Die Massenspektrometrie-basierte Methoden Zur Kartierung Der Phosphorylierungsstelle Hyperphosphoryliertem Proteine ​​angewendet Net1, Ein Regulator Der Austritt Aus Der Mitose in Hefe

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Mar, 2002  |  Pubmed ID: 12096118

Verbesserte Empfindlichkeit Für Phosphopeptid Mapping Mit Kapillarsäule HPLC Und Massenspektrometrie Microionspray: Vergleichende Phosphorylierungsstelle Abbildung Von Gel-abgeleiteten Proteinen

Analytical Chemistry. Jul, 2002  |  Pubmed ID: 12141686

N-terminale Peptid Markierungsstrategie Zum Einbau Von Isotopen-Tags: Ein Verfahren Zur Bestimmung Der Absoluten Ortsspezifische Phosphorylierung Stöchiometrie

Rapid Communications in Mass Spectrometry : RCM. 2002  |  Pubmed ID: 12478578

Tula: Ein SH3-und UBA-haltige Protein, Das an C-Cbl Und Ubiquitin Bindet

Oncogene. Jun, 2004  |  Pubmed ID: 15107835

Selektiver Nachweis Von Glycopeptiden Auf Ionenfallen-Massenspektrometer

Analytical Chemistry. Jun, 2004  |  Pubmed ID: 15167790

Die Phosphorylierung Von Cyclin B-Cdk Zugrunde Freisetzung Von Mitotische Exit-Aktivator Cdc14 Aus Dem Nucleolus

Science (New York, N.Y.). Jul, 2004  |  Pubmed ID: 15273393

Ort Der Proteom-Muster in Biomarkern

Journal of Proteome Research. Jul-Aug, 2005  |  Pubmed ID: 16083265

Zuordnen Von Posttranslationale Modifikationen Von Proteinen Durch MS-basierte Selektive Erkennung: Anwendung Auf Phosphoproteomics

Methods in Enzymology. 2005  |  Pubmed ID: 16413312

In diesem Kapitel werden allgemeine Prinzipien, die für die Analyse der posttranslationale Modifikationen von Proteinen, mit einem Schwerpunkt auf Phosphoproteine gelten. Massenspektrometrie (MS)-basierte Ansätze für selektive Detektion und standortspezifische Analyse von posttranslational Modifizierte Peptide beschrieben werden und eine MS-basierte Methode, die stützt sich auf Produktion und Erkennung von Fragment-Ionen, die spezifisch für die Veränderung(en) von Interesse und, in der Autoren-Labor entwickelt wurde, ausführlich beschrieben. Die Methode ist anwendbar für selektive Detektion von N und O gebundene Kohlenhydrate in Glycoproteinen, O gebundene Sulfat und N und O-gebundene Lipide. Detaillierte Hinweise für die Anwendung dieser Strategie Phosphorylierung-Standortskartierung werden hier vorgestellt.

Systematische Ermittlung Von Menschlichen Mitochondriopathie Gene Durch Integrative Genomics

Nature Genetics. May, 2006  |  Pubmed ID: 16582907

Die Mehrheit der vererbten mitochondrialen Erkrankungen sind durch Mutationen nicht in das mitochondriale Genom (MtDNA), sondern eher in den nuklearen Genen Proteine gezielt an diesem Organell. Aufklärung der molekularen Grundlagen für diese Erkrankungen ist begrenzt, da nur die Hälfte der geschätzten 1.500 mitochondriale Proteine identifiziert wurden. Um diesen Katalog systematisch zu erweitern, wir experimentell und rechnerisch generiert acht Genom-Daten Skalensätze, jeweils entwickelt, um Hinweise auf mitochondriale Lokalisierung: gezielt Sequenz Vorhersage, Protein-Domäne-Anreicherung, Vorhandensein von Cis-regulatorische Motive, Hefe-Homologie, Abstammung, Tandem-Massenspektrometrie, Coexpression und transkriptionelle Induktion während mitochondriale Biogenese. Durch eine integrierte Analyse erweitern wir die Auflistung auf 1.080 Gene, umfasst 368 neuartige Vorhersagen mit einer geschätzten falschen Vorhersage-Rate von 10 %. Durch die Kombination dieser erweiterten Bestandsaufnahme mit genetischen Abständen mit Krankheit verbunden, haben wir identifiziert Kandidatengenen für acht mitochondriale Erkrankungen, führt zur Entdeckung von Mutationen im MPV17, die hepatische MtDNA-Depletionssyndrom führen. Der integrative Ansatz verspricht, die Rolle der Mitochondrien in sowohl selten als auch gemeinsame menschliche Krankheiten besser zu definieren.

Pfeffer, Eine Plattform Für Experimentelle Proteomic Mustererkennung

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Oct, 2006  |  Pubmed ID: 16857664

Quantitative Proteomik vielversprechend erhebliche für Aufklärung der grundlegende Biologie und klinische Biomarker Entdeckung. Jedoch war es schwierig, dieses Versprechen durch übermäßiges Vertrauen auf Identifikation basierenden quantitative Methoden und Probleme im Zusammenhang mit Chromatographische Trennung Reproduzierbarkeit zu erfüllen. Hier beschreiben wir neue Algorithmen genannt "Landmark" Peak Mustervergleiche"und", die diese Probleme deutlich reduzieren. Wahrzeichen Matching führt Zeit Base-unabhängige Vermehrung von Peptid-Identitäten auf genaue Masse LC-MS-Funktionen in einer Weise, die historische Daten nutzt von unterschiedlichen Daten Akquisition Strategien abgeleitet. Spitze Matching baut auf Landmark Matching durch identische Molekulare Arten über mehrere LC-MS-Experimente in Identität-unabhängigen Weise durch clustering zu erkennen. Wir haben diese Algorithmen zusammen mit anderen Algorithmen, Daten Akquisition Strategien und experimentellen Designs für die Schaffung eine Plattform für experimentelle Proteomic-Mustererkennung (Pfeffer) gebündelt. Diese Entwicklungen ermöglichen den Einsatz von etablierten Statistiktools, die zuvor auf Microarray-Analyse für die Behandlung von Proteomics-Daten beschränkt. Wir zeigen, dass die vorgeschlagene Plattform über 2,5 Größenordnungen kalibriert werden kann und kann robuste Quantifizierung der Verhältnisse in sowohl einfache als auch komplexe Mischungen mit guten Eigenschaften für Präzision und Fehler über mehrere Beispiel-Vorbereitungen durchführen. Wir zeigen auch de Novo Markierung Entdeckung basierend auf statistische Signifikanz nicht identifizierter genaue Masse-Komponenten, die zwischen zwei Mischungen geändert. Diese Markierungen wurden später durch genaue Masse-gesteuerte MS/MS-Erwerb identifiziert und zeigten Kontaminanten Proteine bekannten Proteinen, deren Konzentrationen konzipiert wurden, um zwischen den beiden Gemische ändern, zugeordnet werden. Diese Ergebnisse haben eine reale Welt-Validierung der Plattform für Markierung Entdeckung zur Verfügung gestellt.

Protein Biomarker Discovery Und Validierung: Den Langen Und Ungewissen Pfad Zum Klinischen Nutzen

Nature Biotechnology. Aug, 2006  |  Pubmed ID: 16900146

Bessere Biomarker sind dringend notwendig, zur Verbesserung der Diagnose, Molekular gezielte Therapie und Überwachen der Serveraktivität und therapeutische Reaktion über ein breites Spektrum von Krankheit zu führen. Proteomics Methoden auf der Grundlage von Massenspektrometrie halten spezielle Versprechen für die Entdeckung neuartiger Biomarker, die die Grundlage für neue klinische Blut-Tests bilden könnten, aber ihren Beitrag zu der Diagnose Effektivitätsvorteile hat bisher enttäuschend. Dies ist zum Teil auf das Fehlen einer kohärenten Rohrleitung zur Verbindung der Markierung Entdeckung mit bewährten Methoden für die Validierung. Fortschritte in den Methoden und Technologie ermöglichen jetzt Bau eines umfassenden Biomarker von sechs wesentliche Prozesskomponenten: Kandidat Entdeckung, Qualifikation, Überprüfung, Forschung-Assay-Optimierung, Biomarker-Validierung und Vermarktung. Besseres Verständnis des Gesamtprozesses der Biomarker Entdeckung und Validierung und der Herausforderungen und Strategien in jeder Phase inhärente sollten experimentelle Studie Gestaltung zu verbessern, wiederum die Effizienzsteigerung der Biomarker-Entwicklung und Vereinfachung der Lieferung und Bereitstellung von neuartigen klinische Tests.

MSin1 Ist Notwendig Für Akt/PKB-Phosphorylierung Und Seine Isoformen Definieren Drei Unterschiedliche MTORC2s

Current Biology : CB. Sep, 2006  |  Pubmed ID: 16919458

Das Säugetier-Ziel angiomiolipomas (mTOR) ist eine Serin/Threonin-Kinase, die in mindestens zwei unterschiedlichen multiprotein komplexe, mTORC1 und mTORC2 beteiligt ist. Diese komplexe spielen wichtige Rollen bei der Regulierung des Zellwachstums, Weiterverbreitung, Überleben und Stoffwechsel. mTORC2 ist eine hydrophobe Motiv-Kinase für Zelle-Survival Proteins Akt/PKB, und hier, wir mSin1 als Bestandteil der mTORC2 aber nicht mTORC1 identifizieren. mSin1 ist notwendig für die Montage des mTORC2 und seiner Fähigkeit, Akt/PKB phosphoryliert. Alternatives Spleißen generiert mindestens fünf Isoformen des mSin1 Proteins, von die drei in mTORC2 zum Generieren von drei unterschiedlichen mTORC2s zu montieren. Obwohl alle mTORC2s in-vitro-Akt/PKB phosphoryliert werden kann, regelt Insulin die Tätigkeit von nur zwei von ihnen. So schlagen wir vor, dass Zellen einige mTORC2-Varianten enthalten, die als Reaktion auf verschiedene Signale Akt/PKB phosphoryliert kann.

Die Connectivity-Karte: Verwendung Von Genexpression Signaturen Kleine Moleküle, Gene Und Krankheit Zu Verbinden

Science (New York, N.Y.). Sep, 2006  |  Pubmed ID: 17008526

Um einen systematischen Ansatz zur Entdeckung der funktionalen Verbindungen zwischen Krankheiten, genetische Störung und ARZNEIMITTELWIRKUNG zu verfolgen, haben wir die erste Rate einer Verweis-Sammlung von Genexpression Profilen von kultivierten menschlichen Zellen mit bioaktiven kleine Moleküle, zusammen mit Pattern matching Software, um diese Daten von mir behandelt geschaffen. Wir zeigen, dass diese "Connectivity-Karte" Ressource verwendet werden kann, um Verbindungen zwischen den kleinen Molekülen, die eine Aufteilungsmechanismus Aktion, Chemikalien und physiologische Prozesse, und Krankheiten und Arzneimittel zu finden. Diese Ergebnisse zeigen die Machbarkeit des Konzepts und den Wert der großen Gemeinschaftsprojekt Konnektivität Karte vorschlagen.

PRAS40 Ist Ein Insulin Reguliert-Hemmer, Der Die Proteinkinase MTORC1

Molecular Cell. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17386266

Die trimeren mTORC1 Proteinkinase nucleates ein Signalling Netzwerk, fördert Zellwachstum als Reaktion auf Insulin und wird in den Zellen fehlt die TSC1 oder TSC2 Tumor Suppressors konstitutiv aktiv. Insulin stimuliert die Phosphorylierung von S6K1, ein mTORC1 Substrat, aber es ist nicht bekannt, wie mTORC1 Kinase-Aktivität reguliert wird. Wir identifizieren die PRAS40 als ein Raptor-Interaktion-Protein, das bindet an mTORC1 in Zellen Insulin-beraubt und deren in-vitro-Interaktion mit mTORC1 wird gestört durch hohen Salzkonzentrationen. PRAS40 hemmt das Zellwachstum und S6K1 Phosphorylierung Rheb-induzierte Aktivierung des Signalweges mTORC1 und in-vitro-es verhindert, dass den großen Anstieg in mTORC1-Kinase-Aktivität von rheb1-GTP induziert. Insulin stimuliert Akt/PKB-vermittelte Phosphorylierung von PRAS40, die verhindert, die Hemmung der mTORC1 in Zellen und in vitro dass. Wir schlagen vor, dass die relativen Stärken der Rheb - und PRAS40-vermittelter Eingaben in mTORC1 insgesamt Stoffwechselweg Aktivität festgelegt und Insulin mTORC1 durch die koordinierte Regulierung der beide aktiviert.

Proteomic Bildschirm Definiert Die Polo-Box Domäne Interaktom Und Identifiziert Rock2 Als Plk1 Substrat

The EMBO Journal. May, 2007  |  Pubmed ID: 17446864

Polo-Like Kinase 1 (Plk1) phosphorylates eine Zahl mitotische Substrate, aber die Vielfalt der Plk1-abhängige Prozesse schlägt das bestehen zusätzliche Ziele. Plk1 enthält eine spezielle Phosphoserinphosphatase-Threonin Bindung Domäne der Polo-Box (PBD), das Kinase seine Substrate als Ziel postuliert. Verwenden die spezielle PBD Plk1 als Vermittler erfassen Affinität, führten wir einen Bildschirm um die mitotische Plk1-PBD-Interaktom durch Massenspektrometrie zu definieren. Wir haben 622 Proteine, die Phosphorylierung-abhängige Mitose-spezifische Interaktionen, zeigte einschließlich Proteine in etablierten Plk1 geregelten Prozessen beteiligt, und in Prozessen bisher nicht verbunden Plk1 wie translational Steuerung, RNA-Processing und Vesikel Transport identifiziert. Viele Proteine identifiziert in unserem Bildschirm spielen wichtige Rollen in der Zellteilung, wo in den Säugetier-Zellen, die detaillierte mechanistische Rolle der Plk1 schlecht definierter bleibt. Wir gehen auf und charakterisieren die Mitose-spezifischen Interaktion der Plk1-PBD mit der Zellteilung Effektor Kinase Rho-assoziierte aufgerollte Spule Domäne-haltigen Proteinkinase 2 (Rock2), zeigen, dass Rock2 Plk1 Substrat und zeigen, dass colocalizes Rock2 mit Plk1 während der Zellteilung. Schließlich zeigen wir, dass Plk1 RhoA zusammen funktionieren um maximal Rock2 Kinase-Aktivität in vitro und in Zellen zu erhöhen und implizieren Plk1 als einen zentralen Regulator der mehrere Wege, die synergistisch Zusammenwirken um Actomyosin Ring Kontraktion während der Spaltung Furche eindringen zu regulieren.

Quantitative, Multiplex-Assays Für Niedrige Fülle Proteine Im Plasma Durch Gezielte Massenspektrometrie Und Stabile Isotope Dilution

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Dec, 2007  |  Pubmed ID: 17939991

Biomarker Entdeckung erzeugt Listen mit Kandidaten-Marker, deren Präsenz und Ebene in Serum oder Plasma anschließend überprüft werden müssen. Überprüfung stellt einen Paradigmenwechsel dar von unvoreingenommene Entdeckung Ansätze für gezielte, Hypothese-orientierten Methoden und stützt sich auf bestimmte, quantitativen Assays für die selektive Erkennung von Zielproteinen optimiert. Viele Protein-Biomarkern klinische Währung am oder unter dem Bereich Nanogramm/Milliliter im Plasma vorhanden sind und bis heute von MS-basierte Methoden nicht zugänglich gewesen. Mit mehreren Reaction monitoring gepaart mit stabilen Isotopen Verdünnung Massenspektrometrie, wir beschreiben hier Multiplex die Entwicklung der quantitativen,-Assays für sechs Proteine im Plasma, die Grenzen der quantitativen Bestimmung im Bereich von 1-10 ng/ml mit prozentualen Variationskoeffizienten von 3 bis 15 % ohne Immunoaffinity Anreicherung von Proteine oder Peptide zu erreichen. Probieren Sie Verarbeitungsmethoden mit genügend Durchsatz, Recovery und Reproduzierbarkeit zu aktivieren, robuste Nachweis und quantitative Bestimmung der Kandidat Biomarker Proteine wurden entwickelt und optimiert durch Zusatz von exogene Proteine zu Immunoaffinity erschöpft Plasma von einem gesunden Spender. Quantitative mehrere Reaktion Überwachung Assays wurden entworfen und optimiert für Signatur-Peptide aus der Test-Proteine abgeleitet. Kalibrierkurven mit bekannte Spike Protein-Konzentrationen im Plasma zu urteilen, haben wir festgestellt, dass jedes Zielprotein mindestens ein Signatur-Peptid mit einer Beschränkung auf quantitative Bestimmung der 1-10 ng/ml und Linearität in der Regel 2 Größenordnungen in den Messbereich von Interesse hatte. Nachweisgrenzen waren häufig im Bereich von hohen Picogramm/Milliliter. Diese Werte der Assay-Leistung bis zu einem 1000-fache Verbesserung im Vergleich zu direkten Analyse der Proteine im Plasma von MS vertreten und wurden durch einfache, robuste Probenbearbeitung bei denen reichlich Protein Erschöpfung und minimale Fraktionierung durch starke kation-Austausch-Chromatographie auf der Peptid-Ebene vor der LC-Multiple Reaktion Überwachung/MS erreicht. Die hier vorgestellten Methoden bieten eine solide Grundlage für die Entwicklung von quantitativen MS-basierte Assays der niedrigen Ebene Proteine im Blut.

Genaue Aufnahme Mass Screening: Eine Brücke Zwischen Unvoreingenommene Entdeckung Und Gezielte Assay-Entwicklung Für Biomarker-Überprüfung

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Oct, 2008  |  Pubmed ID: 18534968

Überprüfung der Kandidat Biomarker Proteine im Blut erfolgt in der Regel über mehrere Reaction monitoring (MRM) von Peptiden von LC-MS/MS auf triple-Quadrupol-MS-Systemen. MRM-Assay-Entwicklung für jedes Protein erfordert viel Zeit und Kosten, von denen ein Großteil dürfte wenig Wert zu sein, wenn der Kandidat Biomarker unterhalb der Nachweisgrenze im Blut oder ein falsch positives Ergebnis in den Originaldaten der Entdeckung ist. Hier präsentieren wir eine neue Technologie, genaue Aufnahme mass screening (AIMS), entwickelt, um eine Brücke von unvoreingenommene Entdeckung zum MS-basierte Assay-Entwicklung ausgerichtet. Massen auf der Aufnahmeliste Software in jedem Scan auf dem Orbitrap-MS-System überwacht und MS/MS Spektren für Sequenz Bestätigung werden erworben, nur, wenn ein Peptid aus der Liste mit den richtigen genaue Masse und den Ladezustand erkannt wird. Das Ziele-Experiment bestätigt, dass ein bestimmtes Peptid (und damit das Protein, von dem es abgeleitet ist) in das Plasma vorhanden ist. Durchsatz der Methode reicht bis zu hundert Proteine/Woche zu qualifizieren. Die Sensibilität der Ziele ist ähnlich wie MRM auf einem triple-Quadrupol-MS mit optimierten Beispiel Zubereitungsmethoden (niedrige 10 ng/ml im Plasma) und MS/MS-Daten aus der Ziele-Experimente an der Orbitrap können direkt zum Konfigurieren von MRM-Proben. Die Methode wurde gezeigt, dass mindestens 4-fach noch effizienter bei der Erkennung von Peptiden interessieren als ungerichtete LC-MS/MS-Experimente mit die gleiche Instrumentation und relative Quantifizierung Informationen erhalten Sie von Zielen im Fall gegen Regelungs-Experimente. Erkennung von Zielen stellt sicher, dass eine quantitative MRM-gegründeten Probe für das Protein konfiguriert werden kann. Die Methode hat das Potenzial, die große Anzahl von Biomarker-Kandidaten, die auf der Grundlage ihrer Entdeckung im Plasma vor Begehung zu den Zeit und ressourcenintensiven Schritten zur Gründung einer quantitativen Assay zu qualifizieren.

Eine Mitochondriale Protein-Kompendium Erläutert Komplexe Ich Krankheit Biologie

Cell. Jul, 2008  |  Pubmed ID: 18614015

Mitochondrien sind komplexe Organellen, die deren Dysfunktion ein breites Spektrum von Krankheiten zugrunde liegt. Alle der Proteine, die ihren Wohnsitz in diesem Organell zu identifizieren und zu verstehen, wie sie in Bahnen integrieren stellen große Herausforderungen in der Zellbiologie. Zu diesem Zweck führten wir durch Massenspektrometrie, GFP tagging und Maschinelles Lernen um eine mitochondriale Kompendium der 1098 Gene und ihre Proteinexpression über 14 Maus Gewebe zu erstellen. Wir verknüpfen schlecht charakterisiert Proteine in dieser Aufstellung bekannter mitochondriale Bildungswege Kraft gemeinsamen evolutionären Geschichte. Mit diesem Ansatz wir vorhersagen 19 Proteine wichtig für die Funktion des Komplexes sein I (CI) der Atmungskette. Wir überprüfen eine Teilmenge dieser Vorhersagen mit Hilfe der RNAi, einschließlich C8orf38, die wir weiter zeigen Häfen eine vererbte Mutation in ein tödlicher, infantile CI-Mangel. Unsere Ergebnisse haben wichtige Implikationen für das Verständnis von CI-Funktion und Pathogenese und mehr im allgemeinen veranschaulichen, wie unser Kompendium als Grundlage für eine systematische Untersuchungen der Mitochondrien dienen kann.

Metabolic Profiling Der Menschlichen Reaktion Auf Eine Glukose-Herausforderung Zeigt Verschiedene Achsen Der Insulinempfindlichkeit

Molecular Systems Biology. 2008  |  Pubmed ID: 18682704

Glukose-Aufnahme, nachdem eine Übernachtung schnell ein Insulin-abhängigen, homöostatischen Programm ausgelöst, die bei Diabetes verändert wird. Das gesamte Spektrum der biochemischen Änderungen, die diesen Übergang zugeordnet ist derzeit nicht bekannt. Wir haben eine Spektrometrie-basierten Massen-Strategie um gleichzeitig Messen 191 Metaboliten nach Glukose-Einnahme entwickelt. In zwei Gruppen von gesunden Personen (n = 22 und 25), 18 Plasma-Metaboliten reproduzierbar, geändert, Gallensäuren, Harnstoff-Zyklus-Zwischenprodukte und Purin-Abbauprodukte, von denen keine waren zuvor mit Glukose-Homöostase. Der Metabolit Dynamik zeigte auch Insulin des bekannten Aktionen entlang vier Schlüsselbereichen--Proteolyse, Lipolyse, Ketogenese und Glykolyse--einen Wechsel von Katabolismus zu Anabolismus widerspiegelt. In Pre-diabetics (n = 25), beobachteten wir eine abgestumpften Antwort auf allen vier Achsen, die mit Insulinresistenz korreliert. Multivariate Analyse zeigte, die Rückgänge in Glycerin und Leucin/Isoleucin (Marker der Lipolyse und Proteolyse, beziehungsweise) gemeinsam bieten die stärkste Prädiktor für Insulinempfindlichkeit. Diese Beobachtung zeigt, dass manche Menschen selektiv resistent gegen Insulin die Unterdrückung der Proteolyse, während andere, Insulin die Unterdrückung der Lipolyse. Unsere Ergebnisse legen das Fundament für die Verwendung metabolic profiling, zum Definieren eines Individuums 'Insulin Antwort Profil', das Wert in der Vorhersage von Diabetes, seine Komplikationen und in der Führung der Therapie haben könnte.

Metabolit Des Blutes Von Personen, Die Geplante Myokardinfarkt Profilerstellung Zeigt Frühe Marker Einer Myokardialen Schädigung

The Journal of Clinical Investigation. Oct, 2008  |  Pubmed ID: 18769631

Aufstrebenden metabolische haben Werkzeuge erstellt Gelegenheit zur Festlegung der metabolischer Signatures der myokardialen Schädigung. Wir angewendet ein Spektrometrie-basierten Massen-Metabolit Profilerstellung Plattform an 36 Patienten Alkohol Septumdefekt Ablation Behandlung für Hypertrophe obstruktive Kardiomyopathie, eine menschliche Modell der geplanten Myokardinfarkt (PMI). Serielle Blutproben wurden vor und in unterschiedlichen Abständen nach PMI, mit Patienten Ergänzende diagnostische Koronarangiographie und Patienten mit spontanen Myokardinfarkt (SMI) dient als negative und positive Kontrollen, bzw. erzielt. Wir haben Änderungen in zirkulierenden Ebenen von Metaboliten, die Teilnahme an Pyrimidin-Stoffwechsel, der Tricarboxylic Säure-Zyklus wird upstream Beitragenden und Pentosephosphatweg identifiziert. Änderungen in Stufen von mehreren Metaboliten wurden bereits 10 Minuten nach PMI in einer ersten Ableitung-Gruppe erkannt und in eine zweite, unabhängige Gruppe von PMI Patienten validiert wurden. Eine PMI abgeleitete metabolische Signatur bestehend aus aconitic Säure, differenziert Hypoxanthin, Trimethylamin-N-oxid und Threonin Patienten mit SMI von die diagnostische Koronarangiographie mit hoher Genauigkeit und Koronarsinus Probenahme definierten Herz-abgeleitet aus peripheren metabolischen Veränderungen unterzogen. Unsere Ergebnisse eine Rolle für metabolic profiling in der Früherkennung der myokardialen Schädigung zu identifizieren und schlagen vor, daß ähnliche Ansätze für den Nachweis oder die Vorhersage der anderen Krankheitzuständen verwendet werden dürfen.

Protein Quantifizierung Durch Gezielte Massenspektrometrie: Der Weg Aus Dem Fegefeuer Biomarker?

Clinical Chemistry. Nov, 2008  |  Pubmed ID: 18957555

Bead-basierter Profilierung Von Tyrosin-Kinase-Phosphorylierung Identifiziert SRC Als Mögliches Angriffsziel Für Glioblastom-Therapie

Nature Biotechnology. Jan, 2009  |  Pubmed ID: 19098899

Die aberrante Aktivierung von Tyrosinkinasen stellt einen wichtigen Mechanismus der Onkogene und dennoch die Mehrheit solcher Ereignisse bleiben unentdeckt. Hier beschreiben wir eine Bead-based Methode zum Nachweis von Phosphorylierung von beiden Wildtyp und Mutanten Tyrosinkinasen Multiplex, hohen Durchsatz und kostengünstige Weise. Mit dem Ziel einen Tyrosin-Kinase-Aktivierung-Katalog haben wir diese Methode 130 menschlichen Krebs-Linien ein Profil verwendet. Follow-up-Experimente auf der Feststellung, dass SRC häufig in Glioblastom phosphoryliert ist Zell-Linien, die zeigten, dass SRC auch in primären Glioblastom Patientenproben aktiviert wird und die SRC-Hemmer Dasatinib (Sprycel) Lebensfähigkeit und Zelle Migration in-vitro- und in-vivo Tumorwachstum hemmt. Prüfung von Dasatinib säurefeste Tyrosin-Kinase-Allele bestätigt, dass SRC tatsächlich die relevanten Zielgruppen von Dasatinib, das viele Tyrosinkinasen hemmt. Diese Studien schaffen die Durchführbarkeit von Tyrosin Kinome-weite Phosphorylierung Profilerstellung und zeigen auf SRC als mögliche therapeutische Ziel in Glioblastom.

Eine Menschliche Proteom-Nachweis Und Quantitative Bestimmung-Projekt

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. May, 2009  |  Pubmed ID: 19131327

Der Mangel an sensiblen, spezifische, multiplexable Assays für die meisten menschlichen Proteinen ist das Haupthindernis technische Entwicklung von Biomarkern Kandidat in klinisch nützliche Tests behindern. Jüngste Fortschritte in der Spektrometrie-basierten Massen-Assays für Proteotypic Peptide, insbesondere solche mit spezifischen Affinität Peptid Bereicherung, bietet einen systematischen und wirtschaftlichen Pfad zu umfassende quantitative Abdeckung des menschlichen Proteome. Eine komplette Suite von Tests, z. B. zwei Peptide aus dem Protein-Produkt eines jeden der etwa 20.500 menschliche Gene (hier das menschliche Proteom-Nachweis und quantitative Bestimmung-Projekt genannt), würde ermöglichen schnelle und systematische Überprüfung der Kandidat Biomarker und eine quantitative Grundlage für nachfolgende Bemühungen das größere Universum der Splice-Varianten, Übersetzungsänderungen, Protein-Protein Interaktionen und Gewebe Lokalisierung zu definieren.

Vorhersage Von Hoher Reagierende Peptiden Für Gezielte Protein Assays Durch Massenspektrometrie

Nature Biotechnology. Feb, 2009  |  Pubmed ID: 19169245

Protein Biomarker Entdeckung produziert lange Listen mit Kandidaten, die anschließend im Blut oder anderen zugänglich hinter überprüft werden müssen. Verwendung von gezielten Massenspektrometrie (MS), um zu überprüfen, Krankheit oder Therapie-bezogenen Änderungen im Protein-Ebene erfordert die Auswahl von Peptiden, die quantifizierbaren Surrogate für Proteine von Interesse sind. Peptide, die die höchste Ionen-Strom-Antwort (hoher reagierende Peptide) produzieren dürften die beste Erkennung-Empfindlichkeit zu bieten. Identifikation der effektivste Signatur Peptide, besonders in Ermangelung von Versuchsdaten, bleibt eine wichtige Ressource-Einschränkung bei der Entwicklung zielgerichteter MS-basierte Assays. Hier beschreiben wir eine computational Methode, die Protein physikalisch-chemischen Eigenschaften verwendet auswählen hoher reagierende Peptide und ihre Nützlichkeit in identifizierende Signatur Peptide im Plasma, eine komplexe Proteome mit einer breiten Palette von Protein-Konzentrationen zu demonstrieren. Unsere Methode, die ein Random Forest Klassifikators beschäftigt, erleichtert die Entwicklung von gezielten MS basierende Assays für Biomarker Überprüfung oder jede Anwendung, in denen Protein-Ebene gemessen werden müssen.

Identifizieren Die Proteine, Auf Die Klein-Molekül-Sonden Und Drogen Bind in Den Zellen

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Mar, 2009  |  Pubmed ID: 19255428

Die meisten klein-Molekül Sonden und Drogen ändern Zelle Schaltung durch die Interaktion mit 1 oder mehr Proteine. Es ist äußerst selten, ein komplettes Verständnis der interagierenden Proteine und ihre zugeordneten Proteinkomplexe, ob die Verbindungen durch zellbasierte phänotypische oder zielbasierte Bildschirmen erkannt werden. Solche Funktion wird voraussichtlich stark leuchtenden--die starke Hinweise auf die Mechanismen von klein-Moleküle verwendet, um ihre anerkannten Aktionen zu erreichen und schlägt mögliche unbekannte Aktionen sein. Wir beschreiben eine leistungsfähige Methode kombiniert quantitative Proteomik (SILAC) mit Affinität Bereicherung für unvoreingenommene, robust und umfassende Ermittlung der Proteine zu bieten, die klein-Molekül-Sonden und Drogen binden. Die Methode ist skalierbar und allgemeine, erfordern wenig Optimierung über verschiedenen zusammengesetzten Klassen, und hatte bereits eine transformative Wirkung auf unsere Studien von klein-Molekül-Sonden. Hier beschreiben wir in allen Einzelheiten, die Anwendung der Methode auf Ziele der Kinase-Inhibitoren und Immunophilin Bindemittel zu identifizieren.

Beispiel Verhör Nutzt Eine Genaue Ausschluss-basierten Massen-datenabhängige Akquisitionsstrategie (AMEx) Gerichtet

Journal of Proteome Research. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19344186

Die Fähigkeit, gründliche Probenahmen durchzuführen ist von entscheidender Bedeutung bei der Verwendung von Massenspektrometrie, um komplexe Proteomic Mischungen zu charakterisieren. Ein gemeinsamer Ansatz ist es, eine Probe mehrmals von LC-MS/MS reinterrogate. Allerdings werden die konventionelle datenabhängige Erwerb-Methoden, die normalerweise in Proteomics Studien verwendet werden oft redundant Beispiel hoher Intensität Vorläufer Ionen während der Probe niedriger Intensität Vorläufer völlig versäumt. Wir beschreiben eine Methode, wobei die Massen erfolgreich identifizierten Peptide verwendet werden, um eine genaue Masse Ausschlussliste zu generieren, so dass diese Grundstoffe für die Sequenzierung während nachfolgende Analysen nicht ausgewählt sind. Wir spielten mehrere verkettete analytische läuft zum Probieren einer komplexen Zelle lysate, mit genauen Ausschluss-basierten Massen-datenabhängige Erwerb (AMEx) oder Norm datenabhängige Erwerb, und festgestellt, dass die Nutzung von AMEx auf ESI-Orbitrap Instrument deutlich erhöht die Gesamtzahl von validierten Peptid-Identifikationen relativ einen Standardansatz der DDA. Die zusätzliche identifizierten Peptide stellen Vorläufer Ionen, die niedrige Signalintensität in der Stichprobe zeigen. Erhöht die Gesamtzahl von Peptid-Identifikationen erweitert die Anzahl der Proteine identifiziert, ebenso wie verbesserte die Sequenz-Berichterstattung über diese Proteine. Diesen Daten zufolge zusammen mit AMEx ist eine wirksame Strategie zur Charakterisierung von komplexen Proteomic Mischungen zu verbessern.

Entwicklung Von Multiplex-assays Für Troponin I Und Interleukin-33 Im Plasma Von Peptid Immunoaffinity Bereicherung Und Gezielte Massenspektrometrie

Clinical Chemistry. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19372185

Protein Biomarker Kandidaten aus Entdeckung Proteomics müssen quantitativ in Patientenproben überprüft werden, bevor sie auf klinische Validierung Fortschreiten können. Hier zeigen wir, dass Peptid Immunoaffinity Anreicherung mit stabilen Isotope Dilution gekoppelt, die Massenspektrometrie (SISCAPA-MRM) zum Konfigurieren von Proben mit Leistung geeignet für Kandidat Biomarker Überprüfung verwendet werden kann. Als Nachweis der Grundsatz konfiguriert wir SISCAPA Assays für Troponin I (cTnI), einem etablierten Biomarker der kardialen Schädigung und Interleukin 33 (IL-33), ein aufstrebenden immunologische und Herz-Kreislauf-Marker für die robuste Immunoassays zur Zeit nicht verfügbar sind.

Plk1 Selbstorganisation Und Grundierung Phosphorylierung Von HsCYK-4 an Die Spindel Midzone Regulieren Den Ausbruch Der Division in Den Menschlichen Zellen

PLoS Biology. May, 2009  |  Pubmed ID: 19468302

Tierzellen initiieren Zellteilung parallel zu Beginn der Anaphase, wenn ein Actomyosin Ring montiert und durch lokalisierte Aktivierung von die kleine GTPase RhoA, was zu einer Trennungsfurche verengt. Furche Bildung stützt sich auf positionelle Hinweise bereitgestellt durch Anaphase Spindel Mikrotubuli (MTs), aber es bleibt unklar, wie solche Signale generiert werden. Verwenden chemische Genetik, um sowohl zeitliche und räumliche Kontrolle zu erreichen, zeigen wir, dass die selbstorganisierte Lieferung von Polo-Like Kinase 1 (Plk1) die Midzone und seine lokalen Phosphorylierung MT gebundene Substrat sind entscheidend für die generiert diese Furche-induzierende Signals. Als Plk1 aktiv, aber nicht in der Lage, selbst diese äquatorialen Wahrzeichen Ziel war, konnte beide kortikale RhoA Rekrutierung und Furche Induktion auftreten, damit die Auswirkungen der Anaphase-spezifische Plk1 Hemmung Biodiversitätsmonitoring. Mit Tandem-Massenspektrometrie und Phosphospecific Antikörper, fanden wir, dass Plk1 bindet und direkt die HsCYK-4-Untereinheit des Centralspindlin (auch bekannt als MgcRacGAP) an die Midzone phosphorylates. Am Serin 157 erstellt diese Änderung eine große docking-Website für das Tandem, wie, das BRCT des Faktors Austausch Rho GTP Ect2 wiederholt wird. Zellen Ausdrücken nur eine Nonphosphorylatable Form des HsCYK-4 Fehler beim Ect2 an den Midzone zu lokalisieren und wurden in Spaltung Furche-Formation, was bedeutet, dass HsCYK-4 Plk1s geschwindigkeitsbestimmende Ziel stromaufwärts von RhoA stark beeinträchtigt. Umgekehrt Anbindehaltung ein Inhibitor-resistenten Allel des Plk1 bis HsCYK-4 erlaubt Furchen zu bilden trotz globaler Hemmung anderer Plk1-Moleküle in der Zelle. Unsere Ergebnisse beleuchten zwei Schlüsselmechanismen für die Einleitung der Zellteilung in den menschlichen Zellen und illustrieren die Macht der chemische Genetik zu dieser Verordnung, die sowohl in Zeit und Raum zu sondieren.

Multisite Beurteilung Der Genauigkeit Und Reproduzierbarkeit Der Mehrere Reaktion Überwachung-basierte Messungen Der Proteine Im Plasma

Nature Biotechnology. Jul, 2009  |  Pubmed ID: 19561596

Überprüfung der Kandidat Biomarker ist abhängig von spezifischen, quantitative Proben für selektive Erkennung von Zielproteinen optimiert und wird zunehmend als ein entscheidender Schritt bei der Entdeckung pipeline diese Brücken unvoreingenommene Biomarker Entdeckung präklinische Validation gesehen. Obwohl einzelne Laboratorien bewiesen haben, dass mehrere Reaction monitoring (MRM) mit Isotop Verdünnung Massenspektrometrie gekoppelt können Kandidaten Protein quantifizieren Biomarker in Plasma, Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit der diese Proben zwischen Laboratorien nicht nachgewiesen wurden. Wir beschreiben eine multilaboratory Studie Reproduzierbarkeit, Recovery, linearen Dynamikbereich und Nachweisgrenzen und Quantifizierung von Multiplex, MRM-basierte Assays, dirigiert von NCI-CPTAC. Gemeinsame Materialien und standardisierter Protokolle verwenden, zeigen wir, dass diese Proben können hoch reproduzierbare innerhalb und zwischen den Labors und Instrument-Plattformen, und empfindlich auf niedrige Becher/ml Protein-Konzentrationen im Plasma Unfraktioniertes reagieren. Wir liefern Daten und Benchmarks gegen die einzelne Laboratorien können vergleichen ihre Leistung und bewerten neue Technologien für Biomarker Überprüfung im Plasma.

Quantifizierung Der Kardiovaskuläre Biomarker Im Patienten Plasma Durch Gezielte Massenspektrometrie Und Stabile Isotope Dilution

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Oct, 2009  |  Pubmed ID: 19596694

Überprüfung der Kandidat Biomarker erfordert spezifischen Tests gezielt erkennen und quantifizieren von Zielproteinen in zugänglich hinter. Das primäre Ziel der Überprüfung ist auf Bildschirm potenzielle Biomarker um sicherzustellen, dass nur die höchsten Qualität-Kandidaten aus der Orientierungsphase in präklinischen Validierung vorangebracht werden. Da Antikörper Reagenzien für eine klinische Besoldungsgruppe-Immunoassay oft für eine kleine Anzahl von Kandidaten vorhanden sind, müssen alternative Methoden neue und unbewiesene Kandidaten in einer statistisch tragfähige Zahl von Serum oder Plasma-Proben für Anmeldeinformationen. Mit mehreren Reaction monitoring gepaart mit stabilen Isotope Dilution MS, entwickelten wir quantitative, Multiplex-Assays im Plasma für sechs Proteine der klinischen Relevanz für die kardiale Schädigung. Der beschriebene Prozess erfordert keine Antikörper für Immunoaffinity Anreicherung von Proteine oder Peptide. Erfassungsgrenze und Quantisierung für jede Signatur-Peptid als Ersatzzeichen für den Zielproteinen verwendet wurden durch die Methode der standard Addition mit synthetischer Peptide und Plasma von einem gesunden Spender bestimmt. Grenzen der Quantisierung reichte von 2 bis 15 ng/ml für die meisten von den Zielproteinen. Quantitative Messungen wurden für ein bis zwei Signatur-Peptide aus jeder Zielprotein, einschließlich niedrige Fülle Protein-Marker der kardialen Schädigung im Bereich Nanogramm/Milliliter wie die kardiale Troponins erzielt. Intra- und Interassay Variationskoeffizienten waren überwiegend < 10 und 25 %, beziehungsweise. Konfigurierten multiplex Assays wurde dann zur Messung dieser Proteine über drei Mal Punkte bei sechs Patienten Alkohol Septumdefekt Ablation für Hypertrophe obstruktive Kardiomyopathie. Diese Ergebnisse sind die erste Demonstration einer Multiplex, MS-basierte Tests für Erkennung und Quantifizierung von Veränderungen in der Konzentration der Proteine, die kardiale Schädigung im Bereich von niedrigen Nanogramm/Milliliter zugeordnet. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass diese Proben der erforderlichen Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit auf Roman und uncharakterisiertes Kandidat Biomarker für die Überprüfung der Proteine im Blut angewendet werden beibehalten.

Proteomic Und Genetische Ansätze Identifizieren Syk Als AML-Ziel

Cancer Cell. Oct, 2009  |  Pubmed ID: 19800574

Zellbasierte Screening kann die schnelle Identifizierung von Verbindungen, die auslösende komplexer zellulärer Phänotypen erleichtern. Voran eine Verbindung in Richtung der Klinik, erfordert jedoch im Allgemeinen die Identifizierung über genaue Wirkmechanismen. Vorher finden wir, dass epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)-Inhibitoren Akuter Myeloischer Leukämie (AML) Differenzierung über einen nicht-EGFR-Mechanismus bewegen. In diesem Bericht haben wir Proteomic und RNAi-basierte Strategien zu identifizieren, ihre Weg-Ziel, Anti-AML-Mechanismus integriert. Diese orthogonale Ansätze identifiziert Syk als Ziel in AML. Genetische und pharmakologische Inaktivierung von Syk mit einem Medikament in der klinischen Studie für andere Indikationen Differenzierung AML Zellen gefördert und Leukämie Wachstum in-vivo abgeschwächt. Diese Ergebnisse zeigen die Macht der Integration von unterschiedlichen chemischen, Proteomic und genomische Screening Ansätze therapeutische Strategien für Krebs zu identifizieren.

Empirische Analyse Der Bayes Quantitative Proteomics Experimente

PloS One. 2009  |  Pubmed ID: 19829701

Fortschritte in der Spektrometrie-basierten Massen-Proteomics haben die Einbeziehung von Proteomic aktiviert, wenn Daten in Systeme Biologie nähert. Jedoch hat die Entwicklung von Analysenmethoden zurückgeblieben. Hier beschreiben wir einen empirischen Bayes-Rahmen für quantitative Proteomik-Datenanalyse. Die Methode stellt eine statistische Beschreibung der jedes Experiment, einschließlich der Anzahl der Proteine, die in Hülle und Fülle zwischen 2 Proben, das Experiment statistische macht, sie zu erkennen, und die Wahrscheinlichkeit von False positives jedes Proteins zu unterscheiden.

ZBED6, Regelt Ein Neuartigen Transkriptionsfaktor Abgeleitet Eine Domestizierte DNA-Transposon IGF2-Ausdruck Und Muskel-Wachstum

PLoS Biology. Dec, 2009  |  Pubmed ID: 20016685

Eine Einzel-Nukleotid-Substitution in Intron 3 von IGF2 bei Schweinen hebt eine Bindungsstelle für ein Verdränger und führt zu einem 3-Band bis-Regulierung von IGF2 in der Skelettmuskulatur. Die Mutation hat große Auswirkungen auf die Muskel-Wachstum, Größe des Herzens und der Fetteinlagerung. Hier haben wir identifiziert, der Verdränger und feststellen, dass das Protein mit dem Namen ZBED6, vorher unbekannt, spezifisch für Säugetieren und von einer Exapted DNA-Transposon abgeleitet ist. Zum Schweigen der Zbed6 Maus C2C12 Myoblasts betroffen Igf2-Ausdruck, Zellproliferation, Wundheilung und Myotube Bildung. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP)-Sequenzierung mit C2C12 Zellen identifiziert rund 2.500 ZBED6-Bindungsstellen im Genom und das Motiv hergeleiteten Konsens gab eine perfekte Ergänzung zu den etablierten Bindungsstelle in Igf2. Gene im Zusammenhang mit ZBED6-Bindungsstellen zeigte eine höchst bedeutsame Bereicherung für bestimmte Gene Ontology-Klassifikationen, einschließlich Entwicklung und transkriptionelle Regulation. Die phänotypische Effekte in mutant Schweine und ZBED6 zum Schweigen gebracht C2C12 Myoblasts, extreme Sequenz Erhaltung seiner nukleoläres Lokalisierung, die Breite Gewebe-Verteilung und viele Zielgene mit wesentlichen biologischen Funktionen schlagen vor, daß ZBED6 eine wichtige Übertragungfaktor Säugetieren ist die Entwicklung, Zellvermehrung und Wachstum.

Automatische Erkennung Der Falsche Oder Ungenaue Übergänge in Peptid Quantifizierung Durch Mehrere Reaktion Massenspektrometrie Überwachung

Clinical Chemistry. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 20022980

Mehrere Reaktion Überwachung Massenspektrometrie (MRM-MS) Peptide mit stabilen Isotopen-Label internen Standards (SSI) wird zunehmend genutzt, quantitativen Assays für Proteine in komplexen biologischen Matrizen zu entwickeln. Diese Proben können hochpräzise und quantitative, aber das häufige Vorkommen von Interferenzen erfordert, dass MRM-MS Daten manuell überprüft, ein zeitaufwendiger Vorgang unterliegt menschliches Versagen. Wir entwickelten einen Algorithmus, der ungenauen Übergang Daten basierend auf das Vorhandensein von störenden Signal oder inkonsistente Erholung der Parallelproben identifiziert.

Integration Von Proteomic-basierte Tools Für Verbesserte Biomarker Der Myokardialen Schädigung

Clinical Chemistry. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 20022985

Da die sich häufenden Hinweise zu Gunsten der pharmakologische und Katheter-basierte Frühinterventionen für Patienten aus dem Spektrum der akute koronare Syndrome, hätte Entdeckung neuartige diagnostisch sensitive und spezifische Biomarkern, die biochemischen der frühen oder reversible myokardialen Schädigung Nachweis erhebliche positive Auswirkungen auf die Patientenversorgung.

Eine Mitotische Phosphorylierung-Rückmeldung-Netzwerk Verbindet, Cdk1, Plk1, 53BP1 Und Chk2 Zu Inaktivieren Die G (2) / M-DNA Beschädigen Prüfpunkt

PLoS Biology. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 20126263

DNA Beschädigung Prüfpunkte verhaften Zellzyklusprogression DNA-Reparatur zu erleichtern. Die Fähigkeit, genotoxisch Beleidigungen zu Überleben hängt nicht nur auf die Einleitung der Zellzyklus Checkpoints, sondern auch von Prüfpunkt Wartung. Während der Aktivierung der DNA Beschädigung Prüfpunkte ausgiebig studiert hat, sind die molekulare Mechanismen, die Erhaltung und letztlich inaktivieren Zellzyklus Checkpoints beteiligt weitgehend unbekannt. Hier erforschten wir Feedback-Mechanismen, die die Wartung und die Beendigung der Prüfpunkt-Funktion zu steuern, indem eine evolutionär konservierte mitotische Phosphorylierung-Netzwerk innerhalb der DNA-Schäden-Antwort rechnerisch zu ermitteln. Wir zeigen, dass die nicht-enzymatische Prüfpunkt Adapter Protein 53BP1 ein in-vivo-Ziel des Zellzyklus Kinasen Cyclin-abhängige Kinase-1 und Polo-Like Kinase 1 (Plk1). Wir zeigen, dass Plk1 53BP1 während der Mitose bindet und diese Interaktion für ordnungsgemäße Inaktivierung der DNA Beschädigung Prüfpunkt erforderlich ist. 53BP1-Mutanten, die nicht in der Lage, Plk1 zu binden sind nicht Zellzyklus nach ionisierender Strahlung-vermittelte Zellzyklus Verhaftung neu starten. Wichtig ist, zeigen wir, dass Plk1 auch das 53BP1-Bindung Checkpoint Kinase Chk2 phosphorylates zu inaktivieren seiner FHA-Domäne und hemmen die Kinase-Aktivität in den Säugetier-Zellen. So regelt eine mitotische Kinase-vermittelte negativen Rückkopplung den ATM-Chk2 Zweig der Signalisierung Netzwerk durch PHOSPHORYLIEREND konservierte Standorte in 53BP1 und Chk2 zu inaktivieren Prüfpunkt Signalisierung und Steuerung Prüfpunkt Dauer DNA-Schäden.

Optimieren Die Leistung Der Glykopeptide Capture Für Plasma Proteomik

Journal of Proteome Research. Apr, 2010  |  Pubmed ID: 20235580

Selektive Abscheidung von Glycopolypeptides gefolgt von Freigabe und Analyse der ehemaligen Glycosylation-Gelände Peptide ist gezeigt worden, um vielversprechende Mittel zur Reduzierung der Komplexität der Körperflüssigkeiten wie Blut für Biomarker Discovery sein. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll basierend auf Erfassung von Polypeptiden, enthält ein N-chromosomale Kohlenhydrat aus menschlichem Plasma mit kommerziell verfügbare magnetische Perlen gepaart mit Maleinsäurehydrazid Chemie optimiert und teilweise automatisiert durch einen Eisvogel-magnetische Partikel-Prozessor. Vergleich der Bead-basierter Glycocapture auf Protein-Ebene-Vs traten die Peptid-Ebene Unterschiede in der Spezifität, die Reproduzierbarkeit und die absolute Anzahl der ehemaligen Glycosylation-Gelände Peptide erkannt. Auswertung einer Reihe von Capture und Elution Bedingungen führten zu einer optimierten Protokolls mit einer 24 % intraday und 30 % interday CV und eine Glykopeptide Erfassung Spezifität von 99 %. Zum Abbau des Plasmas von 14 hohe Fülle Proteine verbesserte Erkennung Empfindlichkeit um etwa 1 Größenordnung im Vergleich zu nondepleted Plasma und führte zu einer Steigerung von 24 % der Zahl der identifizierten Glykoproteine. Die Empfindlichkeit der SPEG zur Detektion von Glykoproteinen in abgereichertem, nicht fraktioniert Plasma wurde festgestellt, dass 10-100 Pmol/mL entspricht Glykoprotein-Ebenen, die von Hunderten von Nanogramm/mL bis 10 Mikrogramm/ml liegen. Trotz hoher Einnahme Spezifität ist die Gesamtzahl der Glykoproteine erkannt und der Empfindlichkeit der SPEG im Plasma überraschend begrenzt.

Rictor Phosphorylierung Der Thr-1135-Website Erfordert Keine Säugetier-Ziel Von Angiomiolipomas Komplexe 2

Molecular Cancer Research : MCR. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20501647

Wachstumsfaktoren koordinieren in Tierzellen Zellproliferation und Überleben durch die Regelung die Phosphoinositid-3-Kinase/Akt-Signalweges. Deregulierung des dieser Signalweg ist bei verschiedenen menschlichen Krebserkrankungen verbreitet. Das komplexen Signalisierung PI3K abhängige-Kinase definiert als Säugetier-Ziel von angiomiolipomas Komplex 2 (mTORC2) Funktionen als einer regulatorischen Ser-473-Kinase der Akt. Wir finden, dass die Aktivierung der mTORC2 durch das Wachstumsfaktor signalisieren die spezifische Phosphorylierung von seiner Komponente Rictor auf Thr-1135 verknüpft ist. Die Phosphorylierung dieser Website wird durch den Wachstumsfaktor Stimulation und Ausdruck der Onkogene Formen der Ras oder PI3K induziert. Rictor Phosphorylierung reagiert empfindlich auf die Hemmung der PI3K, mTOR oder Ausdruck der Integrin-linked Kinase. Die Substitution von Wildtyp Rictor mit seinen spezifischen Phospho-Mutanten in Rictor null Mäuseembryonalen den Wachstumsfaktor-abhängige Phosphorylierung von Akt, darauf hinweist, dass die Rictor Thr-1135 Phosphorylierung nicht entscheidend bei der Regulierung der mTORC2-Kinase-Aktivität ist, nicht geändert. Wir fanden, dass dieses Rictor Phosphorylierung findet statt in den mTORC2-defizienten Zellen, was darauf hindeutet, dass diese Änderung eine in der Regulierung von nicht nur mTORC2, sondern auch die mTORC2-unabhängige Funktion der Rictor Rolle könnte.

Metabolische Signaturen Der Übung in Humanem Plasma

Science Translational Medicine. May, 2010  |  Pubmed ID: 20505214

Übung bietet zahlreiche heilsame Wirkung, aber unser Verständnis von, wie diese auftreten, ist begrenzt. Wir haben umfassende Plasma Metabolit Signaturen mit Massenspektrometrie zur Messung entwickelt, um ein klareres Bild der Übung induziert metabolischen Antworten zu gewinnen, > 200 Metaboliten vor und nach dem Training. Wir haben Plasma-Indikatoren der Glykogenolyse (Glucose-6-Phosphat), Tricarboxylic Säure Zyklus Span 2 Expansion (Succinat, Malat und Fumarat), sowie Lipolyse (Glycerin), sowie Modulatoren der Insulinempfindlichkeit (Niacinamid) und Fettsäure-Oxidation (Pantothensäure) identifiziert. Metaboliten, die stark mit Fitness-Parametern korreliert waren wurden in Themen, die im akuten Übung Test und Marathon laufen und in 302 Themen von eine longitudinale Kohortenstudie gefunden. Ausübung-induzierten Anstieg Glycerin wurden stark mit Bezug zu Fitness-Level in den normalen Einzelpersonen und bei Patienten mit myokardialer Ischemia abgeschwächt wurden. Eine Kombination von Metaboliten, die im Plasma als Reaktion auf Übung (Glycerin, Niacinamid, Glucose-6-Phosphat, Pantothenat und Succinat) stieg oben-geregelt der Ausdruck des nur77, ein transcriptional Regulator der Glukose-Auslastung und Lipid-Stoffwechsel-gen in der Skelettmuskulatur, die in-vitro. Plasma Stoffwechselprofile erhalten während des Trainings bieten Unterschriften der Ausübung Leistung und Herz-Kreislauf-Erkrankungen Anfälligkeit, zusätzlich zur Hervorhebung molekularer Bahnen, die die heilsame Wirkung der Übung modulieren können.

Genetische Chemikalienstrategie Identifiziert Histon-Deacetylase 1 (HDAC1) Und HDAC2 Als Therapeutische Ziele Bei Sichelzellanämie

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20616024

Die weltweite Belastung der Sichelzellanämie ist enorm, mit mehr als 200.000 Kinder mit der Krankheit jedes Jahr allein in Afrika. Induktion der fetalen Hämoglobin ist eine validierte Strategie zur Verbesserung der Symptome und Komplikationen dieser Krankheit. Die Entwicklung gezielter Therapien wurde durch das Fehlen von diskreten druggable Ziele begrenzt. Wir entwickelten eine einzigartige Bead-basierter Strategie zur Identifizierung von Induktoren der fetalen Hämoglobin Transkripte in primären menschlichen Erythroid Zellen. Ein klein-Molekül-Bildschirm mit bioaktiven Verbindungen identifiziert bemerkenswerte Klasse-assoziierte Aktivität unter Histon-Deacetylase (HDAC)-Hemmer. Mit eine chemische genetische Strategie, die die Bibliotheken von voreingenommenen chemische Sonden und Reverser von RNA-Interferenz konzentriert, haben wir HDAC1 und HDAC2 als molekulare Ziele Vermittlung Fetales Hämoglobin Induktion identifiziert. Unsere Ergebnisse weisen das Potenzial der Isoform-selektive Inhibitoren der HDAC1 und HDAC2 zur Behandlung der Sichelzellanämie.

DNA-Schäden Aktiviert Ein Räumlich Unterschiedliche Späten Zytoplasmatischen Zellzyklus Prüfpunkt Netzwerk Von MK2-vermittelten RNA-Stabilisierung Gesteuert

Molecular Cell. Oct, 2010  |  Pubmed ID: 20932473

Zellen aktivieren nach genotoxischen Stress eine komplexe Kinase-Signalisierung Netzwerk um den Zellzyklus zu verhaften und DNA-Reparatur zu initiieren. p53-Genen Tumorzellen von rewire ihre Prüfpunkt-Reaktion und die p38/MK2-Bahn für Überleben nach DNA-Schäden, trotz einer funktionalen ATR-Chk1 Weg abhängig werden. Wir verwendeten funktionelle Genetik, um die Beiträge von Chk1 und MK2 Prüfpunkt-Steuerelement zu zergliedern. Wir zeigen, dass nukleare Chk1 Aktivität wichtig ist, einen Checkpoint G (2) / m zu etablieren, während zytoplasmatischen MK2-Aktivität für längere Prüfpunkt Wartung durch einen Prozess der Posttranscriptionale mRNA-Stabilisierung von entscheidender Bedeutung ist. Nach DNA-Schäden relocalizes die p38/MK2 Komplex Kern, Zytoplasma, wo MK2 hnRNPA0 phosphorylates, Gadd45α-mRNA, zu stabilisieren, während p38 phosphorylates und frei von der translatorischen Hemmer TIAR. Darüber hinaus phosphorylates MK2 PARN, Gadd45α mRNA Abbau blockiert. Gadd45α-Funktionen innerhalb einer positiven Feedback-Schleife, Erhaltung die MK2-abhängige zytoplasmatische Beschlagnahme von Cdc25B/C Block mitotische Eintrag in der Gegenwart nicht reparierte DNA schädigen. Unsere Ergebnisse zeigen eine entscheidende Rolle für die MK2-Pathway in der Posttranscriptionale Regulation der Genexpression als Teil der Reaktion der DNA-Schäden in Krebszellen.

Auswirkungen Der Kollision Energieoptimierung Auf Der Messung Der Peptide Durch Ausgewählte Reaktion Überwachung (SRM)-Massenspektrometrie

Analytical Chemistry. Dec, 2010  |  Pubmed ID: 21090646

Proteomics Experimente auf der Grundlage von Selected Reaction Monitoring (SRM, auch bezeichnet als Multiple Reaction Monitoring oder MRM) werden eingesetzt, große Anzahl von Protein-Kandidaten in den komplizierten Mischungen als Ziel. Derzeit sind die Geräteparameter oft für jedes Peptid, Zeit und Ressourcen intensiven Prozess optimiert. Große SRM-Experimente sind erheblich erleichtert, indem er die Fähigkeit zur MS-Geräteparameter Vorhersage, die gut mit der breiten Vielfalt von Peptiden, die sie abzielen. Aus diesem Grund haben wir untersucht die Auswirkungen der Verwendung von einfachen linearen Gleichungen, die Aufprallenergie (CE) auf Peptid-Signalintensität vorherzusagen und verglich sie mit den empirischen Optimierung der CE für jedes Peptid und Übergang individuell. Verwenden optimierte Lineare Gleichungen, die Differenz zwischen vorhergesagten und empirisch abgeleiteten CE-Werten erwies sich einen durchschnittlichen Gewinn von nur 7,8 % der Gesamt Peakfläche. Wir fanden auch, dass häufig vorhandene lineare Gleichungen fallen hinter ihr Potenzial, und berechnet sollte für jede Ladezustand und bei der Einführung von neuen Instrument-Plattformen. Wir bieten eine voll automatisierte Pipeline für die Berechnung dieser Gleichungen und individuell optimieren CE von jedem Übergang auf SRM-Instrumente von Agilent, angewendet Biosystems, Thermo Scientific und Gewässer in der open-Source-Skyline-Software-Tool (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline).

Übersicht über Peptid Und Protein-Analyse Durch Massenspektrometrie

Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et Al.]. Nov, 2010  |  Pubmed ID: 21104985

Massenspektrometrie ist ein unentbehrliches Werkzeug für Peptid und Protein-Analyse aufgrund seiner Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Vielseitigkeit. Es kann verwendet werden, um Aminosäuresequenzen Peptide zu ermitteln und um eine Vielzahl von Übersetzungsänderungen wie Phosphorylierung und Glykosylierung zu charakterisieren. Massenspektrometrie kann auch verwendet werden absolute und relative Protein-Mengen, zu bestimmen und können identifizieren und quantifizieren von Tausenden Proteinen aus komplexen Proben, wodurch es ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug für Systeme Biologie Studien. Die Hauptziele dieser Einheit sind Peptid und Protein-Chemiker und Biologen mit den Arten von Massenspektrometern vertraut machen, die eignen sich für die meisten ihrer analytischen Bedürfnisse, um die Arten von Experimenten zu beschreiben, die mit diesen Instrumenten routinemäßig durchgeführt werden können und die Arten von Informationen zu besprechen, die diese Experimente zur Verfügung stellen.

Performance-Kennzahlen Für Flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Systeme Im Proteomics Analysen

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19837981

Ein größerer Handlungsbedarf in LC-MS/MS-basierte Proteomics Analysen ist eine Reihe von Tools für die quantitative Bewertung der Systemleistung und Bewertung der technischen Variabilität. Hier beschreiben wir 46 System-Performance-Kennzahlen für die Überwachung Chromatographische Leistung, Electrospray Quelle Stabilität, MS1 und MS2 Signale, dynamische Probenahme von Ionen für MS/MS und Peptid-Identifikation. -Datensätze von replizieren LC-MS/MS-Analysen angewendet, diese Kennzahlen angezeigt konsistente, vernünftige Antworten zu kontrollierten Perturbationen. Die Metrik normalerweise angezeigt, Variationen und weniger als 10 % und somit sogar subtile Unterschiede in der Leistung der Systemkomponenten offenbaren kann. Analysen von Daten aus Ringversuchen im Rahmen einer gemeinsamen Standard Operating Procedure identifiziert Ausreißer Daten und Hinweise an spezifischen Ursachen. Darüber hinaus zeigt Ringversuch Variation von Metriken reflektiert, welche Systemkomponenten am meisten von Labor zu Labor variieren. Diese Metriken können rational, quantitative Beurteilung für Proteomics und andere analytischen LC-MS/MS-Anwendungen.

Ringversuch Studie Charakterisierung Einer Hefe-Leistungsstandard Für LC-MS-Plattform-Performance-benchmarking

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19858499

Eine optimale Leistung der LC-MS/MS-Plattformen ist entscheidend für die Erzeugung von qualitativ hochwertigen Proteomics Daten. Obwohl einzelne Laboratorien Qualitätskontrolle entwickelt haben, gibt es keine allgemein verfügbar Leistungsstandard der biologischen Komplexität (und zugehörigen Referenz-Datensätze) für das benchmarking von Plattform-Performance für die Analyse von komplexen biologischen Proteome in verschiedenen Laboratorien in der Gemeinschaft. Individuelle Zubereitungen von der Hefe Saccharomyces Cerevisiae Proteome wurden ausgiebig von Laboratorien in der Proteomik-Gemeinschaft verwendet, um LC-MS-Plattform-Performance zu charakterisieren. Das Hefe Proteome ist eindeutig als ein Leistungsstandard attraktiv, weil es die meisten ausgiebig komplexe biologische Proteome und die einzige, die mehrere groß angelegte Studien schätzen die Fülle aller nachweisbaren Proteine zugeordnet gekennzeichnet. In dieser Studie, die wir beschreiben ein operatives Standardprotokoll für groß angelegte Produktion von der Hefe Leistungsstandard und bieten aliquoten in die Gemeinschaft durch das National Institute of Standards und Technologie, wo das Hefe Proteome Entwicklung als ein zertifiziertes Referenzmaterial, die langfristigen Bedürfnisse der Gemeinschaft ist. Mit Hilfe einer Reihe von Metriken, die LC-MS-Leistung charakterisieren, bieten wir ein Referenz-Datensatz zeigen typische Leistung häufig Ionenfalle Instrument Plattformen in expert Labors verwendet; die Ergebnisse bieten eine Grundlage für Laboratorien, benchmark-ihre eigene Leistung, nach aktuellen Methoden zu verbessern und neue Technologien zu bewerten. Darüber hinaus zeigen wir wie die Hefe-Referenz, gespickt mit menschlichen Proteinen, verwendet werden kann, um die Macht der Proteomics-Plattformen für die Erkennung von differentiell exprimierten Proteinen auf verschiedenen Ebenen der Konzentration in einer komplexen Matrix, benchmark und bieten somit eine Metrik zu bewerten und zu minimieren präanalytischen und analytischen Variation in vergleichende Proteomics Experimente.

Einführung: Fortschritte in Der Protein-Analyse Für Das Klinische Labor

Clinical Chemistry. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19910505

Wiederholbarkeit Und Vergleichbarkeit in Proteomic Identifikationen Durch Flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie

Journal of Proteome Research. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19921851

Die Komplexität der Proteomic Instrumentierung für LC-MS/MS führt viele mögliche Fehlerquellen Variabilität. Datenabhängige Probenahme von Peptiden bildet eine stochastische Element im Mittelpunkt der Entdeckung Proteomics. Obwohl diese Variante wirkt sich auf die Identifizierung von Peptiden, sind Proteomic Identifikationen weit von völlig zufällig. In dieser Studie analysierten wir Ringversuch Datensätze aus das NCI klinische Proteomic Technikfolgen-Abschätzung für Krebs, Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit im Peptid und Protein-Identifikationen zu prüfen. Enthaltenen Daten überspannt 144 LC-MS/MS-Experimente auf vier Thermo LTQ und vier Orbitrap-Instrumente. Beispiele enthalten Hefe lysate, NCI-20 Dynamikbereich-Protein-Mischung und der Sigma-UPS-1 definiert equimolar Protein-Mischung. Einige unserer Erkenntnisse verstärkt Volksweisheit, z. B. Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit höher für Proteine als für Peptide. Die meisten Lektionen aus den Daten wurden jedoch subtiler. Orbitraps erwies sich der höhere Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit, aber aberrante Leistung gelegentlich gelöscht, diese Gewinne. Selbst die einfachsten Protein-Verdauung erbrachte weitere Peptid-Ionen als LC-MS/MS, während eine einmalige Erfahrung identifizieren konnte. Wir beobachteten revocation lists, dass Peptid von Paaren der technischen Wiederholungen von 35-60 %, überschnitten eröffnet eine Palette für Peptid-Ebene Wiederholbarkeit in diesen Experimenten. Beispiel Komplexität erschienen nicht Peptid Identifikation Wiederholbarkeit, beeinflussen, selbst als die Zahl der identifizierten Spektren durch eine Größenordnung geändert. Statistische Analyse von Protein spektrale Grafen ergab mehr Stabilität über technische Wiederholungen für Orbitraps, so dass sie überlegen LTQ-Instrumente für Biomarker Kandidat Entdeckung. Die meisten wiederholbaren Peptide wurden die entsprechenden konventionellen tryptic Spaltung Websites, diejenigen, die intensive MS-Signale erzeugt und diejenigen, die aus Proteinen, die viele verschiedene Peptide generieren. Reproduzierbarkeit unter verschiedenen Instrumenten des gleichen Typs zurückgeblieben Wiederholbarkeit an technischen Wiederholungen auf ein einziges Instrument, um mehrere Prozent. Diese Erkenntnisse verstärken die Bedeutung Wiederholbarkeit als ein grundlegendes Merkmal von analytischen Technologien zu bewerten.

Protein-basierte Multiplex-Assays: Presubmissions an Die US Food and Drug Administration Zu Verspotten

Clinical Chemistry. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 20007858

Als Teil der laufenden Bemühungen des Unterausschusses NCI-FDA Interagency Onkologie-Taskforce für Molekulardiagnostik haben Mitglieder der klinischen Proteomic-Technikfolgen-Abschätzung für Cancer Program des National Cancer Institute 2 proteinhaltige multiplex Assay-Beschreibungen zu Office für In Vitro Diagnostic Device Evaluierung und Sicherheit, US Food und Drug Administration eingereicht. Ziel war es, die Beurteilung der analytischen Messkriterien und Studien erforderlich, um Protein-basierte multiplex-Assays zu überprüfen. Jede Einreichung beschrieben eine andere Protein-basierte Plattform: multiplex Immunoaffinity Massenspektrometrie Plattform für Protein Quantifizierung und eine Quantifizierung Glykoprotein-Isoformen immunologische Array-Plattform. Einreichungen bot eine gegenseitig vorteilhafte Möglichkeit für Mitglieder der Proteomik und regulatorischen Gemeinschaften die analytische Probleme identifiziert, die das Feld bei der Entwicklung von proteinbasierten multiplex klinischer Proben soll.

Analytische Validierung Von Protein-basierte Multiplex-Assays: Ein Workshop-Bericht Von Der NCI-FDA Ressortübergreifenden Onkologie Task Force Auf Molekulardiagnostik

Clinical Chemistry. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 20007859

Klinische Proteomics hat das Potenzial, die Früherkennung von Krebs durch die Entwicklung von multiplex-Assays zu ermöglichen, die klinische Entscheidungen informieren können. Jedoch gab es einige Verunsicherung bei translatorischen Forscher und Entwickler, die Kriterien des analytischen Messungen erforderlich, um Protein-basierte multiplex-Assays zu überprüfen. Zunächst an Adresse gibt die Ursachen für diese Unsicherheit, ein Tag lang-Workshop, die mit dem Titel "Interagency Onkologie Task Force Molekulare Diagnose Workshop" stattfand, in dem Mitglieder der Proteomik und regulatorischen Gemeinden viele der analytischen Auswertung erläutert, dass das Feld in der Entwicklung von proteinbasierten multiplex-Assays für den klinischen Einsatz ansprechen sollte. Diese Sitzung Bericht untersucht im Rahmen des Workshops aufgeworfenen Fragen und details die Empfehlungen, die kam aus der Tag-Diskussionen, wie eine Zusammenfassung der analytischen Auswertung Themen, die bestimmte Proteomic Technologien bei der Suche nach Genehmigung der amerikanischen Food and Drug Administration soll Workshops.

Bewertung Der Groß Angelegte Quantitative Proteomic-Assay-Entwicklung Mit Peptid Affinität-basierte Massenspektrometrie

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Apr, 2011  |  Pubmed ID: 21245105

Stabile Isotop Normen und Erfassen von antipeptide Antikörpern (SISCAPA) Paare Affinität Anreicherung von Peptiden mit stabilen Isotope Dilution und Erkennung durch mehrere Reaktion Überwachung Massenspektrometrie um quantitative Messung von Peptiden als Ersatzzeichen für ihre jeweiligen Proteine zu bieten. In diesem Bericht beschreiben wir eine Machbarkeitsstudie, um die Erfolgsrate für die Produktion von passenden Antikörpern für SISCAPA Assays zu ermitteln, um Strategien für eine groß angelegte Assayentwicklung zu informieren. Ein Workflow wurde entworfen, die eine multiplex Immunisierung-Strategie enthalten, in der bis zu fünf Proteotypic Peptide aus ein einzelnes Protein-Ziel verwendet wurden, um einzelne Kaninchen zu immunisieren. Insgesamt 403 Proteotypic tryptic Peptide, 89 Protein Ziele darstellt, wurden als Immunogenen verwendet. Antipeptide Antikörper-Titer gemessen wurden von ELISA und 220 antipeptide Antikörper, die 89 Proteine wurden für Affinitätsreinigung ausgewählt. Diese Antikörper wurden in Bezug auf ihre Leistung im SISCAPA-Multiple Reaktion Überwachung Assays mit Trypsin verdaut Blutplasma Matrix charakterisiert. Mehr als die Hälfte der generierten Tests waren Aufspüren von das Ziel-Peptid bei Konzentrationen von weniger als 0,5 Fmol/μl in menschlichem Plasma Protein-Konzentrationen von weniger als 100 ng/ml entspricht. Die Strategie der Multiplexen fünf Peptid Immunogenen war erfolgreich eine arbeiten-Assay für 100 % der gezielten Proteine in diese Evaluationsstudie zu generieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass es für ein einzelnes Labor entwickeln Hunderte Proben pro Jahr und ermöglichen eine Planung für kostengünstige Generation SISCAPA Assays durchführbar ist.

Lipid Profiling Identifiziert Eine Triacylglycerol-Signatur Der Insulinresistenz Und Diabetes Vorhersage Beim Menschen Verbessert

The Journal of Clinical Investigation. Apr, 2011  |  Pubmed ID: 21403394

Dyslipidämie ist ein unabhängiger Risikofaktor für Typ-2-Diabetes, obwohl genau welche der vielen Plasmas Lipide dazu beitragen unklar bleibt. Wir deshalb untersucht, ob Lipid Profilerstellung Diabetes-Vorhersage informieren kann durch Ausführen einer flüssige Chromatographie/Massen-Spektrometrie basierende Lipid Profilerstellung in 189 Personen, die Typ-2-Diabetes entwickelt und 189 abgestimmt krankheitsfreie Einzelpersonen, mit über 12 Jahren Follow-up in der Framingham Heart Study. Wir fanden, dass Lipiden der niedrigeren Kohlenstoffgehalt, Anzahl und Doppelbindung verbunden mit einem erhöhten Risiko für Diabetes, während Lipiden der höheren Kohlenstoffgehalt, Anzahl und Doppelbindung mit verminderten Risiko verbunden waren. Dieses Muster war am stärksten für die Umwandlung von Triglyceriden (TAGs) und beibehaltene Multivariables bereinigt um Alter, Geschlecht, BMI, nüchtern-Glukose, nüchtern Insulin, total Triglyceride und HDL-Cholesterin. Eine Kombination von 2 TAGs weiter verbesserte Diabetes-Vorhersage. Um mögliche Mechanismen zu untersuchen, die die Verteilung der Plasma Lipide zu modulieren, führten wir Lipid Profilerstellung bei oralen Glukose Toleranz Test, pharmakologische Interventionen und akute Übung testen. TAGs verknüpft mit einem erhöhten Risiko für Diabetes, die als Reaktion auf die Insulinwirkung verringert und wurden auf die Einstellung der Insulin-Resistenz erhöht. Umgekehrt TAGs zugeordnet Diabetes Risiko stieg als Reaktion auf Insulin und waren schlecht mit Insulinresistenz korreliert. Diese Studien eine Beziehung zwischen Lipid Acil Kette Inhalt und Diabetes-Risiko zu identifizieren und demonstrieren, wie Lipid Profilerstellung klinischen Risikobewertung unterstützen könnte.

Eine Pipeline, Die Die Ermittlung Und Überprüfung Des Plasma-Protein-Biomarkern Integriert Enthüllt Kandidat Marker Für Herz-Kreislauf-Erkrankungen

Nature Biotechnology. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21685905

Wir entwickelt eine Pipeline die Proteomic-Technologien, die von der Entdeckung verwendet werden, um die Überprüfung-Stufen der Plasma Biomarkers Identifikation zu integrieren und wendete sie um frühen Biomarker der kardialen Schädigung aus dem Blut des Patienten eine therapeutische, geplante Myokardinfarkt (PMI) für die Behandlung von hypertrophen Kardiomyopathie zu identifizieren. Probenahme von Blut direkt vom Patienten Herzen vor, während und nach der kontrollierten myokardialen Schädigung sicherte Bereicherung für Kandidaten Biomarker und erlaubte Patienten als eigene biologische Kontrollen dienen. LC-MS/MS-Analysen erkannt 121 hoch differenziell ausgedrückt Proteine, einschließlich zuvor Berechtigungsnachweis Marker für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und > 100 Roman Kandidat Biomarker für Myokardinfarkt (MI). Genaue Aufnahme Mass screening (AIMS) qualifiziert, eine Teilmenge der Kandidaten basierend auf hochspezifische, gezielte Erkennung im peripheren Plasma, einschließlich einige Marker voraussichtlich nicht ohne diesen Schritt identifiziert wurden. Analysen der peripheren Plasma von Steuerelementen und Patienten mit PMI oder spontane MI durch quantitative mehrere Reaktion Massenspektrometrie oder Immunoassays Überwachung legen nahe, dass der Kandidat-Biomarker für MI spezifisch sein können. Diese Studie zeigt, dass moderne Proteomic-Technologien, wenn Sie zusammenhängend integriert, neuartige kardiovaskuläre Biomarker verdient weitere Evaluierung in großen, heterogenen Kohorten hervorbringen können.

Exoplasmic Cystein Cys384 HDL Rezeptors SR-BI Ist Entscheidend Für Seine Empfindlichkeit Gegenüber Eine Kleine-Molekül-Inhibitor Und Normalen Lipid Transporttätigkeit

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21746906

Der HDL-Rezeptor, Scavenger-Rezeptor, Klasse B, Typ I (SR-BI), ist ein Homooligomeric Zelle Oberfläche Glykoprotein, das HDL-Struktur und Stoffwechsel steuert durch die selektive Aufnahme von Lipiden, hauptsächlich Cholesterinestern von HDL Vermittlung. Der Mechanismus zugrunde liegenden SR-BI-vermittelter Lipid-Transfer, unterscheidet sich vom klassischen Rezeptor-vermittelte Endozytose, beinhaltet einen zweistufiger Prozess (Bindung gefolgt von Lipid-Transport), der ist oft missverstanden. Unsere vorherige Struktur/Wirkungs-Analyse von der klein-Molekül-Inhibitor-Blocker der Lipid-Transport 1 (BLT-1), die dabei wirksam (IC (50) ∼ 50 nM) Lipid SR-BI-vermittelten Transport, festgestellt, daß der Schwefel in BLT-1-Thiosemicarbazone-Gruppe für Aktivität blockiert. Hier zeigen wir, dass die BLT-1 ist ein irreversibler Hemmstoff des SR-BI, erhöhen die Möglichkeit, dass Cysteine(s) in SR-BI mit BLT-1 zu interagieren. Massenspektrometrische Analyse von gereinigtem SR-BI zeigte, dass zwei seiner sechs Exoplasmic-Cysteine freie Thiol-Gruppen (Cys251 und Cys384) verfügen. Konvertieren von Cys384 (aber nicht Cys251) in Serin ergab komplett BLT-1-Insensitivität, nachzuweisen, dass das einzigartige Molekulare Ziel der BLT-1-Hemmung der zellulären SR-BI-abhängige Lipid-Transport SR-BI selbst ist. Die C384S Substitution haben den Rezeptor systeminterne Lipid Aufnahme Aktivität um ca. 60 % reduziert, ohne wesentlich zu verändern, seine Oberfläche Ausdruck, Homooligomerization oder HDL-Bindung. Daher identifiziert ein klein-Molekül Screening-Konzept eine wichtige Rückstände in SR-BI im Lipid-Güterverkehr, die leistungsstarke Sprungbrett in die Analyse der Struktur und Mechanismus der SR-BI und unterstreicht die Kraft dieses Ansatzes für solche Analysen.

Selektiven Tötung Von Krebszellen Durch Ein Kleines Molekül, Das Gezielt Der Stressantwort Auf ROS

Nature. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21753854

Maligne Transformation, getrieben von Gain of Function-Mutationen im Onkogene und Verlust der Funktion Mutationen im Tumor-Suppressor-Gene, Ergebnisse in der Zelle-Deregulierung, der häufig mit verstärkten zellulären Stress (z. B. oxidative, replicative, metabolische und Proteotoxic Stress und DNA-Schäden) zusammenhängt. Anpassung an diese Belastung-Phänotyp ist erforderlich für Krebszellen zu überleben, und folglich können Krebszellen abhängig von nicht-Onkogene, die nicht normalerweise diese lebenswichtige Funktion in normalen Zellen durchführen werden. Somit kann auf diese nicht-Onkogen-Abhängigkeiten im Zusammenhang mit einer transformierten Genotyp eine synthetische tödliche Wechselwirkung und dem selektiven Tod der Krebszellen führen. Hier haben wir eine zellbasierte klein-Molekül-Screening und quantitative Proteomik-Ansatz, der die unvoreingenommene Identifizierung eines kleinen Moleküls geführt, die selektiv Krebszellen aber nicht normale Zellen tötet. Piperlongumine erhöht die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Apoptotic Zellentod in Krebszellen und normalen Zellen, die so konstruiert, dass eine Krebs-Genotyp, unabhängig von p53-Status haben, aber es hat wenig Auswirkung auf entweder schnell oder langsam teilenden primäre normale Zellen. Signifikante Antitumor-Wirkungen werden in Piperlongumine behandelten Xenograft-Tumor Mausmodelle, mit keine offensichtliche Toxizität bei normalen Mäusen beobachtet. Darüber hinaus hemmt Piperlongumine dabei wirksam die spontan gebildete bösartige Brusttumoren und ihre zugeordneten Metastasen bei Mäusen. Unsere Ergebnisse zeigen die Fähigkeit eines kleinen Moleküls zu Apoptose selektiv in Zellen, die eine Krebs-Genotyp, durch gezielte ein nicht-Onkogen-Co-Abhängigkeit durch den Ausdruck des Krebs-Genotyps als Reaktion auf Transformation induziert oxidativen Stress erworben haben.

AAK1 Identifiziert Als Inhibitor Von Neuregulin-1/ErbB4-abhängigen Neurotrophic Factor Signalisierung Mit Integrativen Chemische Genomik Und Proteomik

Chemistry & Biology. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21802010

Ziel Identifikation bleibt weiterhin schwierig für den Bereich der chemischen Biologie. Wir beschreiben einen integrativen chemischen genomic und Proteomic-Ansatz, die Verwendung von differentiell aktive Analoga von niedermolekularen Sonden mit Stabiles Isotop Kennzeichnung von Aminosäuren in Zelle Kultur-vermittelte Affinität Bereicherung, gefolgt von der anschließenden Test der Kandidat-Ziele, die mit der RNA-Interferenz-vermittelter gen-silencing kombinieren. Wir diesen Ansatz auf charakterisieren das Naturprodukt K252a und seine Fähigkeit, Neuregulin-1 (Nrg1) potenzieren angewendet / ErbB4 (V-Erb-a epidermialen Leukämie Virenoncogenehomolog 4)-abhängige Neurotrophic Faktor Signal- und Neuritogenesis. Wir zeigen, dass AAK1 (Adapter-assoziierten Kinase 1) relevante Ziel von K252a ist, und, daß der Verlust von AAK1 ErbB4 Menschenhandel und Ausdruck Niveaus, den Nachweis für eine zuvor unbekannte Rolle für AAK1 in Nrg1-vermittelte Neurotrophic signalisieren Faktor. Ähnliche Strategien sollten zur Entdeckung neuartiger Ziele für die therapeutische Entwicklung führen.

Status Und Perspektiven Für Die Ermittlung Und Überprüfung Neuer Biomarker Für Herz-Kreislauf-Erkrankungen Von Proteomics

Circulation Research. Aug, 2011  |  Pubmed ID: 21817166

Trotz unerfüllte Bedürfnisse für kardiovaskuläre Biomarker wurden einige neue Protein-Marker zur Diagnose oder Screening von Herz-Kreislauf-Erkrankungen durch die US Food and Drug Administration genehmigt. Spektrometrie-basierten Massen-Proteomics Technologien sind in der Lage, Hunderte bis Tausende von Proteinen in Zellen, Geweben und hinter zu identifizieren. Proteomics können daher die Möglichkeit, neue Biomarker und Wege ohne eine vorherige Verbindung mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen bekannt zu erhellen vorsehen; bleiben jedoch wichtige Hindernisse. In diesem Bericht konzentrieren wir uns auf Zukunftstechniken, die eine schlüssiger integrierte Pipeline zur Überwindung der gegenwärtigen Beschränkungen in Bezug auf die Entdeckung und die Validierung Prozesse bilden können.

Mutationen Im MTFMT Zugrunde Liegen, Eine Menschliche Störung Der Formylation Gestörte Mitochondriale Übersetzung Verursacht Wird

Cell Metabolism. Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21907147

Indem mitochondrische Übersetzung Maschine ist ungewöhnlich in einem einzigen tRNA(Met), die die Doppelrolle des Initiators erfüllt und Elongator tRNA(Met). Ein Teil der Met-tRNA(Met) Pool ist Formylated durch mitochondriale PEGylierter-tRNA-Formyltransferase (MTFMT) zum Generieren von N-formylmethionine-tRNA(Met) (fMet-tRNA(met)), das verwendet wird, für die Übersetzung Einleitung; Allerdings ist das Erfordernis der Formylation zur Einleitung in den menschlichen Mitochondrien noch unter Debatte. Verwenden gezielte Sequenzierung der MtDNA und nukleare Exons, die Codierung des mitochondrischen Proteoms (MitoExome), wir zusammengesetzte heterozygote Mutationen im MTFMT in zwei unabhängige Kinder mit Leigh-Syndrom erkannt und kombiniert OXPHOS-Mangel. Patienten Fibroblasten weisen schwere Mängel in der mitochondrialen Übersetzung, die durch exogene Expression MTFMT gerettet werden können. Darüber hinaus haben Patienten Fibroblasten fMet-tRNA(Met) Ebenen und eine abnorme Formylation Profil mitochondrially übersetzten COX1 drastisch reduziert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass MTFMT ist entscheidend für die effiziente menschliche mitochondrische Übersetzung und offenbaren eine menschliche Störung der Met-tRNA(Met) Formylation.

Cdk5 Ist Erforderlich Für Die Memory-Funktion Und Hippocampal Plastizität über Das CAMP Signalisierung Weg

PloS One. 2011  |  Pubmed ID: 21984943

Gedächtnisbildung wird durch vor- und post-synaptic Signalisierung Ereignisse in Neuronen moduliert. Die neuronale Proteinkinase Cyclin-abhängige Kinase 5 (Cdk5) phosphorylates eine Vielzahl von synaptischen Substraten und ist an der Gedächtnisbildung beteiligt. Es hat auch eine Rolle bei homöostatischen Regulierung der synaptische Plastizität in kultivierten Neuronen gezeigt. Überraschenderweise fanden wir, dass Cdk5 Verlust der Funktion in hippocampal Schaltungen führt zu schweren Beeinträchtigungen in der Gedächtnisbildung und Abruf. Darüber hinaus stört Cdk5 Verlust der Funktion im Hippocampus cAMP Signalisierung durch eine aberrante Zunahme der Phosphodiesterase (PDE) Proteine. Dysregulation des Lagers ist defekt CREB Phosphorylierung zugeordnet und Zusammensetzung der synaptischen Proteine Cdk5-defizienten Mäusen gestört. Rolipram, ein PDE4-Hemmer, die cAMP Erschöpfung, verhindert werden synaptische Plastizität und Gedächtnis-Formation Cdk5-defizienten Mäusen wiederhergestellt. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse eine entscheidende Rolle für Cdk5 in der Verordnung von Lager-vermittelte hippocampal Funktionen für synaptische Plastizität und der Gedächtnisbildung.

Systematische Entdeckung Der TLR-Signalisierung-Komponenten Schildert Virale Erkennung Schaltungen

Cell. Nov, 2011  |  Pubmed ID: 22078882

Entschlüsselung der Signalisierung Netzwerke, die normalen zugrunde liegen und Krankheit Prozesse nach wie vor eine große Herausforderung. Wir berichten hier, die Entdeckung der Signalisierung Komponenten beteiligt: die Toll-Like-Rezeptor (TLR) Reaktion des Immunsystems dendritische Zellen (DCs), einschließlich ein zuvor unbekannter Weg für Säugetier-antivirale Antworten freigegeben. Durch kombinieren transkriptionelle Profilerstellung, genetische und klein-Molekül Perturbationen und Phosphoproteomics entdecken wir 35 Signalling Regulatoren, einschließlich 16 bekannte Regulatoren, TLR-Signalisierung beteiligt. Insbesondere finden wir, dass Polo-wie Kinasen (Plk) 2 und 4 wesentliche Bestandteile der antiviralen Bahnen in vitro und in-vivo sind und eine signalisierende Filiale Beteiligung ein Dutzend Proteine aktivieren, darunter ist Tnfaip2, ein Gen mit Autoimmunkrankheiten, aber deren Rolle war unbekannt. Unsere Studie zeigt die Macht des Kombinierens der systematischen Messungen und Perturbationen komplexe Signalling Schaltungen zu erhellen und mögliche therapeutische Ziele zu entdecken.

Die Matrisome: in Silico-Definition Und In-vivo Charakterisierung Von Proteomics Von Normalen Und Tumor Extrazellularen Matrizen

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22159717

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Netzwerk von querverbundenen Proteinen bietet sowohl biophysikalische und biochemische Hinweise, die wichtige Regulatoren der Zellproliferation, überleben, Differenzierung und Migration sind. Wir präsentieren hier eine Proteomic-Strategie entwickelt, um die in-vivo ECM-Zusammensetzung des normalen Geweben und Tumoren mit Anreicherung des Proteins charakterisieren Extrakte für ECM-Komponenten und anschließende Analyse durch Massenspektrometrie. Parallel haben wir einen Bioinformatic Ansatz zur Vorhersage der in Silico entwickelt ″matrisome″ definiert als Ensemble von ECM-Proteinen und verbundenen Faktoren. Wir berichten die Charakterisierung der extrazellularen Matrizen murine Lung und Doppelpunkt, jeweils mehr als 100 ECM-Proteine und jeweils eine charakteristische Signatur präsentiert. Darüber hinaus zeigen mit menschlichen Tumor Xenografts in Mäuse, wir, dass Tumorzellen und stromal Zellen die Produktion der Tumor Matrix beitragen und Tumoren unterschiedlicher metastasierendem Potenzial in den Tumor- und die Stroma abgeleitete ECM-Komponenten unterscheiden. Die Strategie, die wir beschreiben und illustrieren hier weitgehend angewendet werden kann, und um die Anwendung dieser Methoden von anderen zu erleichtern, bieten wir Ressourcen einschließlich Laborprotokolle, Vorräte von ECM-Domänen und Proteinen und Anweisungen für die Bioinformatically Ableitung der Mensch und Maus Matrisome.

Laborübergreifende Bewertung Der Automatisiert, Multiplex-Peptid Immunoaffinity Bereicherung an Mehreren Reaktion Überwachung Zur Quantifizierung Der Proteine Im Plasma-Massenspektrometrie Gekoppelt Ist

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22199228

Die Unfähigkeit, zahlreicher Proteine im Gewebe und hinter mit hoher Präzision, Sensibilität und Durchsatz zu quantifizieren ist ein großes Hindernis in Biomarker-Studien. Wir zuvor nachweislich Immunoaffinity Anreicherung mit anti-peptide Antikörpern (SISCAPA) zu MRM-MS Kopplung Immuno-MRM Proben produziert, die zur Quantifizierung der Proteine im Plasma mit hoher Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit Multiplexing werden können. Hier berichten wir, dass die erste systematische Bewertung der laborübergreifende Leistung (8-Plex) Immuno-MRM-MS in drei unabhängige Labore Multiplexing. Eine inszenierte Studie wurde durchgeführt, in denen die Wirkung der einzelnen Schritte der Verarbeitung und Analyse auf Probe CV, LOD, LOQ und Recovery ausgewertet wurde. Nachweisgrenzen waren bei oder unter 1 ng/mL für die analysiert Proteine in 30 uL von Plasma. Assay Reproduzierbarkeit war akzeptabel für Überprüfung Studien, mit medianen Intra - und inter - laboratory CVs oberhalb der LOQ von 11 % und < 14 %, jeweils für den gesamten Immuno-MRM-MS-Assay-Prozess, einschließlich enzymatische Verdauung von Plasma. Trypsin-Verdauung und den Umgang damit erforderliche Beispiel trugen die meisten um die Variabilität Brutversuch und die Wiederherstellung der Ziel-Peptide von verdaute Proteine verringert. Mit ein stabiles Isotop Protein als ein internes Standards statt Stabiles Isotop beschriftete Peptide für Verluste im Verdauungprozeß fast Konto Assay Genauigkeit dafür verdoppelt, gleichzeitiger Verbesserung der Assay-Präzision 5 % gekennzeichnet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Multiplex Immuno-MRM-MS in unabhängigen Labors reproduzierbare gemacht werden kann und das Potenzial hat, die weit angenommen werden, für die Prüfung der Proteine in Matrizen so komplex wie Plasma.

ITRAQ Kennzeichnung Ist Ein MTRAQ Für Quantitative Global Proteomics Und Phosphoproteomics Vorzuziehen

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22210691

Kennzeichnung von primären Aminen auf Peptide mit Reagenzien mit stabiler Isotope ist eine häufig verwendete Technik in quantitative Massenspektrometrie. Isobare Kennzeichnung Techniken wie iTRAQ oder TMT ermöglichen relative Quantifizierung von Peptiden, die basierend auf Verhältnisse der Reporter-Ionen in der niedrigen m/Z-Region von Spektren von Vorläufer Ionen Fragmentierung produziert. Im Gegensatz dazu ergibt sich nicht-Isobare Kennzeichnung mit mTRAQ Vorstufen mit verschiedenen Massen, die direkt in MS1 Spektren quantifiziert werden können. In dieser Studie vergleichen wir iTRAQ und mTRAQ-basierte Quantifizierung von Peptiden und Phosphopeptides von EGF-stimuliert HeLa-Zellen abgeleitet. Beide Bezeichnungen haben identische chemische Strukturen, also Vorläufer Ionen - Fragment Ion-basierte Quantifizierung direkt miteinander verglichen werden kann Unsere Ergebnisse zeigen, dass iTRAQ Kennzeichnung eine additive Wirkung auf Vorläufer Intensitäten, während mTRAQ Kennzeichnung zu mehr redundante Scan MS2-Ereignisse verursacht führt durch Triggern auf das gleiche Peptid mit verschiedenen mTRAQ Etiketten. Wir fanden, dass iTRAQ Kennzeichnung fast 3-Band mehr Phosphopeptides (12.129 vs. 4.448) und fast 2-fold mehr Proteine (2.699 vs. 1.597) als mTRAQ bezeichnen quantifiziert. Obwohl die meisten wichtigen Proteine in der EGFR-Signalling-Netzwerk mit beiden Techniken beziffert wurden, werden erlaubt iTRAQ Kennzeichnung Quantifizierung der doppelt so viele Kinasen. Genauigkeit der Reporter Ion Quantifizierung von iTRAQ ist durch Peptide, die im gleichen Vorläufer Isolierung Fenster co-fragmented sind dämpfende beobachteten Verhältnisse in Richtung Einheit beeinträchtigt. Jedoch ähnelte aufgrund enger insgesamt iTRAQ Verhältnis Distributionen, der Anteil der statistisch signifikant geregelten Phosphopeptides und Proteine, die von iTRAQ und mTRAQ erkannt. Wir beobachteten eine lineare Korrelation der logarithmischen iTRAQ mTRAQ-Verhältnisse über zwei Größenordnungen, angibt, eine Möglichkeit, durch eine durchschnittliche Kompressionsfaktor iTRAQ Verhältnisse zu korrigieren. Spike-in Experimente mit Peptide mit definierten Kennzahlen in einem Hintergrund der ungeregelten Peptide zeigen, dass iTRAQ Quantifizierung weniger präzise, aber nicht als Variable als mTRAQ Quantifizierung.

STK33 Kinasehemmer BRD-8899 Hat Keine Auswirkungen Auf KRAS-abhängige Krebs Zelle Entwicklungsfähigkeit

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22323609

Etwa 30 % der menschlichen Krebserkrankungen Hafen Onkogene Gain of Function-Mutationen im KRAS. Trotz des Interesses in KRAS als ein therapeutisches Ziel noch direkte Blockade der KRAS-Funktion mit kleiner Moleküle nachgewiesen werden. Auf der Grundlage von Experimenten, die mRNA-Stufen von Proteinkinasen zu senken, wurden KRAS-abhängige Krebszellen vorgeschlagen, eine einzigartige Voraussetzung für die Serin/Threonin-Kinase STK33 haben. Daher wurde vorgeschlagen, dass klein-Molekül-Inhibitoren STK33 therapeutischen Nutzen diese Krebsarten haben könnte. Hier beschreiben wir die Entwicklung von selektiven, niedrige Nanomolar Inhibitoren des STK33s Kinase-Aktivität. Die potenter und selektiver dieser, BRD8899, Fehler beim KRAS-abhängigen Zellen zu töten. Zwar es mehrere Erklärungen für dieses Ergebnis gibt, sind unsere Daten konsequentesten die Ansicht, dass die Hemmung der STK33s Kinase-Aktivität keine viel versprechende Anti-KRAS-therapeutische Strategie darstellt.

Zellulare Ziele Von Klein-Molekül-Sonden Und Drogen Identifizieren Mit Biochemischen Bereicherung Und SILAC

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2012  |  Pubmed ID: 22065222

Sequenzierung des menschlichen Genoms im letzten Jahrzehnt hat noch nicht zu einem gleichzeitigen Anstieg die Zahlen von neuartigen Medikamenten Zielen geführt. Während die Pharmaindustrie investiert hat Drogen für vorhandene Protein Ziele zu verbessern, hat es nicht an eine ähnliche Investitionen in experimentellen Ansätzen zellulare Ziele von Drogen zu identifizieren eher. Auffallend ist, dass die Ziele der zahlreichen verbreiteten FDA-zugelassene Medikamente unbekannt bleiben. Die Entwicklung von robusten, unvoreingenommene Methoden für Ziel-Identifizierung würde erheblich verbessern unser Verständnis der Mechanismen der Aktionsplans kleiner Moleküle. Zellbasierte phänotypische Bildschirme gefolgt von unvoreingenommene deiner Identifizierung haben das Potenzial, neuartige Kombinationen von kleinen Molekülen und ihre Protein-Ziele zu identifizieren, wird Licht auf Droge Polypharmacology und unvoreingenommene Prüfung Ansätze zur Wirkstoffforschung. Klassische biochemische Anreicherung mit immobilisierten kleine Moleküle wurde seit über vier Jahrzehnten aber hat durch Fragen Spezifität und Sensitivität eingeschränkt worden. Die Anwendung der Massenspektrometrie-basierten Massen-quantitative Proteomik in Kombination mit diese Affinität Reagenzien erweist sich besonders hilfreich bei der Bewältigung dieser häufige Probleme bei der Affinität Reinigung Experimente. Wir beschreiben die Verwendung von SILAC bei der Identifizierung von Proteinen, die klein-Molekül-Sonden und Drogen in einem zellulären Kontext binden.