Mettendo Il Genoma Di Leishmania Al Lavoro: Genomica Funzionale Di Trasposone Intrappolamento E Delineamento Di Espressione

Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. Jan, 2002  |  Pubmed ID: 11839181

Leishmania sono importanti protozoi patogeni degli esseri umani nelle regioni temperate e tropicali. Lo studio dell'espressione genica durante il ciclo infettivo, in mutanti o dopo stimoli ambientali o chimici, è un potente approccio alla comprensione di virulenza del parassita e lo sviluppo di misure di controllo. Come altri trypanosomatids, espressione di gene di Leishmania è mediata da un processo di transcriptional policistronico che pone maggiore enfasi sul espresione meccanismi normativi tra cui elaborazione di RNA e proteina traduzione. Con l'imminente completamento del genoma Leishmania, approcci globali Agrimensura espressione di mRNA e proteine sono ora fattibili. Il nostro laboratorio ha sviluppato il mariner trasposone drosofila come uno strumento per intrappolare Leishmania geni e studiare il loro regolamento in forma di fusioni di proteine; un approccio classico in altri microbi che può essere definito 'proteogenomics'. Allo stesso modo, abbiamo sviluppato dei reagenti e approcci per la creazione di DNA microarrays, che permettono la misura dell'abbondanza di RNA attraverso il genoma del parassita. Progressi in questi settori promette di aumentare notevolmente la nostra comprensione dei meccanismi globali di regolazione genica a livelli di mRNA e la proteina e condurre all'identificazione di molti geni candidati coinvolti nella virulenza.

Trypanosomatid Non-patogeni Protozoi Come Una Piattaforma Per La Produzione E La Ricerca Della Proteina

Protein Expression and Purification. Jul, 2002  |  Pubmed ID: 12135552

Tutti i sistemi di espressione della proteina eucariotica attualmente esistenti sono basati su forme di vita autonome. Per sfruttare i vantaggi pratici potenziali associati con organismi parassitari, che abbiamo sviluppato un nuovo sistema di espressione della proteina basato su Leishmania tarentolae (Trypanosomatidae), un protozoo parassita di lucertole. Per ottenere la trascrizione forte, i geni di interesse sono stati integrati nella gene RNA ribosomiale della subunità piccola. I livelli di espressione ottenuti sono stati fino a 30 mg di proteina ricombinante per litro di coltura di sospensione e aumentato linearmente con il numero di copie del gene integrato. Per valutare il sistema potenziale per la produzione di proteine traduzionali modificate, abbiamo espresso eritropoietina umana in L. tarentolae. La proteina ricombinante isolata dai supernatanti cultura era biologicamente attiva, elaborati in modo nativo al N-terminale e N-glicosilata. La N-glicosilazione è stato eccezionalmente omogenea, con un oligosaccaride mammiferi-tipo biantennary e contabili per la struttura del nucleo Man(3)GlcNAc(2) > 90% dei presenti i glicani. L. tarentolae è così il primo descritto organismo eucariote unicellulare biotecnologicamente utile produrre biantennary completamente galattosilate, core-alfa-1,6-fucosylated N-glicani.

Caratterizzazione Di Quinonoid-diidropteridina Reduttasi (QDPR) Dal Più Basso Dell'eucariota Leishmania Major

The Journal of Biological Chemistry. Oct, 2002  |  Pubmed ID: 12151409

Biopterina è necessaria per la crescita del parassita protozoo Leishmania e viene recuperato dall'host tramite l'attività di un romanzo biopterina transporter (BT1) e ad ampio spettro pteridina reduttasi (PTR1). Qui ci caratterizzano Leishmania major quinonoid-diidropteridina reduttasi (LmQDPR), l'enzima chiave necessaria per la rigenerazione e la manutenzione delle piscine (4) biopterina H. LmQDPR Mostra buona omologia di metazoi quinonoid-diidropteridina reduttasi e la conservazione dei domini implicati nella catalisi e regolamento. A differenza di altri organismi, LmQDPR è codificato da una matrice tandemly ripetuta 8-9 esemplari contenenti LmQDPR plus due altri geni. QDPR mRNA e l'attività enzimatica sono stati espressi a livelli simili in tutto il ciclo infettivo. L'optimum di pH, proprietà cinetiche e specificità di substrato di LmQDPR purificato sono stati trovati per essere simile a quello di altri qDPRs, anche se mancava di un'attività importante per non quinonoid Pteridine. Questi e altri dati suggeriscono che la LmQDPR è improbabile per codificare l'attività della riduttasi diidrobiopterina (PTR2) descritto in precedenza. Allo stesso modo LmQDPR non è inibita da una serie di antifolati mostrando attività anti-leishmanial oltre quello imputabile alla diidrofolato reduttasi o PTR1 inibizione. attività di qDPR è stato trovato nei lisati greggio del Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi, ulteriormente sottolineando l'importanza della biopterina H (4) nel corso di questa famiglia di parassiti umani.

Leishmania LPG3 Codifica Un Omologo GRP94 Necessario Per La Sintesi Di Phosphoglycan Implicati Nella Virulenza Del Parassita, Ma Non La Redditività

The EMBO Journal. Sep, 2002  |  Pubmed ID: 12198148

Leishmania promastigotes esprimere una cella abbondante superficie glicoconiugati, lipophosphoglycan (GPL). LPG contiene un polimero del disaccaride-fosfato ripetizione unità Galbeta1, 4Manalpha1-PO4, condivisa da altre molecole evolutivamente regolamentati implicati nella virulenza del parassita. Complementazione funzionale di una Leishmania donovani LPG-difettoso mutante (OB1) accumulando un tronco LPG contenente solo il residuo Manalpha1-PO4 della prima ripetizione unità identificata LPG3, l'omologo di Leishmania del chaperone mammiferi reticolo endoplasmatico (ER) GRP94. LPG3 assomiglia a GRP94, come esso si localizza al parassita ER, e mutanti lpg3(-) mostrano difetti tra cui down-regulation di superficie proteine GPI ancorate e lievi effetti su altri glycoconjugates. LPG3 lega le proteine cellulari e la Leishmania infantum GRP94 ortholog è altamente immunogenica, suggerendo un ruolo potenziale nel dirigere la risposta immunitaria. Tuttavia, lpg3(-) null mutanti crescono normalmente, sono completamente difettoso nella sintesi di phosphoglycans, e LPG3 mRNA è regolata inerente allo sviluppo, ma non da stress o calore. Così il ruolo di LPG3/GRP94 in Leishmania metabolismo differisce significativamente da altri eucarioti. Come gli altri glicoconiugati sintetico percorsi in questo parassita, sua attività è focalizzata su molecole implicati nella virulenza, piuttosto che di redditività.

Protozomics: Trypanosomatid Genetica Parassita Diventa Maggiorenne

Nature Reviews. Genetics. Jan, 2003  |  Pubmed ID: 12509749

Trypanosomatid protozoi causano malattie importanti degli esseri umani e il loro bestiame domestico. Vari strumenti di genetici molecolari sono ora permettendo rapidi progressi nella comprensione di molti degli aspetti unici della biologia molecolare e cellulare di questi organismi. Diploidy e la mancanza o la difficoltà della traversata sessuale è stata una sfida per la genetica avanti, ma potente selezioni e complementazione funzionale hanno aiutato a superarla in Leishmania. Interferenza del RNA è stato adattato per la genetica avanti in tripanosomi, in cui è anche un potente strumento per la genetica inversa. È interessante notare che, l'efficacia dei diversi strumenti genetici ha guidato la ricerca in diversi aspetti della biologia di questi parassiti.

Mutagenesi Transposon Di Mycobacterium Marinum Identifica Un Locus Che Collega Pigmentazione E Sopravvivenza Intracellulare

Infection and Immunity. Feb, 2003  |  Pubmed ID: 12540574

Micobatteri patogeni di sopravvivono e replicano all'interno dei macrofagi host, ma i meccanismi molecolari coinvolti in questo passaggio necessario nella patogenesi dell'infezione non sono completamente chiari. Mycobacterium marinum è stato recentemente utilizzato come modello per gli aspetti della patogenesi della tubercolosi a causa della sua stretta relazione genetica di Mycobacterium tuberculosis e a causa delle analogie nella patologia e corso di infezioni causate da questo organismo nella sua naturale ospita, pesci e rane, con tubercolosi negli esseri umani. Per avanzare l'utilità del modello M. marinum, abbiamo sviluppato la mutagenesi transposon efficiente dell'organismo utilizzando una trasposone basati su mariner di Drosophila melanogaster. Per determinare l'efficienza di trasposizione, abbiamo analizzato mutanti pigmentazione dalla libreria mutante trasposone. Oltre alle inserzioni in quattro geni noti nella via di biosintesi del pigmento, due inserimenti in nuovi geni sono stati identificati nella nostra biblioteca mutante. Uno di questi è un inibitore della biosintesi carotenoide putativo. Il secondo inserimento inaspettato è una regione intergenic tra due geni omologhi a Rv2603c e Rv2604c di M. tuberculosis. Oltre a un difetto di pigmentazione, questa mutante ha mostrato maggiore suscettibilità di ossigeno singoletto e scarsamente crebbe in macrofagi murini. Complementazione con M. tuberculosis DNA genomico che comprende Rv2603c di Rv2606c corretto i difetti della pigmentazione e crescita del mutante. Questi dati dimostrano l'utilità di mutagenesi transposon mariner-base di M. marinum e quello M. marinum può essere utilizzato per studiare la funzione di M. tuberculosis geni coinvolti nella replicazione e sopravvivenza intracellulare.

Identificazione Funzionale Di Galactosyltransferases (SCGs) Richiesto Per Modifiche Specie-del Lipophosphoglycan Adhesin Controllo Interazioni Volare Leishmania Major-sabbia

The Journal of Biological Chemistry. May, 2003  |  Pubmed ID: 12604613

Lipophosphoglycan (GPL) è una molecola di superficie abbondante che svolge ruoli chiave nel ciclo infettivo della Leishmania major. La caratteristica dominante del GPL è un polimero di phosphoglycan (PG) (6Galbeta1,4Manalpha1-PO(4)) unità ripetente. Nel L. major queste sono ampiamente sostituite con catene laterali Gal(beta1,3), che sono necessari per l'associazione di intestino lectine e sopravvivenza. Abbiamo utilizzato evolutivi polimorfismi in transfezioni struttura e cross-specie di LPG a recuperare i geni che codificano il LPG lato catena beta1, 3-galactosyltransferases (betaGalTs). Una famiglia dispersa di sei geni SCG è stata recuperata, cui predetta proteine esposte caratteristiche degli eucarioti GalTs. Almeno quattro di queste proteine hanno mostrato significative LPG lato catena betaGalT attività; SCG3 esposto l'avvio attività di GalT considerando che SCG2 ha mostrato sia avviato e allungamento attività GalT. Tuttavia, l'attività del SCG2 era dipendente dal contesto, essendo in gran parte silenziosa nella sua normale milieu genomico, e diversi ceppi mostrano variazioni nella misura di LPG galactosylation. Così il genoma major L. codifica per una famiglia di SCGs con diverse specificità e attività, e proponiamo che modelli di ceppo specifico LPG galactosylation riflettano differenze nella loro espressione.

Miglioramenti Nell'efficienza Di Trasfezione E Prove Di Interferenza Del RNA (RNAi) Si Avvicina Nel Protozoo Parassita Leishmania

Molecular and Biochemical Parasitology. May, 2003  |  Pubmed ID: 12742588

Approcci che eliminare direttamente espressione del mRNA sono ideali per le applicazioni di genetica inversa in microbi eucarioti che sono diploidi asessuate, ad esempio il protozoo parassita Leishmania. RNA interference (RNAi) approcci hanno avuto successo in molte specie, comprese le relative parassita Trypanosoma brucei. Per le prove di RNAi in Leishmania, abbiamo sviluppato protocolli migliorate per trasfezione transiente e stabile di DNA, raggiungere efficienze di fino a 25 e 3%, rispettivamente. Ciò ha facilitato la RNAi prove presso il locus alfa-tubulina, cui inibizione dà un forte fenotipo letale in trypanosomatids. Tuttavia, la trasfezione transiente o stabile di DNAs codifica mRNAs per un costrutto di alfa-tubulina gambo-ciclo e GFP per monitorare la transfezione provocato nessun effetto sulla morfologia del parassita, crescita o espressione di tubulina in Leishmania major o L. donovani. Trasfezione transiente di un 24-nucleotide double-stranded alfa-tubulina siRNA ha anche avuto alcun effetto. Risultati simili sono stati ottenuti in studi targeting un gene GFP introdotto con un costrutto del gambo-ciclo GFP. Questi dati suggeriscono che tipici RNAi strategie non possono funzionare efficacemente in Leishmania e aumentare la possibilità che la Leishmania è naturalmente carente per attività di RNAi, come Saccharomyces cerevisiae. Vengono discusse le implicazioni per la biologia del parassita, amplificazione genica e l'analisi genetica.

Identificazione Di Geni Che Codificano Per Arabinosyltransferases (SCA) Modifiche Dello Sviluppo Di Lipophosphoglycan Necessaria Per La Trasmissione Di Sand Fly Di Leishmania Major Di Mediazione

The Journal of Biological Chemistry. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12750366

A passaggi chiave nel ciclo infettivo patogeni devono aderire alle cellule bersaglio, ma altre volte il distacco è necessaria per la trasmissione. Durante le infezioni sand fly dal protozoo parassita Leishmania major, associazione di replica promastigotes è mediata da galattosil catena laterale (scGal) le modifiche di phosphoglycan si ripete della maggiore superficie adhesin, lipophosphoglycan (GPL). Rilascio è mediata da arabinosyl (Ara) tappatura dei residui scbetaGal LPG su differenziazione sul palco metacyclic infettiva. Abbiamo usato intraspecifica polimorfismi di struttura LPG per sviluppare una strategia genetica che portano all'identificazione di due geni (SCA1/2) mediazione scAra tappatura. Questi LPG lato catena beta1, 2-arabinosyltransferases (scbetaAraTs) mostrano motivi glycosyltransferase canonica, e loro sovraespressione conduce a elevati microsomiale scbetaAraT attività. Anche se il livello dei tappi scAra è massimo in parassiti metacyclic, scbetaAraT attività è massima nelle cellule in fase log. Perché quantitativa immunolocalization studi suggeriscono che questo non è mediato dal sequestro della SCA scbetaAraTs dall'apparato di Golgi durante la fase di log, regolamento dei precursori dell'Ara attivati può controllare LPG arabinosylation in vivo. I geni SCA definiscono una nuova famiglia di eucarioti betaAraTs e rappresentano il romanzo inerente allo sviluppo regolamentata LPG-modifica attività identificate in Leishmania.

I Ruoli Di Lipophosphoglycan (GPL) Nello Stabilimento Di Leishmania Infezioni Gravi in Mammalian Host

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12869694

La cella abbondante superficie glicolipide lipophosphoglycan (GPL) è stata implicata in molti passaggi del ciclo infettivo di Leishmania da test biochimici. La presenza di altre superficie abbondante o secrete glycoconjugates condivisione domini LPG, tuttavia, ha portato all'incertezza circa il contributo relativo del GPL in vivo. Qui abbiamo usato un Leishmania major lpg1-mutante, che manca di LPG da solo e Mostra virulenza attenuata, a sezionare il ruolo del GPL nell'istituzione delle infezioni dei macrofagi in vivo. lpg1 - era altamente suscettibile di complemento umano, aveva perso la capacità di inibire transitoriamente phagolysosomal fusion e fu sensibile ossidante. Studi di mutanti del mouse difettosi nei pertinenti meccanismi di difesa hanno confermato il ruolo di GPL in resistenza ossidante ma messa in discussione l'importanza dell'inibizione transitoria di fusione di phagolysosomal per la sopravvivenza dei macrofagi Leishmania. Inoltre, l'attività limitata litico di complemento del mouse sembra essere un meccanismo di difesa inefficace patogeno in vitro e in vivo, a differenza di eserciti umani. Al contrario, lpg1-parassiti associato C3b e resistevano proteasi e basso pH normalmente, macrofagi è entrato in modo efficiente e in silenzio e continuarono ad inibire host-signaling pathways. Questi studi illustrano il valore degli approcci meccanicistici concentrandosi su percorsi di difesa sia parassita e ospite nel dissezionare i ruoli biologici specifici dei fattori di virulenza complessi come LPG.

Glycosylinositolphospholipids Ed Etere Fosfolipidi Non Sono Richiesti Per La Virulenza Di Amastigote O Per Inibizione Dell'attivazione Dei Macrofagi Da Leishmania Major

The Journal of Biological Chemistry. Nov, 2003  |  Pubmed ID: 12944391

Etere fosfolipidi sono componenti importanti delle membrane degli esseri umani e Leishmania. Nei protozoi parassiti che si verificano separatamente o come parte di glicosilfosfatidilinositolo (GPI) delle molecole implicati nella virulenza, come lipophosphoglycan (GPL), più piccolo glycosylinositolphospholipids (GIPLs) e proteine GPI ancorate. Abbiamo generato null mutanti Leishmania major alkyldihydroxyacetonephosphate sintasi (ADS), il primo passo impegnato della sintesi dei lipidi etere. Analisi enzimatica e completa analisi di spettrometria di massa ha mostrato che ads1-knock-out mancava tutti i fosfolipidi di etere, tra cui plasmalogens, GPL e GIPLs. Leishmania ads1 - rappresenta quindi il prima etere sintetizzare lipidi eucariote per cui potrebbe essere ottenuto un mutante completamente null. Notevolmente ads1 - è cresciuto bene e mantenuto zattere lipidiche (membrane resistenti alle detergente). Nei test di virulenza assomigliava LPG-carenti L. major, tra cui sensibilità per complementare e l'impossibilità di sopravvivere la fase iniziale dell'infezione da parte dei macrofagi. Allo stesso modo ha mantenuto la capacità di inibire la segnalazione delle cellule ospite e per formare amastigoti infettive da alcuni parassiti sopravvissuti il difetto di costituzione. Queste scoperte contatore attuali proposte che GIPLs sono necessari per la sopravvivenza di amastigote in mammalian host o quel parassita lyso-alchile o alkylacyl-GPI ancore sono solo responsabile per l'inibizione dell'attivazione dei macrofagi.

Identificazione Genetica Funzionale Di PRP1, Un Membro Di Superfamiglia Trasportatore ABC Che Conferisce Resistenza Pentamidina in Leishmania Major

Molecular and Biochemical Parasitology. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12946844

Pentamidina (penna) è un agente di seconda linea nel trattamento della leishmaniosi cui modalità di azione e di resistenza non è ben compreso. Qui, abbiamo utilizzato una strategia genetica per la ricerca di loci in grado di mediare la resistenza PEN (PENr) quando overexpressed in Leishmania major. Una libreria del cosmide navetta contenenti inserti di DNA genomici è stato transfected in wild-type promastigotes e proiettata per transfettanti PEN-resistente. Sono stati trovati due differenti contengono i cosmidi identificando il locus stesso, che ha differito da altri geni di resistenza di droga Leishmania conosciuti. Il gene PENr è stato mappato da delezione e transposon mutagenesi per un open reading frame (ORF) appartenendo alla P-glicoproteina (PGP) / MRP ATP-binding Superfamiglia trasportatore cassette (ABC) che abbiamo chiamato pentamidina proteina resistenza 1 (PRP1). Il predetta PRP1 proteina codifica 1.807 aminoacidi con la tipica struttura dimerica che coinvolge 10 domini transmembrane e due nucleotide-binding (NBDs). PRP1-mediata PENr potrebbe essere invertito di verapamil e PRP1 overexpressors hanno mostrato resistenza incrociata di antimonio trivalente ma non a pentavalente antimonio (glucantime). Anche se il grado di PENr era modesto (1,7-a 3.7-fold), questo può essere significativo nella clinica farmacoresistenza dato l'efficacia marginale della penna contro la Leishmania.

Persistenza Senza Patologia in Deficit Di Phosphoglycan Leishmania Major

Science (New York, N.Y.). Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12947201

Infezioni da Leishmania comportano una fase acuta di replica all'interno di macrofagi, tipicamente associato alla patologia. Dopo il recupero parassiti persistono per lunghi periodi, che possono portare a grave malattia alla riattivazione. A differenza del ruolo dei fattori di host, fattori di parassita che influenzano la persistenza sono mal capiti. Leishmania major phosphoglycans carente (lpg2-) erano in grado di sopravvivere in sabbia mosche e macrofagi, ma mantenne la capacità di persistere indefinitamente in mammalian host senza indurre la malattia. Il lpg2 major L. - così fornisce una piattaforma per sondare fattori parassita implicati nella persistenza e il suo ruolo nella malattia e immunità.

Il Gene HTBF H Regione Media Resistenza Terbinafine in Leishmania Major

Molecular and Biochemical Parasitology. Sep, 2003  |  Pubmed ID: 12967714

Un Sistema in Vitro Per Studi Di Genetici E Di Sviluppo Di Leishmania Donovani Phosphoglycans

Molecular and Biochemical Parasitology. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 14550894

Glycoconjugates hanno dimostrato di svolgere ruoli importanti nello sviluppo di Leishmania. Tuttavia, la possibilità di studiare queste molecole e altri processi beneficerebbe notevolmente migliorati metodi per manipolazione genetica e l'analisi della fase amastigote. Questo è particolarmente impegnativo per L. donovani, agente della forma più grave di leishmaniosi, che possono rapidamente perdere virulenza durante la coltura in vitro. Qui riportiamo su un sottoriga clonale di un L. donovani 1S2D (LdBob o LdB), che differenzia facilmente da promastigotes di amastigoti in coltura e mantiene questa capacità durante la coltivazione estesa parassita in vitro. Questo derivato può essere placcato e transfected efficiente mentre coltivate come promastigotes o amastigoti. Soprattutto, LdB mantiene la capacità di differenziare mentre subendo alterazioni genetiche necessarie per la creazione di linee integrate e Knockout del gene. Come virulento L. donovani, LdB esibisce down-regulation di sintesi lipophosphoglycan (GPL) e up-regolazione della sintesi proteica A2 in amastigoti. Abbiamo mostrato che ritagli di LPG2, che codifica per un trasportatore di Golgi GDP-mannosio, eliminato phosphoglycan sintesi in amastigoti sono LdB. Questi e altri dati suggeriscono che sono amastigoti LdB sarà generalmente utile come un modello di differenziazione negli studi di espressione genica, virulenza, suscettibilità di droga e funzione glicoconiugati in L. donovani.

Sfingolipidi Sono Essenziali Per La Differenziazione, Ma Non Crescita in Leishmania

The EMBO Journal. Nov, 2003  |  Pubmed ID: 14609948

Sfingolipidi (SLs) giocano un ruolo fondamentale nelle cellule eucariote la formazione di zattere lipidiche, traffico di membrana e trasduzione del segnale. Qui abbiamo creato un mutante null SL nel protozoo parassita Leishmania major attraverso eliminazione mirata della chiave de novo enzima biosintetico serina palmitoiltransferasi subunità 2 (SPT2). Sebbene SLs sono tipicamente essenziali, spt2-Leishmania erano vitale, ma erano completamente carente nella sintesi del de novo sfingolipidi e mancava di inositolo glycosylinositol e altre SLs. notevolmente, parassiti spt2 mantenuto 'zattere lipidiche' come definiti dalla formazione membrana resistente detergente Triton X-100. Al momento dell'ingresso alla fase stazionaria spt2 - non è riuscito a differenziare per infettivi parassiti metacyclic e invece è morto. Morte avvenuta non da apoptosi o cambiamenti nell'espressione del gene metacyclic, ma da problemi catastrofici che portano all'accumulo di piccole vescicole caratteristiche della rete tubulo multivesicular corpo/multivesicular. Specificità di fase può riflettere le modifiche nella struttura della membrana, nonché elevate richieste nel traffico vescicolare necessaria per parassita rimodellamento durante la differenziazione. Suggeriamo che SL-carenti Leishmania forniscono un ambiente biologico utile per test di essenziali enzimi SL in altri organismi dove SL perturbazione è letale.

Vaccinazione Con Deficit Phosphoglycan Leishmania Major Protegge Topi Altamente Sensibili Da Virulento Sfida Senza Indurre Una Forte Risposta Th1

Journal of Immunology (Baltimore, Md. : 1950). Mar, 2004  |  Pubmed ID: 15004184

Immunità a lungo termine per Leishmania può richiedere la presenza di parassiti, ma precedenti tentativi di creare parassiti attenuati che persistono senza causare malattia hanno avuto un successo limitato. Poiché Leishmania major mutanti che la mancanza di lipophosphoglycan e altre phosphoglycans secreta, definito lpg2-, persistono indefinitamente nei topi infetti senza indurre alcuna malattia, abbiamo testato la loro capacità di fornire protezione a virulento sfida importante L.. In risposta alla stimolazione Ag, cellule da lpg2 - leishmanial topi infetti prodotto minimi livelli di IL-4 e IL-10, così come molto bassi livelli di IFN-gamma. Tuttavia, quando infettato da topi BALB/c lpg2-parassiti sono stati sfidati con virulento L. principali erano protetti dalla malattia. Così, questi report risultati su parassiti attenuati che può essere utilizzato per indurre la protezione a lungo termine contro la leishmaniosi e indicare che l'immunità indotta può essere mantenuta in assenza di una forte risposta Th1.

La Famiglia Del Gene LPG1 Di Leishmania Major

Molecular and Biochemical Parasitology. Jul, 2004  |  Pubmed ID: 15138063

In Leishmania major, il nucleo dell'abbondante superficie lipophosphoglycan (GPL) è strutturalmente correlato a quella del più piccolo glycosylinositolphospholipids (GIPLs) contenente galactosylfuranose (residui di Gal(f)) in un Gal(f) (beta1, 3) motivo di uomo. Tuttavia, eliminazione dei Gal putativo (f)-transferasi (Gal(f)T) LPG1 interessati Gal(f) incorporazione in LPG, ma non GIPLs. Abbiamo ipotizzato che il Gal GIPL presuntiva (f)-transferasi potrebbe essere omologhi a LPG1 e identificati tre geni correlati nel genoma principale L.. Questi erano chiamati LPG1L, LPG1R e LPG1G, l'ultimo dei quali è stato trovato in tre copie identiche si trova presso i telomeri dei cromosomi 5, 19 e 32 sulla base dei dati di progetto genoma Leishmania. Né LPG1 né suoi omologhi LPG1L e LPG1R sono stati coinvolti nella biosintesi di GIPLs, come un knockout triple lpg1(-)/lpg1l(-)/lpg1r(-) (il primo in Leishmania) crebbe normalmente e selvaggio-tipo livelli di Gal(f)-contenente GIPLs. In contrasto, iperespressione di questi tre ha condotto all'incorporazione di galattosio elevati nelle glicoproteine. GAL (f)-, contenente glicoproteine non è stata descritta in Leishmania ma a livelli elevati in altri trypanosomatids strettamente correlate tra cui Trypanosoma cruzi Crithidia, Leptomonas ed Endotrypanum e omologhi LPG1L e LPG1R sono stati rilevati in queste specie. Questi dati suggeriscono che le capacità di glico-sintetico di Leishmania e forse altri trypanosomatids possono essere più grande di quanto si pensasse, con alcune attività essendo 'criptico' in diversi lignaggi e potrebbero servire come serbatoi per variazione glicoconiugati durante l'evoluzione. Prove di futuri affronterà sia la famiglia LPG1G codifica l'ipotizzata Gal GIPL specifici (f) T.

Delineamento Di Espressione Usando I Microarrays Del DNA Genomici Casuali Identifica Geni Differenzialmente Espressi Associati a Tre Principali Fasi Di Sviluppo Del Parassita Protozoo Leishmania Major

Molecular and Biochemical Parasitology. Jul, 2004  |  Pubmed ID: 15138069

Per completare il suo ciclo di vita, parassiti protozoi del genere Leishmania sottoporsi ad almeno tre grandi transizioni dello sviluppo. Tuttavia, precedenti tentativi di identificare i geni che mostrano cambiamenti di fase regolata in abbondanza di trascrizione hanno reso relativamente pochi. Qui abbiamo usato expression profiling per valutare i cambiamenti nell'abbondanza di trascrizione in tre fasi: replica promastigotes e metacyclics di non replicare infettiva, che si verificano nel vettore sand fly e nella fase amastigote residente con macrofagi phagolysosomes nei mammiferi. I Microarrays sono stati sviluppati contenenti 11.484 prodotti PCR che comprendeva un certo numero di geni noti e 10.464 frammenti di DNA genomici casuale 1 kb. Matrici sono state ibridate in triplice copia e geni che mostrano due volte o maggiore cambiamenti negli esperimenti di 2/3 sono stati segnati come differenzialmente espressi. Notevolmente, solo circa uno per cento dell'espressione DNAs varia a seconda di questo criteri, in una fase confronto. Analisi Northern blot ha confermato il cambiamento previsto in abbondanza di mRNA per la maggior parte di questi (68%). Questo set di geni incluso la maggior parte di quelli precedentemente identificati nella letteratura come differenzialmente regolata così come un certo numero di nuovi geni. In particolare, Leishmania maxicircle trascrizioni hanno mostrate forte up-regulation in metacyclic e parassiti amastigote, probabilmente associati a cambiamenti nel metabolismo energetico parassita. Tuttavia, dati attuali suggeriscono che expression profiling utilizzando librerie di DNA fucile significativamente sottovaluta la portata delle trascrizioni regolamentate.

Utilizzo Di Mutagenesi in Vitro Navetta Engineered Trasposoni Mariner

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2004  |  Pubmed ID: 15153636

Progressi nella nostra comprensione del protozoo parassita Leishmania sono stata facilitata dallo sviluppo di strumenti molecolari e genetici. Un approccio potente per l'analisi e l'identificazione del gene è mutagenesi transposon. Questa operazione può essere eseguita direttamente in vivo, ma spesso è più conveniente generare trasposizioni in vitro per successive analisi in vivo, in un processo definito "shuttle mutagenesi". Il mariner elemento drosofila è adatto per applicazioni da sia rotta. Sono stati generati elementi Minimal mariner contenenti elementi cis-acting necessari per la trasposizione, che può essere ulteriormente modificati per adattarsi alle esigenze dello sperimentatore. Marcatori genetici aggiuntivi e/o i giornalisti possono essere introdotte, che sono utili per le procedure quali la mutagenesi inserzionale, sequenziamento shotgun o la generazione di proteina e fusioni trascrizionali per analisi successive. Ha attivo può essere generato facilmente seguendo espressione in Escherichia coli, ed efficienze del 10-3/obiettivo può essere ottenuto, permettere-ing la generazione delle librerie di inserimento grande transposon adatte per lo screening successivo in vivo. Questo capitolo spiega i passi necessari per purificare attivo Mos1 permettono e condurre una reazione in vitro trasposizione. Discutiamo anche alcune delle considerazioni relative alla progettazione e applicazione di elementi funzionali mariner (plasmidi donatore) rilevanti per gli studi di Leishmania e altri organismi.

Identificazione Di Un Mutante Compensativa (lpg2-REV) Di Leishmania Major in Grado Di Sopravvivere Come Amastigoti All'interno Dei Macrofagi Senza Glycoconjugates LPG2-dipendente E La Sua Importanza Alle Strategie Di Virulenza E Immunizzazione

Infection and Immunity. Jun, 2004  |  Pubmed ID: 15155672

Diverse specie di Leishmania si affidano a diverse estensioni glycoconjugates abbondanti, come lipophosphoglycan (GPL) e molecole correlate, nelle infezioni dei mammiferi. In precedenza, vi abbiamo mostrato che mutanti di delezione principali Leishmania manca il trasportatore di Golgi GDP-mannosio LPG2, che è necessaria per l'assemblaggio del phosphoglycan dominante (PG) ripete di GPL, erano in grado di sopravvivere in macrofagi. Questi mutanti di lpg2, tuttavia, mantenne la capacità di generare infezioni asintomatiche, persistenti nei topi. Al contrario, Ilg e colleghi hanno mostrato che la Leishmania mexicana LPG2 mutanti mantenuto virulenza per topi. Qui abbiamo identificato una popolazione di revertanti parziale del L. major lpg2-mutanti (designato lpg2(-)REV) che aveva riacquistato la capacità di replicarsi in macrofagi e indurre la patologia della malattia attraverso un cambio compensativo. Come il padre lpg2, il lpg2 revertant REV (-) è stato in grado di sintetizzare PGs LPG2-dipendente nella fase promastigote e così sono rimasto altamente attenuato la capacità di indurre infezioni. Tuttavia, dopo il notevole ritardo lpg2 (-) REV topi infettati da revertant esposto lesioni e amastigoti isolati da queste lesioni sono stati in grado di replicare all'interno dei macrofagi nonostante il fatto che essi erano in grado di sintetizzare la PGs. Così, in alcuni aspetti, la lpg2 (-) REV amastigoti assomigliano a L. mexicana amastigoti. Gli studi futuri dei gene responsabili (i) possono far luce sui meccanismi impiegati da L. major per sopravvivere in assenza di glycoconjugates LPG2-dipendente e possono anche migliorare il potenziale della linea major L. lpg2 per servire come un vaccino vivo parassita di superare la sua tendenza a tornare verso la virulenza.

L'applicazione Della Tecnologia Di Microarray Gene Expression Kinetoplastea Ricerca

Current Molecular Medicine. Sep, 2004  |  Pubmed ID: 15357212

Protozoi parassiti nell'ordine Kinetoplastidi causano grave malattia principalmente nelle aree tropicali e subtropicali. Vaccini per il controllo di queste malattie hanno mostrato qualche promessa, ma nessuno è attivo uso clinico. I trattamenti farmacologici sono disponibili per tutte le infezioni acute, ma l'emergere della resistenza ed una fase cronica che non risponda sono problemi attuali. Rapidi progressi nella tecnologia genomica apre la possibilità di scoprire nuovi geni che possono contribuire alle iniziative di vaccino o servire come obiettivi per lo sviluppo di nuovi farmaci. DNA microarray è una tecnologia genomica, che viene applicata alla nuova scoperta gene in Kinetoplastea parassiti. Sia cDNA Microarray genomico per Leishmania major hanno identificato un certo numero di nuovi geni che sono espressi in maniera specifica fase e i risultati preliminari di un microarray genomico di L. donovani dimostrato anche nuova scoperta del gene. Un microarray di Trypanosoma brucei genomic frammenti identificati nuovi geni cui espressione differisce tra l'insetto a carico di fase e la fase infettiva umana del parassita. I prossimi anni, basandosi su quest'opera fondamentale, dovrebbero testimoniare la tappa più emozionante come microarrays sono applicati a questioni come la base della resistenza ai farmaci, post kala azar leishmaniosi cutanea, il regolamento di differenziazione alle fasi infettive, che collega coordinately regolamentati vie dei geni e lo sviluppo di geneticamente definiti parassiti che possono avere il potenziale come i vaccini vivi attenuati.

Celle Di Memoria Centrale T Mediano L'immunità a Lungo Termine Per Leishmania Major in Assenza Di Parassiti Persistenti

Nature Medicine. Oct, 2004  |  Pubmed ID: 15448686

Infezione da Leishmania major induce una risposta immunitaria protettiva e a lungo termine resistenza alla reinfezione, che si pensa che dipendono da parassiti persistenti. Qui dimostriamo che anche se le cellule effettrici T CD4(+) sono perse in assenza di parassiti, cellule T CD4(+) memoria centrale sono mantenute. Al momento di infezione secondaria, queste cellule della memoria centrale T diventano cellule T effettrici di tessuto-homing e mediano protezione. Così, l'immunità a L. major è mediato da almeno due distinte popolazioni di cellule T CD4(+): cellule longeva memoria centrale indipendente dall'agente patogeno e cellule effettrici patogeno-dipendente di breve durata. Questi dati suggeriscono che le cellule di memoria centrale T dovrebbero essere gli obiettivi per nonlive vaccini contro le malattie infettive che richiedono l'immunità cellulo-mediata.

Carta Moschicida Per Parassiti

Cell. Oct, 2004  |  Pubmed ID: 15507202

In questo numero, Kamhawi et al (2004) descrivono l'identificazione di un insetto galectin come il recettore per la fase-specifici per Leishmania adhesin lipophosphoglycan (GPL). Questa interazione è fondamentale per la sopravvivenza del parassita nell'intestino del relativo vettore sand fly. I risultati aprire nuove strade per gli studi di immunità degli insetti, trasmissione associazione vaccini e coevoluzione ospite-parassita.

Caratterizzazione Di Un Defensina Dal Sand Fly Phlebotomus Duboscqi Indotta Dalla Sfida Con Batteri O Il Protozoo Parassita Leishmania Major

Infection and Immunity. Dec, 2004  |  Pubmed ID: 15557638

Peptidi antimicrobici sono componenti importanti della risposta immunitaria innata delle cellule epiteliali. In insetti vettori, questi peptidi possono giocare un ruolo nel controllo degli agenti patogeni gut. Abbiamo analizzato peptidi antimicrobici, prodotti dalla duboscqi di Phlebotomus sand fly, dopo la sfida di batteri iniettati o alimentazione con batteri o il protozoo parassita Leishmania major. Un nuovo peptide emolinfa con attività antimicrobica è stato identificato e dimostrato di essere un membro dell'insetto defensina famiglia. Curiosamente, questo defensina esibisce un'attività antiparassitario contro le forme promastigote di L. major, che si trovano normalmente all'interno dell'intestino sand fly. P. duboscqi defensina potrebbe essere indotta da infezioni sia emolinfa o intestino. Defensina mRNA è stato indotto dopo infezione da L. wild-type più importanti, e questa induzione era molto meno seguenti infezioni con mutanti knockout major L. che sopravvivono scarsamente in sabbia mosche, a causa di carenze specifiche in cella abbondante superficie glycoconjugates contenente phosphoglycans (tra cui lipophosphoglycan). La capacità degli agenti patogeni budello per indurre l'intestino così come espressione del corpo grasso di defensina solleva la possibilità che questo peptide antimicrobico potrebbe giocare un ruolo chiave nello sviluppo di infezioni parassitarie.

Salvataggio Di Leishmania E Rimodellamento Di Ospitare Sfingolipidi Nella Biogenesi Di Sopravvivenza E Acidocalcisome Amastigote

Molecular Microbiology. Mar, 2005  |  Pubmed ID: 15720561

Sfingolipidi (SLs) svolgono un ruolo essenziale nella maggior parte dei eucarioti, ma nel trypanosomatid protozoo Leishmania major loro funzioni differiscono significativamente. In precedenza vi abbiamo mostrato che null mutanti difettosi in de novo sphingoid SLs sintesi (spt2-) mancato di base, ma è cresciuto bene e zattere lipidiche hanno mantenuto durante la replica come promastigotes in vitro. Tuttavia, hanno sperimentato catastrofici difetti nella membrana traffico in entrata in fase stazionaria e non è riuscito a differenziare la forma infettiva metacyclic. Qui abbiamo mostrato che questa mutante mantenuto la capacità di entrare in silenzio macrofagi e inibire l'attivazione, anche se come previsto la maggior parte dei parassiti sono stati distrutti. Tuttavia, in caso di infezioni del mouse, dopo un ritardo rapidamente progressiva lesioni apparvero e purificato amastigoti erano completamente virulenti di macrofagi e topi. Spettrometria totale di lipidi spt2 amastigote ha rivelato la presenza di livelli elevati di parassita specifico inositolo glycosylinositol (IPCs) non sintetizzato dai mammiferi padroni di casa. Inibitore studi hanno mostrato che il salvataggio avviene a livello del complesso SLs, suggerendo che i parassiti svolgono 'capigruppo' rimodellamento. Inoltre, descriviamo un nuovo difetto di spt2-promastigotes che coinvolgono 'vuoto' acidocalcisomes (ACs), che potrebbero indicare l'origine di questo organello dal pathway di biogenesi corpo correlati lisosoma organello/multivesicular. Tuttavia, ACs in amastigoti spt2 apparso quantitativamente e morfologicamente normali. Così realizzo di SLs e altre molecole di amastigoti intracellulari giocare ruoli chiave nella sopravvivenza delle AC biogenesi e parassita nell'ospite.

Eucariotiche UDP-galattopiranosio Mutasi (gene GLF) in Agenti Patogeni Microbici E Metazoal

Eukaryotic Cell. Jun, 2005  |  Pubmed ID: 15947206

Galactofuranose (Gal(f)) è un romanzo di zucchero assente nei mammiferi ma presente in una varietà di microbi patogeni, spesso all'interno di glycoconjugates che giocano un ruolo fondamentale nella formazione di superficie delle cellule e il ciclo infettivo. Nei procarioti, Gal(f) è sintetizzato come lo zucchero del nucleotide UDP-Gal(f) da UDP-galattopiranosio mutasi (UGM) (gene GLF). Qui abbiamo utilizzato uno schermo di bioinformatica combinatoria per identificare una famiglia del candidato GLFs eucarioti che in precedenza era fuggito il rilevamento. GLFs da tre agenti patogeni, due protozoi (Leishmania major e Trypanosoma cruzi) e un fungo (Cryptococcus neoformans), aveva attività UGM quando espresso in Escherichia coli e dosati in vivo o in vitro. GLFs eucarioti sono strettamente correlati a vicenda ma tiepidi GLFs procariote, mostrando limitata conservazione dei residui di nucleo intorno al sito di legame del substrato e Flavina adenina dinucleotide associazione dominio. Diversi eucarioti non precedentemente indagato per la sintesi di Gal(f) ha anche mostrato forte omologhi GLF con conservazione dei residui chiave. Queste includevano altri funghi, l'alga Chlamydomonas e le alghe phleovirus Feldmannia irregularis, parassiti nematodi (Brugia, Onchocerca e Strongyloides) e Caenorhabditis elegans e tunicati Halocynthia e Cionia. Open reading frame del c. elegans è stato mostrato per codificare attività UGM. La distribuzione filogenetica GLF suggerisce che Gal(f) sintesi possono verificarsi più largamente negli eucarioti, in quanto supposto in precedenza. Nel complesso, GLF/Gal(f) sintesi negli eucarioti sembra verificarsi con una distribuzione disgiunta e spesso in specie patogene, simile a quello che si vede nei procarioti. Così, inibizione UGM può offrire una destinazione attraente droga in quelle eucarioti dove Gal(f) svolge ruoli critici nella vitalità cellulare e virulenza.

Identificazione Di Un Frammento Di DNA Che Aumenta La Stabilità Mitotica Di DNAs Episomal Lineare in Leishmania Major

International Journal for Parasitology. Aug, 2005  |  Pubmed ID: 15996670

Il centromero è una regione specializzata dei cromosomi eucariotici, il sito della formazione del cinetocore, l'attacco mandrino e regolamento di segregazione del cromosoma durante la divisione cellulare mitotica e meiotica. Per identificare sequenze che aumentano la stabilità mitotica e/o agiscono come potenziali centromeri in Leishmania major, abbiamo generato in primo luogo le biblioteche di Leishmania lineare cromosomi artificiali (LACs) cuscinetto kb 30 inserti di DNAs genomic selezionato casualmente. Queste sono state introdotte in parassiti, e quindi la loro stabilità è stata valutata dopo un periodo di 10 passaggi della crescita in assenza di pressione selettiva. Circa l'80% della 108 transfettanti testate perso loro LACs prontamente e solo il 20% dei ricombinanti sono stati mantenuti; di questi sei ha mostrato forte ma parziale stabilità (mantenuto in 30-46% delle cellule). Mappatura e sequenziamento di un clone (cSC10), che conferisce il massimo grado di manutenzione, ha rivelato la presenza di una sequenza che è stato trovato all'interno di un altro episome stabile, e che è dispersa nel genoma di L. major. Vengono discusse le implicazioni di questi dati ai possibili meccanismi di manutenzione cromosomiche.

Il Genoma Del Parassita Kinetoplastea, Leishmania Major

Science (New York, N.Y.). Jul, 2005  |  Pubmed ID: 16020728

Specie di Leishmania infantum causa uno spettro di malattie umane nelle regioni tropicali e subtropicali del mondo. Ci hanno sequenziato i 36 cromosomi del genoma aploide 32,8-megabase di Leishmania major (strain Friedlin) e prevedere 911 geni RNA, 39 pseudogeni e 8272 geni codificanti proteine, di cui 36% può essere attribuita una funzione putativa. Tra questi geni coinvolti nelle interazioni ospite-patogeno, come gli enzimi proteolitici e vasta macchinari per la sintesi del complesso glycoconjugates superficiale. L'organizzazione dei geni codificanti proteine in cluster policistronico lungo, strand-specifici e la mancanza di fattori di trascrizione generali nel L. major, Trypanosoma brucei e genomi di Trypanosoma cruzi (Tritryp) suggeriscono che i meccanismi che regolano la trascrizione di RNA polimerasi II-regia sono distinti da quelle operanti in altri eucarioti, anche se il trypanosomatids appaiono in grado di rimodellamento della cromatina. Abbondanti RNA-binding proteins sono codificati nel genoma Tritryp, coerenza con attivo posttranscriptional regolazione dell'espressione genica.

Strutture Di Complessi Di Leishmania Major Pteridina Reduttasi Rivelano Le Caratteristiche Del Sito Attivo Importante Per L'associazione Del Ligando E Per Guidare La Progettazione Di Inibitore

Journal of Molecular Biology. Sep, 2005  |  Pubmed ID: 16055151

Pteridina reduttasi (PTR1) sono un reduttasi catena corta NADPH-dipendente trovato nei protozoi parassiti trypanosomatid. L'enzima partecipa al salvataggio delle pterine e rappresenta una destinazione per lo sviluppo di migliori terapie per le infezioni causate da questi parassiti. Una serie di analisi cristallografiche di Leishmania major PTR1 sono segnalati. Strutture dell'enzima in un complesso con il cofattore NADPH binari e ternari complessi con cofattore e biopterina e 5,6-diidrobiopterina 5.678 tetraidrobiopterina rivelano che la PTR1 non subire qualsiasi grandi cambiamenti conformazionali a scopo di associazione e di elaborazione dei substrati e confermare che queste molecole si legano in un unico orientamento presso il centro catalitico adatto per le due distinte riduzioni. Complessi ternari con cofattore e CB3717 e trimetoprim (TOP), potenti inibitori della timidilato sintasi e la diidrofolato reduttasi, rispettivamente, sono stati caratterizzati. La struttura con CB3717 rivela che il gruppo quinazoline si lega in modo simile ai substrati/prodotti di pterina e domina le interazioni con l'enzima. Nel complesso con TOP, sterica restrizioni applicate sul sostituente trimethoxyphenyl impediscono la frazione di 2,4-diaminopyrimidine di adottare la modalità pterina di associazione osservata in diidrofolato reduttasi e spiegano le proprietà di inibizione di una gamma di derivati della pirimidina. Il dettaglio molecolare fornito da queste strutture complesse identifica le interazioni importanti necessarie per contribuire allo sviluppo di nuovi inibitori di potenziale valore terapeutico basato su struttura.

Ricostituzione Dell'attività Di Trasporto Di GDP-mannosio Con Proteina Purificata Di Leishmania LPG2 in Liposomi

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2005  |  Pubmed ID: 15542612

Zuccheri attivati nucleotide richiesti per la sintesi di glycoconjugates entro la via secretiva di eucarioti sono forniti dall'azione dei trasportatori di zucchero nucleotide (NSTs). In genere, vengono studiate NSTs in preparazioni microsomiche da linee wild-type o mutanti; Tuttavia, questa impostazione può essere difficile valutare Proprietà NST a causa della presenza di glycosyltransferases e altre attività interferenti. Qui noi abbiamo progettato Leishmania donovani per esprimere alti livelli di un trasportatore LPG2 Golgi PIL-uomo attivo recanti un'etichetta di polyhistidine C-terminale. Il funzionale LPG2, il suo è stato solubilizzato, purificato mediante cromatografia di affinità di metallo e ricostituito in liposomi contenenti fosfatidilcolina utilizzando perle di polistirolo SM-2. La proteoliposomes esposta attività di trasporto PIL-uomo robusto con un'apparente K(m) di mamma 6,6. Attività di trasporto è stato arricchito da precaricamento delle GMP e ha mostrato specificità per substrati multipli (PIL-Ara e PIL-Fuc). In contrasto con l'attività nei microsomi greggi, trasporto non era dipendente dalla presenza di cationi divalenti. Ricostituzione dell'attività di trasporto utilizzando LPG2 proteico purificato in liposomi fornisce quindi solida evidenza sperimentale che un singolo polipeptide è richiesto esclusivamente per l'attività NST ed è in grado di mediare l'assorbimento dei substrati multipli. Questi studi sono pertinenti per lo studio della NST struttura e funzione nei protozoi parassiti così come il loro ospiti eucarioti superiori.

Dimostrazione Di Espressione Eterologa Che Il Leishmania SCA1 Gene Codifica Per Un Arabinopyranosyltransferase

Glycobiology. Mar, 2006  |  Pubmed ID: 16272216

In parte del ciclo di vita all'interno del loro vettore sand fly, principali parassiti Leishmania prima collegare all'intestino di volare attraverso il loro principale superficie adhesin lipophosphoglycan (GPL) e più tardi resynthesize una LPG strutturalmente distinti che si traduce in distacco ed eventuale trasmissione. Una di queste modifiche strutturali richiede l'aggiunta di alpha1, 2-D-arabinopyranose tappi a beta1, catene laterali di galattosio 3 nel dominio phosphoglycan unità di ripetizione del GPL. Noi avevamo precedentemente identificato due lato catena arabinosio geni (SCA1/2) che sono stati coinvolti in alpha1, 2-D-Arap tappatura. SCA1/2 esposizione glycosyltransferase canonica motivi e iperespressione del gene o porta a elevati alpha1 microsomiale, 2-D-ArapT attività, con conseguente arabinopyranosylation del beta1, le catene laterali 3-Gal in LPG (in appresso denominato catena laterale D-arabinopyranosyltransferase [sc-D-ArapT]). Espressione eterologa in uno sfondo di arabinosio null è stato utilizzato per determinare se il gene SCA1 codifica reale sc-D-ArapT. Costrutti di espressione SCA1 introdotti sia cellule COS-7 dei mammiferi e il sistema di cella baculovirus-sf9 esposto considerevole espressione della proteina. Tuttavia, attività funzionale sc-D-ArapT è stata osservata solo in quest'ultimo. Nei saggi in vitro incubati con guanidina 59-difosfato (GDP) - D-[3h] Arap come lo zucchero donatore e utilizzando il GPL esogeno come un accettore, sc-D-ArapT attività significativa è stata osservata quando microsomi dalle cellule baculovirus-sf9 sono stati incubati in presenza di accettore di LPG. Nessuna attività è stata osservata in assenza di GPL. Questi risultati dimostrano che la SCA1 codifica un sc-D-ArapT e fornire il primo esempio di espressione eterologa del gene D-ArapT.

Immunizzazione Con Persistente Attenuati Delta Lpg2 Leishmania Principali Parassiti Richiede Adiuvante Per Fornire Immunità Protettiva Nei Topi C57BL/6

Infection and Immunity. Jan, 2006  |  Pubmed ID: 16369039

Principali parassiti Leishmania, manca il trasportatore di GDP-mannosio, chiamato Deltalpg2 parassiti, non riescono a indurre la malattia nei topi, ma persistono a lungo termine. Abbiamo trovato in precedenza che gli organismi Deltalpg2 proteggono topi BALB/c da virulento sfida importante L.. In contrasto, riportiamo qui che Deltalpg2 parassiti inducono immunità protettiva nei topi C57BL/6 solo quando somministrato con CpG-contenenti oligodeoxynucleotides, indicando che persistenza del parassita da sola non è sufficiente a mantenere l'immunità protettiva a L. major.

Organizzazione Genomica E Espressione Della Famiglia Genica SCG/L/R Espansa Di Leishmania Major: Cluster Interno E Localizzazione Telomerica SCGs Mediando Apetti Modifiche LPG

Molecular and Biochemical Parasitology. Apr, 2006  |  Pubmed ID: 16464509

Stadio-specifiche modifiche al adhesin abbondante superficie lipophosphoglycan (GPL) di Leishmania giocano un ruolo critico nell'associazione e rilascio del parassita durante il suo ciclo infettivo in sabbia al volo e controllano la capacità delle diverse specie di volare per la trasmissione di specie e ceppi parassita differente. In Leishmania major Friedlin V1, associazione a una lectina intestino sand fly è mediata dalla catena laterale ripete galattosil (scGal) modifiche del phosphoglycan LPG (PG), mentre il rilascio si verifica seguente arabinosio-tappatura di scGals. In precedenza abbiamo identificato una famiglia di sei geni SCG codifica PG scbeta-galactosyltransferases, e qui vi mostriamo che la famiglia del gene SCG estesa (ora chiamata SCG/L/R) comprende 14 membri in tre sottofamiglie (SCG, SCGL e SCGR). Northern blot e RT-PCR analisi suggeriscono che la maggior parte dei geni SCG/L/R sono espresse, con distinti modelli durante il ciclo infettivo. I sei geni sottofamiglia SCGR sono raggruppati e sparpagliati con i due geni SCA responsabili arabinosylation inerente allo sviluppo regolato del PG scGals; relazioni tra la SCGR rivelarono chiara evidenza di conversione genica estesa. Al contrario, i sette membri della famiglia 'core' SCG sono localizzati adiacenti ai telomeri. Questi telomeri condividono quantità variabili di sequenza a monte o a valle del ORFs SCG, nuovamente fornendo prove del passato conversioni di gene. Multiple RNAs SCG1-7 sono stati espressi contemporaneamente all'interno di popolazioni del parassita. Potenzialmente, telomerica localizzazione dei geni SCG può funzionare principalmente per facilitare la conversione del gene e l'elaborazione delle diversità evolutiva funzionale in grado di PG sc-galactosylation osservati in altri ceppi di L. major.

Analisi Biochimica E Genetica Della Metilenetetraidrofolato Reduttasi Nel Metabolismo Di Leishmania E Virulenza

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2006  |  Pubmed ID: 17032644

Metilenetetraidrofolato reduttasi (MTHFR; CE 1.5.1.20) è l'unico enzima responsabile della generazione del 5-metiltetraidrofolato, che è richiesto per la sintesi di metionina e fornitura di gruppi metile tramite S-adenosilmetionina. Analisi del genoma ha mostrato che specie di Leishmania, a differenza di Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi, contengono i geni che codificano MTHFR e due distinte metionina synthases. Leishmania MTHFR differivano da quelli negli altri eucarioti dall'assenza di un dominio normativo C-terminale. L. major MTHFR è stata espressa in lievito ed enzima ricombinante è stata prodotta in Escherichia coli. MTHFR non era inibito dalla S-adenosilmetionina e, in modo univoco tra gli enzimi folato-metabolizzare, ha mostrati specificità dual-cofattore NADH e NADPH in condizioni fisiologiche. Mutanti null MTHFR (mthfr(-)) mancavano 5-metiltetraidrofolato, il più abbondante intracellulare folato e non potesse utilizzare omocisteina esogeno per la crescita. In condizioni di metionina limitazione mthfr(-) cellule mutanti è cresciuto poco, considerando che la loro crescita era normale in terreni di coltura standard. Attività in vitro di MTHFR né la crescita di mthfr(-) mutanti o overexpressors MTHFR differenzialmente sono stati colpiti da antifolati noti per inibire la crescita del parassita tramite obiettivi oltre la diidrofolato reduttasi e la pteridina reduttasi 1. In un modello murino di infezione mthfr(-) mutanti hanno mostrato buona infettività e virulenza, indicando che metionina sufficiente è disponibile all'interno del vacuolo parasitophorous per soddisfare le esigenze del parassita.

Redirezione Di Sfingolipidi Metabolismo Verso De Novo Sintesi Di Etanolammina in Leishmania

The EMBO Journal. Feb, 2007  |  Pubmed ID: 17290222

Nella maggior parte dei eucarioti, sfingolipidi (SLs) sono componenti della membrana critica e molecole di segnalazione. Tuttavia, mutanti del trypanosomatid protozoo Leishmania manca palmitoiltransferasi serina (spt2-) e SLs crescita bene, anche se sono difettosi in fermo fase di differenziazione e virulenza. Fenotipi simili sono stati osservati in mutante sfingolipidi (SL) mancano le liasi degradatory enzima sfingosina 1-fosfato (spl-). Questa interazione epistatici ha suggerito che un metabolita a valle della SLs era responsabile. Qui vi mostriamo che a differenza di altri organismi, il pathway di Leishmania SL si è evoluto per essere la più importante strada per la sintesi di etanolammina (EtN), come EtN supplementazione completamente rovesciato i difetti vitalità e differenziazione di entrambi mutanti. Così la Leishmania ha subito due cambiamenti metabolici importanti: primo in orgasmo i ruoli metabolici di SLs se stessi nella crescita, di segnalazione e manutenzione di membrane microdomains, che possono derivare da una combinazione unica di lipidi parassita abbondanti; In secondo luogo, liberato di tipici vincoli funzionali SL e la mancanza di percorsi alternativi per produrre EtN, Leishmania Reindirizzamento metabolismo SL verso massa EtN sintesi. I nostri risultati rivelano così un esempio eclatante di rimodellamento della via metabolica del SL in Leishmania.

Uno Sviluppo Indipendente Lipophosphoglycan Di Leishmania in Permissive Sabbia Mosche

Microbes and Infection / Institut Pasteur. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17307009

Leishmaniases sono gravi malattie parassitarie degli organismi eziologici che vengono trasmesse da insetti vettori, phlebotominae sabbia mosche. Due specie di sand fly, Phlebotomus papatasi e p. sergenti, display notevole specificità per Leishmania parassiti trasmettono in natura, ma molti altri sono largamente permissivi per lo sviluppo di diverse specie di Leishmania. Precedenti studi hanno suggerito che in vettori 'specifiche' lo sviluppo di successo parassita è mediato dal parassita glycoconjugates superficiale e sand fly lectine, tuttavia vi mostriamo qui che le interazioni che coinvolgono 'permissiva' sabbia mosche utilizzano molecole di un altro. Abbiamo trovato che il lipophosphoglycan abbondante superficie glicoconiugati, essenziale per il fissaggio di Leishmania major nel vettore specifico p. papatasi, non è stato richiesto per l'aderenza del parassita o sopravvivenza nella permissiva vettori P. arabicus e Lutzomyia longipalpis. Attaccamento in diverse specie di permissiva sand fly invece correlata con la presenza di glicoproteine intestino cuscinetto terminale N-acetil-galattosamina e con l'occorrenza di un'attività di lectin-like sulla superficie di Leishmania. Questa nuova modalità di associazione ha importanti implicazioni per la trasmissione del parassita e l'evoluzione. Si può contribuire alla riuscita diffusione della Leishmania a causa del loro adattamento in nuovi vettori, vale a dire trasmissione di L. infantum di Lutzomyia longipalpis; Questo evento portò alla fondazione di L. infantum/chagasi in America Latina.

I Trasportatori Di Zucchero Due Di Funzionalmente Divergenti UDP-Gal Nucleotide Partecipano Phosphoglycan Sintesi in Leishmania Major

The Journal of Biological Chemistry. May, 2007  |  Pubmed ID: 17347153

Nel protozoo Leishmania, abbondante superficie e molecole secrete, come lipophosphoglycan (GPL) e proteophosphoglycans (PPGs), contengono galattosio estesa in forma di phosphoglycans (PGs) basato su (Gal-Man-PO(4)) unità di ripetizione. PGs sono sintetizzati nell'apparato del Golgi parassita e richiedono il trasporto dei precursori nucleotide citoplasmatica zucchero lume del Golgi da trasportatori di zucchero nucleotide (NSTs). Trasporto del PIL-uomo è mediata dal prodotto del gene LPG2, e qui ci siamo concentrati su trasportatori per UDP-GAL dati base mineraria ha rivelato 12 candidati NST geni nel genoma major L., compreso LPG2, nonché un trasportatore di reticolo endoplasmatico UDP-glucosio candidato (HUT1L) e molti pseudogeni. Gene knock-out studi stabilito che due geni (LPG5A e LPG5B) con codifica NSTs UDP-Gal. Anche se i mutanti di lpg5A(-) e lpg5B(-) singoli prodotto PGs, un mutante doppia lpg5A(-)/5B(-) era completamente carenza. Sintesi di PG è stato restaurato nel mutante lpg5A(-)/5B(-) di espressione eterologa del trasportatore umano UDP-Gal, ed espressione eterologa di LPG5A e LPG5B salvato i difetti di glicosilazione di mammiferi Lec8 mutante, che è carente in assorbimento UDP-Gal. Curiosamente, le funzioni LPG5A e LPG5B si sovrappongono, ma non sono equivalenti, dal momento che il mutante lpg5A(-) ha mostrato un difetto parziale di LPG, ma non phosphoglycosylation PPG, considerando che il mutante lpg5B(-) ha mostrato un difetto parziale in PPG ma non LPG phosphoglycosylation. Identificazione di queste chiave NSTs in Leishmania faciliterà la dissezione di glicoconiugati sintesi e suoi ruoli nel ciclo di vita del parassita e ulteriormente la nostra comprensione del NSTs in genere.

Confronti Dei Mutanti Mancano I Trasportatori Golgi UDP-galattosio O GDP-mannosio Stabiliscono Che I Phosphoglycans Sono Importanti Per Promastigote Ma Non Amastigote Virulenza in Leishmania Major

Infection and Immunity. Sep, 2007  |  Pubmed ID: 17606605

Abbondante superficie Leishmania phosphoglycans (PGs) contenente [Gal(beta1,4)Man(alpha1-PO(4))]-derivato ripetendo le unità sono importanti in diversi punti del ciclo infettivo di questo protozoo parassita. Sintesi di PG richiede il trasporto dei precursori nucleotide-zucchero attivato dal citoplasma l'apparato di Golgi. Corrispondentemente, null mutanti del trasportatore GDP-mannosio major L. LPG2 mancano PGs e sono gravemente compromesse nella sopravvivenza dei macrofagi e induzione di patologia acuta in topi suscettibili, eppure sono in grado di persistere indefinitamente e indurre immunità protettiva. Lpg2(-) L. mexicana amastigoti similmente manca PGs ma altrimenti normale nel noto glycoconjugates rimangono tuttavia in grado di indurre patologia acuta. Per esplorare questo ulteriore, abbiamo testato l'infettività di un nuovo mutante major L. PG-null, che viene inattivato in due geni UDP-galattosio transporter LPG5A e LPG5B. Sorprendentemente questa mutante ha fatto non ripassare il fenotipo del lpg2(-) major L., invece che assomiglia il mutante di grandi deficit di lipophosphoglycan lpg1(-) L.. Lpg5A(-)/lpg5B(-) metacyclic promastigotes ha mostrato forti difetti nelle fasi iniziali di infezione di macrofagi e di sopravvivenza. Tuttavia, dopo un ritardo di modesto, il mutante lpg5A(-)/lpg5B(-) indotta da patologia lesione nei topi infetti, che da allora in poi progredita normalmente. Amastigoti recuperati da queste lesioni erano completamente infettive nei topi e nei macrofagi, nonostante la continua assenza della PGs. Questo suggerisce che un altro metabolita LPG2-dipendente è responsabile del difetto di virulenza amastigote major L., anche se ulteriori studi escluso mannani citoplasmatiche. Questi dati così risolvono i fenotipi distinti visti tra lpg2(-) specie di Leishmania enfatizzando il ruolo di glycoconjugates diverso da PGs in amastigote virulenza, fornendo ulteriore supporto per il ruolo di PGs in promastigote metacyclic virulenza.

Caratterizzazione Di Inositolo Glycosylinositol Da Leishmania Major Di Spettrometria Di Massa Tandem Con Ionizzazione Elettrospray

Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Sep, 2007  |  Pubmed ID: 17627842

Ci descrivono approcci spettrometria di massa tandem, tra cui la tappa più a trappola ionica e spettrometria di massa tandem tandem attivato dissociazione (CAD) con ionizzazione elettrospray (ESI) per caratterizzare la specie phosphorylceramide (IPC) inositolo visto come di origine [M - H](-) e [M - 2 H + ioni Li](-) in modalità ioni negativi così come [M + H](+), [M + Li](+), e [M - H + ioni 2Li](+) in modalità ioni positivi. Seguito di CAD in una trappola ionica o uno strumento quadrupole triplice-fase, il [M - H](-) ioni di IPC ha reso gli ioni frammento che riflette solo l'inositolo e il sostituente acilico grassi della molecola. In contrasto, gli spettri di massa da MS(3) di [M - H - Inositol](-) ioni contenuti abbondanti ioni che sono facilmente applicabili per l'assegnazione delle moiety (LCB) base lunga catena e acidi grassi. Entrambi gli spettri di ioni prodotto da MS(2) e MS(3) della [M - 2 H + Alk](-), [M + H](+), [M + Alk](+), e [M - H + 2Alk](+) ricchi di ioni contenuti anche frammentano ioni informativi per l'assegnazione univoca del sostituente dell'acilico grassi e il LCB. Tuttavia, la sensibilità degli ioni osservati nelle forme di [M - 2 H + Alk](-), [M + H](+), [M + Alk](+), e [M - H + 2Alk](+) (Alk = Li, Na) è quasi 10 volte inferiore a quello osservato nella [M - forma H](-). Oltre i percorsi principali di frammentazione che conduce all'eliminazione dell'inositolo o moiety di inositolo monofosfato, sono stati osservati diversi ioni strutturalmente informativi derivanti da processi di riorganizzazione. I processi di frammentazione sono simili a quelle riportate in precedenza per ceramidi. Mentre l'approccio di spettrometria di massa tandem usando MS(n) (n = 2, 3) consente le strutture della Leishmania major IPCs costituito da due strutture isomerica per essere svelato in dettaglio, spettri di massa tandem da scansioni costante perdita neutra possono fornire un metodo semplice per la rilevazione di IPC in miscele.

Il Ruolo Del Clivaggio Di Glicina Mitocondriale Complesso Il Metabolismo E La Virulenza Del Parassita Protozoo Leishmania Major

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2008  |  Pubmed ID: 17981801

Per l'agente patogeno umano Leishmania major, una fondamentale funzione metabolica è la sintesi di timidilato, che richiede 5,10-metilenetetraidrofolato (5,10-CH(2)-THF). 5,10-CH (2)-THF può essere sintetizzato dalla glicina da complesso di clivaggio glicina mitocondriale (GCC). L'analisi bioinformatica ha rivelato le quattro subunità del GCC nel genoma major L., e il ruolo del GCC nel metabolismo del parassita e virulenza è stato valutato attraverso studi della subunità P (decarbossilasi glicina (GCVP)). In primo luogo, una proteina GCVP tagged è stato espresso e localizzata per il Mitocondrio parassita. In secondo luogo, un mutante di gcvP(-) è stato generato e mostrato mancanza di significative attività GCC utilizzando un test in vivo indiretta dopo incorporazione dell'etichetta da [C 2-14] glicina nel DNA. Il mutante gcvP(-) è cresciuto poco in presenza di eccesso glicina o serina minimal; questi studi ha inoltre stabilirono che promastigotes major L. richiedono serina per una crescita ottimale. Sebbene amastigoti e gcvP(-) promastigotes hanno mostrato normale virulenza nelle infezioni dei macrofagi in vitro, entrambe le forme del parassita ha mostrato sostanzialmente ritardato replica e lesione patologia nelle infezioni di topi geneticamente sensibili o resistenti. Questi dati suggeriscono che, come la fisiologia del sito di infezione cambia durante il corso dell'infezione, così fanno i vincoli metabolici sulla replica del parassita. Questa conclusione ha un grande significato per l'interpretazione delle esigenze metaboliche di virulenza. Infine, questi studi richiamare l'attenzione in trypanosomatid protozoi per la chiave metabolica intermedio 5,10-CH (2)-THF, situata all'incrocio di Serina, glicina e timidilato metabolismo. In particolare, le previsioni basate su genoma suggeriscono il relativo parassita Trypanosoma brucei è totalmente dipendente da GCC per 5,10-CH (2)-sintesi THF.

Phylogenomic E Analisi Funzionale Di Proteine (COG2154) Famiglia Pterina-4a-carbinolamina Deidratasi in Piante E Microrganismi

Plant Physiology. Apr, 2008  |  Pubmed ID: 18245455

Dehydratases pterina-4a-carbinolamina (PCD) riciclare pterina ossidato cofattori generati dall'amminoacido aromatico idrossilasi (AAHs). PCD sono biochimicamente conosciuto solo da animali e da un batterio, ma PCD-come le proteine (COG2154 nel database Clusters of Orthologous Groups [CMV]) sono codificate da molte piante e genomi microbici. Poiché questi genomi non codificano spesso omologhi AAH, l'annotazione delle loro proteine COG2154 come PCD è discutibile. Inoltre, alcune proteine COG2154 mancano canoniche residui cataliticamente importanti nei mammiferi COG2154 PCD. Diverse proteine della pianta, fungina, protistan, procariote origine e pertanto sono stati testati per attività PCD da complementazione funzionale in Escherichia coli, e le proteine vegetali sono state localizzate mediante fusioni proteina fluorescente verde. Piante superiori e inferiori ha dimostrato di avere due proteine COG2154, uno mitocondriale con attività PCD e un canonica, plastidial uno senza. Analisi filogenetica indicano che quest'ultimo è unico alle piante e si alzò dal precedente all'inizio del lignaggio della pianta. Tutte le 10 proteine microbiche di COG2154 testate avevano attività PCD; Sei di questi provenivano da genomi con nessun AAH, e sei erano canonica. I risultati ha suggerito il motivo [EDKH] - x (3) - H-[HN]-[PC] - x (5,6)-[YWF] - x (9)-[HW] - x (8,15)-D come una firma per l'attività PCD. Organismi, avendo un PCD funzionale ma nessun partner AAH includono Angiosperme, lievito e vari procarioti. In questi casi, PCD ha presumibilmente un'altra funzione. Un ruolo accessorio nel metabolismo del cofattore Molibdopterina, ipotizzato da phylogenomic prove, è stato sostenuto dimostrando attività notevolmente abbassata di due molybdoenzymes in mutanti di Arabidopsis thaliana PCD knockout. Oltre a questo ruolo, noi proponiamo che partnerless PCD supporta la funzione degli enzimi pterina-dipendente non ancora riconosciuti.

Maggiore Sopravvivenza Intracellulare Leishmania Non è Alterato in SHP-1 Mev Carenti O CD45-/-mice

Experimental Parasitology. Nov, 2008  |  Pubmed ID: 18682252

Protozoi parassiti della fuga genere Leishmania dalla risposta immunitaria interferendo con le vie di trasduzione del segnale della sua cellula ospite, il macrofago, quindi stabilire condizioni permissive per la sopravvivenza intracellulare. Inibizione dell'attivazione dei macrofagi dopo infezione da Leishmania è stato suggerito di richiedere l'attivazione di fosfatasi di cella l'host SHP-1. Tuttavia, utilizzando le infezioni di SHP-1 carenti (me(v)) e CD45 topi mutanti null o macrofagi, forniamo prove che sopravvivenza intracellulare di Leishmania major non è in genere dipendente da questi cellulari fosfatasi.

Sintesi Di Sfingolipidi Evolutivamente Regolamentato in Tripanosomi Africani

Molecular Microbiology. Oct, 2008  |  Pubmed ID: 18699867

Sfingolipidi sono componenti essenziali delle membrane eucariote, e molti eucarioti unicellulari, tra cui Kinetoplastea protozoi, si pensiero a sintetizzare esclusivamente inositolo phosphorylceramide (IPC). Qui ci caratterizzano sfingolipidi dal Trypanosoma brucei e una trypanosome sfingolipidi sintasi famiglia genica (TbSLS1-4) che è orthologous per Leishmania IPC sintasi. Tripanosomi prociclico contengono IPC, ma anche della sfingomielina, mentre sorprendentemente parassiti flusso sanguigno-fase contengono sfingomielina ed etanolamina phosphorylceramide (EPC), ma non rilevabili IPC. Ceramide fluorescente in vivo l'etichettatura confermato biosintesi di fase-specifici di sfingomielina e di IPC. Espressione di TbSLS4 in Leishmania ha portato nella produzione di sfingomielina ed EPC suggerendo che la famiglia del gene TbSLS è bi-funzionale sintasi attività. RNAi silenziamento di TbSLS1-4 in tripanosomi flusso sanguigno ha portato all'arresto di rapida crescita e morte cellulare eventuali. Ceramide livelli erano aumentati più di triplice di silenziamento suggerendo un effetto tossico a valle mediato da questo potente Messaggero intracellulare. Previsioni di topologia supportano un modello di dominio transmembrana sei riveduta per il synthases di sfingolipidi Kinetoplastea coerenti con la struttura di sfingomielina mammiferi proposto sintasi. Questo lavoro rivela romanzo diversità e regolamento in sfingolipidi metabolismo in questo importante gruppo di parassiti umani.

Cellule Dendritiche Cutanee Migratorie Fungono Da Sensori Rapide Dei Protozoi Parassiti

PLoS Pathogens. Nov, 2008  |  Pubmed ID: 19043558

Le cellule dendritiche (DC), compresi quelli della pelle, agiscono come sentinelle per intrusione di microrganismi. Nell'epidermide, DC (chiamati cellule di Langerhans, LC) sono sessili e schermo loro microambiente attraverso movimenti occasionali dei loro dendriti. Non è noto l'orchestrazione spazio-temporale dell'antigene incontro da DC dermico (DDC). Poiché queste cellule sono pensate per essere strumentale nell'avvio della risposta immunitaria durante l'infezione, abbiamo studiato il comportamento direttamente all'interno del loro microambiente naturale utilizzando intravital microscopia del due-fotone. Sorprendentemente, abbiamo scoperto che, in condizioni omeostatiche, DDC erano altamente motili, continuamente strisciando attraverso lo spazio interstiziale in modo Galpha(i) protein-coupled receptor-dipendente. Tuttavia, pochi minuti dopo la consegna intradermica del protozoo parassita Leishmania major, DDC divenne immobile e incorporati multipli parassiti nei vacuoli citosolici. Assorbimento di parassita si è verificato attraverso l'estensione del tempo, altamente dinamici pseudopodi capaci di tracking e inghiottendo parassiti. Questa fu poi seguita da retrazione dendrite rapido verso il corpo cellulare. DDC erano abili a discriminare tra parassiti e particelle inerti, e assorbimento di parassita era indipendente dalla presenza di neutrofili. Insieme, il nostro studio ha visualizzato le dinamiche e microenvironmental contesto di parassita incontro da un sottoinsieme di cellula immunitaria innata durante l'iniziazione della risposta immunitaria. I nostri risultati scoprono un programma di sorveglianza unico tessuto migratori di DDC che assicura la rilevazione rapida dei patogeni.

Metilene Tetraidrofolato Deidrogenasi/cicloidrolasi E La Sintesi Di 10-CHO-THF Sono Essenziali in Leishmania Major

Molecular Microbiology. Mar, 2009  |  Pubmed ID: 19183277

10-Formil tetraidrofolato (THF-10-CHO) è un metabolita chiave nel metabolismo del carbonio C1, derivanti per l'azione del formiato-tetraidrofolato ligasi (FTL) e/o 5,10-meteniltetraidrofolato cicloidrolasi/5,10-metilene tetraidrofolato deidrogenasi (DHCH). Leishmania major possiede unico DHCH1 e FTL geni codificano per le proteine citosoliche esclusivamente, a differenza di altri organismi cui isoforme si verificano nel mitocondrio pure. DHCH1 ricombinante ha mostrato tipico NADP (+)-dipendente metilene tetraidrofolato DH e attività CH 5,10-meteniltetraidrofolato e l'attività di DH è stato potentemente inibiti da un substrato analogica 5,10-CO-THF (K(i) 105 nM), come era Leishmania crescita (EC(50) 1.1 microM). Precedenti studi hanno mostrati ftl(-) null mutanti erano normali, alzando la possibilità che perdita del percorso sintetico Purina aveva reso 10-CHO-THF dispensabili in evoluzione. Siamo stati in grado di generare mutanti null dhch1(-) dal rimontaggio del gene, nonostante l'uso di un'ampia gamma di integratori alimentari previsto per bypassare la funzione DHCH. Abbiamo applicato un metodo migliore per il test di geni essenziali in Leishmania, basato su segregational perdita di geni episomal complementare anziché transfezione; analisi degli eventi circa 1400 senza successo perdita di DHCH1 stabilito ancora relativo requisito. Infine, abbiamo impiegato 'complementazione genetica metabolita' utilizzando FTL ectopically espressa come fonte alternativa di 10-CHO-THF; ora dhch1(-) null parassiti facilmente sono stati ottenuti. Questi dati stabilire un requisito per 10-CHO-THF metabolismo nel L. major e forniscono convalida genetica e farmacologica di DHCH come una destinazione per la chemioterapia, in questo e potenzialmente altri protozoi parassiti.

Leishmania Donovani Manca Il Trasportatore Di Golgi PIL-Man LPG2 Esibiscono Virulenza Attenuata in Mammalian Host

Experimental Parasitology. Jul, 2009  |  Pubmed ID: 19328787

Superficie phosophoglycans come lipophosphoglycan (GPL) o proteophosphoglycan (PPG) e fosfolipidi di phosphorylceramides (GIPLs) modulano essenziali interazioni tra Leishmania e macrofagi dei mammiferi. Phosphoglycan sintesi dipende il trasportatore di Golgi GDP-mannosio codificato da LPG2. LPG2-null (lpg2(-)) Leishmania major non può stabilire le infezioni dei macrofagi o indurre patologia acuta, mentre lpg2 (-) Leishmania mexicana conservano virulenza. lpg2 (-) Leishmania donovani è stato segnalato per sopravvivere scarsamente in macrofagi colte, ma non è stata esplorata sopravvivenza in vivo. Qui abbiamo scoperto che, simile a lpg2 (-) L. major, lpg2 (-) L. donovani promastigotes esposto diminuita virulenza nei topi, ma mantenuta a livelli costantemente bassi. lpg2 (-) L. donovani promastigotes non ha potuto stabilire infezione nei macrofagi e non potrebbe inibire transitoriamente phagolysosomal fusion. Inoltre, lpg2(-) promastigotes di L. major, L. donovani e L. mexicana erano altamente sensibili alla lisi mediata dal complemento. Concludiamo che phosphoglycan Assemblea ed espressione mediata da L. donovani LPG2 sono importanti per promastigote ed amastigote virulenza, a differenza di L. mexicana ma simile a L. major.

Dimostrazione Dello Scambio Genetico Durante Lo Sviluppo Ciclico Di Leishmania Nel Vettore Sand Fly

Science (New York, N.Y.). Apr, 2009  |  Pubmed ID: 19359589

Scambio genetico non ha dimostrato di essere un meccanismo sottostante la vasta diversità dei parassiti Leishmania. Riportiamo qui prove che le fasi di invertebrati di Leishmania sono capaci di avere un sessuale ciclo coerente con un processo meiotic come quello descritto per i tripanosomi africani. Progenie ibrida sono stati generati che portava il pieno genomici complementi da entrambi i genitori, ma maxicircles DNA cinetoplasto da uno dei genitori. L'accoppiamento si è verificato solo nel vettore sand fly e ibridi sono stati trasmessi all'host dei mammiferi da sand fly morso. Scambio genetico probabilmente contribuisce alla diversità fenotipica nelle popolazioni naturali, e analisi della progenie ibrida sarà utile per clonazione posizionale dei geni controllo tratti come virulenza trofismo tissutale e la resistenza ai farmaci.

Un Romanzo Ruolo Per Stat1 Acidificazione Fagosoma E Ospite Naturale Resistenza All'infezione Intracellulare Da Leishmania Major

PLoS Pathogens. Apr, 2009  |  Pubmed ID: 19381261

Parassiti intracellulari del genere Leishmania generano gravi malattie negli esseri umani, che sono associati con un fallimento dell'ospite infetto per indurre una gamma di protettivi interferone (IFN)-mediata risposta immunitaria. Abbiamo testato il ruolo di JAK/STAT1 signaling pathway nella patogenesi di Leishmania utilizzando topi knockout difettare del trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione 1 (Stat1) e derivate macrofagi. Inaspettatamente, infezione di macrofagi Stat1-carenti in vitro con promastigotes da Leishmania major e attenuati LPG1 knockout mutanti (lpg(-)) in particolare manca lipophosphoglycan (GPL) ha provocato una duplice aumentata crescita intracellulare, che era indipendente dall'IFN e associato a un sostanziale aumento del pH phagosomal. Phagosomes in Stat1/macrofagi ha mostrato la normale maturazione come giudicato dall'accumulo del marcatore lisosomiale proteina rab7 e fornito vATPase normale attività, ma erano difettosi nel percorso conduttivo anione necessario per acidificazione pieno vescicolare. I nostri risultati suggeriscono un ruolo di pH acido nel controllo della crescita intracellulare di Leishmania presto durante l'infezione e di identificano per la prima volta un ruolo inatteso di Stat1 nella resistenza anti-microbica naturale indipendente dalla relativa funzione come trasduttore di segnale IFN-indotta. Questa romanzo Stat1 funzione può avere importanti implicazioni per gli studi di altri agenti patogeni, come il pH acido phagolysosomal gioca un ruolo importante nell'elaborazione dell'antigene e il processo di uncoating di molti virus.

Regolamentato Espressione Della Leishmania Maggiore Virulenza Superficie Fattore Lipophosphoglycan Utilizzando Condizionalmente Destabilizzato Proteine Di Fusione

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. May, 2009  |  Pubmed ID: 19383793

Superficie glycoconjugates giocano un ruolo importante nel ciclo infettivo della Leishmania major, tra cui il lipophosphoglycan abbondante (GPL) implicato nella sopravvivenza del parassita nel vettore sand fly e le fasi iniziali di stabilimento nel macrofago mammalian host. Descriviamo un sistema per l'espressione inducibile di GPL, applicazione di un innovativo sistema di base di proteine che consente la degradazione controllata di un enzima biosintetico di chiave LPG, UDP-galattopiranosio mutasi (UGM). Questa metodologia si basa su un mutato FK506-binding protein (FKBP) destabilizzando domain (dd) fuse per la proteina di interesse; in assenza di rapamicina analoghi, come ad esempio Shld1, il dominio dd è destabilizzato, conducendo alla degradazione proteosomale, considerando che il trattamento farmacologico conferisce stabilizzazione. Test nel L. major usando dd fusioni a un panel di giornalisti e le proteine cellulari ha confermato la sua funzionalità, con un alto grado di regolamento e di basso fondo, e abbiamo stabilito la cinetica di attivazione della proteina e/o perdita. Due poco costoso e ligandi ampiamente disponibile, FK506 e rapamicina, funzionavano similmente a Shld1, senza effetto sulla crescita di Leishmania o differenziazione. Abbiamo generato parassiti manca UGM attraverso delezione del gene GLF e sostituzione con un costrutto di fusione ddGLF, come knockins cromosomiche o attraverso complementazione episomal; Questi hanno mostrato poca o nessuna espressione LPG in assenza di induttore, considerando che in sua presenza, alti livelli di GPL sono stati raggiunti rapidamente. Test di lisi complemento ha confermato la corretta integrità del mantello Leishmania GPL. Questi dati suggeriscono che l'approccio di dd ha grande promessa nello studio del GPL e altri percorsi pertinenti alla virulenza e alla sopravvivenza del parassita.

Leishmania Major Manca Arginase (ARG) Sono Auxotrofi Per Poliammine Ma Conservano Infettività Di Topi BALB/c Sensibili

Molecular and Biochemical Parasitology. May, 2009  |  Pubmed ID: 19393161

Poliammine sono metaboliti essenziali negli eucarioti che partecipano a una varietà di processi proliferativi, e in trypanosomatid protozoi svolgono un ruolo aggiuntivo nella sintesi della tripanotione tiolo critico. Considerando che la biosintesi delle poliammine derivanti da L-Ornitina è stato ben studiata nei protozoi, la origin(s) metabolica di L-Ornitina hanno ricevuto meno attenzione. Arginase (CE 3.5.3.1) catalizza la seguente l'idrolisi enzimatica di L-arginina, L-Ornitina e urea, e abbiamo testato il ruolo di arginase nella sintesi delle poliammine dalla generazione di un ko arg(?) in Leishmania major da sostituzione doppia gene mirati. Questa mutante mancava attività arginase e necessaria la fornitura nutrizionale di poliammine o L-Ornitina per la crescita. Una linea integrata (arg(?)/ + ARG) esprimendo arginase da un vettore di espressione formulari ha mostrato 30-fold elevazione dell'attività arginase, simili livelli di poliammine e ornitina come wild-type e resistenza agli inibitori?-difluorometilornitina (DFMO) e N(?)-idrossi-l-arginina (NOHA). Questo stabilì che arginase è la più importante strada di sintesi delle poliammine nel promastigotes coltivati in vitro. I parassiti arg(?) mantenuto la capacità di differenziare normalmente alla fase metacyclic infettiva e furono in grado di indurre malattia progressiva dopo inoculazione in topi BALB/c sensibili, seppure in modo meno efficiente rispetto a parassiti WT. Questi dati suggeriscono che la forma amastigote infettiva di Leishmania, che normalmente risiede all'interno di un vacuolo parasitophorous acidificato, può sopravvivere in vivo attraverso recupero di poliammine host e/o altre molecole, aiutati dalla tendenza di compartimenti acidi per concentrare la base metaboliti. Questo può quindi contribuire alla relativa resistenza di Leishmania di inibitori di ornitina decarbossilasi (ODC). La disponibilità di parassiti infettivi, vitali, deficit di arginase dovrebbe rivelarsi utile nel dissezionare il ruolo del metabolismo della l-arginina in entrambi pro - e anti - parasitic risposte che coinvolgono host ossido nitrico sintasi, che richiede L-arginina generare NO.

PTR1-dipendente Dalla Sintesi Di Tetraidrobiopterina Contribuiscono Alla Suscettibilità Ossidante in Trypanosomatid Protozoo Leishmania Major

Current Genetics. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19396443

Leishmania deve sopravvivere lo stress ossidativo, ma mancano di molti enzimi antiossidanti classici e fanno molto affidamento su percorsi tripanotione-dipendente. Abbiamo usato schermi genetici avanti per recuperare loci mediando resistenza ossidante tramite sovraespressione in Leishmania major, che ha individuato la pteridina reduttasi 1 (PTR1). Confronti di linee isogeni ha mostrato ptr1 null mutanti (-) sono stati 18-fold più sensibile a H(2)O(2) linee di sovrapproduzione PTR1 e significativo tre differenze quintuplo erano visti con un ampio pannello di agenti induttori di ossidante. La tossicità dell'ossido nitrico semplici generatori e altre classi di farmaci (ad eccezione di antifolati) erano influenzate da PTR1 livelli. H(2)O(2) suscettibilità potrebbe essere modulata da biopterina esogeno ma non folato, in un modo PTR1 - ma non diidrofolato reduttasi-dipendente, implicando metabolismo B H (4) in particolare. H(2)O(2) consumo né il livello di stress ossidativo intracellulare è stato influenzato dai livelli di PTR1. Accoppiato con il fatto che ridotto Pteridine sono almeno 100 volte meno abbondanti di tioli cellulare, questi dati sostengono fortemente tale atto pteridina ridotta attraverso un meccanismo diverso da quello di scavenging. La capacità di Pteridine non coniugate di stress ossidativo contatore ha implicazioni di infettività e risposta alla chemioterapia. Poiché i livelli di pteridina intracellulare di Leishmania possono essere facilmente manipolati, questi organismi offrono un potente ambiente per la dissezione di suscettibilità ossidante pteridina-dipendente negli eucarioti superiori.

Gli Enzimi Della Via Sintetica 10-formil-tetraidrofolato Si Trovano Esclusivamente Nel Citosol Del Parassita Leishmania Major Trypanosomatid

Molecular and Biochemical Parasitology. Aug, 2009  |  Pubmed ID: 19450731

Nella maggior parte degli organismi 10-formil-tetraidrofolato (THF-10-CHO) partecipa alla sintesi di purine nel citosol e formylation dell'iniziatore mitocondriale methionyl-tRNA(Met). Qui abbiamo studiato 10-CHO-THF biosintesi nel protozoo parassita Leishmania major, un auxotroph delle purine. Sono noti due distinti enzimi sintetici, un bifunzionale metilene-tetraidrofolato deidrogenasi/cicloidrolasi (DHCH) o formil-tetraidrofolato ligasi (FTL), e profilatura phylogenomic ha rivelato una notevole diversità per questi in trypanosomatids. Tutte le specie censite contengono un DHCH1, che è stato recentemente dimostrato di essere essenziale nel L. major. Un secondo DHCH2 si è verificato solo in L. infantum, L. mexicana e T. cruzi e come uno pseudogene nel L. major. DHCH2s bear estensioni del N-terminale e vi abbiamo mostrato che una fusione LiDHCH2-GFP è stata mirata per il mitocondrio. FTLs sono stati trovati in tutte le specie tranne Trypanosoma brucei. Mutanti null L. ftl(-) principali sono stati fenotipicamente normale nella crescita, differenziazione, animale infettività e sensibilità ad un pannello di pteridina analoghi, ma è cresciuto più lentamente quando affamato di serina o glicina, come previsto per gli aminoacidi che sono substrati nel metabolismo dei folati-C1. Il frazionamento delle cellule e macchiarsi occidentale hanno mostrato che sia DHCH1 major L. e FTL erano localizzati nel citosol e non il mitocondrio. Questi dati di localizzazione predicono che nel L. major citosolico 10-formil-tetraidrofolato dovrà essere trasportato nel mitocondrio per sostenere methionyl-tRNA(Met) formylation. Il mantenimento in tutte le trypanosomatids di almeno un enzima coinvolto nella biosintesi di 10-formil-tetraidrofolato e l'essenzialità di questo metabolita nel L. major, suggerisce che questo percorso rappresenta una promettente nuova area per chemioterapico attacco di questi parassiti.

Leishmania Major Phosphoglycans Influenzare La Risposta Immunitaria Precoce Modulando Le Funzioni Delle Cellule Dendritiche

Infection and Immunity. Aug, 2009  |  Pubmed ID: 19487470

Il ruolo preciso di Leishmania glicoconiugati molecole tra cui phosphoglycans (PGs) e lipophosphoglycan (GPL) su cellular responses host è ancora scarsamente definito. Qui, abbiamo studiato l'interazione di Leishmania major LPG2 null mutante (lpg2(-)), che manca sia PGs e GPL, con cellule dendritiche (DCs) e la successiva risposta immunitaria precoce nei topi infetti. Sorprendentemente, l'assenza di phosphoglycans non ha influenzato i pattern di espressione della classe complesso maggiore di istocompatibilità II (MHC II), CD40, CD80 e CD86 su DCs in vitro e in vivo. Tuttavia, lpg2(-) major L. indotta significativamente più alta produzione di interleuchina-12 p 40 (IL-12 p 40) da DCs derivate da midollo osseo infetto (BMDCs) di parassiti di (WT) wild-type in vitro. Inoltre, la produzione di IL-12 p 40 dalle cellule di linfonodo drenante da topi infetti mutante lpg2(-) era superiore a quelli da topi infettati da major WT L.. In esperimenti di presentazione di modello dell'antigene, DCs da topi infetti mutante lpg2(-) indotta più interferone gamma (IFN-gamma) e IL-2 produzione di cellule specifiche per Leishmania T rispetto a quelli da topi infettati da WT. Linfociti isolati da topi infettati per 3 giorni con lpg2(-) parassiti producono simili livelli di IFN-gamma, ma significativamente meno IL-4 e IL-10 rispetto ai controlli WT. Diminuita produzione di IL-4 è stato visto anche in un altro mutante PG-carenti generale mancano i trasportatori di Golgi UDP-galattosio (lpg5A(-) lpg5B(-)), ma non con il mutante lpg1(-) manca solo gas, quindi implicando PGs generalmente nella riduzione della produzione di IL-4. Così, Leishmania PGs influenza precoce risposta immunitaria modulando le funzioni DC in un modo che inibisce la presentazione dell'antigene e promuove la risposta iniziale di IL-4, e loro assenza possa influenzare l'equilibrio tra le risposte Th1 e Th2.

Inoculazione Di Ucciso Leishmania Major in Topi Immuni Rapidamente Sconvolge L'immunità Per Una Sfida Secondaria Tramite Un Processo Mediato IL-10

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Aug, 2009  |  Pubmed ID: 19666482

Recupero da naturale o sperimentale Leishmania major infezione, l'agente eziologico della leishmaniosi cutanea, risultati nello sviluppo dell'immunità durevole in topi ed esseri umani che si manifesta come risoluzione della lesione cutanea e rapido controllo della replica del parassita dopo sfida secondaria. Questa forma di immunità "indotta da infezione" si pensa che si verificano naturalmente in aree endemiche e generalmente è considerata il gold standard per qualsiasi efficacia vaccino contro la leishmaniosi cutanea. Per determinare i fattori che potrebbero aumentare o abrogare l'immunità indotta da infezione, abbiamo studiato l'impatto dell'inoculo antigene morto sotto forma di parassiti Leishmania uccisi a topi guariti. Mostriamo che inoculo dei parassiti uccisi nei topi che risolto loro primari virulenti L. infezione principali risultati relativamente sostenuta e rapida perdita di immunità indotta da infezione. Questa perdita di immunità non era a causa dell'incapacità dei parassiti uccisi per indurre risposte infiammatorie (come ipersensibilità di tipo ritardato), ma si riferiva alla loro incapacità di indurre la risposta IFN-gamma robusta. Inoltre, inoculazione di parassiti Leishmania uccisi in topi guariti ha portato ad una rapida espansione della produzione di IL-10 CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cellule nei linfonodi drenanti il sito di infezione primaria. Trattamento con anti-CD25 o mAb anti-IL-10R abolito ucciso parassita-indotta perdita di immunità. Il nostro studio suggerisce che la vaccinazione con parassiti uccisi potrebbe predisporre individui naturalmente immuni a diventare sensibili a nuove infezioni e/o riattivazione di malattia. Questo può spiegare la mancanza di efficacia di tali vaccini in prove di campo in regioni endemiche. Queste scoperte hanno importanti implicazioni per le strategie di progettazione e vaccinazione vaccino contro la Leishmaniosi umana cutanea.

Degradazione Della Sfingomielina Host è Essenziale Per La Virulenza Di Leishmania

PLoS Pathogens. Dec, 2009  |  Pubmed ID: 20011126

Negli eucarioti, sfingolipidi (SLs) sono componenti della membrana importanti e potenti molecole di segnalazione. Leishmania, il principale gruppo di SLs è inositolo phosphorylceramide (IPC), che è comune in lievito e Trypanosomatids, ma assente nei mammiferi. Al contrario, la sfingomielina non è sintetizzata dalla Leishmania ma è abbondante nei mammiferi. Nella fase di promastigote in vitro, Leishmania utilizzare metabolismo SL come un importante percorso per produrre etanolammina (EtN), un metabolita essenziale per la sopravvivenza e la differenziazione da procyclics non virulento di metacyclics altamente virulenti. Per ulteriore metabolismo sonda SL, abbiamo identificato un gene che codifica per un putativo neutro sfingomielinasi (SMasi) e/o IPC idrolasi (IPCase), designato ISCL (inositolo phosphoSphingolipid fosfolipasi C-Like). Nonostante la mancanza di sintesi della sfingomielina, promastigotes major L. esposto una potente attività di SMasi che fu abolita su eliminazione di ISCL e aumentato seguente sovraespressione di complementazione episomal. Attività ISCL-dipendente con sfingomielina era circa 20 volte maggiore di quello visto con IPC. Null mutanti di ISCL (iscl(-)) mostrò modesto accumulo di IPC, ma è cresciuto e differenziato normalmente in vitro. È interessante notare che, iscl(-) mutanti non indurre la patologia di lesione in topi BALB/c sensibili, ancora mantenuta indefinitamente a livelli bassi presso il sito di infezione. In particolare, la virulenza di iscl(-) acuta è stata completamente restaurata dall'espressione di ISCL o eterologo SMases mammiferi o funghi, ma non da proteine fungine esibendo solo IPCase attività. Insieme, questi risultati suggeriscono fortemente che degradazione della sfingomielina derivato da host gioca un ruolo fondamentale nella proliferazione di Leishmania in mammalian host e la manifestazione della patologia acuta malattia.

Amplificazione Di Un Gene Trasportatore Alternativo Sopprime Il Fenotipo Avirulente Di Glucosio Trasportatore Null Mutanti in Leishmania Mexicana

Molecular Microbiology. Jan, 2009  |  Pubmed ID: 19017272

Un mutante null di glucosio trasportatore di protozoo parassita Leishmania mexicana, in cui sono stati eliminati tre geni di trasportatore di glucosio legate da mirati sostituzione del gene, è in grado di replicare come amastigote forme all'interno di phagolysomes dei macrofagi mammalian host ed è avirulente. Soppressori spontanee del mutante null sono stati isolati che parzialmente ripristinare la replicazione dei parassiti all'interno dei macrofagi. Questi mutanti soppressore hanno amplificato il gene che codifica per un trasportatore esosi alternativi, permeasi LmGT4 (precedentemente chiamato la permeasi D2), su un elemento extracromosomico circolare, e iperesprimono LmGT4 mRNA e proteina. I soppressori inoltre hanno riacquistato la capacità di trasportare esosi ed essi hanno ripristinato altri fenotipi del mutante null esibendo una maggiore resistenza al killing ossidativo, scossa di calore e la fame di sostanze nutritive, come pure aumentati livelli dell'archiviazione carboidrati beta-mannan, aumentata dimensione di cella e aumentata crescita come stadio dell'insetto promastigotes confrontato con il mutante unsuppressed. Complementazione del mutante null con il gene LmGT4 su un vettore di espressione episomal modo ripristinato anche questi fenotipi, confermando che la soppressione deriva dall'amplificazione del gene LmGT4. Questi risultati sottolineano l'importanza dei trasportatori esoso per la fase infettiva del ciclo di vita del parassita.

Metabolismo Di Fosfolipidi E Sfingolipidi in Leishmania

Molecular and Biochemical Parasitology. Apr, 2010  |  Pubmed ID: 20026359

In molti eucarioti, fosfolipidi (PLs) e sfingolipidi (SLs) sono componenti della membrana abbondanti e serbatoi per importanti molecole di segnalazione. In Leishmania, la composizione, il metabolismo e la funzione di PLs e SLs differiscono significativamente da quelle in cellule di mammifero. Anche se solo una manciata di enzimi sono state caratterizzate sperimentalmente, i dati disponibili suggeriscono molti passaggi del metabolismo PL/SL sono critici per Leishmania redditività e/o virulenza e potrebbero essere una fonte per nuove destinazioni di droga. Ulteriori studi di geni coinvolti nella sintesi (de novo e salvataggio) e degradazione dei PLs e SLs rivelerà loro diversi effetti sulla patogenesi di Leishmania.

Leishmania Major Glicosilazione Mutanti Richiedono Phosphoglycans (lpg2-) Ma Non Lipophosphoglycan (lpg1-) Per La Sopravvivenza in Vettori Permissiva Sand Fly

PLoS Neglected Tropical Diseases. 2010  |  Pubmed ID: 20084096

Sand fly specie in grado di sostenere la sopravvivenza del protozoo Leishmania sono stati classificati come permissivo o specifico, basato sulla loro capacità di sostenere un'ampia o limitata gamma di ceppi o specie. Gli studi di un numero limitato di combinazioni di volo/parassita specie sono implicate molecole superficiali parassita in questo processo e qui forniamo ulteriori prove a sostegno di questa proposta. Abbiamo studiato il ruolo di lipophosphoglycan (GPL) e altri phosphoglycans (PGs) nella sopravvivenza sand fly, utilizzando Leishmania major mutanti carenti di LPG (lpg1(-)) e phosphoglycan (PG)-lpg2(-) mutanti carenti. Le specie di sand fly usate erano la permissiva specie Phlebotomus perniciosus e p. argentipes e il vettore specifico p. duboscqi, una specie resistente allo sviluppo di L. infantum.

Proteophosphoglycan Conferisce Resistenza Di Leishmania Principale Enzimi Digestivi Intestino Indotta Dal Sangue Di Alimentazione in Vettoriale Sabbia Mosche

Cellular Microbiology. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20088949

Leishmania sintetizzare molecole di phosphoglycan contenenti abbondante costituiti da unità ripetute [Gal-Man-PO(4)], compreso la superficie lipophosphoglycan (GPL) e la superficie e secreta proteophosphoglycan (PPG). La competenza vettoriale di Phlebotomus duboscqi e Lutzomyia longipalpis sabbia mosche è stata testata utilizzando mutanti di knockout major L. carenti di entrambi phosphoglycans totale (lpg2(-) o lpg5A(-)/5B(-)) o LPG da solo (lpg1(-)) insieme ai loro rispettivi gene add-back controlli. I nostri risultati confermano che il GPL, la molecola di superficie delle cellule principali della Leishmania promastigotes noto per mediare attaccamento per l'intestino del vettore, è necessario per prevenire la perdita di infezione durante l'escrezione dei resti del pasto di sangue da un vettore naturale, p. duboscqi, ma non un vector innaturale, L. longipalpis. Enzimi digestivi intestino indotti dalla somministrazione di sangue rappresentano un'altra barriera di potenziale per la sopravvivenza del parassita. I nostri risultati mostrano che 36-72 h dopo il feed infettivo, tutti i parassiti sviluppato bene tranne la lpg2(-) e la lpg5A(-)/5B(-) mutanti, che ha mostrato la crescita e sopravvivenza significativamente ridotta. Gli inibitori della proteasi promosso la sopravvivenza precoce e la crescita del lpg2(-) del pasto di sangue. PPG ha dimostrato di essere la molecola chiave che conferisce resistenza agli enzimi digestivi di intestino, in quanto ha impedito l'uccisione del lpg2(-) promastigotes esposti all'intestino lysates preparato da mosche nutriti di sangue. La protezione non era associata con inibizione dell'attività enzimatica, ma con acquisizione di superficie cellulare di PPG, che appare alla funzione simili a mammiferi mucine per proteggere la superficie di sviluppo di promastigotes contro i danni proteolitici.

Eliminazione Del UDP-glucosio Del Rivela Un Percorso UDP-glucosio Del Salvataggio Di UDP-galattosio Del Indipendente in Leishmania Major

Glycobiology. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20335578

Lo zucchero del nucleotide UDP-galattosio (UDP-Gal) è essenziale per la biosintesi di parecchi glycoconjugates abbondanti che formano il glicocalice superficie del parassita protozoo Leishmania major. I dati attuali suggeriscono che UDP-Gal potrebbe insorgere de novo da epimerization di UDP-glucosio (UDP-Glc) o da un percorso di salvataggio che coinvolge la fosforilazione del Gal e l'azione di uridylyltransferase UDP-glucose:alpha-D-galactose-1-phosphate come descritto da Leloir. Poiché entrambi percorsi richiedono UDP-Glc, inattivazione della del UDP-glucosio del (UGP) catalizzando l'attivazione del glucosio 1 fosfato per UDP-Glc aspettava di privare i parassiti dell'UDP-Gal necessaria per Leishmania glicocalice formazione. Mirate delezione del gene che codifica l'UGP, tuttavia, solo parzialmente influenzato la sintesi del phosphoglycans di Gal-ricco. Inoltre, nessuna alterazione nel glycoinositolphospholipids di Gal-contenenti abbondante è stata trovata nel mutante di delezione. Coerentemente con questi risultati, la virulenza del mutante UGP-carenti era solo modestamente influenzata. Questi dati suggeriscono che la Leishmania elabora un percorso di salvataggio indipendenti UDP-Glc per la biosintesi di UDP-Gal.

Monitoraggio Dell'efficacia Della Terapia Fotodinamica Antimicrobica in Un Modello Murino Di Leishmaniosi Cutanea Utilizzando L. Principali Che Esprimono GFP

Journal of Biophotonics. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20376860

Un modello murino di leishmaniosi cutanea con proteina fluorescente verde positiva (GFP +) L. major consente il monitoraggio del carico di parassiti tramite misure di intensità di fluorescenza GFP, consentendo un più veloce e più efficiente modo di monitorare l'esito clinico della terapia fotodinamica (PDT). Questo modello può fornire nuove conoscenze sugli aspetti fototossici in PDT. Anche se i regimi PDT possono essere un po ' diversi negli esseri umani, è previsto che il modello sviluppato faciliterà l'ottimizzazione e la traduzione clinica del PDT come terapia per la leishmaniosi cutanea e l'eventuale sviluppo di trattamenti d'attualità PDT per altre infezioni granulomatose.

Phosphoproteome Dinamica Rivela Complessi Della Proteina Heat-shock Specifici Per La Leishmania Donovani Fase Infettiva

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. May, 2010  |  Pubmed ID: 20404152

Leishmania è esposto a un improvviso aumento della temperatura ambientale durante il ciclo infettivo che innesca la differenziazione del palco e si adatta il fenotipo parassita intracellulare sopravvivenza in mammalian host. L'assenza della classiche promotore-dipendente meccanismi di regolazione genica e l'espressione costitutiva della maggior parte delle proteine heat-shock (HSP) in questi patogeni umani sollevare questioni irrisolte importanti per quanto riguarda la regolazione della risposta di scossa di calore e funzioni specifiche di fase di Leishmania HSP. Qui abbiamo utilizzato un approccio quantitativo di gel per valutare la Leishmania donovani phosphoproteome e ha rivelato che il 38% di proteine hanno mostrato significative differenze di fase-specifici, con un forte accento di fosfoproteine amastigote specifico sulla funzione di chaperone. Abbiamo identificato STI1/HOP-contenenti complessi chaperone che interagiscono con le proteine ribosomiali client in un modo specifico del amastigote. Analisi genetica dei siti di fosforilazione STI1/HOP in null parassiti mutante condizionale sti1(-/-) ha rivelato due residui phosphoserine essenziale per la vitalità del parassita. La fosforilazione dei principali chaperoni Leishmania nella fase patogena suggerisce che queste proteine possono essere promettenti bersagli tramite inibizione delle loro rispettive chinasi della droga.

Un Ruolo Per Tetrahydrofolates Nel Metabolismo Dei Cluster Ferro-zolfo in Tutti I Domini Della Vita

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20489182

Ferro-zolfo (Fe/S) cluster enzimi sono cruciali per la vita. Loro assemblaggio richiede una suite di proteine, alcune delle quali sono specifici per particolari sottoinsiemi di enzimi Fe/S. Una tale proteina è lievito Iba57p, che necessitano di Aconitasi e alcuni enzimi S-adenosilmetionina radicale per attività. Iba57p omologhi si verificano in tutti i domini della vita; essi appartengono alla famiglia delle proteine COG0354 e sono strutturalmente simili ai vari enzimi folato-dipendente. Abbiamo quindi studiato la possibile relazione tra folati e gli enzimi di cluster Fe/S utilizzando l'omologo in Escherichia coli Iba57p, YgfZ. Analisi NMR ha confermato che YgfZ purificata ha mostrato associazione folato stereoselettive. Inattivazione ygfZ ridotto l'attività dell'enzima modifica Fe/S tRNA MiaB e alcuni altri enzimi Fe/S, anche se non aconitasi. Quando successivi passaggi nella biosintesi di folato erano ablazione, folE (manca pterine e folati) e folP (mancanza di folati) mutanti imitavano il mutante ygfZ nell'avere bassa attività MiaB, considerando che folE thyA mutanti supplementati con 5-formiltetraidrofolato (privo di pterine e impoverito in diidrofolato) e gcvP glyA mutanti (manca uno-carbonio tetrahydrofolates) avevano intermedia MiaB attività. Questi dati indicano che YgfZ richiede un folato, probabilmente tetraidrofolato. Importante, il mutante ygfZ era ipersensibile allo stress ossidativo e cresciuto male su media minimi. COG0354 geni batterici, archaeal, fungine, protistan, animale o origine vegetale completato uno o entrambi questi fenotipi di crescita così come il fenotipo di attività MiaB. Analisi genomica comparativa indicato associazioni funzionali diffuse tra le proteine COG0354 e metabolismo cluster Fe/S. Così COG0354 le proteine hanno una funzione antica, conservata, folato-dipendente nell'attività di alcuni enzimi di cluster Fe/S.

Espansione Del Bersaglio Della Rapamicina (TOR) Chinasi Della Famiglia E Funzione in Leishmania Dimostra Che TOR3 è Necessaria Per Acidocalcisome Biogenesi E Animale Infettività

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20551225

Bersaglio della rapamicina (TOR) chinasi sono regolatori chiave della crescita cellulare, proliferazione e struttura negli eucarioti, i processi che sono altamente coordinati durante il ciclo infettivo di patogeni eucarioti. Data mining database ha rivelato tre chinasi TOR in trypanosomatid parassita Leishmania major, come definito dalla omologia della fosfoinositide 3-chinasi legate famiglia chinasi (PIKK) e una firma conservati dominio FKBP12/rapamycin-associazione. Coerenti con i ruoli essenziali di complessi TOR in altri organismi, siamo stati in grado di generare TOR1 null o TOR2 mutanti in colto L. major promastigotes. Al contrario, tor3(-) null mutanti prontamente sono stati ottenuti; pur esibendo un po ' più lenta crescita, tor3(-) mantenuto normale morfologia, rapamicina sensibilità e differenziazione nella fase metacyclic animale-infettiva. Significativamente, tor3(-) mutanti non erano in grado di sopravvivere o replicare in macrofagi in vitro, di indurre la patologia o stabilire infezioni nel topo in vivo. La perdita di virulenza è stata associata con un difetto nella formazione di acidocalcisome, come questo organello unico è stata grossolanamente alterato in tor3-mutanti e polifosfati non più accumulati. Corrispondentemente, tor3-mutanti ha mostrato difetti nell'osmoregolazione ed erano sensibili alla fame per glucosio ma non gli amminoacidi, glucosio è un nutriente limito nel vacuolo parasitophorous. Così, in Leishmania, la famiglia di chinasi TOR ha ampliato per includere un ruolo unico in funzione AC e biologia, uno che è essenziale per la sopravvivenza del parassita nella fase infettiva dei mammiferi. Dato loro ruoli importanti nella sopravvivenza cellulare e virulenza, inibizione della funzione della chinasi TOR in trypanosomatids offre un'attraente destinazione per la chemioterapia.

Un Trasposone Toolkit Per Il Trasferimento Genico E Mutagenesi in Protozoi Parassiti

Genetica. Mar, 2010  |  Pubmed ID: 19763844

Protozoi parassiti colpiscono milioni di persone in tutto il mondo. Trattamento e il controllo di queste malattie sono complicate in parte a causa dell'intricato biologia di questi organismi. Le interazioni di specie di Plasmodium, Leishmania e tripanosomi con i loro ospiti sono mediate da un insolito controllo dell'espressione genica che completamente non è capito. La disponibilità della sequenza del genoma di questi protozoi pone le basi per l'utilizzo di strategie più completi, genome-wide per studiare la funzione del gene. Trasposoni sono strumenti efficaci per l'introduzione sistematica di alterazioni genetiche e sistemi differenti di recepimento sono stati adattati per studiare la funzione del gene in questi patogeni umani. Un marinaio trasposone toolkit per l'uso in vivo o in vitro in parassiti Leishmania è stato sviluppato e può essere utilizzato in una varietà di applicazioni. Questi modificati elementi mariner non solo permettono l'inattivazione di geni, ma anche mediare il salvataggio delle fusioni del gene traslazionale, portando un importante contributo all'indagine della funzione del gene Leishmania. Il piggyBac e trasposoni Tn5 hanno anche dimostrati di mobilitare tutta genomi spp. Plasmodium eludere le limitazioni attuali nella manipolazione genetica di questi organismi.

Identificazione Dei Residui Trasporto-critici in Un Trasportatore Di Folato Dalla Famiglia Folato-biopterina Transporter (FBT)

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 19923217

La proteina Synechocystis Slr0642 e sua plastidial Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) ortholog At2g32040 appartengono alla famiglia folato-biopterina transporter (FBT) all'interno della superfamiglia facilitatore principali. Entrambe le proteine di trasporto folati quando espresso in Escherichia coli. Perché i requisiti strutturali per l'attività di trasporto non sono noti per qualsiasi proteina FBT, abbiamo applicato l'analisi per identificare i residui che sono fondamentali per trasporto e interpretato i risultati utilizzando un modello strutturale comparativo basato su permeasi del lattosio e. coli. Trasporto di folato è stata valutata tramite la crescita di un ceppo di e. coli pabA abgT, che non è possibile sintetizzare o assumere folati o p-aminobenzoylglutamate. In totale, 47 residui sono stati sostituiti con Cys o mutazioni di Alabama a 22 posizioni abolito assorbimento di folato senza alterare l'espressione di Slr0642 nelle membrane, mentre altre mutazioni non avevano alcun effetto. Residui importanti per la funzione principalmente linea il predetta cavità centrale e sono concentrati nel nucleo alfa-eliche, H1, H4, H7 e H10. I percorsi essenziali residui sono coerenti con un sito di folati-associazione menzogne più o meno equidistante da entrambe le facce del trasportatore. Arabidopsis ha otto proteine FBT oltre At2g32040, spesso privo di residui conservati di critiche. Quando sei di queste proteine sono state espresse in e. coli o mutanti di Leishmania folato o pterina transporter, nessuno ha mostrato evidenza di folati o pterina attività di trasporto, e solo At2g32040 è stato isolato da funzionale screening di librerie di cDNA Arabidopsis e. coli. Tali dati negativi potrebbero riflettere ruoli nel trasporto di altri substrati. Questi studi forniscono le intuizioni prime la struttura nativa e meccanismo catalitico della famiglia vettori FBT.

Sfingolipidi Nei Protozoi Parassiti

Advances in Experimental Medicine and Biology. 2010  |  Pubmed ID: 20919659

La superficie della maggior parte dei protozoi parassiti si basa pesantemente su molecole ancorate a lipidi, formano barriere protettive e giocare le funzioni critiche necessarie per infettività. Sfingolipidi (SLs) giocano un ruolo importante attraverso la loro abbondanza e il coinvolgimento nella formazione microdomain membrana, come pure che servono come ancoraggio dei lipidi per molte di queste molecole e in alcuni, ma forse non tutte le specie, come importanti molecole di segnalazione. Interazioni del metabolismo sfingolipidi parassita con quello dell'host potenzialmente possono contribuire alla sopravvivenza del parassita e/o difesa ospite. In questo capitolo riassumiamo attuale conoscenza della struttura di SL, la sintesi e la funzione in molti dei principali gruppi protozoi parassiti.

Conservazione E Perdita Di Percorsi Interferenza RNA in Trypanosomatid Protozoi

PLoS Pathogens. 2010  |  Pubmed ID: 21060810

Percorsi di RNA interference (RNAi) sono diffuse in metaozoans, ma i geni necessari mostrano occorrenza variabile o attività in microbi eucarioti, compreso molti agenti patogeni. Mentre alcuni geni Argonaute o Dicer e Leishmania mancanza attività RNAi, mostriamo che Leishmania braziliensis e altre specie entro il Leishmania sottogenere Viannia elaborare attivo RNAi machinery. È stato visto forte attenuazione dell'espressione da una varietà di geni endogeni e reporter. Come previsto, RNAi atterramento del solo Argonaute gene implicato questa proteina in RNAi. Il potenziale funzionale genetica è stato fondato da test RNAi atterramento linee manca l'asta di paraflagellar, un componente chiave del flagello parassita. Questo pone le basi per la sistematica manipolazione dell'espressione genica attraverso la RNAi in questi organismi asessuali prevalentemente diploidi e può anche consentire selettiva chemioterapia a base di RNAi. Indagini funzionali evolutivi di RNAi geni stabilito che RNAi attività fu perso dopo la separazione del sottogenere Viannia Leishmania dalle restanti specie di Leishmania, una divergenza associata a profondi cambiamenti nel ciclo infettivo del parassita e virulenza. Il genere Leishmania offre pertanto un sistema accessibile per test di ipotesi sulle forze che possono selezionare per la perdita di RNAi durante l'evoluzione, come l'invasione di virus, cambiamenti nella plasticità del genoma mediata da elementi trasponibili e amplificazione del gene (compresi quelli mediazione resistenza ai farmaci), e/o alterazioni nella virulenza del parassita.

Leishmania Major Sopravvivenza Nel Selettivo Phlebotomus Papatasi Sand Fly Vettore Richiede Un Modello Di Galactosylation Lipophosphoglycan Con Codifica SCG Specifico

PLoS Pathogens. 2010  |  Pubmed ID: 21085609

Flebotomo sabbia mosche che trasmettere il protozoo parassita Leishmania differiscono notevolmente nella loro capacità di sostenere il parassita di diverse specie o ceppi in laboratorio: mentre alcuni mostrano una notevole selettività, altri sono più permissivi. In "selettivi" sabbia mosche, associazione di Leishmania e la sopravvivenza nell'intestino vola in genere dipende il promastigote abbondante superficie adhesin lipophosphoglycan (GPL), quali modifiche di specie e ceppo-specifiche esposizioni del phosphoglycan dominante (PG) ripetere unità. Per "selettivo" fly Phlebotomus papatasi PpapJ, lato catena galattosil-modifiche (scGal) di ripetizioni PG svolgono un ruolo chiave nell'associazione parassita. Abbiamo sondato la specificità e le proprietà di questo scGal-GPL PAMP (agente patogeno Associated Molecular Pattern) attraverso studi di isolati naturali esibendo una vasta gamma di modelli di galactosylation e di un pannello di L. isogeni principali progettato per esprimere simile scGal-GPL diversità di transfezione di β1 SCG-codificati, 3-galactosyltransferases con diverse attività. Sorprendentemente, linee sia 'poly-scGal' e 'null-scGal' sopravvissero poco rispetto alla L. PpapJ-simpatrica principali FV1 e altre linee 'mono-scGal'. Tuttavia, la sopravvivenza di tutte le linee era equivalente in p. duboscqi, che naturalmente trasmettere ceppi principali L. cuscinetto 'null-scGal'-PAMPs GPL. Abbiamo poi chiesto se scGal-LPG-mediata interazioni erano sufficienti per la sopravvivenza di intestino PpapJ di ingegneria Leishmania donovani, che esprimono normalmente GPL, per esprimere un 'Ottimale PpapJ' scGal-GPL PAMP. Inaspettatamente, queste "L. major FV1 mascherata" linee di L. donovani-SCG rimasero incapace di sopravvivere all'interno di PpapJ mosche. Questi studi stabiliscono che la sopravvivenza di intestino di L. major in PpapJ mosche è squisitamente sensibile alla PAMP scGal-GPL, che richiedono un pattern specifico 'mono-scGal'. Tuttavia, guasto delle linee di 'mono-scGal' L. donovani-SCG di sopravvivere nella selettive PpapJ mosche suggerisce un requisito per il fattore (fattori un'ulteriore, non ancora identificato L. major specifico parassita). L'interazione del GPL PAMP e ulteriore fattore (fattori) con i recettori di intestino sand fly può determinare se un host dato sand fly è "selettiva" o "permissiva", con conseguenze importanti per la trasmissione di malattia e la co-evoluzione naturale di sabbia mosche e Leishmania.

Microbicida Differenziale Gli Effetti Delle Proteine Umane Istone H2A E H2B Su Leishmania Promastigotes E Amastigoti

Infection and Immunity. Mar, 2011  |  Pubmed ID: 21189319

Recenti studi hanno dimostrato che le proteine dell'istone possono agire come peptidi antimicrobici nella difesa ospite contro Leishmania promastigotes, funghi e batteri extracellulari. In questo studio, abbiamo utilizzato le proteine dell'istone ricombinante umana per studiare ulteriormente gli effetti leishmaniacidal e i meccanismi sottostanti. Abbiamo trovato che gli istoni H2A e H2B (ma non H1(0)) potrebbe direttamente ed efficacemente uccidere promastigotes di Leishmania amazonensis, L. major, L. braziliensis e L. mexicana in modo dose-dipendente di trattamento. Microscopia elettronica a scansione rivelò superficie perturbazione dell'istone-trattato promastigotes. Ancora più importante, il preexposure di promastigotes delle proteine dell'istone marcatamente diminuito l'infettività di promastigotes ai macrofagi murini (Mφs) in vitro. Tuttavia, sono e derivato da lesione amastigoti di L. amazonensis e L. mexicana erano relativamente resistenti al trattamento dell'istone, che correlato con i livelli bassi di H2A intracellulare in amastigoti trattata. Per comprendere i meccanismi alla base di queste risposte differenziali, abbiamo studiato il ruolo delle molecole di superficie promastigote nell'uccisione dell'istone-mediata. Confrontati con i corrispondenti controlli, transgenici L. amazonensis promastigotes che esprimono livelli più bassi di proteine di superficie gp63 erano più suscettibili dell'istone H2A, mentre major L. e L. mexicana promastigotes con eliminazione mirata di lipophosphoglycan 2 (lpg2) gene (ma non il gene lpg1) era più resistente di istone H2A. Si discute l'influenza delle principali molecole superficiali promastigote nell'effetto leishmaniacidal delle proteine dell'istone. Questo studio fornisce nuove informazioni sull'immunità innata host a differenti stadi di sviluppo dei parassiti Leishmania.

Virus a RNA Leishmania Controlla La Gravità Della Leishmaniosi Mucocutanea

Science (New York, N.Y.). Feb, 2011  |  Pubmed ID: 21311023

Leishmaniosi mucocutanea sono causata da infezioni da parassiti intracellulari del sottogenere Leishmania Viannia, compresi Leishmania guyanensis. La patologia si sviluppa dopo la diffusione del parassita ai tessuti rinofaringei, dove lesioni metastatiche distruttive formano con infiammazione cronica. Attualmente, i meccanismi coinvolti nello sviluppo di lesione sono capiti male. Qui vi mostriamo che metastasi parassiti hanno un elevato carico di Leishmania RNA virus-1 (LRV1) che è riconosciuto dal recettore Toll-like host 3 (TLR3) per indurre chemochine e citochine proinfiammatorie. Paradossalmente, queste risposte immunitarie mediate TLR3 reso topi più suscettibili alle infezioni, e gli animali ha sviluppato un'aumentata footpad gonfiore e parassitemia. Così, LRV1 nei parassiti metastasi sovvertito la risposta immunitaria alla Leishmania e promosso la persistenza del parassita.

La Suscettibilità Dei Patogeni Trypanosomatid Di Inibitori Della Chinasi PI3/mTOR Offre Una Nuova Opportunità Di Rideterminazione Del Farmaco

PLoS Neglected Tropical Diseases. Aug, 2011  |  Pubmed ID: 21886855

Rideterminazione destinazione utilizza la conoscenza degli obiettivi "druggable" ottenuto in un organismo e sfrutta queste informazioni per perseguire nuovi potenziali bersagli di droga in altri organismi. Qui descriviamo tali studi per valutare se gli inibitori targeting per il dominio della chinasi del mammifero Target of Rapamycin (mTOR) e umane fosfoinositide-3-chinasi (PI3Ks) mostrano promessa contro il Kinetoplastea parassiti Trypanosoma brucei, T. cruzi, Leishmania major e L. donovani. I genomi di trypanosomatids codificano proteine almeno 12 la superfamiglia di proteine di PI3K, alcuni dei quali sono unici a parassiti. Inoltre, la PI3Ks condivisa differiscono notevolmente in sequenza da quelli dell'ospite umano, fornendo in tal modo le opportunità per inibizione selettiva.

Leishmaniosi Muco-cutanea Nel Nuovo Mondo: La Sovversione Finale

Virulence. Nov-Dec, 2011  |  Pubmed ID: 21971185

Infezione dall'umano protozoo parassita Leishmania può portare, a seconda principalmente la specie di parassita, lesioni cutanee o mucocutanee o fatale infezione viscerale generalizzata. Nel nuovo mondo, specie di Leishmania (Viannia) può causare la leishmaniosi mucocutanea (MCL). MCL clinico comporta una forte risposta iper-infiammatoria e parassitarie diffusione (metastasi) da una lesione primaria a siti distanti, portando a distruttivi lesioni secondarie metastatiche soprattutto nelle zone nasopharyngal. Recentemente, abbiamo riferito a che metastasizing, ma non non-metastatici ceppi di Leishmania (Viannia) guyanensis, hanno elevato onere di un virus dsRNA non segmentato, Leishmania RNA Virus (LRV). DsRNA virale è percepito dall'host Toll-like Receptor 3 (TLR3) quindi che inducono una risposta pro-infiammatoria e ad aggravare la malattia. La presenza di LRV in Leishmania apre nuove prospettive nella comprensione di base della relazione intima tra il parassita e LRV, ma anche a comprendere l'importanza della risposta infiammatoria nei pazienti MCL.

Vie Metaboliche Folato in Leishmania

Essays in Biochemistry. 2011  |  Pubmed ID: 22023442

Trypanosomatid parassiti protozoi del genere Leishmania sono autotrofi sia per folato e Pteridine non coniugate. Leishmania salvare questi metaboliti dai loro ospiti mammiferi e insetti vettori attraverso i trasportatori multipli. All'interno il parassita, folati sono ridotti da un DHFR bifunzionale (diidrofolato reduttasi)-TS (timidilato sintasi) e da un romanzo PTR1 (pteridina reduttasi 1), che riduce sia i folati e Pteridine non coniugate. PTR1 può agire come un bypass metabolico dell'inibizione di DHFR, riducendo l'efficacia dei farmaci antifolate esistenti. Leishmania possiedono un insieme ridotto di reazioni metaboliche folato-dipendente e può salvare molti dei prodotti chiavi del metabolismo dei folati dai loro ospiti. Per esempio, essi mancano di sintesi delle purine, che normalmente richiede 10-formiltetraidrofolato, e invece contare su una rete di enzimi di salvataggio delle purine. Leishmania elaborate almeno tre vie per la sintesi del metabolita chiave 5,10-metilene-tetraidrofolato, necessaria per la sintesi di timidilato e per 10-formiltetraidrofolato, cui funzione presuntiva è per methionyl-tRNAMet formylation necessaria per la sintesi proteica mitocondriale. Studi genetici hanno dimostrato che la sintesi della metionina utilizzando 5-metiltetraidrofolato è superflua, come è l'attività del clivaggio di glicina complesso, probabilmente a causa della ridondanza con idrossimetiltransferasi Serina. Anche se non sempre essenziale, la perdita di diversi risultati di enzimi metabolici di folato in attenuazione o perdita di virulenza in modelli animali e un mutante DHFR-TS null è stata utilizzata per indurre immunità protettiva. La via metabolica di folato offre numerose opportunità per la chemioterapia mirata, con un forte potenziale per la 'rideterminazione' di composti originariamente sviluppati per il trattamento di tumori umani o altri agenti infettivi.

[Leishmaniosi Mucocutanea E Un Passeggero Indesiderato]

Médecine Sciences : M/S. Nov, 2011  |  Pubmed ID: 22130014

Rimodellamento Dell'espressione Della Proteina E MRNA in Leishmania Mexicana Indotta Dalla Delezione Di Geni Di Trasportatore Di Glucosio

Molecular and Biochemical Parasitology. Jan, 2011  |  Pubmed ID: 20869991

Glucosio è un nutriente importante in fase di insetto vettore di Leishmania parassiti. Mutanti null di glucosio trasportatore di Leishmania mexicana presentano profondi cambiamenti fenotipiche in fase insetto promastigotes e amastigoti palco ospite mammifero che risiedono all'interno di phagolysosomes dei macrofagi host. Alcuni di questi cambiamenti fenotipici potrebbe essere mediata o attenuato dai cambiamenti nell'espressione genica che accompagnano la delezione dei geni del trasportatore di glucosio. Per cercare cambiamenti nell'espressione della proteina, è stato confrontato il profilo delle proteine rilevate su gel bidimensionali per wild type e glucosio trasportatore null mutante promastigotes. Un totale di 50 punti cui intensità cambiato significativamente e costantemente in esperimenti multipli sono stati rilevati, suggerendo che una coorte di proteine è alterata nei livelli di espressione in parassiti mutanti null. A seguito di identificazione delle proteine di spettrometria di massa, 3 tali proteine regolamentati sono stati scelti per un'analisi più dettagliata: mitocondriale aldeide deidrogenasi, ribokinase ed esochinasi. Immunoblots impiegando antisieri contro questi enzimi ha confermato che i livelli erano sovraregolati sia in mutanti null glucosio trasportatore selvaggio tipo parassiti morti di fame per il glucosio. Quantitativo reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) ha rivelato che i livelli di mRNA codifica questi enzimi inoltre sono stati rafforzati. Delineamento di espressione globale usando i microarrays ha rivelato un numero limitato di ulteriori modifiche, anche se la sensibilità dei microarrays per rilevare modeste variazioni di ampiezza era inferiore a quello dei gel bidimensionali. Quindi, ci è probabile essere una rete di proteine i cui livelli di espressione sono alterati da ablazione genetica dei trasportatori del glucosio, e gran parte del presente regolamento possa essere riflessi da cambiamenti nei livelli dei mRNAs affine. Alcuni di questi cambiamenti nell'espressione della proteina può riflettere una risposta adattativa dei parassiti per la limitazione del glucosio.

Fenilalanina Idrossilasi (PAH) Dal Più Basso Dell'eucariota Leishmania Major

Molecular and Biochemical Parasitology. Jan, 2011  |  Pubmed ID: 20887755

Amminoacido aromatico idrossilasi (AAAH) in genere utilizzano tetraidrobiopterina (H(4)B) come il cofattore. Il protozoo parassita Leishmania major richiede biopterina per crescita ed esprime forti sistemi di recupero e rigenerazione per mantenere i livelli di H (4) B. Qui abbiamo esplorato le conseguenze della manipolazione genetica di sola L. principali fenilalanina idrossilasi (PAH) per esplorare se potrebbe spiegare la Leishmania H (4) il requisito di B. L. major PAH assomiglia a AAAHs di altri organismi, cuscinetto tipo eucariotico dominio organizzazione e conservazione dei residui catalitici chiave compresi quelli implicati nell'associazione pteridina. Un mutante null pah(-) e un derivato di ciclo integrato episomal (pah-/ + IPA) sono stati prontamente ottenuti, metabolici e studi d'etichettatura stabiliti che PAH era tenuta a hydroxylate Phe a Tyr. WT né linee ciclo sono stati in grado di hydroxylate tirosina radioattivo o triptofano, né di sintetizzare catecolamine. WT ma non pah(-) parassiti hanno mostrato reattività con un anticorpo alla melanina Quando coltivate con l-3,4-diidrossifenilalanina (l-dopa), anche se il prodotto reattivo è improbabile da essere strictu sensu melanina. WT era auxotrofi per Phe, Trp e Tyr, suggerendo che PAH attività era insufficiente a soddisfare le normali esigenze di Tyr. Tuttavia, pah(-) ha mostrato una maggiore sensibilità alla privazione di Tyr, mentre l'IPA (-) / + overexpressor IPA ha mostrato maggiore sopravvivenza e potrebbero essere adattati a crescere bene senza aggiunto Tyr. PAH(-) ha mostrato nessun alterazioni nella differenziazione di H (4) B-dipendente, come stabilito dalla metacyclogenesis in vitro, o di sopravvivenza in caso di infezioni del mouse o dei macrofagi. Così Leishmania IPA può attenuare ma non alleviare Tyr Auxotrofia, ma non ha alcun ruolo essenziale nelle fasi del ciclo infettivo del parassita. Queste scoperte suggeriscono che PAH è improbabile per spiegare il requisito di Leishmania per biopterina.

Leishmania Ucciso Ma Metabolicamente Attivo, Come Un Romanzo Vaccino a Cellule Intere Per La Leishmaniosi Viscerale

Clinical and Vaccine Immunology : CVI. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22323556

Non ci sono attualmente vaccini efficaci per la leishmaniosi viscerale, il secondo più infezione mortale parassita in tutto il mondo. Qui descriviamo un approccio romanzo vaccino a cellule intere utilizzando Leishmania infantum chagasi promastigotes trattata con il amotosalen composto di psoraleni (S-59) e basse dosi di raggi ultravioletti una radiazione. Questo trattamento genera permanente, covalente legami crociati del DNA all'interno parassiti e si traduce in Leishmania organismi chiamati ucciso ma metabolicamente attivo (KBMA). In questa relazione, caratterizzano le caratteristiche di crescita in vitro di entrambi KBMA-L. major e KBMA-L. infantum chagasi (KBMA-Lic). Concentrazioni di S-59 che generano parassiti attenuati in modo ottimale sono stati identificati. Come vivere L. infantum chagasi, KBMA-Lic parassiti sono stati in grado di entrare inizialmente in vivo le cellule del fegato dopo l'infezione per via endovenosa. Tuttavia, considerando che vivo infezione da L. infantum chagasi conduce a epatosplenomegalia nei topi dopo sei mesi, KBMA-Lic erano rilevabili negli organi di topi a questo punto del tempo. In vitro, KBMA-Lic ha mantenuto la capacità di entrare in macrofagi e inducono la produzione di ossido nitrico. Queste caratteristiche di KBMA-Lic correlata con la capacità di proteggere profilattico topi tramite vaccinazione sottocutanea a livelli simili di vaccinazione con organismi vivi, virulenti. Splenocytes da topi vaccinati con live L. infantum chagasi o KBMA-Lic visualizzato simile cytokine pattern in vitro. Questi risultati suggeriscono che la tecnologia KBMA è una strategia di vaccino romanzo potenzialmente sicuro ed efficace contro il protozoo intracellulare L. infantum chagasi. Questo approccio potrebbe rappresentare un nuovo metodo per cellule intere vaccinazione contro altri patogeni intracellulari complesse.