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- Dissezione del rene Zebrafish adulti
- Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale
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Articles by Rebecca A. Wingert in JoVE
JoVE General
Dissezione del rene Zebrafish adulti
Department of Biological Sciences, University of Notre Dame
Il rene zebrafish è la patria di entrambi renale ematopoietiche adulte e cellule staminali / progenitrici, e rappresenta una straordinaria opportunità per studiare questi tipi di cellule e la loro progenie in un organismo modello vertebrato. Qui, dimostriamo una procedura dettagliata dissezione che consente al ricercatore di identificare e rimuovere chirurgicamente il rene adulto pesce zebra, che può essere utilizzata per applicazioni quali l'isolamento delle cellule, il trapianto, e studi di espressione del rene e / o popolazioni di cellule del sangue.
JoVE General
Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale
Department of Biological Sciences, University of Notre Dame
Danno renale acuto (AKI) negli esseri umani è un problema comune clinico causato da un danno alle cellule epiteliali che costituiscono nefroni renali e AKI è associata ad elevati tassi di mortalità del 50-70% 1. A seguito di distruzione delle cellule epiteliali, nefroni hanno una limitata capacità di rigenerarsi, anche se i meccanismi e le limitazioni che guidano questo fenomeno sono ancora poco compresi. In questo articolo video, descriviamo la nostra tecnica di ablazione laser mirato delle cellule renali nefrone nel rene embrione zebrafish, o pronephros. Il nostro nuovo metodo può essere utilizzato per integrare nefrotossicità indotta modelli di AKI e ottenere un'immagine ad alta risoluzione comprensione delle alterazioni cellulari e molecolari che sono associati con la rigenerazione epiteliale nel nefrone renale.
Other articles by Rebecca A. Wingert on PubMed
Il Mutante Di Zebrafish Chianti Fornisce Un Modello Per Perturbazione Eritroide-specifico Del Recettore Transferrina 1
Il ferro è un metallo fondamentale per lo sviluppo normale, essendo necessario per la produzione di eme, che è incorporata nel citocromi ed emoglobina. Il mutante di zebrafish chianti (cia) si manifesta un ipocromica, anemia microcitica dopo l'insorgenza della circolazione embrionale, indicativa di una perturbazione nella produzione di emoglobina del globulo rosso. Mostriamo che la cia codifica tfr1a, che si esprime in particolare nel sangue e nel requisito solo per assorbimento di ferro dei precursori eritroidi in via di sviluppo. Nel processo di isolamento zebrafish tfr1, abbiamo scoperto due geni come tfr1 (tfr1a e tfr1b) e un singolo tfr2 ortholog. Abrogazione della funzione tfr1b usando morpholinos antisenso ha rivelato che questo paralog era superfluo per la produzione di emoglobina nei globuli rossi. tfr1b morphants esposta crescita ritardo e cervello necrosi, simile ai difetti del sistema nervoso centrale osservati nel topo Tfr1 null, che indica che tfr1b è probabilmente utilizzato da tessuti non eritroidi per acquisizione di ferro. Sovraespressione di zebrafish tfr1b mouse Tfr1 e mouse Tfr2 salvato parzialmente hypochromia negli embrioni della cia, stabilendo che ciascuno di questi recettori Transferrina sono in grado di supportare l'assorbimento di ferro per la produzione di emoglobina in vivo. Presi insieme, questi dati mostrano che tfr1b e tfr1a di zebrafish condividere la funzione biochimica ma hanno limitato domini di espressione del tessuto e stabilire un modello genetico per studiare la funzione specifica del Tfr1 in cellule eritroidi.
Perdita Di Gata1 Ma Non Gata2 Converte L'eritropoiesi Myelopoiesis in Embrioni Di Zebrafish
La differenziazione dei progenitori ematopoietici in eritroidi o lignaggi di cellule mieloidi è pensata per dipendono i livelli relativi di gata1 fattori di trascrizione e pu.1. Mentre la perdita di funzione analisi dimostra che gata1 è necessaria per la differenziazione eritroide terminale, nessuno studio ha dimostrato che perdita di gata1 altera la differenziazione mieloide durante l'ontogenesi. Qui forniamo prove in vivo che perdita di Gata1, ma non Gata2, trasforma i precursori del sangue primitive cellule mieloidi, risultante in una massiccia espansione del granulocitica neutrofili e macrofagi a scapito dei globuli rossi. Oltre a questo cambiamento del destino, espressione di molti geni eritroidi è stato trovato a dipendere differenzialmente Gata1 da sola, sia Gata1 e Gata2, o indipendente di entrambi i fattori Gata, suggerendo che percorsi più regolano espressione del gene eritroidi. I nostri studi stabilire una gerarchia di transcriptional di dipendenza fattore Gata durante ematopoiesi e dimostrano che gata1 gioca un ruolo fondamentale nel dirigere le decisioni di destino di lignaggio mielo-eritroide durante l'embriogenesi.
Deficit Di Glutaredossina 5 Rivela Cluster Fe-S Sono Necessari Per La Sintesi Di EME Vertebrati
Ferro è necessaria per produrre eme e i cluster ferro-zolfo (Fe-S), i processi di pensiero che si verifichi in modo indipendente. Qui vi mostriamo che l'anemia ipocromica mutanti di zebrafish shiraz (sir) è causata dal deficit di glutaredossina 5 (grx5), un gene necessario nel lievito per assembly cluster Fe-S. Abbiamo trovato che grx5 è stato espresso nelle cellule eritroidi di zebrafish e topi. Zebrafish grx5 salvato l'Assemblea del lievito grx5 Fe-S, mostrando che la funzione biochimica di grx5 è evolutivamente conservata. In contrasto con il lievito, vertebrati utilizzano proteine normativo ferro 1 (IRP1) per senso ferro intracellulare e regolare la stabilità mRNA o la traduzione dei geni di metabolismo del ferro. Abbiamo scoperto che la perdita dell'Assemblea cluster Fe-S in sir animali attivato IRP1 e bloccato eme biosintesi catalizzata da aminolaevulinate sintasi 2 (ALAS2). Sovraespressione di ALAS2 RNA senza il 5' ferro elemento risposta che lega IRP1 salvò sir embrioni, considerando che la sovraespressione di ALAS2 compreso l'elemento di risposta di ferro non ha fatto. Più ulteriormente, antisenso atterramento di IRP1 restaurato sir sintesi di emoglobina embrionale. Queste scoperte scoprono un collegamento tra eme biosintesi e cluster Fe-S, che indica che produzione di emoglobina nella differenziazione cellula rossa è regolato tramite assembly cluster Fe-S.
Mitoferrin è Essenziale Per L'assimilazione Di Ferro Eritroidi
Il ferro ha un ruolo fondamentale in molti processi metabolici, tra cui trasporto degli elettroni, deossiribonucleotide sintesi, trasporto di ossigeno e molte reazioni redox essenziali che coinvolgono proteine di cluster Fe-S e haemoproteins. Omeostasi del ferro difettoso provoca carenza di ferro o sovraccarico di ferro. Regolazione precisa del trasporto del ferro nei mitocondri è essenziale per la biosintesi di eme, emoglobina produzione e assemblaggio di proteine Fe-S cluster durante lo sviluppo delle cellule rosse. Qui descriviamo un mutante di zebrafish, frascati (frs), che mostra la profonda ipocromica anemia ed eritroidi arresto della maturazione a causa di difetti di assorbimento di ferro mitocondriale. Attraverso la clonazione posizionale, mostriamo che il gene mutato in mutante frs è un membro della famiglia di vertebrati vettore soluto mitocondriale (SLC25) che noi chiamiamo mitoferrin (mfrn). mfrn è altamente espresso nei tessuti ematopoietici fetali ed adulti di zebrafish e mouse. Eritroblasti generati da murine cellule staminali embrionali null per Mfrn (noto anche come Slc25a37) Visualizza arresto della maturazione con gravemente compromessa incorporazione di 55Fe in EME. Interruzione del lievito mfrn orthologues, MRS3 e MRS4, causa difetti nel metabolismo del ferro e mitocondriale biogenesi di cluster Fe-S. Mfrn murino salvò i difetti nello zebrafish frs e zebrafish mfrn integra il mutante di lievito, che indica che la funzione del gene può essere altamente conservata. I nostri dati mostrano che mfrn funziona come l'importatore principale ferro mitocondriale essenziale per la biosintesi di EME in vertebrati eritroblasti.
I Geni Cdx E Acido Retinoico Controllo Posizionamento E Segmentazione Del Pronefro Del Danio Rerio
Funzione renale dipende dal nefrone, che comprende un filtro del sangue, un tubulo che è suddivisa in segmenti funzionalmente distinti e un condotto di raccolta. Come queste regioni presentano durante lo sviluppo è scarsamente compreso. Il pronefro zebrafish è costituito da due nefroni lineare che si sviluppano dal mesoderma intermedio lungo la lunghezza del tronco. Qui vi mostriamo che, contrariamente a dogma corrente, questi nefroni possiedono più domini del tubulo prossimale e distale che ricordano l'organizzazione del nefrone dei mammiferi. Abbiamo esaminato se pronefrico segmentazione è mediato dall'acido retinoico (RA) e i fattori di trascrizione caudale (cdx), che sono noti regolatori dell'identità segmentale durante lo sviluppo. Inibizione di RA segnalazione provocato una perdita dei segmenti prossimali e un'espansione dei segmenti distali, mentre il trattamento RA esogena indotta fates segmento prossimale a scapito dei destini distali. Perdita della funzione cdx causato abrogazione dei segmenti distali, uno spostamento posteriore nella posizione del pronefro e alterazioni nei confini espressione di raldh2 e cyp26a1, che codificano enzimi che sintetizzano e degradano RA, rispettivamente. Questi risultati suggeriscono che i geni cdx agiscano per localizzare l'attività del RA lungo l'asse, quindi determinare dove le forme pronefro. Coerentemente con questo, il difetto pronefrico-posizionamento e la perdita del destino del tubulo distale sono stati salvati in embrioni doppiamente carenti per cdx e ra Questi risultati rivelano un romanzo collegamento tra le vie RA e cdx e fornire un modello per come pronefrico nefroni sono segmentati e posizionati lungo l'asse embrionale.
Combinatoria Regolazione Dell'espressione Genica Eritroidi Romanzo Nello Zebrafish
La specificazione e la differenziazione delle cellule staminali in cellule rosse del sangue richiede coordinamento preciso da più fattori di trascrizione. La maggior parte dei geni importanti per la maturazione eritroide sono regolati dalla famiglia Gata di DNA-binding proteins. In precedenza, abbiamo identificato tre nuovi geni kelch-repeat contenenti proteine (krcp), kiaa0650 e trascrizione inducibili testhymin/glucocorticoidi 1 (glcci1) per essere espresso nelle cellule eritroidi in maniera indipendente-Gata, e abbiamo cercato di capire ulteriormente come queste trascrizioni sono regolate durante ematopoiesi zebrafish.
Montalcino, Un Modello Zebrafish Per Variegarlo Porfiria
Mutazioni ereditate o acquisite il pathway biosintetico dell'eme porta a una classe di malattie conosciute collettivamente come le porfirie, con sintomi che possono includere anemia, fotosensibilità cutanea e disfunzione neurovisceral debilitante. In uno schermo genetico di mutanti ematopoietiche, abbiamo isolato un mutante di zebrafish, montalcino (mno), che visualizza la porfiria e l'anemia ipocromica. L'obiettivo di questo studio era di identificare il gene difettoso e caratterizzano il fenotipo del mutante di zebrafish.
Transferrina-a Modula Espressione Di Epcidina in Embrioni Di Zebrafish
Il ferro ormone regolamentazione epcidina è transcriptionally up-regolate in risposta al carico di ferro, ma i meccanismi con cui sono rilevati livelli di ferro non sono ben compresi. Schermi genetici su larga scala in the zebrafish hanno determinato l'identificazione di mutanti di anemia ipocromica con una gamma di mutazioni che colpiscono i percorsi conservati nel metabolismo del ferro e la sintesi dell'eme. Abbiamo ipotizzato che Transferrina gioca un ruolo fondamentale nel trasporto del ferro e nella regolazione della espressione di epcidina in embrioni di zebrafish. Qui riportiamo l'identificazione e la caratterizzazione del mutante zebrafish anemia ipocromica, gavi, che esibisce la carenza di transferrina a causa di mutazioni in Transferrina-a. Oligonucleotides atterramento di transferrina-a nel selvaggio-tipo embrioni riprodotto il fenotipo di anemia e diminuito somite e intestino terminale ferro colorazione, mentre co-iniezione di transferrina-a cRNA parzialmente restaurata, questi difetti. Embrioni con Transferrina-a o recettore della Transferrina 2 (TfR2) deficit esposto bassi livelli di espressione di epcidina, tuttavia, l'anemia, in assenza di un difetto nella via della transferrina, non è riuscito ad alterare l'espressione di epcidina. Questi dati indicano che ferro-Transferrina a trasporti e quella espressione di epcidina è regolato da un percorso di transferrina-a-dipendente nell'embrione di zebrafish.
Identificazione Dei Progenitori Del Nefrone Adulto Capace Di Rigenerazione Del Rene in Zebrafish
Perdita della funzione renale è alla base di molte malattie renali. Mammiferi parzialmente in grado di riparare i nefroni (le unità funzionali del rene), ma non possono formare quelli nuovi. Al contrario, pesce aggiungere nefroni in tutta la loro durata e rigenerare nefroni de novo dopo l'infortunio, fornendo un modello per comprendere come mammiferi rigenerazione renale può essere attivato terapeuticamente. Qui si rintracciare la fonte del nuovi nefroni in the zebrafish adulto a piccoli aggregati cellulari contenenti progenitori del nefrone. Il trapianto dei singoli aggregati costituiti da 10-30 celle è sufficiente Raft adulti e generare più nefroni. Esperimenti di trapianto seriale per test di auto-rinnovamento ha rivelato che progenitori del nefrone sono longevi e in posseggono di significative potenzialità replicativa, coerente con l'attività delle cellule staminali. Il trapianto di progenitori nefrone misto taggati con sia verde o rosse proteine fluorescenti ha reso alcuni nefroni mosaico, che indica che più progenitori nefrone contribuiscono a un singolo nefrone. Coerente con questa, imaging live della formazione del nefrone in larve trasparenti hanno mostrato che aggregati nefrogeno formano dalla coalescenza di più celle e poi differenziano in nefroni. Presi insieme, questi dati dimostrano che il rene di zebrafish contiene probabilmente autorinnovabile cellule staminali/progenitrici di nefrone. L'identificazione di queste cellule spiana la strada per isolare o ingegneria le cellule equivalenti nei mammiferi e lo sviluppo di nuove terapie rigenerative renale.
Zebrafish Nephrogenesis Comporta Cambiamenti Dinamici Espressione Spatiotemporal Progenitori Renali E Segnali Essenziali Da Acido Retinoico E Irx3b
Nefroni renali sono composte da segmenti del tubulo prossimale e distale che svolgono ruoli unici nell'escrezione. I percorsi dello sviluppo che stabiliscono l'identità di segmento di nefrone da progenitori renali sono capiti male. Qui, abbiamo usato il pronefro zebrafish per studiare la segmentazione del nefrone. Abbiamo trovato che progenitori nefrone zebrafish subiscono modifiche elaborate spatiotemporal espressione di molti geni prima dell'adozione di un destino di segmento. Inizialmente, due domini di progenitori del nefrone sono stabiliti, allora sono suddivisi e delimitano i segmenti del nefrone individuali. Utilizzando modelli genetici genetiche e chimiche del deficit (RA) l'acido retinoico, abbiamo scoperto che RA modula formazione progenitrice rostrale. Per delineare percorsi a valle, abbiamo abbattuto il fattore di trascrizione irx3b e trovato che disciplina la dimensione di segmento del tubulo prossimale e distale del segmento differenziazione. I nostri risultati suggeriscono un modello per cui modelli RA inizio campo di progenitori del nefrone, con successivi fattori come irx3b che agisce per affinare successivamente sottodomini progenitore e garantire l'attivazione di programmi di gene specifico segmento.
Wt1a, Foxc1a E Il Mediatore Tacca Rbpj Fisicamente Interagire E Regolano La Formazione Dei Podociti Nello Zebrafish
Podociti aiutano a formare che la barriera di filtrazione glomerulare sangue nel rene e loro lesioni o perdita conduce alla malattia renale. Wilms' tumore soppressore-1 (Wt1) e i fattori di trascrizione FoxC1/2, come pure tacca di segnalazione, sono stati implicati come importanti regolatori del Podocita destino. Non è noto se questi fattori funzionano in parallelo o in sequenza su bersagli diversi gene o come complessi di transcriptional di ordine superiore su geni comuni. Qui, usiamo il zebrafish per dimostrare che gli embrioni trattati con morpholinos contro wt1a, foxc1a, o la tacca transcriptional mediatore rbpj sviluppare meno podociti, come determinato dall'espressione wt1b, hey1 e Nefrina, mentre gli embrioni carenti in due di questi fattori mancano completamente podociti. Da GST-pull-down e co-immunoprecipitazione esperimenti ci mostrano che Wt1a, Foxc1a e Rbpj possono interagire fisicamente con l'altro, considerando che solo Rbpj si lega al dominio intracellulare di Notch (NICD). Dosaggi di transattivazione, combinazioni di Wt1, FoxC1/2 e NICD sinergicamente inducono il promotore di Hey1 e hanno effetti additivi o repressivi sul promotore Podocalixina, a seconda del dosaggio. Presi insieme, questi dati suggeriscono che Wt1 FoxC1 e/2, Notch signaling convergono su geni bersaglio comune dove interagiscono fisicamente per regolare un programma specifico del Podocita gene. Questi risultati ulteriormente la nostra comprensione i circuiti transcriptional responsabile Podocita formazione e differenziazione durante lo sviluppo del rene.
