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Articles by Ida Rishal in JoVE
JoVE Neuroscience
Isolement axoplasme du nerf sciatique du rat
Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science
Nous démontrons un protocole pour l'isolement du nerf axoplasme sciatique de rat adulte repose sur la dissection des fascicules nerveux et l'incubation dans le milieu hypotonique pour libérer de la myéline et Lyse non axonale structures, suivie de l'extraction de l'axone reste-matériau enrichi.
Other articles by Ida Rishal on PubMed
Na + Favorise La Dissociation Entre Galpha GDP Et Gbeta Gamma, Activation Des Canaux K + Sensibles à La Protéine G
G protéine k (+) canaux (GIRK ou Kir3) sont activés par la liaison directe de Gbetagamma ou de Na cytosolique. Activation de la Na est rapide, indépendant de la Gbetagamma et probablement via un direct, faible fixation d'affinité (EC(50), 30-40 mm) de Na au canal. Ici, nous démontrons qu'une augmentation de la concentration intracellulaire de Na, [Na(+)](in), dans les limites physiologiques (5-20 mm), active GIRK quelques minutes grâce à un mécanisme supplémentaire, lent. L'activation lente est observée chez les mutants GIRK dépourvus de l'effet direct de la Na. Elle est inhibée par un charognard de Gbetagamma, d'où il est dépendant du Gbetagamma ; mais il ne nécessite pas de GTP. Nous avons émis l'hypothèse que Na élève la concentration cellulaire de Gbetagamma libre en encourageant la dissociation de la heterotrimer Galphabetagamma en Galpha(GDP) libre et Gbetagamma. Directs mesures biochimiques ont montré que Na provoque une diminution modérée (environ 2 fois) de l'affinité de l'interaction entre Galpha(GDP) et Gbetagamma. En outre, en accord avec les prédictions de notre modèle, activation lente de Na est augmentée par coexpression douce de Galpha(i3). Nos résultats révèlent un mécanisme jusque-là inconnu de la régulation des protéines G et démontrent une nouvelle régulation Gbetagamma-dépendante de GIRK par Na. Nous proposons que Na peut agir comme un facteur de normalisation, ou même un second messager, qui réglemente les effecteurs via Gbetagamma.
Cartographie Des Sites De Liaison Gbetagamma En Sous-unités GIRK1 Et GIRK2 De La G-protéine Activée Canal K +
G protéine K + canaux (Kir3 ou GIRK) sont activés par la liaison directe de Gbetagamma. Les sites de fixation de Gbetagamma dans la GIRK1 omniprésent sous-unité (Kir3.1) n'ont pas été clairement indiqué et dans le GIRK2 neuronale sous-unité (Kir3.2), la liaison de la Gbetagamma n'a pas été étudiée. Nous avons vérifié et prolongé la carte des sites de liaison du Gbetagamma en GIRK1 à l'aide de deux approches : liaison de Gbetagamma à des fragments de sous-unités GIRK (menu déroulant) et la concurrence de ces fragments à la sous-unité de Galphai1 pour se lier à Gbetagamma directe. Aussi, nous avons localisé les sites de liaison Gbetagamma en GIRK2. Dans les deux sous-unités, le terminus de N lie Gbetagamma. Dans la partie C-terminale, les sites de liaison Gbetagamma en deux sous-unités ne sont pas identiques ; GIRK1, mais pas GIRK2, a un précédemment non reconnu Gbetagamma-interaction segments dans le premier la moitié de la partie C terminale. Le segment principal de la liaison C-terminal Gbetagamma trouvé dans les deux sous-unités se situe approximativement entre acides aminés 320 et 409 (par le comte de GIRK1). Mutation de leucines C-terminal 262 ou 333 en GIRK1, reconnu auparavant comme cruciale pour le règlement de la Gbetagamma du canal et des leucines correspondantes 273 et 344 dans GIRK2 considérablement modifié les propriétés de K + courants via les canaux de GIRK1/GIRK2 exprimés dans des ovocytes de Xenopus, mais n'a pas sensiblement réduit la liaison de la Gbetagamma pour les protéines de fusion correspondant, indiquant que ces résidus sont surtout importantes pour la régulation des changements induits par la Gbetagamma à canal blocage plutôt que de la liaison Gbetagamma.
Galphai1 Et Galphai3 Différentiellement Interagissent Avec Et D'ajuster, Le Canal K + Activé Par Protéine G
G protéine k (+) canaux (GIRKs ; Kir3) sont activés par la liaison directe des sous-unités Gbetagamma libéré des protéines G hétérotrimériques. Dans les tissus natifs, seules la coqueluche sensibles à la toxine G protéines de la famille des G(i/o), Galpha(i2) et préférence Galpha(i3) sont des donneurs de Gbetagamma pour GIRK. Comment parvient-on à cette spécificité n'est pas connu. Ici, à l'aide d'une méthode pull-down, a confirmé la présence de Galpha(i3-GDP) binding site en N-terminal de GIRK1 et identifié des sites de liaison de nouveau à l'extrémité N terminale de GIRK2 et dans les terminus de C de GIRK1 et GIRK2. La guanosine non hydrolysable GTP d'analogique, 5' -3 - O-(thio) triphosphate, réduit la liaison de Galpha(i3) par un facteur de 2-4. Galpha(I1-GDP) lié à GIRK1 et GIRK2 beaucoup plus faible que Galpha(i3-GDP). Expression titrée de composants de signalisation de la voie dans des ovocytes de Xenopus et leur activation par les récepteurs muscariniques m2 a révélé que G(i3) active GIRK plus efficacement que les G(i1), comme indiqué par les courants plus grandes et plus rapidement évoquée par l'agoniste. Activation de GIRK de Gbetagamma purifié dans des parcelles de membrane excisées a été fortement augmentée par la coexpression de Galpha(i3) et moins de Galpha(i1). Différences dans les interactions physiques GIRK avec Galpha PIB lié aux sous-unités ou Galphabetagamma heterotrimers, peuvent dicter des degrés différents de Galphabetagamma d'ancrage, influent sur l'efficacité de l'activation de Gbetagamma GIRK et jouent un rôle dans la détermination de spécificité de signalisation.
Gbetagamma-dépendants Et Indépendants De Gbetagamma Activité Basale De G-protéine Activée Canaux K +
Cardiaques et neurones G protéine activée canaux K + (GIRK ; Kir3) ouvert suite à la liaison des sous-unités Gbetagamma, libéré de protéines Gi/o activés par des neurotransmetteurs. GIRKs possèdent aussi une activité basale contribuant au potentiel de repos dans les neurones. Il semble dépendre en grande partie libre Gbetagamma, mais une composante indépendante de la Gbetagamma a également été envisagée. Nous avons étudié la dépendance de l'activité basale de GIRK Gbetagamma (A(GIRK,basal)) quantitativement, par expression titrée des charognards de Gbetagamma, dans des ovocytes de Xenopus exprimant GIRK1/2 canaux et récepteurs muscariniques m2. Le piégeur de Gbetagamma largement utilisé, terminus de myristoylated C de kinase bêta-adrénergique (m-cbetaARK), A(GIRK,basal) a réduit de 70 à 80 % et éliminé le courant induite par l'acétylcholine (I(ACh)). Cependant, nous avons constaté que m-cbetaARK lie directement à GIRK, ce qui complique l'interprétation des données physiologiques. Parmi plusieurs charognards nouvellement construits de Gbetagamma, phosducin avec un signal supplémentaire myristoylation (m-phosducin) a été plus efficace dans la réduction des courants GIRK. m-phosducin déménagé à la fraction de membrane et ne lie pas GIRK. Expression titrée de m-phosducin a entraîné une réduction de A(GIRK,basal) jusqu'à 90 %. Expression de GIRK était accompagnée d'une augmentation du niveau de Gbetagamma et Galpha dans la membrane plasmique, soutenant l'existence de complexes préformés de GIRK aux sous-unités de protéine G. Une expression accrue de Gbetagamma et de son lien constitutif avec GIRK pourraient expliquer la A(GIRK,basal) excessivement élevés observés au niveau de la forte expression de GIRK. Seulement 10 à 15 % des A(GIRK,basal) ont persisté une expression de m-phosducin et cbetaARK. Ces résultats démontrent qu'une grande partie du Ibasal est Gbetagamma-dépendante à tous les niveaux d'expression des canaux et seule une petite fraction (< 10 %) peut être indépendant de la Gbetagamma.
Cinétique, Modélisation De Na (+)-induite, Activation Gbetagamma-dépendante De G Protéine K Canaux
G protéine activée K(+)(GIRK) canaux sont activés par nombreux neurotransmetteurs qui agissent sur les protéines Gi/o, via une interaction directe avec la sous-unité Gbetagamma des protéines G. En outre, les canaux GIRK relèvent positivement na intracellulaire via une interaction directe (voie rapide) et par un mécanisme dépendant du GGbetagamma (voie lente). La modulation lente a été proposée à partir de ce phénomène récemment décrit de Na (+)-a induit une réduction de l'affinité de l'interaction entre les sous-unités GalphaGDP et Gbetagamma des protéines G. Dans ce scénario, Na élevés améliore la dissociation basale de heterotrimers de G de protéines, élévation libre Gbetagamma cellulaire et en activant GIRK. Cependant, c'est ne pas clair si cette hypothèse peut expliquer les aspects quantitatifs et cinétiques du règlement observé. Nous rapportons ici le développement d'un modèle quantitatif de lent, Na (+)-activation de protéines par dépendant, G de GIRK. L'activité des canaux de GIRK1F137S, qui sont dépourvues de l'interaction directe avec Na, a été mesurée dans des parcelles de membrane excisées et utilisée comme un indicateur des niveaux de GGbetagamma libres. Le changement dans l'activité du canal a été utilisé pour calculer la Na (+)-changement dépendant de l'affinité de l'interaction de sous-unité de protéine G. Sous un large éventail de conditions initiales, le modèle prédit qu'une relativement faible diminution de l'affinité de l'interaction entre GalphaGDP et GGbetagamma (environ le double dans la plupart des conditions) représente l'activation double de GIRK induite par na, en accord avec les données biochimiques publiées auparavant. Le modèle également correctement décrit l'évolution lente de prise d'effet de Na et a expliqué l'amélioration observée précédemment de Na (+)-induite par l'activation de GIRK par Galphai3 coexpressed. C'est le premier modèle quantitatif qui décrit l'équilibre basale entre sous-unités de protéine G libres et liées et ses conséquences sur la réglementation d'un effecteur de la GGbetagamma.
Amplitude Histogramme-méthode D'analyse Des Enregistrements De Serrage Patch Qui Impliquent Des Changements Extrêmes De Niveaux D'activité De Canal
Nombreux canaux ioniques montre la faible activité basale, ce qui est des centaines-multiplié par le facteur de blocage. Les canaux de k G-protéine-activé d'activation (GIRK) par dimère de sous-unité de Gbetagamma en est un exemple classique. Le degré d'activation (courant par rapport à la base), défini, est un paramètre physiologique important, estimé généralement facilement des enregistrements de cellules entières. Cependant, calcul de défini souvent devient non négligeable en plaques multicanaux en raison des changements extrêmes en activité lors de l'activation, à partir d'un modèle apparemment monocanal macroscopique à un. Dans ce cas, calculer le net courant traversant les canaux dans le patch, j'ai, avant et après activation peut nécessiter différentes méthodes d'analyse. Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé neuronale canaux GIRK activée par Gbetagamma purifiée en plaques excisés des ovocytes de Xenopus laevis. Canaux ont été exprimées à différentes densités, de quelques-uns à plusieurs centaines par patch. Nous présentons une méthode simple et rapide de calcul j'ai analyse histogramme amplitude et d'établir l'exactitude des informations en comparant avec j'ai calculé à partir des listes d'événements. Cette méthode permet l'analyse des variations extrêmes dans I en patches multicanaux, ce qui seraient impossibles en utilisant les méthodes standards d'idéalisation et de génération de liste événement.
Signalisation Rétrograde Dans La Régénération Axonale
La régénération neuronale dans le système nerveux périphérique nécessite la mobilisation de mécanismes intrinsèques excroissance des neurites. Ce processus dépend de signalisation rétrograde entre le site de la lésion et le soma de fournir des informations exactes et à jour sur la nature et l'étendue des lésions axonales, et pour provoquer une réponse cellulaire de l'organe approprié. Une première phase de signalisation électrophysiologique est suivie par un ensemble de signaux à moteur, dont certains dépendent de la traduction locale de protéines dans l'axone et la formation d'un complexe importines coordonnée rétrograde. En plus de déclencher la réaction corps cellulaire, des analyses de calcul indiquent que ce mécanisme biphasique peut fournir des informations sur la distance de l'emplacement leson du corps cellulaire neuronale. Encourager les données récentes suggèrent qu'il pourrait être possible d'appliquer cette nouvelle compréhension des mécanismes de signalisation rétrograde pour activer les mécanismes de régénération intrinsèques également dans la croissance réfractaires neurones centraux.
Isolement Axoplasme De Nerfs Périphériques
Changements localisés dans la composition du cytoplasme axonal (axoplasme) sont essentielles pour de nombreux processus biologiques, y compris le guidage axonal, les réponses à des blessures, la croissance des neurites, et des axones des cellules gliales-interactions. Des études biochimiques et moléculaires de ces mécanismes ont été fortement axée sur des systèmes in vitro en raison de la difficulté d'obtenir des extraits de tissus de mammifères subcellulaires in vivo. Comme dans les systèmes in vitro pourrait ne pas reproduire la situation in vivo, des méthodes fiables d'extraction axoplasme de nerf entier serait utile pour les études mécanistiques sur les axones. Ici, nous développer et d'évaluer une nouvelle procédure pour la préparation de axoplasme du nerf périphérique chez le rat, basé sur l'incubation d'séparés segements courts de faisceaux nerveux dans un milieu hypotonique à séparer de la myéline et lyser structures nonaxonal, suivie par l'extraction de l'axone reste-matériau enrichi. Nous montrons que cette nouvelle procédure permet de réduire la contamination de cellules gliales et le sérum et facilite les analyses protéomiques de contenu axonales.
Signalisation Aux Réseaux De Transcription Dans La Réponse Neuronale Rétrograde Des Blessures
Signalisation rétrograde de l'axone vers le soma active des mécanismes de régénération intrinsèques dans lésés neurones sensoriels périphériques, mais les liens entre la signalisation des lésions axonales et la réponse du corps cellulaire ne sont pas bien comprises. Ici, nous avons utilisé phosphoprotéomique et des microréseaux d'impliquer environ 900 phosphoprotéines des blessures rétrograde de signalisation dans les axones du nerf sciatique de rat in vivo et environ 4500 dans les transcriptions de la réponse in vivo à des blessures dans les ganglions de la racine dorsale. Analyses computationnelles de ces ensembles de données identifié environ 400 réseaux de signalisation redondants axonales connectés à 39 facteurs de transcription impliqués dans la réponse des neurones sensoriels de lésions axonales. Perturbation expérimentale de l'individu surreprésentés protéines de signalisation, y compris les moyeux Abl, AKT, p38, et la protéine kinase C, affecté la croissance des neurites dans les neurones sensoriels. Paradoxalement, cependant, des perturbations combiné de Abl ainsi que les protéines du moyeu d'autres ont eu un effet réduite par rapport à la perturbation des protéines individuelles. Nos données indiquent que les réponses des blessures nerveuses sont contrôlés par de multiples composants de régulation, et de suggérer que les licenciements du réseau offrent la robustesse de la réponse des blessures.
Phénotypes Comportementaux Et Autres Dans Une Lumière Dynéine Cytoplasmique Intermédiaire Chaîne 1 De Souris Mutantes
Le complexe dynéine cytoplasmique est fondamentalement important pour toutes les cellules eucaryotes pour le transport de diverses cargaisons essentielles le long des microtubules dans la cellule. Ce complexe joue également des rôles plus spécialisés dans les neurones. Le complexe se compose de 11 types de protéines qui interagissent les uns avec les autres et avec des adaptateurs externes, des régulateurs et des cargaisons. Malgré l'importance du complexe dynéine cytoplasmique, nous savons relativement peu des rôles de chaque protéine composant, et chez les mammifères mutants existent qui nous permettent d'explorer les effets des défauts dans la dynéine processus contrôlés dans le contexte de l'organisme entier. Ici, nous avons adopté une approche axée sur le génotype de la souris (Mus musculus) à analyser le rôle d'un sous-unité, la dynéine lumière intermédiaire de la chaîne 1 (Dync1li1). Nous constatons que, de façon surprenante, une mutation ponctuelle dans cette N235Y résultats de protéines dans le développement neuronal modifié, comme indiqué par des études in vivo dans le cortex en développement, et les analyses de la fonction électrophysiologique. En outre, les souris mutantes afficher augmentation de l'anxiété, reliant ainsi les fonctions de dynéine à un phénotype comportemental chez les mammifères pour la première fois. Ces résultats démontrent le rôle important que la dynéine processus contrôlés par jouer dans le développement correct et la fonction du système nerveux des mammifères.
Facteurs De Transcription Axonales Signal Rétrograde Dans Des Nerfs Périphériques Lésés
Rétrograde de signalisation des lésions axonales stimule les réponses du corps cellulaire dans lésés neurones périphériques. L'implication des importines dans le transport rétrograde suggère que des facteurs de transcription (FT) pourrait être directement impliquée dans la signalisation des lésions axonales. Ici, nous montrons que plusieurs facteurs de transcription se trouvent dans les axones et de s'associer avec la dynéine dans axoplasme du nerf lésé. La validation biochimique et fonctionnel pour une famille TF établit que STAT3 axonale est localement traduit et activé lors d'une lésion, et est transporté par voie rétrograde avec la dynéine et importine α5 de moduler la survie des neurones sensoriels périphériques après la blessure. Par conséquent, le transport rétrograde de FO à partir de sites de lésion axonale fournit un lien direct entre l'axone et le noyau.
