Poner El Genoma De Leishmania a Trabajar: Genómica Funcional Por Captura De Transposones Y Perfiles De Expresión

Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. Jan, 2002  |  Pubmed ID: 11839181

Leishmania son importantes patógenos protozoarios de seres humanos en regiones templadas y tropicales. El estudio de la expresión génica durante el ciclo infeccioso, en mutantes o tras estímulos ambientales o químicos, es un potente enfoque hacia la comprensión de la virulencia del parásito y el desarrollo de medidas de control. Como otros trypanosomátidos, expresión génica de Leishmania es mediada por un proceso transcripcional policistrónico que pone mayor énfasis en los mecanismos de regulación postranscripcional incluyendo proceso del ARN y la traducción de la proteína. Con la inminente finalización del genoma Leishmania, enfoques globales de expresión de mRNA y proteína que examina ahora son factibles. Nuestro laboratorio ha desarrollado a la mariner de transposones de Drosophila como una herramienta para atrapar genes de Leishmania y estudiar su regulación en la forma de fusiones de proteína; un enfoque clásico en otros microbios que pueden denominarse 'proteogenomics'. Asimismo, hemos desarrollado reactivos y enfoques para la creación de microarrays de ADN, que permiten la medición de la abundancia de RNA en el genoma del parásito. Progreso en estas áreas promete aumentar considerablemente nuestra comprensión de los mecanismos globales de regulación génica a nivel de mRNA y proteína y llevar a la identificación de genes candidatos implicados en la virulencia.

Trypanosomatida No Patógenas De Protozoos Como Una Plataforma Para La Investigación De La Proteína Y La Producción

Protein Expression and Purification. Jul, 2002  |  Pubmed ID: 12135552

Todos los sistemas de expresión de proteínas eucarióticas actualmente existentes se basan en formas de vida autónomas. Explotar los potenciales beneficios prácticos asociados con organismos parasíticos, que hemos desarrollado un nuevo sistema de expresión de proteínas basado en Leishmania tarentolae (Trypanosomatidae), un protozoo parásito de lagartos. Para lograr la transcripción fuerte, los genes de interés se integraron en el gene de ARN ribosómico de la subunidad pequeña. Niveles de expresión obtenidos fueron hasta 30 mg de proteína recombinante por litro de la cultura de la suspensión y aumentaron linealmente con el número de copias del gen integrado. Para evaluar el sistema potencial para la producción de proteínas postraduccional modificadas, hemos expresado la eritropoyetina humana en L. tarentolae. La proteína recombinante aislada de los sobrenadantes de cultura era biológicamente activa, procesados nativamente en el extremo N-terminal y N-glicosilados. La N-glicosilación era excepcionalmente homogénea, con un oligosacárido de mamíferos-tipo biantennary y la estructura de la base de Man(3)GlcNAc(2) representando > 90% de los glicanos presentes. L. tarentolae es así el primer organismo eucariotas unicelulares biotecnología útil descrito produciendo biantennary totalmente galactosylated, núcleo-alfa-1, 6-fucosylated N-glicanos.

Caracterización De Quinónicos-Dihidropteridina Reductasa (QDPR) De Los Eucariotas Inferiores Leishmania Major

The Journal of Biological Chemistry. Oct, 2002  |  Pubmed ID: 12151409

Biopterin es necesario para el crecimiento del parásito protozoo Leishmania y es rescatado desde el host a través de las actividades de una novela biopterin transportador (BT1) y amplio espectro pteridina reductasa (PTR1). Aquí se caracteriza Leishmania principales quinónicos-Dihidropteridina Reductasa (LmQDPR), la enzima clave necesaria para la regeneración y mantenimiento de piscinas (4) biopterin de H. LmQDPR demuestra buena homología metazoarios quinónicos-Dihidropteridina Reductasa y conservación de dominios implicados en la catálisis y regulación. A diferencia de otros organismos, LmQDPR está codificada por un conjunto tándem repetido de 8-9 copias que contiene LmQDPR y dos otros genes. QDPR mRNA y la actividad enzimática se expresaron en niveles similares en todo el ciclo infeccioso. Los grados óptimos de pH, propiedades cinéticas y especificidad de sustrato de LmQDPR purificada resultaron para ser similar a la de otras qDPRs, aunque carecía de una actividad significativa para no quinónicos pteridines. Estos y otros datos sugieren que la LmQDPR es poco probable que codifican la actividad de la reductasa de la dihidrobiopterina (PTR2) se ha descrito anteriormente. Del mismo modo LmQDPR no es inhibida por una serie de antifolates que muestra actividad anti-leishmanial más allá de eso atribuible a la dihidrofolato reductasa o inhibición de PTR1. actividad de qDPR se encontró en crudo lisados de Trypanosoma brucei y Trypanosoma cruzi, además, destacando la importancia de biopterin H (4) a lo largo de esta familia de parásitos humanos.

Leishmania LPG3 Codifica Un Homólogo GRP94 Necesaria Para La Síntesis De Phosphoglycan Implicados En La Virulencia Del Parásito Pero No Viabilidad

The EMBO Journal. Sep, 2002  |  Pubmed ID: 12198148

Promastigotes de Leishmania expresan una célula abundante glycoconjugate superficial, lipophosphoglycan (LPG). LPG contiene un polímero del disacárido-fosfato repetición unidad Galbeta1, 4Manalpha1-PO4, compartida por otros desarrollo regulados moléculas implicadas en la virulencia del parásito. Complementación funcional de un Leishmania donovani LPG defectuosas mutante (OB1) acumulando un LPG truncado que contiene sólo el residuo de Manalpha1-PO4 del primer repetir unidad identificada LPG3, el homólogo de Leishmania de la acompañante de mamíferos retículo endoplásmico (ER) GRP94. LPG3 se asemeja a GRP94, ya que localiza al parásito ER, y mutantes lpg3(-) Mostrar defectos incluyendo regulación de proteínas GPI-ancladas superficiales y efectos leves en otros glicoconjugados. LPG3 se une a proteínas celulares y su ortólogo de GRP94 de Leishmania infantum es altamente inmunogénica, sugiriendo un papel potencial en la dirección de la respuesta inmune. Sin embargo, lpg3(-) null mutantes crecen normalmente, son totalmente defectuoso en la síntesis de phosphoglycans, y el mRNA de LPG3 está regulado al desarrollo pero no por el estrés o el calor. Así el papel de LPG3/GRP94 en metabolismo de Leishmania difiere significativamente de otros eucariotas. Como los otros glycoconjugate sintético caminos en este parásito, su actividad se centra en moléculas implicadas en la virulencia en lugar de viabilidad.

Protozomics: Genética Del Parásito De Tripanosomatídeos Viene De La Edad

Nature Reviews. Genetics. Jan, 2003  |  Pubmed ID: 12509749

Trypanosomatida protozoarios causan enfermedades importantes de los seres humanos y sus animales domésticos. Varias herramientas genéticas moleculares ahora están permitiendo rápidos progresos en la comprensión de muchos de los aspectos únicos de la biología molecular y celular de estos organismos. Diploidia y la falta o la dificultad de cruce sexual ha sido un reto para la genética hacia adelante, pero poderosas selecciones y complementación funcional han ayudado a superarlo en Leishmania. ARN de interferencia ha sido adaptado para adelante genética en tripanosomas, en la que también es una herramienta poderosa para la genética inversa. Curiosamente, la eficacia de diferentes herramientas genéticas ha dirigido la investigación en diferentes aspectos de la biología de estos parásitos.

Mutagénesis De Transposones De Mycobacterium Marinum Identifica Un Locus Que Enlazan a La Pigmentación Y Supervivencia Intracelular

Infection and Immunity. Feb, 2003  |  Pubmed ID: 12540574

Micobacterias patógenas sobreviven y replican dentro de los macrófagos de host, pero no comprende los mecanismos moleculares implicados en este paso necesario en la patogenia de la infección. Mycobacterium marinum recientemente se ha utilizado como modelo para los aspectos de la patogenia de la tuberculosis debido a su estrecha relación genética con Mycobacterium tuberculosis y debido a las similitudes en la patología y el curso de la infección causada por este organismo en su huésped natural, peces y ranas, con tuberculosis en los seres humanos. Para avanzar la utilidad del modelo M. marinum, hemos desarrollado la mutagénesis transposon eficiente del organismo utilizando un transposón basadas en mariner de Drosophila melanogaster. Para determinar la eficacia de la transposición, hemos analizado a mutantes de la pigmentación de la biblioteca del mutante de transposones. Además de inserciones en cuatro genes conocidos en la vía de biosíntesis del pigmento, se identificaron dos inserciones en genes nuevos en nuestra biblioteca mutante. Uno de ellos es en un supuesta inhibidor de la vía de biosíntesis de carotenoides. La segunda inserción inesperada es en una región intergénica entre dos genes homólogos a Rv2603c y Rv2604c de M. tuberculosis. Además de un defecto de pigmentación, este mutante mostró mayor predisposición a oxígeno singlete y creció mal en macrófagos murinos. Complementación con ADN genómico de M. tuberculosis que abarca Rv2603c a Rv2606c corregir los defectos de pigmentación y crecimiento del mutante. Estos datos demuestran la utilidad de mutagénesis transposon basadas en mariner de M. marinum y eso M. marinum puede utilizarse para estudiar la función de M. tuberculosis genes involucrados en la replicación y supervivencia intracelular.

Identificación Funcional De Galactosyltransferases (SCGs) Necesaria Para Sobre Modificaciones De La Adhesina Lipophosphoglycan Controlar Moscas Interacciones De Leishmania Major-arena

The Journal of Biological Chemistry. May, 2003  |  Pubmed ID: 12604613

Lipophosphoglycan (GLP) es una molécula de superficie abundante que juega un papel clave en el ciclo infeccioso de Leishmania major. La característica dominante del LPG es un polímero de phosphoglycan (PG) (unidades de repetición de 6Galbeta1,4Manalpha1-PO(4)). En L. principales y estos son ampliamente sustituidos con cadenas laterales de Gal(beta1,3), que son requeridos por la Unión a lectinas midgut y supervivencia. Utilizamos evolutivos polimorfismos en transfecciones estructura y entre especies de LPG para recuperar genes que codifican la LPG lado cadena beta1, 3-galactosyltransferases (betaGalTs). Se recuperó una familia dispersa de seis genes de SRB, cuyas proteínas predijo exhiben características de GalTs eucariotas. Al menos cuatro de estas proteínas demostraron actividad significativa en LPG lado cadena betaGalT; SCG3 mostraron inicia actividad de GalT mientras que SCG2 demostró tanto iniciando y se alarga la actividad GalT. Sin embargo, la actividad de SCG2 era dependiente del contexto, en gran medida silenciosa en su medio normal de genómica, y diferentes cepas muestran una considerable variación en el grado de galactosylation de LPG. Así, el genoma de L. principal codifica una familia de SCGs con actividad y especificidad variables, y proponemos que la cepa específica LPG galactosylation patrones reflejan diferencias en su expresión.

Mejoras En La Eficiencia De Transfección Y Análisis De ARN De Interferencia (ARNi) Se Acerca En El Protozoo Parásito Leishmania

Molecular and Biochemical Parasitology. May, 2003  |  Pubmed ID: 12742588

Enfoques que eliminan la expresión del mRNA directamente son ideales para aplicaciones de la genética reversa en eucariotas microbios que son diploides asexuales, como el protozoo parásito Leishmania. RNA de interferencia (ARNi) enfoques han tenido éxito en muchas especies, incluyendo los relacionados con parásito Trypanosoma brucei. Para las pruebas de RNAi en Leishmania, hemos desarrollado protocolos mejorados para transfección transitoria y estable del DNA, lograr eficiencias de hasta 25 y 3%, respectivamente. Esto facilitó pruebas de RNAi en el lugar geométrico de la alfa-tubulina, cuya inhibición da un fenotipo letal fuerte en trypanosomátidos. Sin embargo, transfección transitoria o estable de DNAs codificación mRNAs para una construcción de alfa-tubulina-lazo del vástago y GFP monitorizar transfección dio lugar a ningún efecto sobre la morfología del parásito, el crecimiento o la expresión de la tubulina en comandante de Leishmania o L. donovani. Transfección transitoria de un 24-nucleótido double-stranded alfa-tubulina siRNA también tuvo ningún efecto. Se obtuvieron resultados similares en estudios dirigidos a un gen de la GFP introducido con una construcción de lazo del vástago de la GFP. Estos datos sugieren que estrategias de ARNi típicos no pueden trabajar eficazmente en Leishmania y mencionan la posibilidad que la Leishmania es naturalmente deficiente actividad de RNAi, como Saccharomyces cerevisae. Se discuten las implicaciones para la biología del parásito, amplificación del gen y el análisis genético.

Identificación De Genes Que Codifican Arabinosyltransferases (SCA) Mediar Modificaciones Del Desarrollo De La Lipophosphoglycan Necesaria Para La Transmisión De La Mosca De La Arena De Leishmania Major

The Journal of Biological Chemistry. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12750366

En pasos clave en el ciclo infeccioso patógenos deben adherirse a las células diana, pero en otras ocasiones desprendimiento es necesario para la transmisión. Durante las infecciones de la mosca de la arena por el protozoo parásito Leishmania major, vinculante de replicar promastigotes está mediada por la cadena lateral de galactosil (scGal) modificaciones de phosphoglycan se repite de la adhesina superficial mayor, lipophosphoglycan (LPG). Liberación es mediada por arabinosyl (Ara) para envases de residuos de scbetaGal LPG sobre diferenciación a la etapa contagiosa de métodos. Utilizamos intraespecíficas polimorfismos de estructura de LPG para desarrollar una estrategia genética hacia la identificación de dos genes (SCA1/2) mediar scAra tapado. Estos LPG lado cadena beta1, 2-arabinosyltransferases (scbetaAraTs) exhiben motivos glicosiltransferasa canónica, y su sobreexpresión conduce a scbetaAraT microsomal elevada actividad. Aunque el nivel de tapas scAra es máximo en métodos parásitos, scbetaAraT actividad es máxima en células de la fase de registro. Porque inmunolocalización cuantitativa estudios sugieren que esto no es mediada por secuestro de SCA scbetaAraTs lejos el aparato de Golgi durante la fase logarítmica, regulación de precursores de Ara activados puede controlar LPG arabinosylation in vivo. Los genes de la SCA definen una nueva familia de betaAraTs eucariotas y representan actividades de LPG-modificar novela desarrollo reguladas, identificadas en Leishmania.

Las Funciones De Lipophosphoglycan (LPG) En El Establecimiento De Leishmania Principales Infecciones En Hospedadores Mamíferos

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12869694

La célula abundante superficie glicolípidos lipophosphoglycan (LPG) estuvo implicado en muchos pasos del ciclo infeccioso Leishmania por pruebas bioquímicas. Sin embargo, la presencia de otra superficie abundante o secretada glicoconjugados compartir dominios de LPG, ha llevado a la incertidumbre sobre la contribución relativa de LPG en vivo. Aquí utilizamos a un Leishmania principal lpg1-mutante, que carece de LPG solo y muestra de virulencia atenuada, diseccionar el papel de GLP en el establecimiento de infecciones de macrófagos in vivo. lpg1 - era altamente susceptible a complemento humano, había perdido la capacidad de inhibir la phagolysosomal fusión transitoriamente y era sensible de oxidante. Estudios de mutantes de ratón defectuosos en importantes mecanismos de defensa confirmaron el papel de LPG en resistencia oxidante pero puso en duda la importancia de inhibición transitoria de la fusión de phagolysosomal para la supervivencia del macrófago de Leishmania. Además, la limitada actividad lítica del complemento de ratón parece ser un mecanismo de defensa ineficaz patógeno in vitro e in vivo, a diferencia de los ejércitos humanos. En cambio, lpg1-parásitos obligados C3b resistieron las proteasas y pH bajo normalmente, entraron macrófagos eficiente y silencioso y continuaron inhibir las vías de señalización de anfitrión. Estos estudios ilustran el valor de los enfoques mecanicistas centrándose en vías de defensa tanto anfitrión como parásito en las funciones biológicas específicas de complejos factores de virulencia como LPG de disección.

No Se Requieren Para Virulencia De Amastigote O Para La Inhibición De La Activación De Los Macrófagos Por Leishmania Major Glycosylinositolphospholipids Y éter Fosfolípidos

The Journal of Biological Chemistry. Nov, 2003  |  Pubmed ID: 12944391

Éter fosfolípidos son componentes importantes de las membranas de los seres humanos y Leishmania. En protozoos parásitos que se presentan por separado o como parte del ancla glicosilfosfatidilinositol (GPI) de moléculas implicadas en la virulencia, como lipophosphoglycan (LPG), más pequeño glycosylinositolphospholipids (GIPLs) y proteínas GPI-ancladas. Hemos generado a mutantes nulos de la Leishmania alkyldihydroxyacetonephosphate principales sintasa (ADS), el primer paso comprometido de la síntesis de lípidos de éter. Análisis enzimático y espectrometría de masa integral demostraron que carecían de ads1-knock-outs todos los fosfolípidos de éter, incluyendo plasmalógenos, LPG y GIPLs. Leishmania ads1 - así representa el eucariotas primera "éter lípidos-síntesis" que podría obtenerse un mutante nulo completamente. Notable ads1 - creció bien y mantuvo las balsas lipídicas (membranas resistentes a detergentes). En ensayos de virulencia cerca parecía LPG-deficiente L. major, incluyendo sensibilidad para complementar e incapacidad para sobrevivir a la fase inicial de la infección de macrófagos. Además conservó la capacidad de inhibir la señalización de las células huésped y para formar los amastigotes infecciosos de los parásitos pocos sobreviven el defecto del establecimiento. Estos resultados contrarrestar las propuestas actuales que GIPLs son necesarios para la supervivencia de amastigote en el anfitrión mamífero o eso parásito lyso-alquilo o alkylacyl-GPI anclajes están el único responsables de la inhibición de la activación de los macrófagos.

Identificación Genética Funcional De PRP1, Un Miembro De La Superfamilia De ABC Transportador Que Confiere Resistencia De Pentamidina En Comandante De Leishmania

Molecular and Biochemical Parasitology. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12946844

Pentamidina (PEN) es un agente de segunda línea en el tratamiento de la leishmaniasis, cuyo modo de acción y resistencia no se entiende bien. Aquí, se utilizó una estrategia genética buscar lugares geométricos capaces de mediar la resistencia de la pluma (PENr) cuando se sobreexpresa en comandante de Leishmania. Una biblioteca de cósmido de lanzadera con injertos de ADN genómicos fue transfectada en promastigotes de tipo salvaje y defendida para transfectants PEN-resistente. Se encontraron dos diferentes cósmidos identificar el lugar geométrico del mismo, que diferenció de otros conocidos genes de resistencia a drogas Leishmania. El gen PENr fue trazado por eliminación y transposon mutagénesis a un marco de lectura abierta (ORF) pertenecientes a la glicoproteína P (PGP) / MRP ATP-binding Superfamilia de transportador de cassette (ABC) que nombramos 1 (PRP1) de la proteína de la resistencia de pentamidina. La proteína PRP1 predijo codifica 1.807 aminoácidos con la típica estructura dimérica 10 dominios transmembrana y dos dominios de unión a nucleótido (NBDs). PENr PRP1-mediada podría revertirse por verapamil y PRP1 overexpressors demostró resistencia cruzada a antimonio trivalente pero no a pentavalente antimonio (glucantime). Aunque el grado de PENr fue modesto (1.7-a 3.7-fold), esto puede ser importante en clínica farmacorresistencia dada la eficacia marginal del PEN contra Leishmania.

Persistencia Sin Patología En Deficiencia De Phosphoglycan Comandante De Leishmania

Science (New York, N.Y.). Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12947201

Infecciones por Leishmania implican una fase aguda de la replicación en macrófagos, normalmente asociada a patología. Después de la recuperación parásitos persisten durante largos periodos, que pueden conducir a la enfermedad severa sobre reactivación. A diferencia del papel de anfitrión factores, factores del parásito que afecta a la persistencia son poco conocidos. Leishmania phosphoglycans falta principales (lpg2-) fueron incapaces de sobrevivir en moscas de la arena y macrófagos, pero conserva la capacidad de persistir indefinidamente en el anfitrión mamífero sin provocar enfermedad. El L. principales lpg2 - así proporciona una plataforma para sondear los factores del parásito implicados en la persistencia y su papel en la enfermedad y la inmunidad.

El Gen HTBF H Región Media Resistencia De Terbinafina En Comandante De Leishmania

Molecular and Biochemical Parasitology. Sep, 2003  |  Pubmed ID: 12967714

Un Sistema in Vitro Para Estudios Genéticos Y De Desarrollo De Leishmania Donovani Phosphoglycans

Molecular and Biochemical Parasitology. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 14550894

Glicoconjugados han demostrado un papel importante en el desarrollo de Leishmania. Sin embargo, la capacidad para estudiar estas moléculas y otros procesos se beneficiaría enormemente de mejorar los métodos de manipulación genética y análisis de la fase amastigote. Esto es sobre todo un reto para L. donovani, el agente de la forma más severa de la leishmaniasis, que puede perder rápidamente la virulencia durante el cultivo in vitro. Aquí divulgamos sobre una sublínea clonal de una 1S2D de L. donovani (LdBob o LdB), que distingue fácilmente de promastigotes de amastigotes en cultivo axénico y mantiene esta habilidad durante el cultivo extendido parásito in vitro. Este derivado puede ser plateado y transfectada eficientemente mientras crece como promastigotes o amastigotes. Lo importante, LdB mantiene la capacidad de distinguir mientras que experimenta alteraciones genéticas, necesarias para la creación de agujeros ciegos de gene y complementadas las líneas. Como virulento L. donovani, LdB exhibe abajo-regulación de la síntesis de lipophosphoglycan (LPG) y para arriba-regulación de la síntesis de proteína A2 en amastigotes. Demostramos que nocauts de LPG2, codificación de un transportador de Golgi PIB-manosa, eliminaron phosphoglycan síntesis en amastigotes axénicos LdB. Estos y otros datos sugieren que los amastigotes axénicos LdB será generalmente útiles como un modelo de diferenciación en los estudios de expresión génica, virulencia, susceptibilidad de función y de la droga glycoconjugate en L. donovani.

Esfingolípidos Son Esenciales Para La Diferenciación Pero No Crecimiento En Leishmania

The EMBO Journal. Nov, 2003  |  Pubmed ID: 14609948

Esfingolípidos (SLs) juegan un papel crítico en las células eucariotas en la formación de las balsas lipídicas, trata de membrana y transducción de señales. Aquí creamos a un mutante nulo de SL en el protozoo parásito Leishmania major a través de la eliminación dirigida de la subunidad de clave de novo biosintética de la enzima serina palmitoiltransferasa 2 (SPT2). Aunque típicamente imprescindibles SLs, spt2-Leishmania eran viable, pero eran totalmente deficiente en la síntesis de novo esfingolípidos y carecía de inositol phosphorylceramides y otros SLs. notable, spt2-parásitos mantenido 'balsas lipídicas"como definidas por la formación de membrana resistente al detergente Triton X-100. Al entrar a la fase estacionaria spt2 - no pudo distinguir a los parásitos métodos infecciosas y murió en su lugar. La muerte ocurrió no por apoptosis o cambios en la expresión génica de métodos, sino de problemas catastróficos que conduce a la acumulación de pequeñas vesículas características de la red de túbulo multivesicular/cuerpo multivesicular. Especificidad de la etapa puede reflejar cambios en la estructura de la membrana, así como las demandas elevadas en el tráfico vesicular necesarios para la remodelación de parásito durante la diferenciación. Sugerimos que SL-deficiente Leishmania proporcionan un entorno biológico útil para pruebas de enzimas esenciales SL en otros organismos donde la perturbación SL es letal.

Vacunación Con Deficiencia De Phosphoglycan De Leishmania Major Protege Muy Susceptibles De Desafío Virulenta Sin Inducir Una Fuerte Respuesta Th1

Journal of Immunology (Baltimore, Md. : 1950). Mar, 2004  |  Pubmed ID: 15004184

Inmunidad a largo plazo para Leishmania puede requerir la presencia de parásitos, pero los intentos anteriores para crear parásitos atenuados que persisten sin causar enfermedad han tenido un éxito limitado. Puesto que los mutantes principales de Leishmania que carecen de lipophosphoglycan y otras phosphoglycans secretadas, denominado lpg2-, persistan indefinidamente en ratones infectados sin provocar ninguna enfermedad, probamos su capacidad para proporcionar protección al reto virulento L.. En respuesta a leishmanial estimulación Ag, células de lpg2--ratones infectados producen niveles mínimos de IL-4 e IL-10, así como niveles muy bajos de IFN-gamma. Sin embargo, cuando los ratones BALB/c infectaron con lpg2-parásitos fueron desafiadas con L. virulento importantes estaban protegidos de la enfermedad. Por lo tanto, estos resultados Informe parásitos atenuados que pueden utilizarse para inducir protección a largo plazo frente a la leishmaniosis e indica que la inmunidad inducida puede ser mantenida en la ausencia de una fuerte respuesta Th1.

La Familia De Genes De LPG1 De Leishmania Major

Molecular and Biochemical Parasitology. Jul, 2004  |  Pubmed ID: 15138063

En Leishmania major, el núcleo de la lipophosphoglycan superficial abundante (LPG) está relacionada estructuralmente con que de los glycosylinositolphospholipids más pequeños (GIPLs) en que contiene galactosylfuranose (residuos de Gal(f)) en un Gal(f) (beta1, 3) motivo de hombre. Sin embargo, la eliminación de la supuesta Gal (f)-transferasa (Gal(f)T) LPG1 afectados Gal(f) incorporación en LPG pero no GIPLs. Presumimos que la presunta GIPL Gal (f)-transferasas podría ser homólogas a LPG1 e identificado tres genes relacionados en el genoma de L. principal. Éstos fueron llamados LPG1L, LPG1R y LPG1G, el último de los cuales fue encontrado en tres copias idénticas a los telómeros de los cromosomas 5, 19 y 32 basado en datos de proyecto del genoma de Leishmania. Ni LPG1 ni sus homólogos LPG1L y LPG1R estuvieron implicados en la biosíntesis de GIPLs, como un golpe de gracia triple de lpg1(-)/lpg1l(-)/lpg1r(-) (la primera en Leishmania) creció normalmente y hecho salvaje-tipo niveles de Gal(f)-que contiene GIPLs. En cambio, la sobreexpresión de estos tres condujo a incorporación de galactosa elevados en glicoproteínas. Gal (f)-glicoproteínas que contienen no habían sido descritos en Leishmania pero ocurren en niveles altos en otros trypanosomátidos estrechamente relacionados incluyendo Trypanosoma cruzi, Crithidia, Leptomonas y Endotrypanum, y homólogos de LPG1L y LPG1R fueron detectados en estas especies. Estos datos sugieren que las capacidades de glyco-sintético de Leishmania y quizás otros trypanosomátidos pueden ser más grandes que se pensaba, con algunas actividades siendo 'secreta' en diversos linajes y potencialmente servir como recipientes para glycoconjugate variación durante la evolución. Pruebas futuras abordará si la familia de LPG1G codifica el hipotético Gal GIPL específicos (f) T.

Perfil De Expresión Utilizando Microarrays De DNA Genómico Aleatorio Identifica Genes Expresados Diferencialmente Asociados Con Tres Grandes Etapas Del Desarrollo Del Protozoo Parásito Leishmania Major

Molecular and Biochemical Parasitology. Jul, 2004  |  Pubmed ID: 15138069

Para completar su ciclo de vida, parásitos protozoos del género Leishmania se someten a por lo menos tres transiciones importantes de desarrollo. Sin embargo, los esfuerzos anteriores para identificar los genes que cambia la regulada en abundancia de transcripción han producido relativamente pocos. Aquí utilizamos la expresión perfilado para evaluar los cambios en la abundancia de la transcripción en tres etapas: replicación de promastigotes y metacyclics infecciosa no replicativa, que ocurren en el vector de la mosca de la arena y en la fase amastigote residentes con macrófagos phagolysosomes en mamíferos. Microarrays se desarrollaron que contengan 11.484 productos PCR que incluyeron un número de genes conocidos y 10.464 fragmentos de ADN genómicos de 1 kb al azar. Matrices fueron hibridadas en triplicado y mostrando el doble de genes o cambios mayores en 2/3 experimentos fueron anotados como diferencialmente expresados. Notable, solamente cerca del uno por ciento de la expresión de DNAs variada por este criterio, en cualquiera etapa comparación. Análisis de Northern blot confirmó el cambio previsto en abundancia de ARNm para la mayoría de estos (68%). Este conjunto de genes incluye la mayoría de los identificados previamente en la literatura como diferencialmente regulada así como un número de genes nuevos. En particular, Leishmania maxicircle transcripciones demostradas para arriba-regulación fuerte en métodos y parásitos de amastigote, probablemente asociados a cambios en el metabolismo de la energía del parásito. Sin embargo, los datos actuales sugieren que expresión perfiles utilizando bibliotecas de ADN escopeta significativamente subestima la magnitud de las transcripciones reguladas.

Traslado in Vitro Utilizando Mutagénesis Había Dirigida Transposones Mariner

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2004  |  Pubmed ID: 15153636

Avances en nuestra comprensión del protozoo parásito Leishmania se han facilitado por el desarrollo de herramientas moleculares y genéticos. Un enfoque poderoso para el análisis y la identificación de genes es mutagénesis transposon. Esto puede realizarse directamente en vivo, pero a menudo es más conveniente generar transposiciones in vitro para posterior análisis in vivo, en un proceso denominado "traslados de mutagénesis." Los navegantes de elemento de Drosophila es idóneo para el uso por cualquier vía. Se han generado elementos mariner mínima que contiene elementos cis acción necesarios para la transposición, que puede ser modificada para satisfacer las necesidades del experimentador. Pueden introducirse más marcadores genéticos y/o reporteros, que son útiles para procedimientos como insertional mutagénesis, secuenciación de la escopeta o la generación de proteína y fusiones transcripcionales para posterior análisis. Transposase activo puede generarse fácilmente siguiendo la expresión en Escherichia coli, y puede obtener eficiencias de 10-3/objetivo, permitir-ing la generación de bibliotecas de grandes transposon inserción adecuadas para la posterior proyección en vivo. Este capítulo explica los pasos necesarios para purificar activo transposasa Mos1 y llevar a cabo una reacción de transposición in vitro. También discutimos algunas de las consideraciones pertinentes para el diseño y aplicación de elementos funcionales mariner (plásmidos de donantes) correspondientes a los estudios en Leishmania y otros organismos.

Identificación De Un Mutante Compensatorio (lpg2-REV) De Leishmania Major Capaces De Sobrevivir Como Amastigotes Dentro De Macrófagos Sin Glicoconjugados De LPG2-dependiente Y Su Importancia Para Las Estrategias De Inmunización Y Virulencia

Infection and Immunity. Jun, 2004  |  Pubmed ID: 15155672

Diferentes especies de Leishmania dependen a los diferentes grados de glicoconjugados abundante, como lipophosphoglycan (LPG) y moléculas relacionadas, en infecciones mamíferas. Previamente, hemos demostrado que los mutantes de la canceladura principales de Leishmania que carecen del transportador de Golgi PIB-manosa LPG2, que es necesario para el montaje de la phosphoglycan dominante (PG) se repite de LPG, eran incapaces de sobrevivir en los macrófagos. Estos lpg2-mutantes, sin embargo, conservan la capacidad de generar infecciones asintomáticas, persistentes en ratones. Por el contrario, Ilg y sus colegas demostraron que la Leishmania mexicana LPG2 mutantes retenido virulencia para los ratones. Aquí identificamos una población revertida parcial de los L. principales lpg2-mutantes (lpg2(-)REV) señaló que había recuperado la capacidad de replicar en macrófagos e inducir la patología de la enfermedad a través de un cambio compensatorio. Como el padre de lpg2, el lpg2 (-) REV revertant era incapaz de sintetizar PGs LPG2-dependiente en la etapa de promastigote y así seguía siendo altamente atenuada en la capacidad de inducir la infección. Sin embargo, después de considerable retardo lpg2 (-) REV revertant-infectado ratones exhibieron lesiones y amastigotes aislados de estas lesiones fueron capaces de replicar dentro de los macrófagos a pesar del hecho de que eran incapaces de sintetizar PGs. Así, en algunos aspectos, la lpg2 (-) REV amastigotes se asemejan a L. mexicana amastigotes. Los estudios futuros de los genes responsables pueden arrojar luz sobre los mecanismos empleados por L. major para sobrevivir en la ausencia de los glicoconjugados de LPG2-dependiente y también pueden mejorar el potencial de la línea principal de lpg2-L. servirá como una vacuna de parásito vivo por superar su tendencia a volver hacia la virulencia.

La Aplicación De La Tecnología De Microarrays De Expresión Génica a La Investigación De La HSP70

Current Molecular Medicine. Sep, 2004  |  Pubmed ID: 15357212

Parásitos protozoarios en el orden Kinetoplastida causan enfermedad grave sobre todo en zonas tropicales y subtropicales. Vacunas para controlar estas enfermedades han mostrado cierta promesa, pero ninguno está en uso clínico activo. Tratamientos farmacológicos están disponibles para todas las infecciones agudas, pero la aparición de resistencia y una fase crónica insensible son problemas actuales. Rápidos avances en tecnología genómica abren la posibilidad de descubrir nuevos genes que pueden contribuir a las iniciativas de la vacuna o servir como metas para el desarrollo de nuevos fármacos. El microarray de ADN es una tecnología genómica, que se está aplicando al nuevo descubrimiento de genes en parásitos de la HSP70. Tanto cDNA y micromatrices genómicas para Leishmania major han identificado un número de nuevos genes que se expresan de manera específica de etapa y los resultados preliminares de un microarray genómica L. donovani también demostraron el nuevo descubrimiento de genes. Un microarray de Trypanosoma brucei fragmentos genomic identificado nuevos genes cuya expresión difiere entre el insecto transmitidas por etapa y la etapa infecciosa humana del parásito. Los próximos años, partiendo de esta obra fundamental, deben presenciar la etapa más emocionante como microarrays se aplican a cuestiones como la base de la resistencia a los medicamentos, leishmaniasis cutánea del poste kala azar, la regulación de la diferenciación a etapas infecciosas, enlazan a vías coordinadamente reguladas de los genes y el desarrollo de parásitos genéticamente definidas que puede tener un potencial como vacunas vivas atenuadas.

Centrales Células T De Memoria Mediar Inmunidad a Largo Plazo De Leishmania Major En La Ausencia De Parásitos Persistentes

Nature Medicine. Oct, 2004  |  Pubmed ID: 15448686

La infección por Leishmania major induce una respuesta inmune protectora y la resistencia a largo plazo a la reinfección, que se cree que depende de los parásitos persistentes. Aquí nos demuestran que, aunque efectoras CD4 (+) las células T se pierden en la ausencia de parásitos, CD4 centrales de memoria (+) las células T se mantienen. Tras la infección secundaria, estas células de memoria T se vuelven centrales mensajeras tejido las células T efectoras y median en la protección. Así, la inmunidad a L. major está mediada por lo menos dos poblaciones distintas de CD4 (+): las células T de corta duración patógeno dependientes de células efectoras y de larga vida de patógenos independientes células de memoria central. Estos datos sugieren que las células T de memoria centrales deben ser los objetivos para las vacunas contra las enfermedades infecciosas no son en directo que requieren inmunidad mediada por células.

Flypaper Para Los Parásitos

Cell. Oct, 2004  |  Pubmed ID: 15507202

En esta edición, Kamhawi et al (2004) describen la identificación de un insecto galectin como receptor para la etapa específica Leishmania adhesina lipophosphoglycan (LPG). Esta interacción es fundamental para la supervivencia del parásito en el intestino medio del vector mosca de la arena. Los resultados abren nuevas vías para estudios de inmunidad insecto, vacunas de enlace de transmisión y coevolución huésped-parásito.

Caracterización De Una Defensina De La Mosca De La Arena Por Flebótomos Duboscqi Inducida Por Desafío Con Bacterias O El Protozoo Parásito Leishmania Major

Infection and Immunity. Dec, 2004  |  Pubmed ID: 15557638

Péptidos antimicrobianos son componentes principales de la respuesta inmune innata de células epiteliales. En insectos vectores, estos péptidos pueden desempeñar un papel en el control de patógenos del intestino. Hemos analizado los péptidos antimicrobianos producidos por la mosca de la arena por flebótomos duboscqi, después del desafío por bacterias inyectadas o alimentación con bacterias o el protozoo parásito Leishmania major. Un nuevo péptido hemolinfa con actividad antimicrobiana fue identificado y demostrado para ser un miembro del insecto defensina familia. Curiosamente, este defensina exhibe una actividad antiparasitaria contra las formas del promastigote de L. major, que residen normalmente en el intestino medio de mosca de la arena. Duboscqi p. defensina podría ser inducida por infecciones tanto hemolinfa o intestino. Defensina mRNA fue inducida después de la infección por wild-type L. major, y esta inducción era mucho menos infecciones siguientes con mutantes de nocaut principales L. que sobreviven mal en moscas de la arena, debido a las deficiencias específicas en abundantes células superficiales glicoconjugados que contiene phosphoglycans (incluyendo lipophosphoglycan). La capacidad de inducir la tripa de patógenos del intestino así como expresión de la grasa corporal de defensina plantea la posibilidad de que este péptido antimicrobiano podría desempeñar un papel clave en el desarrollo de infecciones parasitarias.

Salvamento De Leishmania Y Remodelación De Sede De Esfingolípidos En Amastigote Biogénesis De Supervivencia Y Acidocalcisome

Molecular Microbiology. Mar, 2005  |  Pubmed ID: 15720561

Esfingolípidos (SLs) desempeñan un papel esencial en la mayoría de eucariotas, pero en el Trypanosomatida protozoo Leishmania major sus funciones difieren significativamente. Anteriormente mostramos que mutantes nulos defectuosos en de novo esfingoide SLs de síntesis (spt2-) carecida de base pero crecieron bien y retuvo las balsas lipídicas mientras replicar como promastigotes in vitro. Sin embargo, experimentado catastróficos defectos de membrana trata sobre entrada en fase estacionaria y no se pudo distinguir a la forma infecciosa de métodos. Aquí mostramos que este mutante conserva la capacidad de entrar silenciosamente en los macrófagos y de inhibir la activación, aunque como era de esperar la mayoría parásitos fueron destruidos. Sin embargo, en infecciones de ratón, después una lesiones rápidamente progresiva retraso aparecieron y purificaron amastigotes eran totalmente virulentos a los macrófagos y los ratones. Espectrometría de masas de lípidos spt2-amastigote reveló la presencia de altos niveles de inositol parásito-específica phosphorylceramides (IPCs) no sintetizados por las huestes mamíferas. Inhibidor estudios demostraron que el salvamento se produce a nivel del complejos SLs, sugiriendo que los parásitos realizan 'headgroup' remodelación. Además, describimos un nuevo defecto de los promastigotes-spt2 con acidocalcisomes 'vacío' (ACs), que puede hacer el origen de este organelo de la vía de la biogénesis de cuerpo relacionados con lisosoma orgánulo/multivesicular. Sin embargo, ACs en spt2-amastigotes aparecían cuantitativamente y morfológicamente normales. Así salvamento de SLs y otras moléculas por amastigotes intracelulares juegan papeles claves en la supervivencia de la biogénesis y parásito de la AC en el host.

Eucariota UDP-galactopyranose Mutase (gene GLF) En Patógenos Microbianos Y Metazoal

Eukaryotic Cell. Jun, 2005  |  Pubmed ID: 15947206

Galactofuranose (Gal(f)) es un azúcar novela ausente en mamíferos pero presentes en una variedad de microbios patógenos, a menudo dentro de glicoconjugados que desempeñan un papel crítico en la formación superficial de la célula y el ciclo infeccioso. En procariotas, Gal(f) se sintetiza como el azúcar del nucleótido UDP-Gal(f) por UDP-galactopyranose mutase (UGM) (gene GLF). Aquí utilizamos una pantalla de Bioinformática combinatoria para identificar una familia de candidato GLFs eucariotas que previamente habían escapado de detección. GLFs de tres patógenos, dos protozoos (comandante de Leishmania y Tripanosoma cruzi) y un hongo (Cryptococcus neoformans), tenían actividad UGM cuando estaba expresado en Escherichia coli y repetir el ensayo in vivo o in vitro. GLFs eucariotas están estrechamente relacionadas entre sí pero distante relacionada con GLFs procariotas, mostrando limitada conservación de residuos de núcleo alrededor del sitio de unión a sustrato y dominio de FLAVINA-adenina-dinucleótido obligatorio. Eucariotas varios investigan no previamente para la síntesis de Gal(f) también se mostró fuertes homólogos GLF con conservación de residuos claves. Éstos incluyeron otros hongos, el alga Chlamydomonas y el phleovirus algas Feldmannia irregularis, nematodos (Brugia, Onchocerca y Strongyloides) y Caenorhabditis elegans y las urocordados Halocynthia y Cionia. El marco de lectura abierto de C. elegans fue demostrado para codificar la actividad de la UGM. La distribución filogenética de GLF sugiere que Gal(f) síntesis pueden ocurrir más ampliamente en eucariotas que supone previamente. En general, síntesis de GLF/Gal(f) en eucariotas parece ocurrir con una distribución disjunta y a menudo en las especies patógenas, similares a lo que se ve en procariotas. Así, la inhibición de la UGM puede proporcionar un objetivo atractivo de la droga en los eucariotas donde Gal(f) juega un papel crítico en la viabilidad celular y virulencia.

Identificación De Un Fragmento De ADN Que Aumenta La Estabilidad Mitótica De DNAs Lineales Episomal En Comandante De Leishmania

International Journal for Parasitology. Aug, 2005  |  Pubmed ID: 15996670

El centrómero es una región especializada de los cromosomas eucariotas, el sitio de formación cinetocoro, eje fijación y regulación de segregación cromosómica durante la división celular mitótica y meiótica. Para identificar secuencias que aumentan estabilidad mitótico o actúan como potenciales centrómeros en comandante de Leishmania, primero generamos bibliotecas de Leishmania cromosomas artificiales lineales (LACs) teniendo 30 kb inserciones de ADN genómico seleccionado al azar. Éstos fueron introducidos en los parásitos, y luego evaluaron su estabilidad después de un período de 10 pasos de crecimiento en ausencia de presión selectiva. Aproximadamente el 80% de los 108 transfectants probados perdió sus lagos con prontitud y conservaron sólo el 20% de los recombinantes; de estas seis mostraron estabilidad fuerte pero parcial (mantenido en 30-46% de las células). Mapeo y secuenciación de un clon (cSC10), que le confiere el mayor grado de mantenimiento, revelaron la presencia de una secuencia que fue encontrada dentro de otro episome estable, y que se dispersa en el genoma de L. major. Se discuten las implicaciones de estos datos a los posibles mecanismos de mantenimiento cromosómico.

El Genoma Del Parásito HSP70, Comandante De Leishmania

Science (New York, N.Y.). Jul, 2005  |  Pubmed ID: 16020728

Especies de Leishmania causan un espectro de enfermedades humanas en regiones tropicales y subtropicales del mundo. Han secuenciado los 36 cromosomas del genoma haploide 32.8-megabase de Leishmania major (Friedlin tensión) y predecir 911 genes de ARN, 39 pseudogenes y 8272 genes proteína-codificación, de los cuales 36% puede ser atribuyen a una supuesta función. Se trata de genes implicados en huésped-patógeno, como enzimas proteolíticas y extensa maquinaria para la síntesis de complejos glicoconjugados superficial. La organización de genes proteína-codificación en racimos policistrónico largo, filamento específicos y la falta de factores generales de la transcripción en el genoma de Trypanosoma cruzi (Tritryp), L. major y Trypanosoma brucei sugieren que los mecanismos de regulación de la transcripción de ARN polimerasa II dirigida son distintos de las que operan en otros eucariotas, aunque los trypanosomátidos parecen ser capaces de remodelación de la cromatina. Proteínas de unión de ARN abundantes están codificadas en los genomas de Tritryp, consistentes con activo regulación postranscripcional de la expresión génica.

Estructuras De Leishmania Pteridina Principales Complejos De Reductasa Revelan Las Características De Sitio Activo Importantes Para Ligando Y Guía De Diseño De Inhibidor

Journal of Molecular Biology. Sep, 2005  |  Pubmed ID: 16055151

Pteridina reductasa (PTR1) es una reductasa de NADPH-dependiente de la cadena corta en protozoos parásitos tripanosomatídeos. La enzima participa en el salvamento de pterins y representa un objetivo para el desarrollo de mejores terapias para infecciones causadas por estos parásitos. Divulgan una serie de análisis cristalográficos de Leishmania PTR1 principales. Estructuras de la enzima en un complejo con el cofactor NADPH de binarios y ternarios complejos con cofactor y biopterin, 5,6-dihidrobiopterina y 5.678-tetrahidrobiopterina revelan que PTR1 no experimentan grandes cambios conformacionales para lograr el enlace y procesamiento de substratos y confirmar que estas moléculas se unen en una sola orientación en el centro catalítico adecuado para dos reducciones distintas. Complejos ternarios con cofactor y CB3717 y trimetoprim (TOP), inhibidores potentes de la timidilato sintasa y la dihidrofolato reductasa, respectivamente, han sido caracterizados. La estructura con CB3717 revela que la quinazolina se une de forma similar a los productos y sustratos 1,2,3-trihydroxypropyl y domina las interacciones con la enzima. En el complejo con la tapa, estérica restricciones aplicadas en el sustituto de trimethoxyphenyl prevenir la molécula de 2, 4-diaminopyrimidine de adoptar el modo de 1,2,3-trihydroxypropyl de enlace observada en la dihidrofolato reductasa y explican las propiedades de inhibición de una gama de derivados de la pirimidina. El detalle molecular proporcionado por estas estructuras complejas identifica las interacciones importantes necesarias para el desarrollo basadas en la estructura de los inhibidores de la enzima novela de potencial valor terapéutico.

Reconstitución De La Actividad De Transporte De PIB-manosa Con Proteínas Purificadas De Leishmania LPG2 En Liposomas

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2005  |  Pubmed ID: 15542612

Azúcares nucleótidos activados necesarias para la síntesis de los glicoconjugados dentro de la vía secretora de eucariotas son proporcionados por la acción de transportadores de azúcar del nucleótido (NSTs). Por lo general, se estudian NSTs en preparaciones microsomales de líneas mutantes o de tipo salvaje; sin embargo, en esta configuración puede ser difícil evaluar propiedades NST debido a la presencia de glicosiltransferasas y otras actividades que puedan interferir. Aquí hemos diseñado Leishmania donovani para expresar niveles altos de un transportador de LPG2 Golgi PIB-hombre activo con una etiqueta de polyhistidine C-terminal. El funcional LPG2-su fue solubilizado, purificada mediante cromatografía de afinidad de metal y reconstituido en liposomas que contienen fosfatidilcolina con perlas de poliestireno SM-2. El proteoliposomes exhibe actividad de transporte de PIB-hombre robusta con una aparente k de 6.6 mamá. Actividad de transporte fue había acompañada de precarga de GMP y mostró especificidad para múltiples soportes (PIB-Ara y PIB-Fuc). En contraste con la actividad en los microsomas crudos, transporte no era dependiente de la presencia de cationes divalentes. Así, la reconstitución de la actividad de transporte usando la proteína purificada de LPG2 en liposomas proporciona firme evidencia experimental que un solo polipéptido es únicamente requiere para la actividad NST y es capaz de mediar la captación de múltiples sustratos. Estos estudios son relevantes para el estudio de la estructura NST y función tanto protozoos parásitos, así como sus huéspedes eucariotas superiores.

Manifestación De Expresión Heteróloga Que La Leishmania SCA1 Gen Codifica Una Arabinopyranosyltransferase

Glycobiology. Mar, 2006  |  Pubmed ID: 16272216

En parte del ciclo vital dentro de su vector de la mosca de la arena, principales parásitos de Leishmania primero fije al celular de la mosca a través de su superficie principal de la adhesina lipophosphoglycan (LPG) y más tarde resynthesize una LPG estructuralmente distinto que da lugar a la separación y eventual transmisión. Una de estas modificaciones estructurales requiere la adición de alpha1, 2-D-arabinopyranose tapas para beta1, cadenas de lado 3-galactosa en el dominio de la unidad de repetición de phosphoglycan de gas licuado. Anteriormente habíamos identificamos dos lado arabinosa genes de la cadena (SCA1/2) que participaron en el alpha1, 2-D-Arap tapado. SCA1/2 exposición canónica glicosiltransferasa motivos y la sobreexpresión de cualquier gen conduce a elevados alpha1 microsomal, actividad 2-D-ArapT, resultando en arabinopyranosylation de beta1, cadenas de lado de 3-Gal en LPG (en adelante llamado cadena lateral D-arabinopyranosyltransferase [sc-D-ArapT]). Expresión heteróloga en un fondo de arabinosa nulo se utilizó para determinar si el gen SCA1 codifica el real sc-D-ArapT. Construcciones de expresión SCA1 introducidas en mamíferas células COS-7 tanto el sistema de célula de baculovirus-sf9 exhibieron gran expresión de la proteína. Sin embargo, se observó actividad funcional de la sc-D-ArapT sólo en el último. En estudios in vitro se incubaron con guanidina 59-difosfato (PIB) - D-[3 H] Arap como el azúcar donantes y utilizando LPG exógeno como aceptor, sc-D-ArapT una actividad significativa se observó cuando los microsomas de las células sf9-baculovirus se incubaron en presencia del aceptador de LPG. Ninguna actividad se observó en la ausencia de LPG. Estos resultados demuestran que SCA1 codifica un sc-D-ArapT y proporcionar el primer ejemplo de expresión heteróloga de un gen de D-ArapT.

Inmunización Con Persistentes Atenuadas Delta Lpg2 Principales Parásitos De Leishmania Requiere Adyuvante Para Proporcionar Inmunidad Protectora En Ratones C57BL/6

Infection and Immunity. Jan, 2006  |  Pubmed ID: 16369039

Principales parásitos de Leishmania que carece el transportador del PIB-manosa, denominado Deltalpg2 parásitos, capaces de inducir la enfermedad en ratones pero persisten a largo plazo. Previamente, encontramos que los organismos Deltalpg2 protegen ratones BALB/c de virulento reto de L.. En cambio, se presenta aquí que Deltalpg2 parásitos inducen inmunidad protectora en ratones C57BL/6 sólo cuando se administra con oligodeoxynucleotides que contienen CpG, indicando que la persistencia del parásito solo no es suficiente para mantener inmunidad protectora a L. major.

Organización Genómica Y Expresión De La Familia Ampliada Del Gene De La SCG/L/R De Leishmania Major: Grupos Internos Y Localización Telomérica De SCGs Mediar Sobre Modificaciones De LPG

Molecular and Biochemical Parasitology. Apr, 2006  |  Pubmed ID: 16464509

Modificaciones de la etapa específica de la adhesina lipophosphoglycan superficie abundante (LPG) de Leishmania juegan papeles críticos en encuadernación y liberación del parásito durante su ciclo infeccioso en la mosca de la arena y controlan la capacidad de diferentes especies de moscas para transmitir especies y cepas de parásitos diferentes. En Leishmania principales Friedlin V1, atar a una lectina de mosca de la arena del midgut está mediada por la cadena lateral galactosil (scGal) modificaciones de la phosphoglycan de LPG (PG) se repite, mientras que la liberación se produce arabinosa-nivelación de scGals siguientes. Previamente hemos identificado a una familia de seis genes que SRB codifican la PG scbeta-galactosyltransferases, y a continuación os mostramos que la familia extendida del gene de la SCG (ahora llamada SRB/L/R) abarca a 14 miembros en tres subfamilias (SRB, SCGL y SCGR). Mancha blanca /negra norteña y análisis de RT-PCR sugieren que la mayoría de los genes de la SCG/L/R se expresa, con patrones distintos durante el ciclo infeccioso. Los seis genes de subfamilia SCGR son agrupados y entremezclados con los dos genes SCA responsables de desarrollo regulado arabinosylation de PG scGals; las relaciones entre el SCGR revelaron pruebas claras de la conversión del gene extensa. En contraste, los siete miembros de familia 'núcleo' SRB se localizan adyacentes a los telómeros. Estos telómeros compartan cantidades variables de secuencia ascendente o descendente de la SCG ORFs, otra vez quede constancia de últimos conversiones de gene. Múltiples SCG1-7 RNAs expresaron simultáneamente dentro de las poblaciones de parásitos. Potencialmente, telomérica localización de genes de la SCG puede funcionar principalmente para facilitar la conversión del gene y la elaboración de diversidad evolutiva funcional en el grado de PG sc-galactosylation observado en otras cepas de L. major.

Análisis Bioquímico Y Genético De Metilenotetrahidrofolato Reductasa En El Metabolismo De La Leishmania Y Virulencia

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2006  |  Pubmed ID: 17032644

Metilenotetrahidrofolato Reductasa (MTHFR; EC 1.5.1.20) es la única enzima responsable de la generación de 5-metiltetrahidrofolato, que se requiere para la síntesis de la metionina y la provisión de grupos metilo vía S-adenosilmetionina. Análisis del genoma demostraron que especies de Leishmania, a diferencia de Trypanosoma brucei y Trypanosoma cruzi, contienen genes que codifican MTHFR y dos distintos metionina Sintasas. Leishmania MTHFR diferían de las de otros eucariotas por la ausencia de un dominio regulador c-terminal. MTHFR principal L. se expresó en la levadura y enzima recombinante fue producida en Escherichia coli. MTHFR no fue inhibida por la S-adenosilmetionina y, únicamente entre enzimas metabolizadoras de folato, demostradas especificidad dual-cofactor con NADH y NADPH bajo condiciones fisiológicas. Mutantes nulos de la MTHFR (mthfr(-)) carecía de 5-metiltetrahidrofolato, el folato intracelular más abundante y no podría utilizar homocisteína exógena para el crecimiento. Bajo condiciones de limitación de metionina mthfr(-) las células mutantes crecieron mal, mientras que su crecimiento era normal en medios de cultivo estándar. Actividad in vitro de la MTHFR ni el crecimiento de mutantes de mthfr(-) o overexpressors de la MTHFR afectaron diferencialmente antifolates sabe que inhiben el crecimiento de los parásitos mediante objetivos más allá de la dihidrofolato reductasa y pteridina reductasa 1. En un modelo murino de infección mthfr(-) mutantes mostraron buena infectividad y virulencia, indicando suficiente metionina disponible dentro de la vacuola parasitófora para satisfacer las necesidades del parásito.

Redirección De Metabolismo De Esfingolípidos Hacia La Síntesis De Novo De Etanolamina En Leishmania

The EMBO Journal. Feb, 2007  |  Pubmed ID: 17290222

En la mayoría de eucariotas, esfingolípidos (SLs) son componentes críticos de la membrana y moléculas de señalización. Sin embargo, mutantes del protozoario Trypanosomatida Leishmania que carecen de serina palmitoiltransferasa (spt2-) y SLs crece bien, aunque sean defectuosos en estacionario fase diferenciación y virulencia. Fenotipos similares se observaron en el mutante de esfingolípidos (SL) falta la liasa de 1-fosfato degradatory enzima esfingosina (spl-). Esta interacción epistáticas sugirió que era responsable de un metabolito aguas abajo de SLs. Aquí mostramos que a diferencia de otros organismos, la vía de Leishmania SL ha desarrollado para ser la vía principal para la síntesis de etanolamina (EtN), como suplementos de EtN revirtió totalmente los defectos de la viabilidad y la diferenciación de ambos mutantes. Así Leishmania ha sufrido dos cambios metabólicos importantes: primero en restando énfasis a las funciones metabólicas de SLs ellos mismos en crecimiento, señalización y mantenimiento de los microdominios de membrana, que puedan derivarse de una combinación única de lípidos abundantes parásito; En segundo lugar, liberada de las limitaciones funcionales típicas de SL y la falta de rutas alternativas para producir EtN, Leishmania redirigido metabolismo de SL hacia a granel EtN síntesis. Así, nuestros resultados revelan un ejemplo asombroso de remodelación de la vía metabólica de SL en Leishmania.

Un Desarrollo Independiente De La Lipophosphoglycan De Leishmania En Moscas De Arena Permisivas

Microbes and Infection / Institut Pasteur. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17307009

Leishmaniasis son graves enfermedades parasitarias los organismos etiológicos de las cuales son transmitidos por insectos vectores, phlebotominae flebótomos. Dos especies de mosca de la arena, Phlebotomus papatasi y p. sergenti, Mostrar la especificidad notable para los parásitos de Leishmania que transmiten en la naturaleza, pero muchos otros son ampliamente permisivos al desarrollo de diferentes especies de Leishmania. Estudios previos han sugerido que en vectores 'específicos' el desarrollo exitoso del parásito es mediado por el parásito superficie glicoconjugados y lectinas de la mosca de la arena, sin embargo aquí mostramos que las interacciones que implican "permisiva" moscas de arena utilizan otra moléculas. Encontramos que la abundante glycoconjugate superficial lipophosphoglycan, esencial para la fijación de Leishmania major en el vector específico p. papatasi, no era necesario para la adhesión del parásito o la supervivencia en los vectores permisiva P. arabicus y Lutzomyia longipalpis. Accesorio en varias especies de mosca de la arena permisiva en cambio correlacionada con la presencia de las glicoproteínas del midgut teniendo n-acetil-galactosamina terminal y con la ocurrencia de una actividad de tipo lectina en superficie de Leishmania. Esta nueva modalidad de enlace tiene implicaciones importantes para la transmisión del parásito y evolución. Puede contribuir a la difusión exitosa de Leishmania debido a su adaptación a nuevos vectores, es decir, la transmisión de L. infantum por Lutzomyia longipalpis; este acontecimiento llevó al establecimiento de l infantum /. en América Latina.

Funcionalmente Divergentes UDP-Gal Dos Transportadores De Nucleótido Azúcar Participan En La Síntesis De Phosphoglycan En Comandante De Leishmania

The Journal of Biological Chemistry. May, 2007  |  Pubmed ID: 17347153

En el protozoo parásito Leishmania, superficie abundante y moléculas secretadas, como lipophosphoglycan (LPG) y proteophosphoglycans (motores), contienen galactosa amplia en forma de phosphoglycans (PGs) basado en (Gal-Man-PO(4)) unidades. PGs se sintetizan en el parásito, el aparato de Golgi y requieren transporte de precursores de azúcar del nucleótido citoplasmática a la luz de Golgi por los transportadores de azúcar del nucleótido (NSTs). Transporte PIB-hombre es mediada por el producto del gen LPG2, y aquí nos hemos centrado en transportadores para datos de UDP-gal base minera reveló 12 candidato NST genes en el genoma de L. principal, incluyendo LPG2, así como un transportador de retículo endoplásmico UDP-glucosa del candidato (HUT1L) y varios pseudogenes. Estudios de knock-out del gen establecido que dos genes (LPG5A y LPG5B) codifican NSTs UDP-Gal. Aunque los mutantes lpg5A(-) y lpg5B(-) solos producción PGs, un lpg5A(-)/5B(-) doble mutante era totalmente deficiente. Síntesis de PG fue restaurado en el mutante de lpg5A(-)/5B(-) por la expresión heteróloga del transportador humano de UDP-Gal, y la expresión heteróloga de LPG5A y LPG5B rescató los defectos de glicosilación del mamífero mutante Lec8, que es deficiente en la absorción de la UDP-Gal. Curiosamente, las funciones LPG5A y LPG5B se superponen pero no son equivalentes, ya que el mutante lpg5A(-) demostró un defecto parcial en LPG pero no phosphoglycosylation PPG, mientras que el mutante lpg5B(-) demostró un defecto parcial en la PPG pero no phosphoglycosylation de LPG. Identificación de estos clave NSTs en Leishmania facilitará la disección de la síntesis de glycoconjugate y su rol en el ciclo de vida del parásito y aún más nuestra comprensión de NSTs generalmente.

Comparaciones De Mutantes Que Carecen De Los Transportadores De Golgi UDP-galactosa O PIB-manosa Establecen Que Phosphoglycans Son Importantes Para Promastigote Pero No Amastigote Virulencia En Comandante De Leishmania

Infection and Immunity. Sep, 2007  |  Pubmed ID: 17606605

Abundante superficie Leishmania phosphoglycans (PGs) que contiene [Gal(beta1,4)Man(alpha1-PO(4))]-derivadas repitiendo unidades son importantes en varios puntos en el ciclo infeccioso de este protozoo parásito. Síntesis de PG requiere transporte de precursores de azúcar nucleótido activado desde el citoplasma al aparato de Golgi. Correspondientemente, mutantes nulos del transportador de PIB-manosa principal L. LPG2 carecen de PGs y se comprometen seriamente en la supervivencia del macrófago y la inducción de la patología aguda en ratones susceptibles, pero son capaces de persistir indefinidamente e inducen inmunidad protectora. Sin embargo, lpg2(-) L. mexicana amastigotes asimismo carecer PGs pero de otra manera normal en glycoconjugates conocidos siguen siendo capaces de inducir patología aguda. Para descubrir más, probamos la infectividad de un nuevo mutante principal L. PG-null, que es inactivo en los dos genes de transportador de la UDP-galactosa LPG5A y LPG5B. Sorprendentemente este mutante no recapitular el fenotipo de L. lpg2(-) principales, en cambio, que se asemeja al mutante de importante deficiencia lipophosphoglycan lpg1(-) L.. Lpg5A(-)/lpg5B(-) métodos promastigotes demostró fuertes defectos en los pasos iniciales de la infección de macrófagos y supervivencia. Sin embargo, después de un retraso modesto, el mutante lpg5A(-)/lpg5B(-) inducida por patología de la lesión en ratones infectados, que posteriormente progresó normalmente. Amastigotes recuperados de estas lesiones fueron completamente infecciosos en ratones y en macrófagos a pesar de la continua ausencia de PGs. Esto sugiere que otro metabolito LPG2-dependiente es responsable por el defecto de virulencia de L. principales amastigote, aunque más estudios descartar mananos citoplásmicos. Estos datos así resolución los distintos fenotipos vistos entre lpg2(-) especies de Leishmania, haciendo hincapié en el papel de los glicoconjugados distintos PGs en amastigote virulencia, mientras que proporcionar más apoyo para el papel de PGs en métodos promastigote virulencia.

Caracterización De Inositol Phosphorylceramides De Leishmania Major Por Espectrometría De Masas En Tándem Con Ionización Por Electrospray

Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Sep, 2007  |  Pubmed ID: 17627842

Describimos enfoques espectrometría de masa tándem, incluyendo múltiples etapa-trampa de iones y espectrometría total en tándem (CAD) de la disociación collisionally activado con ionización por electrospray (ESI) para caracterizar especies de phosphorylceramide (IPC) de inositol consideradas de origen [M - H](-) y [M - 2 H + los iones Li](-) en el modo de iones negativos como [M + H](+), [M + Li](+), y [M - H + los iones 2Li](+) en el modo de iones positivos. Después de CAD en una trampa de iones o un instrumento de etapas triple cuadrupolo el [M - H](-) iones de IPC rindieron iones fragmento que refleja sólo el inositol y el sustituto de la molécula de acil graso. En contraste, los espectros de masas de MS(3) de [Inositol](-) M - H - iones contenidos abundantes iones que son fácilmente aplicables para la asignación de los bandos de (LCB) base de ácidos grasos y de cadena larga. Tanto los espectros de producto-ion de MS(2) y MS(3) de la [M - 2 H + Alk](-), [M + H](+), [M + Alk](+), y [M - H + fragmento de 2Alk](+) rica en iones también contenidos iones informativos para asignación inequívoca de sustituto acil graso y la LCB. Sin embargo, se observó en las formas de la sensibilidad de los iones [M - 2 H + Alk](-), [M + H](+), [M + Alk](+), y [M - H + 2Alk](+) (Alk = Li, Na) es casi 10 veces menor que la observada en la [M - H](-) forma. Además de las vías principales de la fragmentación hacia la eliminación del inositol o molécula de monofosfato de inositol, se observaron varios iones estructuralmente informativos resultantes de procesos de cambio. Los procesos de fragmentación son similares a los reportados previamente de ceramidas. Mientras que el método de espectrometría de masa tándem usando MS(n) (n = 2, 3) permite a las estructuras de la Leishmania major IPCs que consiste en dos estructuras isoméricos a se dio a conocer en detalle, la espectrometría de masas de tándem de análisis constante pérdida neutral puede proporcionar un método sencillo para detectar IPC en mezclas.

El Papel De La División De La Glicina Mitocondrial Complejo En El Metabolismo Y La Virulencia Del Parásito Protozoo Leishmania Major

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2008  |  Pubmed ID: 17981801

Para el patógeno humano comandante de Leishmania, una función metabólica dominante es la síntesis de timidilato, que requiere de 5, 10-Metilenotetrahidrofolato (5,10-CH(2)-THF). 5,10-CH 2-THF puede sintetizarse de glicina por el clivaje de la glicina mitocondrial complejo (GCC). Análisis bioinformático revelaron las cuatro subunidades del CCG en el genoma de L. principal, y el papel del CCG en metabolismo del parásito y virulencia se evaluó a través de estudios de la subunidad de P (decarboxilasa de la glicocola (GCVP)). En primer lugar, una proteína GCVP etiquetada fue expresada y localizada en la mitocondria del parásito. En segundo lugar, un mutante de gcvP(-) fue generado y se muestra a la falta de actividad significativa del GCC usando un indirecto análisis in vivo después de la incorporación de etiqueta de glicina [2-14 C] en el ADN. El mutante gcvP(-) creció mal en presencia de glicina exceso o serina mínimo; Estos estudios también establecieron que los promastigotes principales L. requieren Serina para un crecimiento óptimo. Aunque los amastigotes y gcvP(-) promastigotes mostró virulencia normal en infecciones de macrófagos in vitro, ambas formas del parásito patología substancialmente retrasada de la replicación y lesión en infecciones de ratones genéticamente susceptibles o resistentes. Estos datos sugieren que, como la fisiología del sitio infección cambia durante el curso de la infección, también lo hacen las restricciones metabólicas en la replicación del parásito. Esta conclusión tiene gran importancia para la interpretación de necesidades metabólicas de virulencia. Por último, estos estudios llaman la atención en protozoos Trypanosomatida a la clave metabólico intermedio 5,10-CH 2-THF, situado en el cruce de metabolismo timidilato, glicina y serina. En particular, las predicciones basadas en el genoma sugieren que la relacionados con parásito Trypanosoma brucei depende totalmente del GCC para síntesis de 5,10-CH 2-THF.

Phylogenomic Y Análisis Funcional De Las Proteínas De La Familia (COG2154) 1,2,3-Trihydroxypropyl-4a-carbinolamine Dehydratase En Plantas Y Microorganismos

Plant Physiology. Apr, 2008  |  Pubmed ID: 18245455

1,2,3-Trihydroxypropyl-4a-carbinolamine Deshidratasas (PCDs) reciclan cofactores oxidados 1,2,3-trihydroxypropyl generados por aminoácido aromático hidroxilasas (AAHs). PCD es proteínas bioquímico conocidas solamente de animales y una bacteria, pero como PCD (COG2154 en la base de datos de grupos de los grupos Orthologous [CV]) se codifican por muchas plantas y genomas microbianos. Porque estos genomas no codifican a menudo homólogos AAH, la anotación de sus proteínas de COG2154 como PCD es cuestionable. Por otra parte, carecen de algunas proteínas de COG2154 canónicos residuos que son catalíticamente importantes en mamíferas PCDs. diverso COG2154 proteínas de plantas, hongos, Protista y origen procariota por lo tanto fueron probados para la actividad PCD por complementación funcional en Escherichia coli, y las proteínas de la planta fueron localizadas mediante fusiones de la proteína verde fluorescente. Plantas superiores e inferiores demostraron para tener dos proteínas de COG2154, una mitocondrial con actividad PCD y una plastidial, noncanonical sin. Análisis filogenético indicó que este último es exclusivo de las plantas y surgieron los primeros principios en el linaje de la planta. Todos 10 microbianas COG2154 proteínas analizadas tenían actividad PCD; seis de ellas vinieron de genomas con no AAH, y seis eran noncanonical. Los resultados sugirieron el motivo [EDKH] - x (3) - H-[HN]-[PC] - x (5,6)-[YWF] - x (9)-[HW] - x (8,15)-D como una firma para la actividad de la PCD. Organismos tener un PCD funcional pero sin pareja AAH incluyen angiospermas, levadura y varios procariotas. En estos casos, PCD presumiblemente tiene otra función. Un papel auxiliar en el metabolismo del cofactor molybdopterin presumido de phylogenomic pruebas, fue apoyado por demostrar actividades significativamente reducidas de dos molybdoenzymes en mutantes de Arabidopsis thaliana PCD nocaut. Además de este papel, proponemos que le PCDs admite la función de enzimas de 1,2,3-trihydroxypropyl-dependiente aún no reconocidas.

Mayor Supervivencia Intracelular Leishmania No Se Altera En SHP-1 Mev Deficiente O CD45-/-ratones

Experimental Parasitology. Nov, 2008  |  Pubmed ID: 18682252

Protozoos parásitos del género Leishmania escapar la inmunorespuesta interfiriendo con vías de transducción de la señal de su célula huésped, el macrófago, estableciendo condiciones permisivas para supervivencia intracelular. Inhibición de la activación del macrófago después de la infección por Leishmania ha sugerido que requieren activación de fosfatasa de la célula huésped SHP-1. Sin embargo, mediante la utilización de las infecciones de SHP-1 deficientes (me(v)) y ratones mutantes nulos CD45 o macrófagos, Proporcionamos evidencia que supervivencia intracelular de Leishmania major no es generalmente dependiente de estos celulares fosfatasas.

Síntesis De Esfingolípidos Desarrollo Regulado En Tripanosomas Africanos

Molecular Microbiology. Oct, 2008  |  Pubmed ID: 18699867

Esfingolípidos son componentes esenciales de las membranas eucariotas, y muchos eucariotas unicelulares, incluyendo Kinetoplastea protozoos, se cree que sintetizar exclusivamente inositol phosphorylceramide (IPC). Aquí se caracterizan esfingolípidos de Trypanosoma brucei y un Tripanosoma esfingolípidos synthase gene familiares (TbSLS1-4) que es orthologous a Leishmania IPC sintasa. Tripanosomas procíclicas contienen IPC, sino también de la esfingomielina, mientras que sorprendentemente parásitos en el torrente sanguíneo-Estadio contienen phosphorylceramide de esfingomielina y etanolamina (EPC), pero no detectable IPC. Etiquetado ceramida fluorescente in vivo confirmó la biosíntesis de la fase específica de esfingomielina y IPC. Expresión de TbSLS4 en Leishmania dio lugar a la producción de esfingomielina y EPC sugiriendo que la familia del gene TbSLS tiene actividad sintasa bifuncional. ARNi silenciamiento de TbSLS1-4 en tripanosomas torrente sanguíneo condujo a la detención de rápido crecimiento y la muerte eventual de la célula. Los niveles de ceramida aumentaron más de tres veces por silenciamiento sugiriendo un efecto descendente tóxico mediado por este potente mensajero intracelular. Predicciones de topología apoyan un modelo de dominio transmembrana de seis revisado para las HSP70 esfingolípidos Sintasas consistentes con la estructura de la sintasa de esfingomielina mamíferos propuesto. Esta obra revela diversidad novela y regulación en el metabolismo de esfingolípidos en este importante grupo de parásitos humanos.

Las Células Dendríticas Cutáneas Migratorias Actúan Como Sensores Rápidos De Protozoos Parásitos

PLoS Pathogens. Nov, 2008  |  Pubmed ID: 19043558

Células dendríticas (DC), las de la piel, incluidas actúan como centinelas para entrometerse microorganismos. En la epidermis, DC (llamado células de Langerhans, LC) son sésil y su microambiente a través de movimientos ocasionales de sus dendritas de la pantalla. No se conoce la orquestación espacio-temporal de antígeno encuentro por DC cutáneo (DDC). Puesto que estas células se cree en la iniciación de la respuesta inmune durante la infección, investigamos su comportamiento directamente dentro de su microambiente natural usando microscopia intravital de dos fotones. Sorprendentemente, encontramos que, bajo condiciones homeostáticas, DDC eran altamente móviles, continuamente arrastrándose a través del espacio intersticial en una forma dependiente de receptor acoplado a proteínas de Galpha(i). Sin embargo, pocos minutos después de la entrega intradérmica del protozoo parásito Leishmania major, DDC se convirtió inmóvil e incorpora múltiples parásitos de vacuolas citosólicas. Absorción del parásito se produjo a través de la extensión de pseudópodos, altamente dinámicos capaces de seguimiento y que azota los parásitos. Esto fue seguido por retracción rápida dendrita hacia el cuerpo de la célula. DDC fueron en discriminar entre parásitos y partículas inertes y parásito fue independiente de la presencia de neutrófilos. Juntos, nuestro estudio ha visualizado la dinámica y contexto microambiental del parásito encuentro por un subconjunto de células inmunitarias innatas durante la iniciación de la respuesta inmune. Nuestros resultados descubren un programa de vigilancia único tejido migratorias de DDC que asegura la detección rápida de patógenos.

Metileno Tetrahidrofolato Deshidrogenasa/cyclohydrolase Y La Síntesis De 10-CHO-THF Son Esenciales En Comandante De Leishmania

Molecular Microbiology. Mar, 2009  |  Pubmed ID: 19183277

10-Formil-tetrahidrofolato (THF-CHO-10) es un metabolito clave en el metabolismo de carbono C1, que se presenta a través de la acción de formato-tetrahidrofolato ligasa (FTL) y/o 5,10-meteniltetrahidrofolato ciclohidrolasa/5,10-metileno tetrahidrofolato deshidrogenasa (DHCH). Leishmania major posee genes individuales de DHCH1 y FTL codifican las proteínas citosólicas exclusivamente, a diferencia de otros organismos donde isoformas ocurren en la mitocondria, así. DHCH1 recombinante mostró típico NADP (+)-dependiente metileno tetrahidrofolato DH y 5,10-meteniltetrahidrofolato CH actividades y la actividad de DH potentemente fue inhibida por un sustrato analógica 5,10-CO-THF (K(i) 105 nM), como fue el crecimiento de Leishmania (EC(50) 1.1 microM). Anteriores estudios mostraron nula ftl(-) mutantes eran normales, incrementa la posibilidad de que la pérdida de la vía sintética de purina había rendido 10-CHO-THF prescindible en evolución. Fuimos incapaces de generar a mutantes nulos dhch1(-) por el reemplazo del gen, a pesar de utilizar una amplia gama de suplementos nutricionales que se espera para anular la función DHCH. Aplicamos un método mejorado para la prueba de genes esenciales en Leishmania, basado en parcelaria pérdida de genes complementarios episomal en lugar de transfección; Análisis de aproximadamente 1400 eventos sin éxito pérdida de DHCH1 había restablecida su requisito. Por último, empleamos 'complementación genética metabolito' utilizando FTL ectópicamente expresada como una fuente alternativa de 10-CHO-THF; ahora fácilmente se obtuvieron dhch1(-) null parásitos. Estos datos establecen un requisito para el metabolismo de 10-CHO-THF en L. major y proporcionan validación genética y farmacológica de DHCH como un objetivo para la quimioterapia, en esto y potencialmente Otros protozoos parásitos.

Leishmania Donovani Falta El Aparato De Golgi PIB-Man LPG2 Transportador Virulencia Atenuada En El Anexo Huéspedes Mamíferos

Experimental Parasitology. Jul, 2009  |  Pubmed ID: 19328787

Phosophoglycans superficie, tales como lipofosfoglicano (GLP) o proteophosphoglycan (PPG) y fosfolípidos (glycosylinositol GIPLs) modulan las interacciones esenciales entre Leishmania y los macrófagos de mamíferos. La síntesis de Phosphoglycan depende del aparato de Golgi PIB-manosa transportista codificada por LPG2. LPG2 nulo (lpg2 (-)) Leishmania major no se puede establecer infecciones de macrófagos o inducir a la patología aguda, mientras que lpg2 (-) Leishmania mexicana mantener la virulencia. lpg2 (-) Leishmania donovani se ha informado que sobreviven mal en macrófagos cultivados pero en la supervivencia in vivo no ha sido explorado. Aquí hemos descubierto que, al igual que lpg2 (-) L. lpg2 importante, (-) L. donovani promastigotes mostraron la virulencia disminuida en ratones, pero se mantuvieron en niveles constantemente bajos. lpg2 (-) L. promastigotes donovani no podía establecer la infección en los macrófagos y no podía transitoriamente inhibir la fusión fagolisosómico. Por otra parte, lpg2 (-) promastigotes de L. major, L. donovani y L. mexicana eran muy susceptibles a la lisis mediada por complemento. Llegamos a la conclusión de que la Asamblea phosphoglycan y la expresión mediada por L. donovani LPG2 son importantes para promastigotes y amastigotes de virulencia, a diferencia de L. mexicana, pero similar a L. major.

Demostración De Intercambio Genético Durante El Desarrollo Cíclico De Leishmania En El Vector De La Mosca De La Arena

Science (New York, N.Y.). Apr, 2009  |  Pubmed ID: 19359589

Intercambio genético no ha demostrado ser un mecanismo subyacente a la amplia diversidad de parásitos de Leishmania. Se presenta aquí evidencia que las etapas invertebradas de Leishmania son capaces de tener un sexual ciclo consistente con un proceso meiótico que descrito por tripanosomas africanos. Progenie híbrida se generaron que llevaban complementos genómicos completo de ambos padres, pero cinetoplasto ADN maxicircles de uno de los padres. Apareamiento ocurrió solamente en el vector de la mosca de la arena, y híbridos fueron transmitidos a la huésped mamífero por picadura de la mosca de la arena. Intercambio genético probablemente contribuye a la diversidad fenotípica en poblaciones naturales, y análisis de progenie híbrida será útil para el clonaje posicional de los genes que controlan características como virulencia, tropismo de tejido y resistencia a los medicamentos.

Un Papel Nuevo Para Stat1 En Acidificación Del Fagosoma Y Huésped Natural Resistencia a La Infección Por Leishmania Major Intracelular

PLoS Pathogens. Apr, 2009  |  Pubmed ID: 19381261

Parásitos intracelulares del género Leishmania generan graves enfermedades en los seres humanos, que se asocian a un fracaso del huésped infectado para inducir una protección de interferón gamma (IFNgamma)-respuesta inmune mediada por. Probamos el papel de la JAK/STAT1 señalización vía en la patogenesia de Leishmania utilizando ratones knockout carecer el transductor de señal y activador de transcripción 1 (Stat1) y derivados de los macrófagos. Inesperadamente, la infección de macrófagos deficientes Stat1 in vitro con promastigotes de Leishmania major y atenuadas mutantes de octavos de final de LPG1 (lpg(-)) lipophosphoglycan específicamente carecer (LPG) resultó en un crecimiento intracelular de doble aumentada, que era independiente de IFNgamma y asociada con un aumento sustancial en el pH phagosomal. Fagosomas de Stat1-/-macrófagos demostraron la maduración normal según lo juzgado por la acumulación de la rab7 de proteínas lisosomales marcador y proporcionan la actividad normal de la vATPase, pero eran defectuosos en el camino de anión conductor requerido para la acidificación completo vesicular. Nuestros resultados sugieren un papel de pH ácido en el control de crecimiento intracelular de Leishmania temprano durante la infección e identifican por primera vez un papel inesperado de Stat1 en resistencia antimicrobiana natural independiente de su función como transductor de señal IFNgamma-inducida. Esta función de Stat1 novela puede tener importantes implicaciones para los estudios de otros patógenos, como el pH ácido phagolysosomal desempeña un papel importante en el proceso uncoating de muchos virus y procesamiento de antígeno.

La Expresión Regulada De La Leishmania Virulencia Superficial Importante Factor Lipophosphoglycan Uso Condicional Había Desestabilizado Proteínas De Fusión

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. May, 2009  |  Pubmed ID: 19383793

Superficies glicoconjugados desempeñan papeles importantes en el ciclo infeccioso de Leishmania major, incluyendo la lipophosphoglycan abundante (LPG) implicado en la supervivencia del parásito en el vector de la mosca de la arena y las etapas iniciales del establecimiento en el macrófago huésped mamífero. Se describe un sistema de expresión inducible de LPG, aplicando un novedoso sistema de base proteica que permite la degradación controlada de una enzima biosintética clave LPG, UDP-galactopyranose mutase (UGM). Esta metodología se basa en una proteína mutada de FK506-binding (FKBP) desestabilizar el dominio (dd) fusionado a la proteína de interés; en ausencia de rapamicina análogos, tales como Shld1, el dominio de la dd es desestabilizado, conduciendo a la degradación proteasomal, Considerando que el tratamiento farmacológico confiere estabilización. Las pruebas en L. major con fusiones de dd a un panel de periodistas y proteínas celulares confirmaron su funcionalidad, con un alto grado de regulación y bajo fondo, y establecimos la cinética de activación de la proteína o pérdida. Dos barato y ampliamente disponibles ligandos, FK506 y rapamicina, funcionaban de manera similar a Shld1, sin efecto en el crecimiento de Leishmania o diferenciación. Generamos parásitos falta UGM a través de la eliminación del gen GLF y sustitución con una construcción de fusión ddGLF, pines cromosómicas o a través de la complementación episomal; Estos demostraron poca o ninguna expresión de LPG en ausencia del inductor, mientras que en su presencia, altos niveles de gas licuado se lograron rápidamente. Complemento lisis pruebas confirmaron la integridad correcta de la capa de LPG de Leishmania. Estos datos sugieren que el enfoque de dd tiene gran promesa en el estudio de LPG y otras vías pertinentes a la virulencia y la supervivencia del parásito.

Leishmania Major Falta Arginasa (ARG) Son Auxotrófica Para Poliaminas Pero Conservar La Infectividad En Ratones BALB/c Susceptibles

Molecular and Biochemical Parasitology. May, 2009  |  Pubmed ID: 19393161

Las poliaminas son metabolitos esenciales en eucariotas participan en una variedad de procesos proliferativos y en Trypanosomatida protozoos desempeñan un papel adicional en la síntesis de la trypanothione crítica tiol. Mientras que la biosíntesis de poliaminas derivados de L-ornitina se ha estudiado bien en protozoos, los orígenes metabólicos de L-ornitina han recibido menos atención. Arginasa (EC 3.5.3.1) cataliza la hidrólisis enzimática de L-arginina L-ornitina y urea, y probamos el papel de arginasa en síntesis de poliamina por la generación de un nocaut en arg(?) en comandante de Leishmania por el reemplazo de genes específicos doble. Este mutante carecía de actividad arginasa y requiere la prestación nutricional de poliaminas o L-ornitina para crecimiento. Una línea complementa (arg(?)/ + ARG) expresando la arginasa de un vector de expresión múltiple mostró elevación 30 veces de actividad arginasa, similares niveles de poliaminas y ornitina como el salvaje-tipo y resistencia a los inhibidores?-difluoromethylornithine (DFMO) y N(?)-hidroxi-l-arginina (NOHA). Esto estableció que arginasa es la principal ruta de síntesis de poliaminas en promastigotes cultivadas in vitro. Los parásitos arg(?) conservó la capacidad de distinguir normalmente a la etapa contagiosa de métodos y fueron capaces de inducir la enfermedad progresiva después de la inoculación en ratones BALB/c susceptibles, aunque menos eficientemente que parásitos WT. Estos datos sugieren que la forma amastigote infecciosa de Leishmania, que normalmente reside dentro de una vacuola parasitófora acidificado, puede sobrevivir en vivo a través de salvamento de poliaminas anfitrión y/o otras moléculas, ayudados por la tendencia de compartimentos ácidas concentrarse metabolitos básicos. Esto puede contribuir a la resistencia relativa de Leishmania a inhibidores de ornitina descarboxilasa (ODC). La disponibilidad de parásitos infectantes, viables, deficiencia de arginasa puede ser muy útil en el papel del metabolismo de la l-arginina en ambas respuestas pro - y anti - parasitic con host óxido nítrico sintasa, que requiere de la L-arginina generar de disección NO.

Síntesis De PTR1-dependiente De Tetrahidrobiopterina Contribuyen a La Susceptibilidad De Oxidante En Los Trypanosomatida Protozoo Parásito Leishmania Major

Current Genetics. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19396443

Leishmania debe sobrevivir el estrés oxidativo, pero carecen de muchas enzimas antioxidantes clásicos y dependen en gran medida dependientes de trypanothione caminos. Utilizamos pantallas genéticas hacia adelante para recuperar lugares geométricos mediar resistencia oxidante mediante la sobreexpresión de Leishmania major, que identificó pteridina reductasa 1 (PTR1). Comparaciones de líneas isogénicas mostraron ptr1 fueron /por más sensibles al h que PTR1-superproductoras líneas mutantes nulos (-), y tres importantes-a cinco veces las diferencias fueron vistos con un amplio panel de agentes inductores de oxidante. La toxicidad de simple óxido nítrico generadores y otras clases de fármacos (excepto antifolates) fueron afectada por los niveles de PTR1. H susceptibilidad podría ser modulada por biopterin exógeno pero no folato, una manera PTR1 - pero no la dihidrofolato reductasa dependiente, implicando específicamente metabolismo B H (4). H consumo ni el nivel de estrés oxidativo intracelular fue afectado por los niveles de PTR1. Junto con el hecho que reduce pteridines son por lo menos cien veces menos abundantes que celular tioles, estos datos sostienen fuertemente ese acto de pteridines reducido a través de un mecanismo que no sea borrado. La capacidad de pteridines no conjugada de estrés oxidativo contador tiene implicaciones para la infectividad y la respuesta a la quimioterapia. Puesto que los niveles de pteridina intracelular de Leishmania pueden ser fácilmente manipulados, estos organismos ofrecen un ambiente poderoso para la disección de la susceptibilidad de pteridina dependiente oxidante en eucariotas superiores.

Las Enzimas De La Vía Sintética 10-formil-tetrahidrofolato Se Encuentran Exclusivamente En El Citosol De Los Trypanosomatida Parásito Leishmania Major

Molecular and Biochemical Parasitology. Aug, 2009  |  Pubmed ID: 19450731

En la mayoría de los organismos 10-formil-tetrahidrofolato (THF-CHO-10) participa en la síntesis de purinas en el citosol y formylation de methionyl-tRNA(Met) de iniciador mitocondrial. Aquí estudiamos 10-CHO-THF biosíntesis en el protozoo parásito Leishmania major, un auxotroph de purina. Se conocen dos distintas enzimas sintéticas, un bifuncional metileno-tetrahidrofolato deshidrogenasa/cyclohydrolase (DHCH) o formil-tetrahidrofolato ligasa (FTL), y perfiles phylogenomic revelan una considerable diversidad de éstos en trypanosomátidos. Todas las especies encuestadas contienen un DHCH1, que fue demostrado recientemente para ser esencial en L. major. Un segundo DHCH2 ocurrió sólo en L. infantum, L. mexicana y T. cruzi y como un pseudogene en L. major. DHCH2s oso extensiones N-terminal y mostramos que una fusión LiDHCH2-GFP afectó a la mitocondria. FTLs encontradas en todas las especies excepto Trypanosoma brucei. Mutantes nulos de L. ftl(-) principales eran fenotípicamente normales en el crecimiento, la diferenciación, animal infectividad y sensibilidad a un panel de pteridina análogos, pero crecieron más lentamente cuando hambrientos de serina o glicina, según lo esperado para los aminoácidos que son sustratos en el metabolismo del folato C1. Fraccionamiento celular y western blot demostraron que L. DHCH1 principales tanto FTL fueron localizados en el citosol y no de la mitocondria. Estos datos de localización predicen que en L. principal citosólica 10-formil-tetrahidrofolato deberá transportarse en la mitocondria para apoyar methionyl-tRNA(Met) formylation. La retención en todos los trypanosomátidos de al menos una enzima implicada en la biosíntesis de 10-formil-tetrahidrofolato y la esencialidad de este metabolito en L. major, sugiere que esta vía representa una nueva área prometedora para ataque quimioterapéutico en estos parásitos.

Leishmania Phosphoglycans Principales Influyen En La Respuesta Inmune Temprana De Host Mediante La Modulación De Las Funciones De La Célula Dendrítica

Infection and Immunity. Aug, 2009  |  Pubmed ID: 19487470

El papel exacto de Leishmania glycoconjugate moléculas phosphoglycans (PGs) y lipophosphoglycan (LPG) en respuestas celulares anfitrión es aún poco definido. Aquí, hemos investigado la interacción de Leishmania principal LPG2 mutante nulo (lpg2(-)), que carece de PGs y LPG, con las células dendríticas (DCs) y la posterior respuesta temprana de inmune en ratones infectados. Sorprendentemente, la ausencia de phosphoglycans no influyó en el patrón de expresión de la clase complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II), CD40, CD80 y CD86 en DCs in vitro e in vivo. Sin embargo, lpg2(-) L. major induce significativamente mayor producción de interleucina - 12 p 40 (IL - 12 p 40) por DCs infectados de médula ósea (BMDCs) que parásitos de tipo salvaje (WT) in vitro. Además, la producción de IL - 12 p 40 por drenaje ganglionar células de ratones infectados mutante de lpg2(-) era superior a las de los ratones infectados con mayor de WT L.. En experimentos de presentación de antígeno de modelo, DCs de ratones infectados mutante de lpg2(-) inducida por más interferón gamma (IFN-gamma) y producción de IL-2 por las células T específicas Leishmania que los de los ratones infectados con WT. Linfocitos aislados de ratones infectados por 3 días con lpg2(-) parásitos producen niveles similares de IFN-gamma, pero significativamente menos IL-4 e IL-10 que los controles de peso. También se observó disminución producción de IL-4 en otro mutante general de PG-deficientes que carece de los transportadores de Golgi UDP-galactosa (lpg5A(-) lpg5B(-)), pero no con el mutante lpg1(-) falta sólo LPG, tal modo implicando PGs generalmente en la reducción de la producción de IL-4. Así, Leishmania PGs influencia temprana inmunorespuesta del anfitrión modulando funciones de DC de una manera que inhibe la presentación antigénica y promueve la pronta respuesta de IL-4, y su ausencia puede afectar el equilibrio entre las respuestas Th1 y Th2.

Inoculación De Comandante De Leishmania Muerto En Ratones Inmunes Interrumpe Rápidamente Inmunidad a Un Desafío Secundario Mediante Proceso Mediada Por IL-10

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Aug, 2009  |  Pubmed ID: 19666482

Recuperación de infección principal de Leishmania de natural o experimental, el agente causante de la leishmaniasis cutánea, resultados en el desarrollo de inmunidad duradera en ratones y humanos que se manifiesta como control rápido de la replicación del parásito y la resolución de la lesión cutánea después del desafío secundario. Esta forma de inmunidad "inducida por la infección" se piensa para ocurrir naturalmente en áreas endémicas y generalmente se considera el estándar de oro para cualquier vacuna eficaz contra la leishmaniasis cutánea. Para determinar los factores que pueden aumentar o derogar la inmunidad inducida por infección, investigamos los efectos de inocular antígeno muerto en forma de parásitos de Leishmania mataron a los ratones curadas. Demostramos la inoculación de parásitos muertos en ratones que resolvió sus virulentas L. infección principales resultados primarios pérdida rápida y relativamente sostenida de la inmunidad inducida por la infección. Esta pérdida de inmunidad no era debido a la incapacidad de parásitos muertos para inducir las respuestas inflamatorias (como la hipersensibilidad de tipo retardado), dado que estaba vinculado a su incapacidad para inducir respuesta robusta de IFN-gamma. Además, inoculación de parásitos de Leishmania muertos en ratones curadas condujo a la rápida expansión de las células de T de CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) productores de IL-10 en los ganglios linfáticos que drenan el sitio de la infección primaria. Tratamiento con anti-CD25 o anti-IL-10R mAb suprimido mató parásito inducida por la pérdida de inmunidad. Nuestro estudio sugiere que la vacunación con parásitos muertos podría predisponer individuos naturalmente inmunes a ser susceptible a nuevas infecciones o reactivación de la enfermedad. Esto puede explicar la falta de eficacia de las vacunas en pruebas de campo en regiones endémicas. Estos resultados tienen implicaciones importantes para las estrategias de diseño y vacunación de vacuna contra la leishmaniasis cutánea humana.

Degradación De Esfingomielina Anfitrión Es Esencial Para La Virulencia De Leishmania

PLoS Pathogens. Dec, 2009  |  Pubmed ID: 20011126

En eucariotas, esfingolípidos (SLs) son componentes importantes y poderosas moléculas de señalización. En Leishmania, el mayor grupo de SLs es inositol phosphorylceramide (IPC), que es común en levadura y trypanosomátidos pero ausente en mamíferos. En contraste, la esfingomielina no es sintetizada por Leishmania pero es abundante en los mamíferos. En la etapa de promastigote in vitro, Leishmania utilizan metabolismo SL como una vía importante para producir etanolamina (EtN), un metabolito esencial para la supervivencia y diferenciación de procyclics no virulenta a metacyclics altamente virulenta. Metabolismo de otra sonda SL, se identificaron un gen que codifica una supuesta esfingomielinasa neutro (SMase) o IPC hidrolasa (IPCase), señalado ISCL (Inositol phosphoSphingolipid fosfolipasa C-como). A pesar de la falta de síntesis de la esfingomielina, L. principales promastigotes exhibió una potente actividad de SMase que fue suprimida a la eliminación de ISCL y sobreexpresión siguiente aumento por complementación episomal. Actividad de ISCL-dependiente con esfingomielina era cerca de 20 veces más grande que visto con IPC. Null mutantes de ISCL (iscl(-)) demostró la acumulación modesta de IPC, pero creció y distinguido normalmente in vitro. Curiosamente, iscl(-) mutantes no indujo la patología de la lesión en los ratones BALB/c susceptibles, sin embargo, persistieron indefinidamente en niveles bajos en el sitio de infección. En particular, la virulencia aguda de iscl(-) fue completamente restaurada por la expresión de ISCL o SMases heterólogo de mamíferos o por hongos, pero no por proteínas fúngicas sólo IPCase actividad. Juntos, estos resultados sugieren fuertemente que la degradación de la esfingomielina derivado del anfitrión desempeña un papel crucial en la proliferación de Leishmania en mamíferos anfitriones y la manifestación de la patología de la enfermedad aguda.

La Amplificación Del Gen De Un Transportador Alternativo Suprime El Fenotipo Insipidez De Mutantes Nulos De Transportador De Glucosa En Leishmania Mexicana

Molecular Microbiology. Jan, 2009  |  Pubmed ID: 19017272

Un mutante nulo del transportador de glucosa del parásito protozoo Leishmania mexicana, en la que se han eliminado tres genes del transportador de glucosa enlazadas por dirigido el reemplazo del gen, es incapaz de replicar como amastigote forma dentro de la phagolysomes de macrófagos huésped mamífero y es avirulento. Supresores espontáneos del mutante nulo se han aislado que restablecer parcialmente la replicación de parásitos dentro de los macrófagos. Estos mutantes supresor han amplificado el gen de un transportador de hexosa alternativos, la permeasa LmGT4 (anteriormente llamado la permeasa D2), en un elemento extracromosómico circular, y sobreexpresan LmGT4 mRNA y proteína. Los supresores también han recuperado la capacidad para el transporte de hexosas y han vuelto otros fenotipos del mutante nulo que exhibe la mayor resistencia a matanza oxidativo, choque térmico y hambre de nutrientes, así como niveles aumentados del beta de carbohidratos de almacenamiento-Manano, aumentado tamaño de la célula y aumentaron en el crecimiento como promastigotes etapa insectos en comparación con el mutante no suprimido. Complementación del mutante nulo con el gen de la LmGT4 en un vector de expresión episomal MultiCopia también revertir estos fenotipos, confirmando que la supresión resulta de la amplificación del gen LmGT4. Estos resultados subrayan la importancia de los transportadores de hexosa para la etapa infecciosa del ciclo de vida del parásito.

Metabolismo De Fosfolípidos Y Esfingolípidos En Leishmania

Molecular and Biochemical Parasitology. Apr, 2010  |  Pubmed ID: 20026359

En muchos de los eucariotes, fosfolípidos (PLs) y esfingolípidos (SLs) son componentes de la membrana abundantes y depósitos para importantes moléculas de señalización. En Leishmania, la composición, metabolismo y función de PLs y SLs difieren significativamente en células de mamíferos. Aunque sólo un puñado de enzimas se han caracterizado experimentalmente, los datos disponibles sugieren muchos pasos del metabolismo PL/SL son esenciales para la viabilidad de Leishmania y/o virulencia y podrían ser una fuente de nuevas dianas farmacológicas. Otros estudios de genes implicados en la síntesis (de novo y salvamento) y de la degradación de PLs y SLs revelará sus efectos diversos en la patogenesia de Leishmania.

Leishmania Glicosilación Principales Mutantes Requieren Phosphoglycans (lpg2-) Pero No Lipophosphoglycan (lpg1-) Para La Supervivencia En Vectores De La Mosca De Arena Permisiva

PLoS Neglected Tropical Diseases. 2010  |  Pubmed ID: 20084096

Especies capaces de soportar la supervivencia del parásito protozoo Leishmania han sido clasificados como permisiva o específicos, dependiendo de su capacidad para soportar un rango amplio o limitado de cepas o especies. Estudios de un número limitado de combinaciones de especies de mosca/parásito han implicado moléculas superficiales de parásito en este proceso y aquí proporcionamos más evidencia en apoyo de esta propuesta. Investigamos el papel de lipophosphoglycan (LPG) y otros phosphoglycans (PGs) en la supervivencia de la mosca de la arena, utilizando Leishmania principales mutantes deficientes en LPG (lpg1(-)) y el phosphoglycan (PG)-lpg2(-) mutante deficiente. La especie de mosca de la arena utilizada fueron las especies permisiva Phlebotomus perniciosus y p. argentipes y el vector específico p. duboscqi, una especie resistente al desarrollo de L. infantum.

Proteophosphoglycan Confiere Resistencia De Leishmania Major a Las Enzimas Digestivas Celular Inducidas Por La Alimentación En El Vector Arena Moscas De Sangre

Cellular Microbiology. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20088949

Leishmania sintetizar moléculas abundantes que contienen phosphoglycan, compuestas por unidades de repetición [Gal-Man-PO(4)], incluyendo la superficie lipophosphoglycan (LPG) y la superficie y secretada proteophosphoglycan (PPG). La competencia de vector de duboscqi Phlebotomus y Lutzomyia longipalpis flebótomos fue probada utilizando a L. principales nocaut mutantes deficientes en cualquiera de los dos phosphoglycans total (lpg2(-) o lpg5A(-)/5B(-)) o LPG solo (lpg1(-)) junto con sus respectivos genes add-back controles. Nuestros resultados confirman que el LPG, la molécula de superficie de células principales de promastigotes de Leishmania conocido para mediar el accesorio para el celular de vector, es necesario para evitar la pérdida de la infección durante la excreción de los restos de comida de sangre de un vector natural, p. duboscqi, pero no un vector antinatural, L. longipalpis. Enzimas digestivas celular inducidas por la alimentación de la sangre constituyen otra barrera potencial para la supervivencia del parásito. Nuestros resultados muestran que 36-72 h después de la alimentación infecciosa, que todos parásitos desarrollaron bien excepto el lpg2(-) y el lpg5A(-)/5B(-) mutantes, que demostraron una reducción significativa de la supervivencia y crecimiento. Inhibidores de la proteasa promovieron la supervivencia temprana y crecimiento de lpg2(-) en la harina de sangre. PPG mostró ser la molécula clave que confieren resistencia a las enzimas digestivas del midgut, como impidió matanza de promastigotes lpg2(-) expuestos a midgut lisados preparado de moscas alimentados con sangre. La protección no se asoció con la inhibición de actividades enzimáticas, pero con la adquisición de superficie de células de la PPG, que parece funciones parecidas a los mamíferos mucinas para proteger la superficie de desarrollar promastigotes contra daños proteolítica.

Eliminación De La UDP-glucosa Pirofosforilasa Revela Un Camino Del Salvamento UDP-galactosa Independiente UDP-glucosa En Comandante De Leishmania

Glycobiology. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20335578

El azúcar del nucleótido UDP-galactosa (UDP-Gal) es esencial para la biosíntesis de varios glicoconjugados abundantes, formando el Glicocálix superficie del protozoo parásito Leishmania major. Los datos actuales sugieren que la UDP-Gal podría presentarse de novo por Epimerización de la UDP-glucosa (UDP-Glc) o por un camino del salvamento que implica la fosforilación de los Gal y la acción de UDP-glucose:alpha-D-galactose-1-phosphate Uridililtransferasa descrito por Leloir. Puesto que ambas vías requieren UDP-Glc, inactivación de la UDP-glucosa pirofosforilasa (UGP) cataliza la activación de glucosa 1 fosfato en UDP-Glc esperaba privar a parásitos de UDP-Gal, necesaria para la formación de Glicocálix de Leishmania. Eliminación específica del gene que codificaba la UGP, sin embargo, sólo parcialmente afectada la síntesis de la phosphoglycans rica en Gal. Por otra parte, ninguna alteración en la glycoinositolphospholipids de Gal que contienen abundante fue encontrada en el mutante de eliminación. De acuerdo con estos resultados, la virulencia de los mutantes deficientes en UGP fue afectada sólo modestamente. Estos datos sugieren que la Leishmania elabora un camino del salvamento independiente de UDP-Glc para la biosíntesis de la UDP-Gal.

Seguimiento De La Eficacia De La Terapia Fotodinámica Antimicrobiana En Un Modelo Murino De Leishmaniasis Cutánea Uso Mayor L. Expresando Las Buenas Prácticas Agrarias

Journal of Biophotonics. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20376860

Un modelo murino de la leishmaniasis cutánea con la proteína verde fluorescente positivo (GFP +) L. major permite el monitoreo de la carga parasitaria a través de mediciones de la intensidad de la fluorescencia de GFP, lo que permite una forma más rápida y más eficaz de seguimiento de la evolución clínica de la terapia fotodinámica (PDT). Este modelo puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los aspectos fototóxicas en PDT. Aunque los regímenes de PDT puede ser algo diferente en los seres humanos, se espera que el modelo desarrollado facilitará la optimización y la traducción clínica de la terapia fotodinámica como tratamiento para la leishmaniasis cutánea y el eventual desarrollo de tratamientos tópicos para las infecciones granulomatosas PDT otros.

Phosphoproteome Dinámica Revela Complejos De La Proteína De Choque Térmico Específicos Para La Etapa Infecciosa De Leishmania Donovani

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. May, 2010  |  Pubmed ID: 20404152

Leishmania está expuesto a un aumento repentino en la temperatura ambiente durante el ciclo infeccioso que provoca la diferenciación de la etapa y se adapta el fenotipo del parásito a supervivencia intracelular en el anfitrión mamífero. La ausencia de promotor clásicos-mecanismos de regulación génica y expresión constitutiva de la mayoría de las proteínas de choque térmico (HSPs) en estos patógenos humanos recaudar importantes cuestiones sin resolver en cuanto a la regulación de la respuesta a shock térmico y las funciones específicas de etapa de Leishmania HSPs. Aquí utilizamos un enfoque cuantitativo basado en gel para evaluar la phosphoproteome de Leishmania donovani y reveló que 38% de las proteínas mostraron diferencias significativas de la fase específica, con un fuerte enfoque de fosfoproteínas amastigote específicos en función de acompañante. Identificamos que contengan STI1/HOP complejos de acompañante que interactúan con proteínas ribosomales cliente de una manera específica de amastigote. El análisis genético de sitios de fosforilación de STI1/HOP en sti1(-/-) condicional de parásitos mutante nulo reveló dos residuos de Fosfoserina esenciales para la viabilidad del parásito. Fosforilación de los principales acompañantes de Leishmania en la etapa de patógena sugiere que estas proteínas pueden ser prometedoras blancos vía inhibición de sus respectivas proteínas quinasas de la droga.

Un Papel De Tetrahidrofolatos En El Metabolismo De Hierro-azufre Grupos En Todos Los ámbitos De La Vida

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20489182

Enzimas de clúster hierro-azufre (Fe/S) son cruciales para la vida. Su montaje requiere un conjunto de proteínas, algunas de las cuales son específicas para subconjuntos particulares de enzimas de Fe/S. Una tal proteína es levadura Iba57p, que requieren aconitasa y ciertas enzimas de S-adenosilmetionina radicales para la actividad. Iba57p homólogos ocurren en todos los ámbitos de la vida; pertenecen a la familia de proteínas de COG0354 y son estructuralmente similares a varias enzimas dependientes de folato. Por lo tanto, investigamos la relación posible entre los folatos y enzimas de clúster de Fe/S con el homólogo de Iba57p de Escherichia coli, YgfZ. NMR análisis confirmó que YgfZ purificada mostró estereoselectiva vinculante de folato. Inactivar ygfZ reduce la actividad de la enzima de la modificación de Fe/S tRNA MiaB y ciertas otras enzimas de Fe/S, aunque no aconitasa. Cuando fueron ablación etapas sucesivas en la biosíntesis del ácido fólico, folE (falta de pterins y folatos) y mutantes folP (falta de folatos) mímico al mutante ygfZ en tener bajas MiaB actividades, mientras que folE thyA mutantes 5-formiltetrahidrofolato (falta pterins y empobrecido en dihidrofolato) y gcvP glyA mutantes (falta de Tetrahidrofolatos-carbono) tenían actividades de MiaB intermedias. Estos datos indican que YgfZ requiere un folato, probablemente tetrahidrofolato. Importante, el mutante de ygfZ era extremadamente sensible al estrés oxidativo y creció mal en medios mínimos. COG0354 genes de bacterias, arqueobacterias, hongos, Protista, animal u origen vegetal complementan uno o ambos de estos fenotipos de crecimiento, así como el fenotipo de actividad MiaB. Análisis genómico comparativo indican generalizadas asociaciones funcionales entre las proteínas COG0354 y metabolismo del racimo de Fe/S. Así COG0354 las proteínas tienen una función antigua, conservada, dependiente de folato en la actividad de ciertas enzimas de clúster de Fe/S.

Expansión Del Objetivo De La Familia De Quinasas De Rapamicina (TOR) Y Función En Leishmania Muestra Que TOR3 Es Necesario Para Acidocalcisome La Biogénesis Y Animal Infectividad

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20551225

Objetivo de quinasas de la rapamicina (TOR) son reguladores claves del crecimiento celular, proliferación y estructura en eucariotas, procesos que están altamente coordinados durante el ciclo infeccioso de patógenos eucariotas. Minería de bases de datos reveló tres quinasas de TOR en el Trypanosomatida parásito Leishmania major, según lo definido por homología a la fosfatidilinositol 3-quinasa-related familia quinasa (PIKK) y una firma conservaron dominio FKBP12/rapamicina-obligatorio. En concordancia con los roles esenciales de complejos de TOR en otros organismos, fuimos incapaces de generar TOR1 nulo o cultivan de TOR2 mutantes en promastigotes principales L.. Por el contrario, fácilmente se obtuvieron mutantes nulos tor3(-); mientras que exhibe un crecimiento algo más lento, tor3(-) mantiene la morfología normal, la sensibilidad de la rapamicina y diferenciación en el animal-método infectiva. Significativamente, tor3(-) mutantes pudieron sobrevivir o replicar en macrófagos in vitro, o de inducir patología o establecer infecciones en ratones in vivo. La pérdida de virulencia se asoció con un defecto en la formación de acidocalcisome, como este organelo único grueso fue alterado en tor3-mutantes y polifosfatos no acumulada. En consecuencia, tor3-mutantes demostraron defectos en osmoregulación y fueron sensibles a la inanición de glucosa pero no los aminoácidos, glucosa, ser un nutriente limitante en la vacuola parasitófora. Así, en Leishmania, la familia de cinasa TOR se ha ampliado para abarcar un papel único en función de la CA y de la biología, que es esencial para la supervivencia del parásito en los mamífero infectiva. Dado su papel importante en la supervivencia celular y virulencia, inhibición de la función de cinasa TOR en trypanosomátidos ofrece un atractivo destino para la quimioterapia.

Un Transposón Toolkit Para La Transferencia De Genes Y Mutagénesis En Protozoos Parásitos

Genetica. Mar, 2010  |  Pubmed ID: 19763844

Protozoos parásitos afectan a millones de personas alrededor del mundo. Tratamiento y control de estas enfermedades son complicados debido en parte a la intrincada biología de estos organismos. Las interacciones de especies de Plasmodium y Leishmania tripanosomas con sus anfitriones están mediadas por un inusual control de la expresión génica que no se entiende completamente. La disponibilidad de la secuencia del genoma de estos protozoos prepara el escenario para el uso de estrategias más integrales, genoma para estudiar la función del gene. Transposones son herramientas eficaces para la introducción sistemática de las alteraciones genéticas y sistemas de transposición diferentes se han adaptado para estudiar la función del gen en estos patógenos humanos. Un marinero transposon toolkit para uso in vivo o in vitro en los parásitos de Leishmania ha sido desarrollado y puede ser utilizado en una variedad de aplicaciones. Estos modificado elementos mariner no sólo permite la inactivación de genes, pero también mediar el rescate de fusiones de gene traslacional, aportando una importante contribución a la investigación de la función del gen de Leishmania. PiggyBac los transposones Tn5 también han demostrado para movilizar a través de genomas de spp. Plasmodium eludir las limitaciones actuales de la manipulación genética de estos organismos.

Identificación De Residuos Transportes Críticas En Un Transportador De Folato De La Familia De Folato-biopterin Transportador (FBT)

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 19923217

La proteína de Synechocystis Slr0642 y su plastidial Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) ortólogo At2g32040 pertenecen a la familia del transportador (FBT) de folato-biopterin dentro de la superfamilia de facilitador principal. Ambas proteínas transportan folatos cuando estaba expresado en Escherichia coli. Porque no se conocen los requerimientos estructurales para la actividad de transporte para cualquier proteína FBT, aplicamos el análisis mutacional para identificar residuos que son esenciales para el transporte e interpretaron los resultados mediante un modelo estructural comparativo basado en e. coli lactosa permeasa. Transporte de folato se evaluó mediante el crecimiento de una cepa de e. coli pabA abgT, que no puede sintetizar o tomar los folatos o p-aminobenzoylglutamate. En total, 47 residuos fueron reemplazados con Cys o mutaciones de Alabama en 22 posiciones abolió la absorción de ácido fólico sin afectar la expresión de Slr0642 en las membranas, mientras que otras mutaciones no tuvieron ningún efecto. Residuos importantes para la función principalmente línea la cavidad central prevista y se concentran en las base alfa-hélices H1, H4, H7 y H10. Las ubicaciones de residuos esenciales son consistentes con un sitio de unión a folato mentira más o menos equidistante de ambas caras del transportador. Arabidopsis tiene ocho de proteínas de FBT, además de At2g32040, a menudo falta residuos conservados de críticos. Cuando seis de estas proteínas se expresaron en e. coli o mutantes de transportador de folato o 1,2,3-trihydroxypropyl de Leishmania, ninguno demostró evidencia de la actividad de transporte de folato o 1,2,3-trihydroxypropyl, y At2g32040 sólo fue aislado por la investigación funcional de bibliotecas de cDNA de Arabidopsis en e. coli. Tales datos negativos podrían reflejar papeles en el transporte de otros substratos. Estos estudios proporcionan las primeras penetraciones en la estructura nativa y mecanismo catalítico de familiares portadores FBT.

Esfingolípidos En Protozoos Parásitos

Advances in Experimental Medicine and Biology. 2010  |  Pubmed ID: 20919659

La superficie de la mayoría de protozoo parásitos depende fuertemente de moléculas de lípidos-ancladas, para formar barreras protectoras y desempeñar funciones críticas requeridas de infectividad. Esfingolípidos (SLs) juegan un papel importante por su abundancia y su participación en la formación de la membrana microdomain, así como servir como el ancla de lípidos para muchas de estas moléculas y posiblemente no todas pero algunas especies, como moléculas de señalización importantes. Interacciones del metabolismo de esfingolípidos parásito con eso del host potencialmente pueden contribuir a la supervivencia del parásito o de defensa del huésped. En este capítulo se resumen los conocimientos actuales de la estructura de SL, la síntesis y la función en varios de los principales grupos de protozoos parásitos.

Retención Y Pérdida De Vías De Interferencia De RNA En Trypanosomatida Protozoarios

PLoS Pathogens. 2010  |  Pubmed ID: 21060810

Vías de RNA de interferencia (ARNi) están muy extendidas en metaozoans, sin embargo, los genes necesarios Mostrar ocurrencia variable o actividad en microorganismos eucariotas, incluyendo muchos agentes patógenos. Mientras que algunos genes Argonaute o Dicer y Leishmania falta actividad ARNi, mostramos que la Leishmania braziliensis y otras especies dentro del subgénero Leishmania Viannia elaboran activa ARNi maquinaria. Fue visto fuerte atenuación de la expresión de una variedad de reportero y genes endógenos. Como era de esperar, Arni caídas del único Argonaute gen habían implicado esta proteína en RNAi. El potencial para la genética funcional se estableció analizando ARNi líneas de precipitación que carece de la varilla de filamento paraflagelar, un componente clave del flagelo parásito. Esto prepara el escenario para la manipulación sistemática de la expresión génica a través de RNAi en estos organismos asexuales predominante diploides y también puede permitir a quimioterapia selectiva basada en RNAi. Encuestas evolutivas funcionales de los genes de ARNi establecieron que actividad de RNAi se perdió tras la separación del subgénero Leishmania Viannia de las restantes especies de Leishmania, una divergencia asociada a cambios profundos en el ciclo infeccioso de parásito y virulencia. Por lo tanto, el género Leishmania ofrece un sistema accesible para probar hipótesis sobre las fuerzas que puede seleccionar para la pérdida de RNAi durante la evolución, como la invasión de virus, cambios en la plasticidad del genoma mediada por elementos transponibles y amplificación del gen (incluyendo ésos mediador farmacorresistencia) y/o alteraciones en la virulencia del parásito.

Leishmania Mayor Supervivencia En Selectivo Phlebotomus Papatasi Vector De Mosca De La Arena Requiere Un Patrón De Galactosylation De Lipophosphoglycan SCG-codificado Específico

PLoS Pathogens. 2010  |  Pubmed ID: 21085609

Moscas de arena de flebotomos que transmiten el parásito protozoo Leishmania difieren mucho en su capacidad para soportar diferentes especies o cepas en el laboratorio: mientras que algunos muestran gran selectividad, otros son más permisivas. En moscas de arena "selectivas", enlace de Leishmania y supervivencia en la mosca del midgut típicamente depende el promastigote abundante superficie adhesina lipophosphoglycan (LPG), que exhibe específicos de especie y cepa modificaciones de la phosphoglycan dominante (PG) repetición unidades. Para los "selectivo" mosca Phlebotomus papatasi PpapJ, lado cadena galactosil-modificaciones (scGal) de repeticiones PG juegan papeles claves en la Unión del parásito. Hemos sondeado la especificidad y las propiedades de este scGal-LPG PAMP (patrón Molecular asociado a patógenos) a través de estudios de aislamientos naturales que exhibe una amplia gama de patrones de galactosylation y de un panel de isogénicas L. principales diseñados para expresar diversidad de scGal-LPG similar por la transfección de SCG-codificado β1, 3-galactosyltransferases con diferentes actividades. Sorprendentemente, tanto 'poli-scGal' y 'null-scGal' líneas sobrevivieron mal en relación con L. PpapJ-simpátricas principales FV1 y otras líneas de 'mono-scGal'. Sin embargo, la supervivencia de todas las líneas fue equivalente en p. duboscqi, naturalmente que transmiten las tensiones principales L. cojinete 'null-scGal'-LPG pmap. Nos preguntó si scGal-LPG-mediada por interacciones eran suficientes para la supervivencia celular PpapJ Ingeniería Leishmania donovani, que normalmente expresan la LPG no sustituido, para expresar un PAMP scGal-LPG "PpapJ-óptima". Inesperadamente, estos "L. major FV1-bajo el manto de" líneas de L. donovani-SCG seguía siendo incapaces de sobrevivir dentro de moscas PpapJ. Estos estudios establecen que la supervivencia celular de L. major en PpapJ moscas es exquisitamente sensible a la scGal-LPG PAMP, que requieren un patrón específico 'mono-scGal'. Sin embargo, la falta de líneas de 'mono-scGal' L. donovani-SRB para sobrevivir en el selectivos PpapJ moscas sugiere un requisito para una L. parásito específico importante factor adicional, aún no identificado. La interacción del factor adicional con receptores de mosca de la arena del midgut y PAMP LPG puede determinar si un host de la mosca de la arena dada es "selectiva" o "permisivo", con importantes consecuencias para la transmisión de la enfermedad tanto la co-evolución natural de moscas de la arena y Leishmania.

Efectos De Microbicidas Diferencial De Proteínas Humanas De La Histona H2A Y H2B En Promastigotes De Leishmania Y Amastigotes

Infection and Immunity. Mar, 2011  |  Pubmed ID: 21189319

Estudios recientes han demostrado que las proteínas histonas pueden actuar como péptidos antimicrobianos en defensa del huésped contra los promastigotes de Leishmania, hongos y bacterias extracelulares. En este estudio, utilizamos las proteínas histonas recombinante humana para estudiar aún más sus efectos leishmanicidas y los mecanismos subyacentes. Encontramos que las histonas H2A y H2B (pero no H1(0)) directamente y eficiente maten promastigotes de Leishmania amazonensis, L. major, L. braziliensis y L. mexicana de una manera dependiente de la dosis de tratamiento. Microscopía electrónica de barrido reveló interrupción superficial de promastigotes tratados con histonas. Más importante aún, la preexposición de promastigotes a proteínas histonas disminuyó notablemente la infectividad de promastigotes a los macrófagos murinos (Mφs) in vitro. Sin embargo, los amastigotes axénicos y lesión derivados de L. amazonensis y L. mexicana fueron relativamente resistentes al tratamiento de las histonas, que correlaciona con los niveles bajos de H2A intracelular en amastigotes tratados. Para comprender los mecanismos subyacentes a estas respuestas diferenciales, investigamos el papel de moléculas superficiales promastigote en histonas mediada por homicidio. En comparación con los controles correspondientes, transgénicos L. amazonensis promastigotes expresando niveles más bajos de proteínas de la superficie de la gp63 eran más susceptibles a la histona H2A, mientras que L. major y L. mexicana promastigotes con supresión específica de la lipophosphoglycan 2 (lpg2) gene (pero no el gen lpg1) era más resistente a las histonas H2A. Se discute la influencia de grandes moléculas superficiales de promastigote en el efecto leishmanicidas de proteínas histonas. Este estudio aporta nueva información sobre inmunidad innata de anfitrión en diferentes etapas del desarrollo de los parásitos de Leishmania.

Virus De ARN De Leishmania Controla La Severidad De La Leishmaniasis Mucocutánea

Science (New York, N.Y.). Feb, 2011  |  Pubmed ID: 21311023

Leishmaniasis mucocutánea es causada por infecciones con parásitos intracelulares del subgénero Leishmania Viannia, incluyendo Leishmania guyanensis. La patología se desarrolla después de la difusión del parásito a los tejidos nasofaríngeos, donde se forman las lesiones metastáticas destructivas con inflamación crónica. Actualmente, los mecanismos implicados en el desarrollo de la lesión son poco conocidos. Aquí mostramos que extenderse por metástasis parásitos tienen una alta carga de Leishmania RNA virus-1 (LRV1) que es reconocida por el receptor Toll-like de anfitrión 3 (TLR3) para inducir quimiocinas y citocinas proinflamatorias. Paradójicamente, estas respuestas inmune mediada por TLR3 prestados ratones más susceptibles a la infección, y los animales desarrollaron un bandolero mayor inflamación y parasitemia. Así, LRV1 en los parásitos extenderse por metástasis había subvertido la inmunorespuesta del anfitrión a Leishmania y había promovido la persistencia del parásito.

La Susceptibilidad De Los Patógenos Trypanosomatida a Inhibidores De La Cinasa PI3/mTOR Brinda Una Nueva Oportunidad Para La Reasignación De La Droga

PLoS Neglected Tropical Diseases. Aug, 2011  |  Pubmed ID: 21886855

Reasignación de destino utiliza el conocimiento de los objetivos "druggable" obtenidos en un organismo y aprovecha esta información para alcanzar nuevos objetivos de medicamentos potenciales en otros organismos. Aquí describimos tales estudios para evaluar si son prometedores inhibidores contra el dominio de la cinasa de fosfatidilinositol-3-quinasas humanas (PI3Ks) los mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR) contra la HSP70 parásitos Trypanosoma brucei, T. cruzi, Leishmania major y L. donovani. Los genomas de trypanosomátidos codifican por lo menos 12 proteínas pertenecientes a la superfamilia de proteínas de PI3K, algunas de las cuales son únicas a los parásitos. Por otra parte, la PI3Ks compartido difieren mucho en la secuencia de los del anfitrión humano, proporcionando oportunidades para inhibición selectiva.

La Leishmaniasis Cutánea-muco En El Nuevo Mundo: La última Subversión

Virulence. Nov-Dec, 2011  |  Pubmed ID: 21971185

Infección por el parásito protozoario humano Leishmania puede conducir, dependiendo principalmente de la especie de parásito, lesiones mucocutáneas o cutáneas o infección visceral generalizada fatal. En el nuevo mundo, especies de Leishmania (Viannia) pueden provocar leishmaniasis mucocutánea (MCL). MCL clínica implica una fuerte respuesta hiper-inflamatoria y parasitaria diseminación (metástasis) de una lesión primaria a sitios distantes, llevando a lesiones secundarias metastáticas destructivas especialmente en las áreas de nasopharyngal. Recientemente, informó que la metástasis, pero no no metastásicas cepas de Leishmania (Viannia) guyanensis, tienen alta carga de un virus de dsARN no segmentado, Leishmania RNA Virus (LRV). DsRNA viral es detectada por el anfitrión Toll-like Receptor 3 (TLR3) de tal modo induciendo una respuesta proinflamatoria y exacerbar la enfermedad. La presencia de LRV en Leishmania abre nuevas perspectivas, no sólo en la comprensión básica de la íntima relación entre el parásito y LRV, sino también en la comprensión de la importancia de la respuesta inflamatoria en pacientes MCL.

Rutas Metabólicas De Folato En Leishmania

Essays in Biochemistry. 2011  |  Pubmed ID: 22023442

Trypanosomatida parásitos protozoos del género Leishmania son autótrofos para folato y pteridines no conjugada. Leishmania salvar estos metabolitos de sus anfitriones mamíferos insectos vectores a través de múltiples transportadores. Dentro el parásito, los folatos se reducen en un DHFR bifuncional (dihidrofolato reductasa)-TS (timidilato sintasa) y por una novela PTR1 (pteridina reductasa 1), que reduce tanto los folatos y pteridines no conjugada. PTR1 puede actuar como un bypass metabólico de la inhibición de la DHFR, reduciendo la eficacia de fármacos antifolatos existentes. Leishmania poseen un conjunto reducido de reacciones metabólicas dependientes de folato y puede salvar a muchos de los productos claves del metabolismo del folato de sus anfitriones. Por ejemplo, carecen de la síntesis de purinas, que normalmente requiere 10-formiltetrahidrofolato, y sino que se basan en una red de enzimas de salvamento de purinas. Leishmania elaboradas por lo menos tres vías para la síntesis de los principales metabolitos 5,10-metileno-tetrahidrofolato, necesaria para la síntesis de timidilato y 10-formiltetrahidrofolato, cuya presunta función es para Metionil-tRNAMet formylation necesaria para la síntesis de proteínas mitocondriales. Estudios genéticos han demostrado que la síntesis de metionina utilizando 5-metiltetrahidrofolato es prescindible, como es la actividad de la división de la glicina compleja, probablemente debido a la redundancia con serina Hidroximetiltransferasa. Aunque no siempre es indispensable, la pérdida de varios resultados de enzimas metabólicas de folato en la atenuación o pérdida de virulencia en modelos animales y un mutante nulo de DHFR-TS se ha utilizado para inducir inmunidad protectora. La ruta metabólica del ácido fólico ofrece numerosas oportunidades para la quimioterapia dirigida, con gran potencial para "reasignación" de compuestos desarrollados originalmente para el tratamiento de los cánceres humanos u otros agentes infecciosos.

Leishmaniasis Mucocutánea Y Un Pasajero No Deseado

Médecine Sciences : M/S. Nov, 2011  |  Pubmed ID: 22130014

Remodelación De La Expresión De La Proteína Y El MRNA En Leishmania Mexicana Inducida Por Deleción De Genes Del Transportador De Glucosa

Molecular and Biochemical Parasitology. Jan, 2011  |  Pubmed ID: 20869991

La glucosa es un nutriente importante en la etapa de insectos vectores de parásitos de Leishmania. Mutantes nulos de transportador de glucosa de Leishmania mexicana presentan profundos cambios fenotípicos en promastigotes etapa insectos y huésped mamífero etapa amastigotes que residen dentro de la phagolysosomes de macrófagos del anfitrión. Algunos de estos cambios fenotípicos podrían ser mediados o atenuadas por cambios en la expresión génica que acompañan la eliminación de los genes del transportador de glucosa. Para buscar cambios en la expresión de la proteína, se comparó el perfil de proteínas detectadas en geles bidimensionales de tipo salvaje y glucosa promastigotes mutante nulo de transportador. Se detectaron un total de 50 puntos cuyas intensidades cambiaron significativamente y consistente en múltiples experimentos, sugiriendo que una cohorte de proteínas está alterada en los niveles de expresión en los parásitos mutantes nulos. Tras la identificación de proteínas por espectrometría de masa, 3 tales proteínas regulados fueron escogidos para un análisis más detallan: mitocondrial aldehído deshidrogenasa, ribokinase y hexoquinasa. Immunoblots empleando antisueros contra estas enzimas confirmó que sus niveles de alza tanto en mutantes nulos del transportador de glucosa parásitos de tipo salvaje hambrientos de glucosa. De la transcriptasa reversa cuantitativa PCR (qRT-PCR) reveló que los niveles de estas enzimas de codificación de mRNAs también mejoraron. Perfil de expresión global utilizando microarrays reveló un número limitado de cambios adicionales, aunque la sensibilidad de los microarrays para detectar cambios modestos en amplitud fue inferior a la de geles bidimensionales. Por lo tanto, es probable que sea una red de proteínas cuyos niveles de expresión se ven alterados por ablación genética de transportadores de la glucosa, y gran parte del presente Reglamento puede verse reflejado por los cambios en los niveles de los mRNAs cognados. Algunos de estos cambios en la expresión de la proteína pueden reflejar una respuesta adaptativa de los parásitos a la limitación de la glucosa.

Fenilalanina Hidroxilasa (PAH) En El Bajo Mayor Eukaryote Leishmania

Molecular and Biochemical Parasitology. Jan, 2011  |  Pubmed ID: 20887755

Aromáticos hidroxilasas de aminoácidos (AAAH) suelen utilizar tetrahidrobiopterina (H (4) B) como el cofactor. El parásito protozoario Leishmania major biopterina requiere para el crecimiento y recuperación expresa fuerte y los sistemas de regeneración para mantener H (4) niveles de B. Aquí hemos explorado las consecuencias de la manipulación genética de la fenilalanina hidroxilasa única L. major (HAP) para explorar si se podría dar cuenta de la H Leishmania (4) B requerimiento. L. major HAP se asemeja a aaahs de otros organismos, teniendo eucariota de tipo dominio de la organización, y la conservación de los principales residuos catalíticos incluidos los implicados en pteridina vinculante. Un pah (-) y un mutante nulo episomal complementa derivado de la sobreexpresión (HAP-/ + HAP) se obtuvieron con facilidad, y los estudios metabólicos de etiquetado establecido que los HAP se requiere que hidroxilar Phe en Tyr. Ni WT ni líneas sobreexpresan fueron capaces de hidroxilar tirosina marcada radiactivamente o triptófano, ni para sintetizar catecolaminas. WT pero no HAP (-) parásitos mostró reactividad con un anticuerpo a la melanina cuando se cultivan con L-3 ,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), aunque el producto reactivo es poco probable que sea melanina en sentido estricto. WT se auxotróficos de Phe, Trp y Tyr, lo que sugiere que la actividad de HAP era insuficiente para satisfacer las necesidades normales de Tyr. Sin embargo, pah (-) mostró un aumento de la sensibilidad a la privación de Tyr, mientras que el pah (-) / + HAP overexpressor mostraron una mayor supervivencia y podría ser adaptado para crecer bien sin Tyr añadió. pah (-) no mostró alteraciones en H (4) B dependiente de la diferenciación, según lo establecido por en metaciclogénesis in vitro, o la supervivencia de las infecciones de ratón o de los macrófagos. Por lo tanto Leishmania HAP puede mitigar, pero no aliviar el auxotrofía Tyr, pero no juega un papel esencial en los pasos del ciclo de infección del parásito. Estos hallazgos sugieren la HAP es poco probable para explicar el requisito de Leishmania de biopterina.

Muertos, Pero Leishmania Metabólicamente Activo Como Una Novela Vacuna De Células Enteras De La Leishmaniasis Visceral

Clinical and Vaccine Immunology : CVI. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22323556

Actualmente no hay vacunas efectivas para la leishmaniasis visceral, la segunda infección parasitaria más mortal en el mundo. Aquí se describe una novela de células enteras enfoque de la vacuna con el protozoo Leishmania infantum chagasi promastigotos tratados con el compuesto de psoraleno amotosaleno (S-59) y dosis bajas de radiación ultravioleta. Este tratamiento genera entrecruzamientos covalentes de ADN permanentes, dentro de los parásitos, y los resultados en los organismos de Leishmania denominada muerto, pero metabólicamente activa (KBMA). En este informe, se caracteriza el crecimiento in vitro de las características de ambos KBMA-L. importante y KBMA-L. infantum chagasi (KBMA-LIC). Las concentraciones de S-59 que generan parásitos óptimamente atenuadas fueron identificados. Al igual que en vivo L. infantum chagasi, KBMA-Lic parásitos fueron capaces de entrar en un principio las células del hígado in vivo después de la infección por vía intravenosa. Sin embargo, mientras que L. infantum chagasi en vivo infección conduce a la hepatoesplenomegalia en ratones después de seis meses, KBMA-Lic. fueron indetectables en los órganos de los ratones en este punto del tiempo. In vitro, el Lic. KBMA-mantienen la capacidad de entrar en los macrófagos e inducir la producción de óxido nítrico. Estas características de KBMA-Lic. correlaciona con la capacidad de proteger profilácticamente ratones a través de la vacunación subcutánea a niveles similares a la vacunación con organismos vivos, virulentas. Los esplenocitos de los ratones vacunados con ya sea en vivo o de L. infantum chagasi KBMA-Lic muestran los patrones de citoquinas similar in vitro. Estos resultados sugieren que la tecnología KBMA es una estrategia novedosa vacuna potencialmente segura y eficaz contra el protozoo intracelular L. infantum chagasi. Este enfoque puede representar un nuevo método para células enteras vacunación contra otros patógenos intracelulares complejos.