L'expression Des ARNm Dans Les Embryons De Poissons Zèbres
Examen de la structure du gène expression spatiale et temporelle est une étape clé vers la compréhension de la fonction des gènes. Par conséquent, l'hybridation in situ de l'ARNm est l'une des techniques utilisées, les plus puissants et largement en biologie. Les progrès récents permettent la détection fiable et simultanée de transcrits d'ARNm, ou des combinaisons de l'ARNm et de protéines, chez le poisson zèbre embryos.Here nous décrivons un protocole standard pour la visualisation du profil d'expression précise d'un seul transcrit ou de produits de gènes multiples. La procédure de fixation et perméabilisation emploie des embryons, suivie d'une hybridation avec ribosondes antisens marqués. Sondes en excès sont ensuite lavées et hybrides sont détectés par l'intermédiaire d'enzyme immunohistochimie en utilisant soit des substrats chromogènes ou fluorescents.
Le Neuropeptide Hypothalamique L'ocytocine Est Nécessaire à La Formation De L'interface Neurovasculaire De L'hypophyse
Le système hypothalamo-neurohypophysaire (HNS) est la structure neurovasculaire à travers lequel les neuropeptides hypothalamiques ocytocine et l'arginine-vasopressine sortie du cerveau dans la circulation sanguine, où ils vont à affecter la physiologie périphérique. Ici, nous étudions les signaux moléculaires qui régulent le contact entre les axones hypothalamiques neurovasculaire et neurohypophysaire capillaires du poisson zèbre. Nous avons développé un système transgénique dans laquelle les deux axones hypothalamiques et le système vasculaire neurohypophysaire peut être analysée in vivo. Nous avons identifié l'organisation cellulaire des HNS poisson zèbre, ainsi que les processus dynamiques qui contribuent à la formation de l'interface neurovasculaire HNS. Nous montrons que la formation de cette interface est régulée au cours du développement par la libération locale de l'ocytocine, qui affecte la morphogenèse endothéliale. Ce processus de communication cellulaire est essentielle pour la mise en place d'une interface étanche axovasal entre les neurones et les vaisseaux sanguins de la Convention HNS. Nous présentons un exemple unique d'axones qui affectent la morphogenèse endothéliale par la sécrétion d'un neuropeptide.
Le Régulateur Métabolique PGC-1α Directement Contrôle L'expression De L'axe Hypothalamo Ocytocine Neuropeptide
La transcription coactivateur PGC-1α est un régulateur clé de la dépense énergétique cellulaire dans les tissus périphériques. Des études récentes indiquent que PGC-1α-souris nulles pour développer l'obésité à début tardif et que l'inactivation des neurones de PGC-1alpha provoque une augmentation de l'apport alimentaire. Cependant, le rôle exact de PGC-1α dans le SNC n'est pas clair. Ici, nous montrons que les PGC-1α régule directement l'expression de l'axe hypothalamo ocytocine, un neuropeptide, un régulateur central de l'appétit connue. Nous avons développé une approche génétique unique dans le poisson zèbre, nous permettant de surveiller et de manipuler PGC-1α activité dans les neurones oxytocinergic. Nous avons constaté que PGC-1α est co-exprimé avec l'ocytocine dans l'hypothalamus du poisson zèbre. Knockdown ciblée de l'activité du gène PGC-poisson-zèbre 1α a entraîné une diminution marquée des taux d'ARNm d'ocytocine et inhibé l'expression d'un rapporteur GFP transgénique dirigé par le promoteur d'ocytocine. L'effet de PGC-1α perte de fonction sur l'activité des gènes d'ocytocine a été secouru par tissu-spécifique ré-expression de PGC-soit précurseur 1α ou l'ocytocine dans les neurones oxytocinergic poisson-zèbre. PGC-1α activé le promoteur d'ocytocine dans un système de culture cellulaire hétérologue, et la surexpression de PGC-1α induite par l'expression ectopique de l'ocytocine dans les muscles et les neurones. Formes Enfin, PGC-1alpha une dans le complexe in vivo avec le promoteur, mais l'ocytocine dans nourris pas jeûné animaux. Ces résultats démontrent que PGC-1α est à la fois nécessaire et suffisante pour la production d'ocytocine, impliquant l'hypothalamus PGC-1α dans l'activation directe d'une hormone hypothalamique connue pour contrôler l'apport énergétique.
Otp Protéine à Homéodomaine Et De L'activité-dépendante épissure Module Adaptation Neuronale Au Stress
Règlement de la corticotropine-releasing hormone (CRH) l'activité est critique pour l'adaptation de l'animal à des défis de stress, et sa dérégulation est associée à des troubles psychiatriques chez les humains. Cependant, le mécanisme moléculaire qui sous-tend cette réponse transcriptionnelle au stress n'est pas bien comprise. Utilisation de paradigmes différents stress chez la souris et le poisson zèbre, nous montrons que la transcription hypothalamique orthopédie facteur module l'expression de la CRH, ainsi que le facteur d'épissage ataxine 2-Binding Protein-1 (A2BP1/Rbfox-1). Nous montrons en outre que le récepteur couplé aux protéines G PAC1, qui est une cible connue A2BP1/Rbfox-1 épissage et un médiateur important de l'activité CRH, est un épissage alternatif en réponse à un défi stressant. La génération de PAC1-hop isoforme ARN messager par l'épissage alternatif est requis pour la résiliation de la transcription CRH, l'activation normale de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien et adaptative anxiété comme comportement. Notre étude identifie une voie évolutionnaire conservé biochimique qui module l'adaptation neuronale au stress grâce à l'activation de la transcription et l'épissage alternatif.
