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Articles by Stephen I. Lentz in JoVE
JoVE Neuroscience
在单个细胞中的线粒体DNA复制的可视化EDU信号放大
1Michigan Research Community, Undergraduate Research Opportunity Program, University of Michigan, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology, and Diabetes, University of Michigan
我们制定了一个敏感的技术标签在单个细胞中新合成的线粒体DNA（mtDNA），为了研究线粒体DNA的生物合成。该技术结合了一个酪胺信号放大（TSA）协议EDU纳入可视化的神经元亚细胞车厢内线粒体DNA的复制。
JoVE Clinical and Translational Medicine
三维成像伤害表皮内神经纤维在人体皮肤活检
1Department of Neurology, University of Michigan, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan
为了研究伤害表皮内神经纤维（IENFs）在痛苦神经病（PN）的变化，我们开发的协议，可以直接检查观察伤害IENFs的三维形态变化。三维分析IENFs的有潜力评估的形态变化IENF PN。
Other articles by Stephen I. Lentz on PubMed
磷脂酰肌醇-3 激酶和 Akt 效应器调解胰岛素样生长因子-我在背根神经节细胞的神经保护作用。
胰岛素样生长因子-我 (胰岛素样生长因子-我) 保护周围神经系统的神经元细胞凋亡，但基础从信号转导通路还不太清楚。我们研究胰岛素样生长因子-介导的胚胎背根神经节 (DRG) 细胞信号传导。背根节神经元表达胰岛素样生长因子-我受体 (胰岛素样生长因子-IR) 和胰岛素样生长因子-我激活磷脂酰肌醇-3 激酶 (肌醇） / Akt 通路。高糖暴露诱导细胞凋亡，而抑制胰岛素样生长因子-我通过肌醇/Akt 通路。胰岛素样生长因子-我肌醇/Akt 通路的刺激 phosphorylates 三个已知的 Akt 效应器： 生存转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白 (CREB) 和促凋亡效应蛋白糖原合酶激酶-3beta (GSK 3beta) 和 forkhead (FKHR)。胰岛素样生长因子-我规定了核一级通过积累的背根节神经元细胞核、 增加的 CREB 介导的转录和核排斥 FKHR 的磷酸化 Akt 的生存。高血糖增加 pro 凋亡 Bcl 蛋白 Bim （FKHR 转录目标） 的表达。但是，胰岛素样生长因子-我没有规定 Bim 或抗凋亡 Bcl-xl 蛋白表达水平，这表明，胰岛素样生长因子-我神经保护作用不是通过其表达的调节。高糖也诱使启动器半胱氨酸蛋白酶-9 的损失和增加半胱氨酸蛋白酶-3 的乳沟里，影响受阻胰岛素样生长因子-我。这些数据表明，胰岛素样生长因子-我可以防止背根节神经元凋亡，通过调节肌醇/Akt 通路效应器，包括葛兰素史克 3beta、 CREB 和 FKHR，并通过阻止半胱氨酸蛋白酶激活。
荧光共振能量转移报告属性的 Syntaxin1a 与 Munc18-1 在体内的相互作用。
Syntaxin1A，神经特定 N-ethylmaleimide-敏感因子附着蛋白受体蛋白对神经递质的释放，隔离形式 N 终端阿尔法螺旋束封闭构象折叠后网罗母题 (H3 域），从而限制与同源圈套的 H3 域相互作用至关重要。Munc18-1，神经特定成员的 Sec1/Munc18 蛋白家族，将绑定到 syntaxin1A，稳定这封闭的构象。我们使用荧光共振能量转移 （音品） 完整细胞的 Munc18-1/syntaxin1A 相互作用的特点。作为人类胚胎肾人胚胎肾 293-S3 中的供、 受体对和肾上腺嗜铬细胞有人增强蓝绿色荧光蛋白-Munc18-1 和水晶 variant 类型的增强黄色荧光蛋白-syntaxin1A 或这些蛋白的突变体。明显衡量音品效率与补充结果毫不含糊地验证音品和提供音品效率空间映射使用两个独立的办法。此外，加强了蓝绿色荧光蛋白-Munc18-1 和水晶 variant 类型的增强黄色荧光蛋白 syntaxin1A colocalized 与高尔基标记和展出音品早时候表达时，而强等离子膜共定位，具有相似的音品值，显然在稍后的时间。贩卖到细胞质膜的 syntaxin1A 是依赖于 Munc18-1 的存在。Syntaxin1A(L165A/E166A)、 一打开构象的突变种和 syntaxin1A(I233A)，H3 域点突变，表现出明显的音品效率，是从控制减少约 70%。相比之下，H3 域突变体 syntaxin1A(I209A) 有没有影响。通过使用 phosphomimetic 突变体的 Munc18-1，我们还设立该 Ser 313、 Munc18-1 蛋白激酶 C 的磷酸化网站和苏氨酸-574、 细胞周期蛋白依赖性激酶 5 磷酸化站点、 规范 Munc18-1/syntaxin1A 相互作用在人胚胎肾 293-S3 和肾上腺嗜铬细胞中。我们得出的结论音品成像在活细胞中的可能允许相关的规例的 Munc18-1/syntaxin1A 相互作用对 Ca(2+) 调节分泌事件。
Tomosyn Syntaxin 1A 相互作用中牛肾上腺嗜铬细胞的受体介导的调节。
Tomosyn，确定为 Q 网罗 syntaxin 1A，绑定伙伴可溶性 R 网罗蛋白被认为是设置为 neurosecretion 的融合主管网罗配合物水平的关键。到目前为止，一直没有直接评价的动态 tomosyn 网罗配合物通过哪些 tomosyn 过境或哪个 tomosyn 网罗到配合物受分泌需求的程度。在这里，我们采用生化和光学的方法来描述 tomosyn syntaxin 1A 配合物中的动态属性住肾上腺嗜铬细胞。我们证明促泌刺激导致细胞质液从 tomosyn 到细胞质膜区域快速移位和此易位是与 tomosyn syntaxin 1A 互动，包括增加循环的 tomosyn 到 tomosyn 网罗配合物中增加相关联。促泌诱导的相互作用强烈减少了药理作用抑制 Rho 相关卷线圈成型激酶，符合调查结果表明 RhoA 促泌诱导激活的结果。刺激肾上腺嗜铬细胞溶血磷脂酸，一种 nonsecretory 的刺激，强烈激活 RhoA，导致对 tomosyn 类似的应用促泌的影响。在 PC 12 细胞超量表达 tomosyn，存在溶血磷脂酸促泌刺激导致减少诱发分泌反应，被淘汰出局后的 Rho 相关卷线圈成型激酶抑制的效果。此外，这种效果需要 tomosyn 和 syntaxin 1A 完好无损的相互作用。因此，tomosyn syntaxin 1A 互动促泌激活响应调制是允许动态调节分泌反应的一个重要机制。
糖尿病神经病变的小鼠模型。
糖尿病神经病变 (DN) 是一种削弱 1 型和 2 型糖尿病的并发症。DN 的啮齿动物模型不完全复制人类患者中观察到的病理。我们仔细研究 DN 菌素 (STZ)-诱导 [B6] 和自发的 1 型糖尿病 [B6Ins2(Akita)] 和 [B6-db/db、 BKS-db/db] 自发性 2 型糖尿病。尽管持续高血糖，治疗 STZ B6 和 B6Ins2(Akita) 小鼠人想去 DN 的发展。相比之下，DN 制定两种类型 2 糖尿病模型： B6-db/db 和 BKS-db/db 小鼠。持续的高血糖和 B6-db/db 小鼠 DN 的发展需要增加高脂饮食虽然 BKS-db/db 小鼠发达国家严重 DN 和仍然是标准鼠标周梁淑怡议员对高血糖。我们的数据支持的遗传背景和饮食影响 DN 的发展，和发展新模式的 DN 时应考虑的假设。
用于创建和评估小鼠模型的糖尿病神经病变的标准。
糖尿病神经病变 (DN) 是严重和使人虚弱的并发症，两者的 1 型和 2 型糖尿病。尽管紧密的研究努力到多个方面的这种并发症，包括血管和神经的代谢紊乱，唯一的治疗仍然是 euglycemia 的维修。负责 DN 机制的基本研究依赖于使用最合适的动物模型。基因操纵的到来已移动到最前沿的人类疾病小鼠模型。插入或删除基因在人类患者中受影响的能力提供了独到的见解，纳入疾病进程 ；然而，小鼠仍人类并不在解释这些动物从派生的数据仍有困难。大量的研究进行了调查而小鼠所述 DN 但很难来比较这些研究与对方或人类 DN 由于实验包括背景应变、 糖尿病的类型、 感应方法和持续时间的糖尿病、 动物的年龄和性别的差异。这项检讨描述当前使用的 DN 动物模型。我们遵循标准化的糖尿病感应议定书和设计和执行一套震撼参数进行分类发展和严重程度的 DN。通过应用标准的协议，我们希望以方便的比较和 DN 跨不同背景菌株，希望发现大多数人类像模型，用来测试潜在疗法的表征。
过氧化氢诱导 Akt 磷酸化调节 Bax 活化。
活性氧物种如过氧化氢 (H(2)O(2)) 参与调节细胞命运的积极和消极的许多细胞过程。H(2)O(2)，作为细胞内信使，将激活磷脂酰肌醇-3 激酶 (肌醇） 和其下游的目标 Akt，并促进细胞存活。本研究的目的是了解这种机制通过哪些肌醇/Akt 信号转导促进 SH SY5Y 神经母细胞瘤细胞的生存。我们表现出肌醇/Akt 介导的促凋亡 Bcl-2 家庭成员 Bax 的磷酸化。这个磷酸化抑制细胞凋亡和促进细胞存活。增加的生存面前 H(2)O(2) 由于 LY294002，抑制剂肌醇激活而受阻。LY294002 阻止 Bax 磷酸化和 Bax 易位导致线粒体、 细胞色素 c 释放、 半胱氨酸蛋白酶-3 活化和细胞死亡。集体，这些结果显示机制由哪些 H (2) O (2)-肌醇/Akt 诱导的活化影响 Bax 的翻译后修饰和可灭活细胞死亡机制的一个关键组成部分。
线粒体 DNA (mtDNA) 生物发生： 可视化和 BrdU 决斗纳入和 EdU 到新合成的 MtDNA 体外。
线粒体是细胞能量的主要监管机构，一大批审查调节线粒体动力学与生物发生在健康和患病情况研究的重点。监测线粒体生物发生学的一种方法是线粒体 DNA (mtDNA) 复制的速度进行测量。我们开发敏感技术，研究线粒体基因复制的神经元亚细胞车厢内可视化新合成的 mtDNA 中单独的单元格。技术结合 BrdU 和/或教育将纳入 mtDNA tyramide 信号放大议定书 》。我们采用这种方法，可视化和测量 mtDNA 生物发生在单个单元格。EdU 的贴标过程允许通过允许成立为法团的比较与其他细胞内标记因为它不需要苛刻酸或酶消化恢复 BrdU 抗原表位需更全面的结果。此外，利用 BrdU 和 EdU 允许连续脉冲大通实验要遵循细胞内的线粒体基因复制本地化。量化线粒体生物发生学的能力包括神经炎和神经退行性疾病的多个细胞疾病的发病机制中所涉及的线粒体动力学中调查改建为提供必不可少的工具。
经国先生独立 MTORC1 激活膳食蛋白诱导胰腺外分泌生长过程。
日粮蛋白质可以刺激胰腺增长缺席 CCK 释放，但经国先生独立生长调节上有小的数据。若要标识即蛋白质刺激胰腺生长缺席的 CCK 释放的机制，C57BL/6 控制和经国 null 雄性小鼠被喂食正常蛋白 （14%酪蛋白） 或高蛋白质 (75%酪蛋白） 周梁淑怡议员 7 天。增加了 C57BL/6 小鼠 32%和 26%经国 null 小鼠胰腺的重量喂高蛋白质周梁淑怡议员。控制小鼠胰腺重量的变化是由于细胞肥大和增生由于在 DNA-蛋白质比率、 总 DNA 内容和 DNA 合成增加。经国先生 null 小鼠胰腺增长几乎完全是由于肥大的 DNA-蛋白质比率和单元格大小越来越没有 DNA 含量或 DNA 合成明显增加。ERK、 钙调神经磷酸和哺乳动物的雷帕霉素复杂 1 (mTORC1) 的目标，激活模型的诱导经国先生的生长，但没有差异中 ERK 或之间的钙调神经磷酸激活禁食和美联储经国 null 小鼠。相比之下，喂养后增加 mTORC1 激活，并且激活的持续时间延长小鼠喂高蛋白质周梁淑怡议员与周梁淑怡议员正常蛋白相比。被完全抑制胰腺的重量和 RNA 含量的变化，和蛋白质含量的变化部分缓解，当 mTORC1 抑制剂雷帕霉素周梁淑怡议员高蛋白质喂养期间管理。因此需要膳食蛋白诱导胰腺癌生长在没有经国先生长期的 mTORC1 激活。
Vulnerability of the Retinal Microvasculature to Oxidative Stress: Ion Channel-dependent Mechanisms
Although oxidative stress is a hallmark of important vascular disorders such as diabetic retinopathy, it remains unclear why the retinal microvasculature is particularly vulnerable to this pathophysiological condition. We postulated that redox-sensitive ion channels may play a role. Using H(2)O(2) to cause oxidative stress in microvascular complexes freshly isolated from the adult rat retina, we assessed ionic currents, cell viability, intracellular oxidants, and cell calcium by using perforated-patch recordings, trypan blue dye exclusion, and fura-2 fluorescence, respectively. Supporting a role for the oxidant-sensitive ATP-sensitive K (K(ATP)) channels, we found that these channels are activated during exposure of retinal microvessels to H(2)O(2). Furthermore, their inhibition by glibenclamide significantly lessened H(2)O(2)-induced microvascular cell death. Additional experiments established that by increasing the influx of calcium into microvascular cells, the K(ATP) channel-mediated hyperpolarization boosted the vulnerability of these cells to oxidative stress. In addition to the K(ATP) channel-dependent mechanism for increasing the lethality of oxidative stress, we also found that the vulnerability of cells in the capillaries, but not in the arterioles, was further boosted by a K(ATP) channel-independent mechanism, which our experiments indicated involves the oxidant-induced activation of calcium-permeable nonspecific cation channels. Taken together, our findings support a working model in which both K(ATP) channel-independent and K(ATP) channel-dependent mechanisms render the capillaries of the retina particularly vulnerable to oxidative stress. Identification of these previously unappreciated mechanisms for boosting the lethality of oxidants may provide new targets for pharmacologically limiting damage to the retinal microvasculature during periods of oxidative stress.
