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Articles by Haitang Li in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope, 3Shared Resource-DNA/RNA Peptide, Beckman Research Institute of City of Hope
Diversi 2'-Fluoro aptameri contro l'HIV-RNA 1BA-L gp120 con nanomole affinità sono isolati da una libreria di RNA
Other articles by Haitang Li on PubMed
Espressione Del Piccolo RNAs D'interferenza Mirati Contro Le Trascrizioni Rev HIV-1 Nelle Cellule Umane
Interferenza del RNA (RNAi) è il processo di silenziamento genico sequenza-specifico, posttranscriptional in animali e piante iniziate da double-stranded (ds) RNA che è omologo al gene silenziato. Questa tecnologia ha coinvolto solitamente iniezione o la transfezione di dsRNA in nonvertebrate organismi modello. Il più lungo RNAds vengono trasformate in breve (19 25 nucleotidi) piccolo RNAs d'interferenza (siRNAs) da un complesso proteico ribonucleotide che include una RNAsi III correlati nucleasi (Dicer), un membro della famiglia elicasi e possibilmente una chinasi e una RNA polimerasi di RNA-dipendente (RdRP). Nelle cellule dei mammiferi è noto che dsRNA 30 coppie di base o più può innescare risposte di interferone che sono intrinsecamente sequenza-aspecifici, limitando così l'applicazione di RNAi come agente terapeutico e sperimentale. Duplex del siRNA di 21-nucleotide con breve 3' strapiombi, tuttavia, possono mediare RNAi in modo sequenza specifico in cellule di mammifero coltivate. Una limitazione nell'uso del siRNA come reagente terapeutico in vertebrati cellule è che RNAs corto, altamente definita devono essere trasportato alle cellule bersaglio - una prodezza finora compiuta soltanto tramite l'uso del sintetico, duplex RNAs esogenicamente trasportato alle cellule. In questo rapporto, descriviamo un mammifero sistema promotore Pol III capace di esprimere funzionale double-stranded siRNAs dopo trasfezione in cellule umane. Nel caso le 293 cellule cotransfected con il DNA proviral pNL4-3 di HIV-1 e i costrutti di siRNA-produzione, siamo stati in grado di raggiungere fino a 4 registri di inibizione dell'espressione dal DNA dell'HIV-1.
SiRNA Funzionale Espressione Da Transfected Prodotti Di PCR
Interferenza del RNA (RNAi) è un processo in cui il RNA double-stranded (dsRNA) induce la degradazione di postranscriptional di trascrizioni omologhe. RNAi può essere avviata da esponendo le cellule a dsRNA via transfezione o espressione endogena. Nei sistemi dei mammiferi, la sequenza-specifico RNAi effetto è stato osservato dall'espressione delle trascrizioni base 21-23 in grado di formare duplex, o tramite espressione di short hairpin RNAs. Descriviamo qui una strategia facile PCR basata per la rapida sintesi di siRNA espressione unità e le loro prove in cellule di mammifero. I costrutti di espressione siRNA sono costruiti mediante PCR, e i prodotti di PCR sono direttamente transfected nelle cellule di mammiferi con conseguente espressione funzionale del siRNA. Questo approccio dovrebbe rivelarsi utile per l'identificazione delle combinazioni di siRNA-destinazione ottimale e per multiplexing siRNA espressione in cellule di mammifero.
Piccolo RNAs D'interferenza Espressa Da Un Promotore Pol III Sopprimere La Trascrizione EWS/Fli-1 in Una Linea Di Cellule Sarcoma Di Ewing
Il gene di fusione EWS/Fli-1 codifica per una proteina di fusione oncogenica. La fusione è un prodotto della traslocazione t(11;22) (q24; q12), che viene rilevato nell'85% del sarcoma di Ewing e primitivi Neuroectodermici cellule tumorali. Utilizzando intracellularly espresso 21-23 nucleotidi piccolo RNAs d'interferenza (siRNAs) targeting della trascrizione di fusione EWS/Fli-1 in una linea di cellule sarcoma di Ewing, abbiamo raggiunto una maggiore riduzione del 80% nella trascrizione EWS/Fli-1. La riduzione dei livelli di trascrizione è stata accompagnata da inibizione della crescita di una linea cellulare di Ewing. Oltre alla quantificazione della riduzione della trascrizione di fusione, abbiamo attentamente monitorato riduzione di endogeno EWS e Fli-1 mRNAs pure. Uno dei due siRNAs mirati per la trascrizione di fusione anche parzialmente downregolata Fli-1 mRNA, ulteriormente POTENZIANTI l'inibizione della crescita. Questi risultati evidenziano sia la potenza di siRNA e le potenziali reazioni collaterali che devono essere attentamente monitorati. Inoltre, questi risultati forniscono la prima dimostrazione di siRNA espresso riducono una trascrizione di fusione oncogenica. I risultati e le osservazioni da questi studi, devono risultare utile nel targeting altra caratteristica di trascrizioni di fusione dei sarcomi ed erythroleukemias.
Amplificazione Di RNAi - Targeting HLA MRNAs
Posttranscriptional soppressione dell'espressione del gene può essere ottenuto dall'introduzione delle doppiette di (si) RNA interferenti piccole sequenza-specifici e da de novo la sintesi intracellulare di breve sequenza-specifico double-stranded RNA. Tuttavia, raggiungere i livelli desiderati di atterramento è un ostacolo alla riuscita applicazione analitica e terapeutica. Dimostriamo che crescente espressione di introdotto short hairpin RNA (shRNA) può notevolmente migliorare la interferenza del RNA (RNAi) e che questo approccio può essere utilizzato per ottenere massima destinazione down-regulation, quando la scelta dei siti di siRNA-associazione ottimale è limitata o quando geni multipli simultaneamente sono mirati e sta limitando la quantità di siRNA. Un effetto di RNAi dose-dipendente è stato compiuto ponendo copie di shRNA sotto il controllo del promotore di RNA nucleare piccolo Pol III U6 in tandem in un vettore di DNA. Utilizzando questo sistema, abbiamo raggiunto simultanea down-regulation dell'espressione del classico umani antigene del leucocita (HLA) di classe I geni in colture e primarie T cellule umane, che potrebbero essere applicate per aiutare aggirare T-cell-mediated rifiuto del allograft immunogenica e/o HLA-disparati.
Metilazione Short Hairpin RNA-diretto Citosina (CpG) Del Promotore Del Gene RASSF1A in Cellule HeLa
La metilazione di cytosines in motivi CpG è un importante meccanismo per la regolazione epigenetica dell'espressione genica in cellule di mammifero. Gli eventi di avvio per de novo metilazione nelle cellule dei mammiferi, in particolare nel cancro, sono sconosciuto. Nelle piante, breve RNAs omologhe alle sequenze del DNA sono noti per avviare de novo metilazione. Per indagare se short hairpin RNAs (shRNAs) può anche fungere da iniziatori per de novo metilazione nelle cellule umane abbiamo espresso short hairpin RNAs complementari all'isola CpG compreso il promotore e primi regioni trascritti del gene umano RASSF1A. RASSF1A codifica un soppressore tumorale putativo che è hypermethylated in una varietà di tumori umani, considerando che in alcune linee cellulari umane, come ad esempio HeLa, RASSF1A è transcriptionally active e non metilato. Dimostriamo che shRNAs complementari al promotore di RASSF1A o prime regioni trascritti può dirigere bassi livelli di metilazione del DNA di de novo e silenziamento genico parziale in cellule HeLa. Al contrario, un shRNA harboring quattro disadattamento centrale con l'obiettivo non può dirigere tale metilazione. I risultati presentati suggeriscono provocatori possibili meccanismi per silenziamento genico transcriptional tramite metilazione del DNA nelle cellule tumorali.
Espressione Stabile Di ShRNAs in Cellule Umane CD34 + Progenitore Può Evitare Di Induzione Di Risposte Di Interferone a SiRNA in Vitro
Interferenza del RNA si verifica quando citoplasmatica piccolo RNAs d'interferenza (siRNAs) immettere il RNA-induced silencing complex e un filo guida clivaggio del target RNA dalla proteina Argonaute 2. Una preoccupazione significativa quando applicando siRNA o esprimendo tornante piccolo RNAs (shRNAs) nelle cellule umane è l'attivazione della risposta di interferone (IFN). SiRNA sintetici harboring determinati motivi possono indurre una risposta immunitaria quando consegnato al mouse e cellule immunitarie umane come cellule mononucleate di sangue periferico, monociti, plasmacytoid le cellule dendritiche (pDCs) e nonplasmacytoid dendritiche cells (MDC). Nel presente studio abbiamo testato gli effetti immunostimolante del lipido-consegnato siRNAs versus Pol III promotore-espresso shRNAs in primarie CD34 + progenitrici ematopoietiche cellule derivate. Mostriamo che in questo sistema, lipido-consegnato siRNAs sono potenti induttori di IFNalpha ed espressione del gene IFN di tipo I, considerando che le stesse sequenze quando espresso in modo endogeno sono nonimmunostimulatory.
RNAi in Combinazione Con Un Ribozima E Richiamo Di Catrame Per Il Trattamento Dell'infezione Da HIV in Terapia Genica Delle Cellule Ematopoietiche
Combinatoriale terapie per il trattamento dell'infezione da HIV hanno cambiato il corso dell'epidemia di AIDS nei paesi sviluppati, dove la combinazioni di farmaci antivirali sono prontamente disponibili. Nonostante questo progresso, ci sono molti problemi associati alla chemioterapia per AIDS tra cui tossicità e comparsa di mutanti virali resistenti ai farmaci. Il nostro obiettivo è stato lo sviluppo di un trattamento di terapia genica ematopoietiche per l'infezione da HIV. Come la chemioterapia, terapia genica per il trattamento dell'infezione da HIV deve essere utilizzata combinatoriamente. Così abbiamo combinato tre diversi geni inibitori per il trattamento dell'infezione da HIV in una spina dorsale singolo vettore lentivirale. Gli agenti inibitori impegnano RNAi attraverso una short hairpin RNA targeting HIV mRNAs tat/rev, un richiamo di localizzazione nucleolare che lega e sequestra la proteina Tat di HIV, e un ribozima che fende e sottoregola la CCR5 chemokine receptor utilizzata dall'HIV per cellulare entry. Questa tripla combinazione ha dimostrato di essere altamente efficace per inibire la replicazione di HIV in cellule ematopoietiche primarie ed è attualmente in pista per applicazione clinica umana.
Consegna Combinatoria Di Small Interfering RNAs Riduce Efficacia RNAi Per Incorporazione Selettiva in RISC
Nonostante il grande potenziale di RNAi, espressione ectopica di shRNA o siRNAs detiene il rischio intrinseco della concorrenza per componenti critici di RNAi, alterando così le funzioni di regolamentazione di alcuni cellulari microRNA. Inoltre, specifici siRNA sequenze potenzialmente possono ostacolare l'incorporazione di altri siRNA quando viene utilizzato un approccio combinatorio. Mostriamo che sia siRNA sintetici espressi shRNAs competere contro gli altri e con i microRNA endogeno per trasporto e per incorporazione nel RNA induced silencing complex (RISC). Le stesse sequenze di siRNA non visualizzare concorrenza quando espresso da una dorsale di microRNA. Mostriamo anche che TAR RNA binding protein (TRBP) è uno dei sensori per la selezione e l'incorporazione della sequenza guida della RNAs d'interferenza. Questi risultati rivelano che approcci combinatori siRNA possono essere problematica e hanno importanti implicazioni per la metodologia di espressione e l'uso di RNA interferenti terapeutico.
La Clonazione E Il Rilevamento Di MicroRNA Firma Dalle Cellule Di Mammiferi
MicroRNA (miRNAs) è circa 19 - a 24-nucleotidi lungo non codificante normativo piccolo RNAs che poteva tacere espressione genica tramite accoppiamento base alle sequenze complementari della regione 3' non tradotte (3'UTR) dei geni bersaglio. Essi sono evolutivamente conservati e svolgono un ruolo importante regolamentare in embriogenesi, proliferazione e differenziazione delle cellule. Sono anche coinvolti nella patogenesi e progressione di alcune malattie umane. Ci sono circa 1000 miRNAs umano previsto oggi, e si stima che essi potevano target circa il 30% di tutte le trascrizioni umane. Profilatura miRNAs che sono espressi nelle cellule sperimentale, è diventato una questione importante come miRNAs firma esprimono diverse celle diverse o express i miRNAs stesso a diverso livello. Piccoli RNA clonazione è un modo affidabile per caratterizzare i miRNAs firma specifici tessuti o cellule. Questo capitolo descrive un relativamente nonlaborious mediata poliadenilazione DNA complementare (cDNA) clonazione metodo che identificherà la maggior parte di piccolo RNAs espressa nelle cellule di interesse. Questa procedura può anche essere utilizzata per verificare predizioni bioinformatiche di miRNAs/small interfering RNA (siRNA) da identificare nuovi miRNAs/siRNA.
Espressione Del Tornante Lungo Anti-HIV-1 RNA Per La Generazione Di Più SiRNA: Vantaggi E Limiti
Promotore espresso lungo-hairpin RNAs (lhRNAs) che possono essere trasformati in più piccolo RNA interferente (siRNA) sono essere considerati come agenti efficaci per trattare rapidamente la mutazione di virus come il virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Nel presente studio, hanno generato umano U6 promotore-driven lhRNAs 50, 53 e 80 paia di basi (bp) sequenze contigue all'interno di tat di targeting e rev geni di HIV-1 e valutato l'efficacia di queste lhRNAs, come pure la loro trasformazione in cellule. Utilizzando molteplici incongruenze G:U in fusti, siamo stati in grado di integrare facilmente le strutture lungo tornanti in un sistema di trasduzione del vettore lentivirale. Qui vi mostriamo che tali tornanti lunghi possono essere stabile e funzionale espresso per un lungo periodo in cellule T suscettibili di HIV-1, dove forniscono potente inibizione della replicazione di HIV contro mutanti e non mutanti varianti di HIV-1. I nostri studi forniscono supporto forte per l'uso della G:U oscillare coppia contenente lhRNAs per generare i siRNAs multipli da una singola trascrizione, ma ci mostrano anche che lhRNAs di 80 bp può essere il limite di dimensione superiore per produrre efficacemente multiplo, siRNA funzionali.
Uso Di Un U16 Contenenti SnoRNA Ribozima Libreria Per Identificare Gli Obiettivi Ribozima in HIV-1
Hammerhead ribozimi hanno dimostrati di silenzio 1 virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1) espressione del gene di clivaggio site-specific di mRNA virale. I due fattori principali che determinano se i ribozimi sarà efficaci per il silenziamento genico sono presenza il ribozima e RNAs il bersaglio e la scelta di un sito di destinazione appropriato su mRNA. Una strategia di screening efficace per potenziali bersagli sul genoma virale è l'uso di librerie di ribozima nella coltura delle cellule. Capitalizzando i risultati precedenti che HIV-1 e i ribozimi possono essere colocalized nel nucleolo, abbiamo creato una libreria di ribozima hammerhead romanzo inserendo hammerhead ribozimi con steli completamente randomizzati 1 e 2 nel corpo di U16 small nucleolar RNA (snoRNA). Dopo tre turni di cotransfection con un HIV-1 DNA proviral harboring l'herpes simplex virus timidina chinasi (HSV-TK) gene, abbiamo selezionato per le cellule resistenti alle gancyclovir e identificato una ribozima sequenza che potrebbe potenzialmente bersaglio i geni U5 e gag di HIV-1 regioni del genoma di HIV-1 mediante parziale omologie con questi obiettivi. Quando i ribozimi sono stati convertiti in piena complementarità con gli obiettivi, hanno fornito la potente inibizione della replicazione di HIV-1 in coltura cellulare. Questi risultati forniscono un approccio innovativo per l'identificazione di bersagli ribozima in HIV-1.
Romanzo Doppia Funzione Inibitoria Aptamer-siRNA Delivery System Per La Terapia Dell'HIV-1
Uso riuscito di piccolo RNAs d'interferenza (siRNAs) per scopi terapeutici richiede la consegna sicura ed efficiente a specifiche cellule e tessuti. In questo studio dimostriamo consegna tipo-specifiche delle cellule di immunodeficienza anti-virus (HIV) siRNA tramite la fusione di un aptamer anti-gp120. La glicoproteina busta è espresso sulla superficie delle cellule HIV-1-infected, permettendo di associazione e interiorizzazione di aptamer-siRNA molecole chimerici. Dimostriamo che la chimera aptamer-siRNA anti-gp120 specificamente è preso dalle cellule che esprimono gp120 di HIV-1, e che il siRNA accodato elaborato da Dicer; Questo rilascia un anti-tat/rev siRNA che, a sua volta, inibisce la replicazione dell'HIV. Vi mostriamo per la prima volta una doppio funzionamento aptamer-siRNA chimera in cui entrambi i aptamer e le porzioni di siRNA hanno attività potente anti-HIV. Mostriamo anche quello gp120 espressi sulla superficie delle cellule infette da HIV può essere utilizzato per aptamer-mediate consegna di siRNA anti-HIV.
Proprietà Di Localizzazione Intracellulare E Funzionale Di U6 Promotore-espresso SiRNA, ShRNAs E Chimerico VA1 ShRNAs in Cellule Di Mammifero
Sistemi di espressione RNA polimerasi III (Pol III) per short hairpin RNAs (U6 shRNAs o chimerici VA1 shRNAs) o singolarmente espresso senso/antisenso piccoli d'interferenze RNA (siRNA) ciocche sono stati utilizzati per attivare l'interferenza del RNA (RNAi) in cellule di mammifero. Qui vi mostriamo che espressione singolarmente espresso siRNA costruisce produrre 21-nucleotide siRNA che fortemente si accumulano siRNAs come duplex nel nucleo delle cellule umane, esercitare attività silenziamento sequenza-specifiche simili a siRNA citoplasmatici derivata dalla U6 o tornante VA1-espresso precursori. Al contrario, 29-mer siRNAs separatamente espresse come ciocche di senso/antisenso non riescono a suscitare RNAi attività, nonostante l'accumulo di questi RNAs nel nucleo. I nostri risultati delineano modelli diversi di accumulo intracellulare per le strategie di tre espressione e suggeriscono la possibilità di un percorso di RNAi nucleare che richiede duplex 21-mer.
Selezione, Caratterizzazione E Applicazione Del Nuovi RNA HIV Gp 120 Aptameri Per Facile Consegna Della Cubettatrice Substrato SiRNAs in HIV Infetta Le Cellule
La glicoproteina busta del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) è costituito da una glicoproteina esterno (gp120) e un dominio trans-membrana (gp41) e ha un ruolo importante in entrata virale in cellule. Entrata HIV-1 è stato convalidato come una strategia anti-virale clinicamente rilevante per la scoperta della droga. Nel presente lavoro, più 2'-F sostituito RNA aptameri che si legano alla proteina gp120 HIV-1(BaL) con affinità nanomole sono stati isolati da una libreria di RNA dalla procedura SELEX (evoluzione sistematica dei ligandi di arricchimento esponenziale). Da due di questi aptameri abbiamo creato una serie di nuovi doppia funzione inibitoria anti-gp120 aptamer-siRNA chimere. Le chimere aptamer-siRNA e aptameri specificamente legano e vengono interiorizzate in cellule che esprimono l'HIV gp160. La cubettatrice-substrato siRNA consegnato dagli aptameri funzionalmente elaborato da Dicer, con conseguente inibizione specifica della replicazione dell'HIV-1 e l'infettività in CEM T-cellule coltivate e cellule mononucleari del sangue primario (PBMCs). Inoltre, abbiamo introdotto una sequenza 'appiccicosa' su un aptamer chimicamente sintetizzato che facilita l'attaccamento del cubettatrice substrato siRNA per potenziali multiplexing. I nostri risultati forniscono una serie di nuovi agenti inibitori per bloccare la replicazione dell'HIV e convalidare ulteriormente l'utilizzo di aptameri per la consegna della cubettatrice substrato siRNA.
Polimorfismi Dei Geni Umani MiRNA Possono Influenzare Biogenesi E Funzione
MicroRNA (miRNAs) è 21-25-nucleotide-lungo, RNA non codificante che è coinvolti nella regolazione translational. La maggior parte dei miRNAs derivano da un'elaborazione sequenziale in due fasi: la generazione di pre-miRNA da pri-miRNA dal Drosha/DGCR8 complesso nel nucleo e la generazione di mature miRNAs da pre-miRNAs dalla cubettatrice/TRBP complesso nel citoplasma. Variazione di sequenza intorno ai siti di elaborazione e le variazioni di sequenza nel miRNA maturo, soprattutto la sequenza di seme, possono avere influenza profonda su miRNA biogenesi e funzione. Nel contesto di analizzare i ruoli di miRNAs nella schizofrenia e autismo, abbiamo definito almeno 24 varianti di miRNA umana legata al X. Dosaggi funzionali sono stati sviluppati ed eseguite su queste varianti. In questo studio abbiamo indagare gli effetti di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) sulla generazione di miRNAs maturo e la loro funzione e relazione che naturalmente SNPs possono alterare o migliorare miRNA elaborazione così come alterare i siti di elaborazione. Dal momento che i miRNAs sono piccole unità funzionali, singole modifiche base in entrambi gli elementi precursori così come la sequenza di miRNA maturi possono guidare l'evoluzione di microRNA nuova alterando la loro funzione biologica. Infine, i miRNAs esaminati in questo studio sono X-linked, suggerendo che gli alleli mutanti potrebbero essere determinanti nell'eziologia delle malattie.
Contesto Di Sequenza Di Fuori Della Regione Di Destinazione Influenza L'efficacia Dei Siti Di Destinazione MiR-223 in RhoB 3'UTR
MicroRNA (miRNAs) è 21-22 nucleotidi normativo piccolo RNAs che reprimere traduzione messaggio via base-pairing con sequenze complementari della regione 3' non tradotte (3'UTR) del targeting per le trascrizioni. Ad oggi, è ancora difficile trovare un bersaglio vero miRNA dovuta alla mancanza di una chiara comprensione di come miRNAs interagire funzionalmente con loro trascrizioni mirate per la repressione efficiente. Studi precedenti hanno mostrato che 6:58 nucleotidi a 5'-estremità di un miRNA maturo, la sequenza' seme', può nucleano interazioni miRNA/destinazione. Nello studio corrente, noi abbiamo convalidato che il mRNA RhoB è un obiettivo miR-223 bona fide. Abbiamo analizzato l'attività funzionale di due siti di legame di miR223 all'interno del RhoB 3'UTR. Troviamo che i due siti di destinazione miR-223 in RhoB 3'UTR differenzialmente contribuiscono la repressione totale della traduzione RhoB. Inoltre, abbiamo dimostrato che alcuni motivi di AU-rich si trovano a monte del sito distale miRNA-associazione di migliorare la funzione di miRNA, indipendente delle sequenze bersaglio miRNA in fase di test. Dimostriamo anche degli elementi della sequenza AU-rich sono polari che non influenzano le attività dei miRNAs cui siti si trovano a Monte di questi elementi. Questi studi forniscono ulteriore supporto per il ruolo di sequenze di fuori della regione di destinazione miRNA che influenzano la funzione di miRNA.
Design Razionale Dei Micro-RNA-come Bifunzionale SiRNAs Targeting HIV E Il Coreceptor CCR5 Di HIV
Small-interfering RNA (siRNA) e micro-RNA (miRNAs) si distinguono per la loro modalità di azione. SiRNAs servono come guida per la scissione specifica sequenza di mRNA complementari e gli obiettivi possono essere nella codifica o non codificante regioni le trascrizioni di destinazione. MiRNAs inibire traduzione via base-pairing parzialmente complementari a regioni non tradotta 3' (UTRs) e sono generalmente inefficace quando la destinazione è regioni codificanti di una trascrizione. In questo studio, abbiamo deliberatamente progettato siRNA che contemporaneamente diretto clivaggio e traslazionale soppressione di HIV RNA o clivaggio del mRNA codifica il coreceptor CCR5 di HIV e la soppressione della traduzione dell'HIV. Questi siRNAs bifunzionale innescare l'inibizione di replica nella coltura delle cellule e l'infezione da HIV. I principi di progettazione hanno ampie applicazioni in tutto il genoma, come circa il 90% dei geni harbor siti che rendono possibile la progettazione di siRNA bifunzionale.
Terapia Genica Basata Su RNA HIV Con Lentivirali Vector-modificato CD34(+) Cellule Nei Pazienti Sottoposti a Trapianto Per Linfomi AIDS-correlati
Pazienti affetti da AIDS che sviluppano il linfoma sono spesso trattati con le cellule progenitrici ematopoietiche trapiantate. Come primo passo nello sviluppo di un trattamento di terapia genica basate sulle cellule ematopoietiche, quattro pazienti sottoposti a trattamento con queste cellule trapiantate erano anche dato gene modificato derivato dal sangue (CD34(+)) progenitrici ematopoietiche cellule periferiche che esprimono tre moiety anti-HIV RNA-based (tat/rev short hairpin RNA decoy TAR e ribozima CCR5). Analisi in vitro di queste cellule modificate gene ha mostrato alcuna differenza nella loro potenziale ematopoietico confrontato con cellule nontransduced. Stime in vitro di successo expression le moiety anti-HIV sono stati inizialmente alte come il 22% ma è diminuita di circa l'1% oltre 4 settimane della cultura. Disegno dello studio etico richiesto che i pazienti da trapiantare con entrambe le cellule progenitrici ematopoietiche gene modificato e manipolate ottenute dal paziente mediante aferesi. Celle transfected sono stata trapiantate con successo in tutti e quattro i pazienti infusi di giorno 11, e non c'erano nessun imprevisto tossicità correlati a infusione. Espressione vettoriale persistente in molteplici linee cellulari è stato osservato a livelli bassi fino a 24 mesi, come era espressione del introdotto piccolo RNA interferente e ribozima. Pertanto, abbiamo dimostrato stabile vettore espressione in cellule del sangue umane dopo il trapianto di cellule autologhe progenitrici ematopoietiche gene modificato. Questi risultati supportano lo sviluppo di una piattaforma di terapia cellulare basata su RNA dell'HIV.
Una Chimera Aptamer-siRNA Sopprime Carichi Virali Di HIV-1 E Protegge Dal Declino Di Cellule Helper T CD4(+) Nel Topo Umanizzato
Strategie terapeutiche progettati per trattare l'infezione da HIV con combinazioni di farmaci antivirali hanno dimostrato di essere l'approccio migliore per rallentare la progressione verso l'AIDS. Nonostante questo progresso, non ci sono problemi con la resistenza ai farmaci virali e tossicità, che necessita di nuovi approcci per combattere l'infezione da HIV-1. Abbiamo quindi sviluppato un approccio differente combinazione per il trattamento dell'infezione da HIV in cui un aptamer di RNA, con affinità di legame ad alta per l'HIV-1 (gp120) proteine e virus neutralizzazione proprietà della busta, è associata a e offre un piccolo RNA interferente (siRNA) che innesca la degradazione di sequenza-specifici di HIV RNA. Abbiamo testato l'attività antivirale di questi chimerici RNAs in un modello di mouse Rag2(-/-)γc(-/-) (RAG-hu) umanizzato con ematopoiesi umana multilineare. In questo modello animale, replica di HIV-1 e deplezione delle cellule T CD4(+) imitare la situazione vista in pazienti affetti da HIV umani. I nostri risultati mostrano che trattamento con l'anti-gp120 aptamer o aptamer-siRNA chimera soppressa la replicazione dell'HIV-1 da parecchi ordini di grandezza e ha impedito il declino di cella CD4(+) T helper virale indotta. In confronto la aptamer da solo, la combinazione aptamer-siRNA fornito inibizione più estesa, con conseguente un significativamente più effetto antivirale che esteso parecchie settimane oltre l'ultima dose iniettata. La aptamer agisce così come un agente neutralizzante l'HIV ad ampio spettro e un veicolo di consegna siRNA. L'agente combinato aptamer-siRNA fornisce un approccio terapeutico attraente, non tossico per il trattamento dell'infezione da HIV.
Somministrazione Sistemica Di Combinatoria DsiRNAs Tramite Nanoparticelle Sopprime Efficientemente Infezione HIV-1 Nei Topi Umanizzati
Abbiamo valutato l'efficacia in vivo di dendrimeri PAMAM cationico, strutturalmente flessibile come un piccolo sistema di consegna d'interferenza RNA (siRNA) in un Rag2 (-) / - γc-/-modello murino umanizzato (RAG-hu) per l'infezione da HIV-1. Infezione da HIV umanizzati Rag2-/-γc-/-mice (RAG-hu) sono stati iniettati per via endovenosa (i.v.) con nanoparticelle dendrimero-siRNA composto da un cocktail di cubettatrice substrato siRNA (dsiRNAs) targeting trascrizioni virali e cellulari. Riportiamo in questo studio che il trattamento dendrimero-dsiRNA soppresso l'infezione da HIV-1 da parecchi ordini di grandezza e protetto contro virale indotta deplezione CD4(+) T-cell. Abbiamo dimostrato anche che iniezioni di follow-up della dsiRNAs dendrimero cocktailed seguito rebound virale ha provocato una inibizione totale di titoli di HIV-1. Biodistribuzione studi dimostrano che il dendrimero-dsiRNAs preferenzialmente si accumulano nel fegato e cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) e non presentano alcuna tossicità percepibile. Questi dati dimostrano per la prima volta efficace combinatoria consegna di siRNA anti-host ed - virale per il trattamento di HIV-1 in vivo. L'approccio di consegna dendrimero rappresenta quindi un metodo promettente per consegna sistemica di combinazioni di siRNA per il trattamento dell'infezione da HIV-1.
Interplay Tra Infezione Da HIV-1 E Host MicroRNA
Utilizzando analisi di microRNA matrice delle cellule in vitro di HIV-1-infected CD4(+), troviamo che diversi host microRNA è significativamente up - o downregolata intorno al tempo picchi di infezione da HIV-1 in vitro. Mentre i livelli di microRNA-223 erano notevolmente arricchiti in HIV-1-infected CD4(+)CD8(-) PBMCs, microRNA-29a/b, microRNA-155 e microRNA-21 livelli sono sensibilmente ridotti. Basata sul potenziale per i siti di legame di microRNA in una sequenza conservata del Nef-3'-LTR, diversi host microRNA potenzialmente poteva influenzare l'espressione di gene HIV-1. Tra questi microRNA, la famiglia di microRNA-29 ha complementarità di seme in HIV-1 3'-UTR, ma il potenziale effetto soppressivo di microRNA-29 su HIV-1 è severamente bloccato dalla struttura secondaria della regione di destinazione. I nostri dati supportano un circuito regolamentare possibile presso la replica di picco di HIV-1 che coinvolge downregulation di microRNA-29, espressione di Nef, l'apoptosi delle cellule CD4 host e sovraregolazione di microRNA-223.
