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Articles by Manjunath Hegde in JoVE
JoVE General
Microfluidiques Co-culture de cellules épithéliales et des bactéries d'enquête sur les Soluble signal médiée par des interactions
1McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University
Ce protocole décrit une microfluidique de co-culture de modèle pour la culture simultanée et localisée des cellules épithéliales et des bactéries. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le rôle des différents signaux moléculaires solubles sur la pathogenèse ainsi que l'écran de l'efficacité des souches bactériennes probiotiques putatifs.
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Effets Différentiels De L'épinéphrine, La Norépinéphrine Et L'indole Sur Escherichia Coli O157: H7 Chimiotactisme, La Colonisation, Et L'expression Génique
Au cours de l'infection dans le tractus gastro-intestinal, Escherichia coli entérohémorragique (EHEC) O157: H7 est exposé à un large éventail de molécules de signalisation, y compris l'adrénaline et la noradrénaline eucaryote hormones, et des molécules de signalisation bactériens tels que l'indole. Étant donné que ces molécules de signalisation ont été montré pour être impliquée dans la régulation des phénotypes tels que la motilité et de la virulence qui sont cruciales pour les infections à EHEC, nous avons supposé que ces molécules régissent également la comptabilisation initiale de l'environnement du gros intestin et l'attachement à la surface des cellules hôte. Ici, nous déclarons que, par rapport à l'indole, adrénaline et la noradrénaline exercent des effets divergents sur EHEC chimiotactisme, la motilité, la formation de biofilm, l'expression des gènes, et la colonisation des cellules HeLa. Utilisation d'un roman en deux fluorophore essai de chimiotaxie, il a été constaté que les EHEC est attiré à l'adrénaline et la noradrénaline alors qu'il est repoussé par l'indole. En outre, l'épinéphrine et la norépinéphrine a également augmenté la motilité EHEC et la formation de biofilm tandis que l'indole atténués ces phénotypes. L'analyse des puces à ADN de la surface associée à EHEC a indiqué que l'épinéphrine / norépinéphrine régulée à la hausse l'expression des gènes impliqués dans la colonisation et la virulence de surface tandis que l'exposition en indole diminué leur expression. Les données d'expression génique a également suggéré que l'absorption autoinducteur 2 a été réprimée lors de l'exposition à l'adrénaline / noradrénaline, mais pas d'indole. Expériences in vitro ont confirmé que l'adhésion adrénaline et la noradrénaline a augmenté son attachement aux cellules épithéliales tandis indole diminué adhésion. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que l'adrénaline et la noradrénaline augmentation EHEC infection pendant l'indole atténue le processus.
Modèle Utilisation De Drogue En Soins Dentaires Ambulatoires En Hôpital De Soins Tertiaires Dans L'ouest Du Népal
Une forte incidence de maladies dentaires a été signalée au Népal. Des études antérieures, tant dans l'hôpital universitaire de Manipal, Pokhara, Népal et autres centres a révélé des problèmes dans l'utilisation des médicaments en médecine dentaire. Un certain nombre d'initiatives visant à améliorer la prescription ont été réalisé. L'étude présentée ici a été entreprise pour évaluer l'impact de ces initiatives sur l'utilisation des médicaments chez les patients ambulatoires dentaires. L'étude a été menée auprès de patients fréquentant le service dentaire ambulatoire de l'hôpital sur une période de six mois. Détails démographiques ont été étudiés. Les classes de médicaments et les médicaments prescrits ont été enregistrés. Le coût des médicaments est calcule à l'aide de la liste de prix pharmacie ambulatoire. Les prescriptions ont été analysées à l'aide de l'OMS / INRUD prescrire des indicateurs. Des anomalies ont été relevées dans la prescription. Amélioration a été notée dans certains paramètres par rapport aux études antérieures. Les initiatives éducatives doivent être renforcées. Des interventions de gestionnaires peuvent être envisagées. D'autres études sont nécessaires.
Signalisation Cellulaire Indole Se Produit Principalement à Basse Température Dans Escherichia Coli
Nous avons montré que les signaux quorum-sensing acylhomosérine lactones, autoinducteur-2 (AI-2) et l'indole influencer la formation du biofilm d'Escherichia coli. Ici, nous examinons comment l'environnement, qui est, la température, affecte de signalisation indole et AI-2 dans E. coli. Nous montrons dans les biofilms que l'addition d'indole conduit à l'expression différentielle de gènes plus large à 30 degrés C (186 gènes) que à 37 ° C (59 gènes), que l'indole réduit la formation de biofilm (sans affecter la croissance) de façon plus significative à 25 et 30 degrés Celsius qu'à 37 degrés C et que l'effet est associé à la protéine de SDIA quorum-sensing. L'ajout de l'indole à 30 degrés C par rapport à 37 degrés C la plupart des gènes réprimés de manière significative impliqués dans uridine monophosphate (UMP) biosynthèse (CCRAC, pyrLBI, pyrC, pyrD, pyrF et upp) et le transport uracile (AACU). Ces gènes uracile-connexes sont également réprimés à 30 degrés C par SDIA, qui confirme SDIA est impliqué dans la signalisation indoliques. Également, par rapport à 37 degrés C, de l'indole plus significativement diminué flagelles liée qseB, flhD et une activité de promoteur FLIA, une résistance accrue aux antibiotiques et la division cellulaire inhibée à 30 degrés C. Dans la différence de l'indole et SDIA, l'addition de (S) -4 ,5-dihydroxy-2 ,3-pentanedione (le précurseur AI-2) conduit à l'expression différentielle de gènes plus large à 37 degrés C (63 gènes) que moins 30 degrés C (11 gènes), et, plutôt que la répression des gènes de synthèse UMP , AI-2 induit les moins 37 degrés C (mais pas à 30 degrés C). En outre, l'ajout de l'IA-2 induit la transcription des gènes de virulence dans entérohémorragique E. coli O157: H7 à 37 degrés C mais pas à 30 degrés C. Par conséquent, les signaux cellulaires provoquer des réactions diverses à des températures différentes, et de l'indole-et-AI 2-base de signalisation sont intimement liés.
Le Hormone Appelée Noradrénaline Neuroendocrine Augmente Pseudomonas Aeruginosa PA14 Virulence Grâce à La Las Quorum-sensing Pathway
Il a été proposé que l'environnement tractus gastro-intestinal contenant des niveaux élevés d'hormones neuroendocrines est important pour l'intestin dérivés infections à Pseudomonas aeruginosa. Dans cette étude, nous rapportons que la noradrénaline hormone augmente P. aeruginosa PA14 la croissance, la production de facteurs de virulence, l'invasion de l'HCT-8 cellules épithéliales, et la motilité de nager dans une manière dépendante de la concentration. L'analyse du transcriptome de P. aeruginosa exposés à 500 microM, mais pas 50 microM, la noradrénaline pour 7 h montré que les gènes impliqués dans la régulation de la virulence facteurs déterminants de la pyocyanine, l'élastase, et le Pseudomonas quinolone signal (PQS, 2-heptyl-3-hydroxy -4-quinolone) ont été régulés à la hausse. La production de rhamnolipides, qui sont aussi important dans les infections à P. aeruginosa, n'a pas été sensiblement modifié dans les cultures de suspension lors de l'exposition à 500 microM noradrénaline, mais a diminué sur les surfaces semi-solides. Motilité essaimage, un phénotype qui est directement influencée par rhamnolipides, a également diminué sur 500 l'exposition noradrénaline microM. L'augmentation de l'activation transcriptionnelle de LASR mais pas celle de RHLR et l'augmentation des niveaux de PQS suggèrent que les effets de la noradrénaline sont médiés principalement par le biais du las quorum-sensing voie. Ensemble, nos données suggèrent fortement que la noradrénaline peut jouer un rôle important dans l'intestin dérivés infections en augmentant la pathogénicité de P. aeruginosa PA14.
Co-culture De Cellules épithéliales Et Des Bactéries Pour Enquêter Sur Les Interactions Hôte-pathogène
La gastro-intestinal humain (GI) est un environnement unique dans lequel les cellules épithéliales intestinales et non-pathogènes (commensaux) les bactéries co-existent. Cet équilibre est perturbé par l'entrée d'agents pathogènes dans le tractus gastro-intestinal. Une étape clé dans le processus d'infection est la navigation de l'agent pathogène à travers la couche bactérienne commensale se fixer aux cellules épithéliales. Il a été proposé que le microenvironnement que l'agent pathogène rencontre dans la couche commensale joue un rôle important dans la détermination de la mesure de l'attachement et de la colonisation. Méthodes de culture actuelles pour enquêter sur la colonisation pathogène ne sont pas bien adaptés pour enquêter sur cette hypothèse, car ils ne permettent pas de co-culture de bactéries et de cellules épithéliales d'une manière qui imite le microenvironnement tractus gastro-intestinal. Nous rapportons ici le développement d'une co-culture microfluidique modèle qui permet la culture indépendante des cellules eucaryotes et les bactéries, et de tester l'effet du microenvironnement commensal sur la colonisation pathogène. Un système pneumatique actionné a été développé pour former des îles réversibles qui permettent le développement d'un biofilm bactérien avec la culture d'une monocouche de cellules épithéliales. Le modèle de co-culture utilisée pour développer un biofilm coli commensales Escherichia entre les cellules HeLa, suivie par l'introduction de E. coli entéro-hémorragique (EHEC) dans l'île commensal, dans une séquence qui reproduit la séquence des événements dans les infections des voies gastro-intestinal. Utilisation de type sauvage de E. coli et un mutant tnaA (manque de signal de l'indole) que les bactéries commensales, nous démontrons que le microenvironnement biofilm commensal est un déterminant clé de l'infectiosité et la virulence EHEC. Notre modèle a le potentiel pour être utilisé dans des études fondamentales de l'enquête de l'effet de signaux tractus gastro-intestinal sur la virulence EHEC ainsi que pour le dépistage des différentes souches de probiotiques pour moduler l'infectivité des agents pathogènes dans le tractus gastro-intestinal.
Chimiotactisme Aux Conditions De Quorum-sensing Signal AI-2 Nécessite L'Chimiorécepteur Tsr Et La Périplasmique LsrB AI-2-La Liaison Aux Protéines
AI-2 est un autoinducteur faite par de nombreuses bactéries. LsrB lie AI-2 dans le périplasme, et de la TSR est la chimiorécepteurs L-sérine. Nous montrons que l'IA-2 attire fortement Escherichia coli. Les deux LsrB et Tsr sont nécessaires pour détecter AI-2, mais AI-2 n'est pas l'absorption, ce qui suggère que LsrB et Tsr interagir directement dans le périplasme.
Synthétique Quorum-sensing Circuit Pour Contrôler La Formation De Biofilm Consortial Et La Dispersion Dans Un Dispositif Microfluidique
Pour utiliser les biofilms pour les transformations chimiques dans les bioraffineries dont ils ont besoin d'être contrôlés et remplacés. Auparavant, nous avons conçu le régulateur global Hha et cycliques diguanylate contraignant BDCA pour créer des protéines qui permettent la dispersion du biofilm. Nous rapportons ici un circuit de biofilm qui utilise ces deux protéines de dispersion avec une population axée quorum-sensing interrupteur. Avec ce circuit de synthèse, dans un dispositif microfluidique nouvelle, on forme une première colonisateur biofilm, introduire un second type de cellules (disperseurs) en ce biofilm existant, sous forme solide une double espèces biofilm et déplacer les cellules initiales colonisateur dans le biofilm avec un extracellulaire signal provenant des cellules disperseur. Nous avons également supprimer le biofilm disperseur avec un interrupteur chimiquement induite, et la population consortium pourrait accorder. Par conséquent, pour la première fois, les cellules ont été conçus qui sont capables de déplacer un biofilm existant et ensuite être retiré sur commande permettant à un pour contrôler la formation de biofilm consortium pour diverses applications.
Un Dispositif Microfluidique Pour Les études à Haut Débit Biofilm Bactérien
Les bactéries sont presque toujours trouvé dans des niches écologiques que la matrice-enveloppé, surface associés, multi-espèces des communautés connues sous le nom biofilms. Il est bien établi que les signaux chimiques solubles produits par les bactéries influencer l'organisation et la structure du biofilm et, par conséquent, il ya un intérêt significatif pour comprendre comment les signaux chimiques différents sont utilisés de manière coordonnée pour le développement communautaire. Les méthodes classiques d'enquête sur la formation de biofilm, comme des cellules d'écoulement macro-échelle sont faibles débit, exigent de grands volumes, et ne permettent pas de contrôle spatial et temporel de la formation de la communauté de biofilm. Ici, nous décrivons le développement d'un PDMS à base de bi-couche écoulement microfluidique de cellules (μFC) dispositif d'enquêter sur la formation de biofilm bactérien et l'organisation en réponse à différentes concentrations de signaux solubles. Le dispositif contient huit μFC microchambres distincts pour cultiver des biofilms exposés à huit concentrations différentes de signaux par le biais d'un seul mélange diffusif basé sur générateur de gradient de concentration. La présence de vannes pneumatiques et un port cellule séparée semis qui est indépendante du gradient de mélange des canaux offre une isolation complète de la microchambre biofilm du mélangeur gradient, et effectue également bien continus, discontinus ou semi-batch conditions. Nous démontrons l'utilité de la μFC en étudiant l'effet de différentes concentrations de signaux biofilm indole-comme (7-hydroxy et isatine), que ce soit individuellement ou en combinaison, sur le développement du biofilm des E. coli pathogènes. Ce modèle peut être utilisé pour développer une compréhension fondamentale des événements menant à la fixation des bactéries sur des surfaces qui sont important dans les infections et les produits chimiques qui influent sur la formation du biofilm ou d'inhibition.
